本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞的分離、鑒定及分化領(lǐng)域，具體為一種骨髓單核細(xì)胞分離、鑒定及誘導(dǎo)分化的方法。

背景技術(shù)：

隨著老齡化社會(huì)的到來，骨質(zhì)疏松癥已成為危害老齡人口健康的第四大因素。作為一種系統(tǒng)性骨病，骨質(zhì)疏松的臨床表現(xiàn)主要為骨量下降、骨微結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加等?？梢鹑黻P(guān)節(jié)酸痛，腰背疼痛甚至骨折，大大降低了患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也給家庭、社會(huì)帶來巨大壓力。如何預(yù)防和延遲骨質(zhì)疏松的發(fā)生已經(jīng)成為當(dāng)下重要的健康課題。骨質(zhì)疏松的發(fā)生在病理上與破骨細(xì)胞有著密切的關(guān)系，如何成功獲得破骨細(xì)胞是進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵。

目前，破骨細(xì)胞的獲取方法主要分為機(jī)械分離法和誘導(dǎo)法。由于破骨細(xì)胞是一種高代謝終末分化細(xì)胞，具有無法傳代、存活時(shí)間短等特點(diǎn)，且破骨細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量極少，因此機(jī)械分離獲取困難。在現(xiàn)有的誘導(dǎo)方法中，通過raw264.7細(xì)胞系誘導(dǎo)是目前最常用的誘導(dǎo)方法，然而，由于raw264.7是細(xì)胞系，與原代細(xì)胞基因系存在的具體差異無法知曉。骨髓單核細(xì)胞作為一種較為前體的破骨細(xì)胞，采用其作為研究對(duì)象更有說服力。另外，通過骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的破骨細(xì)胞在數(shù)量、純度、成熟度等方面均優(yōu)于脾細(xì)胞誘導(dǎo)法和外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)法獲得的破骨細(xì)胞。

關(guān)于骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)獲得破骨細(xì)胞的方法國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要原因是采用骨髓單核細(xì)胞作為研究對(duì)象需要進(jìn)行原代提取，而原代提取需要精細(xì)剝離長(zhǎng)骨周圍軟組織，需要大量的精力和時(shí)間。這不僅降低了研究人員的積極性，而且常導(dǎo)致提取的原代細(xì)胞活性較低，誘導(dǎo)分化效果較差。

因此，建立一種簡(jiǎn)便快速的體外分離、擴(kuò)增骨髓單核細(xì)胞的方法，同時(shí)高效地將其誘導(dǎo)為破骨細(xì)胞，為進(jìn)一步探索骨代謝疾病提供研究基礎(chǔ)顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種步驟簡(jiǎn)單、工作量小、耗時(shí)短，且保證分離獲得的細(xì)胞具有良好的細(xì)胞活性和分化能力，本發(fā)明提供了一種骨髓單核細(xì)胞分離、鑒定及誘導(dǎo)分化的方法。

技術(shù)方案：一種骨髓單核細(xì)胞分離、鑒定及誘導(dǎo)分化的方法，包括以下步驟：

第1步、骨髓單核細(xì)胞分離

a、取移液槍槍頭，剪取其下端1～1.5cm的移液口，采用尖頭鑷子將移液口進(jìn)行擴(kuò)口處理；

b、取1.5ml規(guī)格的ep管，將步驟a中的移液口置于ep管中，組裝后滅菌；

c、無菌條件下分離完整的大鼠脛骨、股骨，將其剪斷后斷端朝下，置于步驟b中滅菌處理后的移液口中，6000r/min×30s離心1次；

第2步、骨髓單核細(xì)胞鑒定

d、將第1步分離的骨髓單核細(xì)胞接種至含25～100ng/mlm-csf(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天半量換液，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；

e、培養(yǎng)3～5天后，取步驟d培養(yǎng)的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面抗原cd11b(白細(xì)胞分化抗原11b)的陽性表達(dá)率；

f、取步驟d培養(yǎng)了1～9天的細(xì)胞，采用cck-8法(細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法)繪制生長(zhǎng)曲線；

第3步、骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化

g、取步驟d培養(yǎng)的細(xì)胞，采用m-csf和rankl(核因子κb受體活化因子配基)誘導(dǎo)其分化，并通過trap(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色、ctr(降鈣素受體)熒光染色鑒定為成熟破骨細(xì)胞。

優(yōu)選的，步驟c中脛骨、股骨取自新生1周內(nèi)的sd大鼠。

優(yōu)選的，步驟d中所述完全培養(yǎng)基的組分為α-mem(α基礎(chǔ)培養(yǎng)基)75～90％，胎牛血清10～25％，抗生素10～100u/ml。

優(yōu)選的，步驟g中m-csf的使用濃度為25～100ng/ml，rankl的使用濃度為50～100ng/ml。

優(yōu)選的，步驟e中培養(yǎng)5天，細(xì)胞密度至少為90％。

優(yōu)選的，步驟e中單核細(xì)胞的表面抗原cd11b的陽性表達(dá)率達(dá)到98.6％。

有益效果：(1)本發(fā)明采用骨髓單核細(xì)胞作為研究對(duì)象，較破骨前體細(xì)胞系更具有說服力；(2)本發(fā)明所述方法克服了傳統(tǒng)的注射器沖洗骨髓腔法的不足，大大縮短了獲得骨髓單核細(xì)胞的時(shí)間，提高了細(xì)胞活性；(3)本發(fā)明所述方法分離后的骨髓單核細(xì)胞能夠被成功誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞；(4)本發(fā)明所述方法分離純化獲得的骨髓單核細(xì)胞數(shù)量可觀、性狀穩(wěn)定、活性較高，能夠?yàn)楹罄m(xù)的骨代謝疾病的基礎(chǔ)研究提供可靠的細(xì)胞來源。

附圖說明

圖1是骨髓單核細(xì)胞分離裝置示意圖；

圖2是骨髓單核細(xì)胞在m-csf刺激下第1、3、5天的形態(tài)特征圖，

其中a為第1天的形態(tài)特征圖，b為第3天的形態(tài)特征圖，c為第5天的形態(tài)特征圖；

圖3是骨髓單核細(xì)胞表面抗原cd11b流式檢測(cè)結(jié)果圖，

其中，a為同型對(duì)照組，b為加入0.5μlcd11b熒光抗體實(shí)驗(yàn)組；

圖4是骨髓單核細(xì)胞在m-csf刺激下的生長(zhǎng)曲線；

圖5是骨髓單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞后trap染色結(jié)果圖，其中a為對(duì)照組，b為誘導(dǎo)組；

圖6是骨髓單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞后ctr免疫熒光染色和hochest33342熒光染色結(jié)果圖，其中a為降鈣素受體染色(ctr)，b為核染色(nucleus)，c為混合(merged)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1骨髓單核細(xì)胞分離

取若干實(shí)驗(yàn)室常用的塑料移液槍頭，剪取下端1～1.5cm，使用尖頭鑷子將移液口進(jìn)行擴(kuò)口處理。另取若干實(shí)驗(yàn)室常用的1.5mlep管，每管中放入一小段剪取的移液槍頭下段，組裝成如圖1所示裝置后，進(jìn)行高壓滅菌處理，備用。

無菌條件下分離出新生大鼠的脛骨和股骨，初步分離周圍軟組織，并放入無血清α-mem中備用；將大鼠脛骨、股骨從中間剪斷，斷面朝下，置于如圖1所示的分離裝置的移液槍頭中；將ep管6000r/min×30s離心1次。

移除ep管中的槍頭，每管用含1％青鏈雙抗(ps)、5％fbs的α-mem培養(yǎng)基200μl吹打重懸，收集在一起后將細(xì)胞懸液從200目篩網(wǎng)中濾過后，1500r/min離心5min，棄上清；加入10倍于細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，冰上裂解8min，1500r/min離心5min，棄紅色上清后，再用pbs溶液洗滌細(xì)胞兩遍；然后用含25ng/ml的m-csf、1％ps、5％fbs的α-mem培養(yǎng)基重懸，并按照4×10⁵/cm²的密度接種，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％co2培育箱靜置培養(yǎng)過夜(12～18h)；收集上清1200r/min離心5min，用含25ng/ml的m-csf、1％ps、5％fbs的α-mem重懸，直至細(xì)胞增殖到合適密度。

實(shí)施例2骨髓單核細(xì)胞鑒定

將實(shí)施例1分離的骨髓單核細(xì)胞接種至含25～100ng/mlm-csf的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天半量換液，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。分別取細(xì)胞增殖培養(yǎng)過程中第1、3、5天的細(xì)胞，采用日本olympus倒置顯微鏡記錄單核細(xì)胞的形態(tài)特征及形態(tài)變化。

如圖2所示，培養(yǎng)1天，細(xì)胞基本呈小圓形，雜細(xì)胞較少；培養(yǎng)3天，細(xì)胞數(shù)目增多，體積稍大，大多呈橢圓形，部分細(xì)胞兩端長(zhǎng)出觸角；培養(yǎng)5天，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞觸角更加明顯，形態(tài)均一，大小一致，細(xì)胞密度可達(dá)90％以上。

取上述培養(yǎng)3～5天的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面抗原cd11b的陽性表達(dá)率。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代大鼠單核細(xì)胞輕輕吹下，調(diào)整密度至10⁶個(gè)/ml，收集于2個(gè)ep管中各400μl，各加入含1％fbs(用1％nan3溶解)200μl冰上封閉30min，并標(biāo)記a、b。a管為同型對(duì)照，b管加入0.5μlcd11b熒光抗體，冰上靜置30min。離心后用pbs清洗兩次，轉(zhuǎn)移到流式管中上機(jī)檢測(cè)。

如圖3所示，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果表明通過實(shí)施例1所述方法分離培養(yǎng)的原代單核細(xì)胞的cd11b表達(dá)率可達(dá)98.6％，符合骨髓單核細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)。

取上述培養(yǎng)了1～9天的細(xì)胞，采用cck-8法繪制生長(zhǎng)曲線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代大鼠單核細(xì)胞按照10⁴個(gè)/孔，分為兩組，每組8孔，一組加入含100ng/ml的m-csf的含血清培養(yǎng)基，另外一組只加含血清培養(yǎng)基，各100μl。分別在接種后的第1、3、5、7、9天，以cck-8法檢測(cè)其細(xì)胞活力。每次檢測(cè)時(shí)均加入10μl的cck-8檢測(cè)液，放入培養(yǎng)箱中孵育4h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在450nm處的吸光度，每組取8孔測(cè)定值的平均值。以天數(shù)為橫軸，od值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。

結(jié)果如圖4所示，m-csf可明顯促進(jìn)大鼠骨髓單核細(xì)胞的增殖。在接種3天前細(xì)胞的生長(zhǎng)相對(duì)較緩，應(yīng)屬于平臺(tái)期。3天后細(xì)胞快速生長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。5天后細(xì)胞增速逐漸放緩，進(jìn)入平臺(tái)期。而沒有加入m-csf的對(duì)照組生長(zhǎng)基本停滯，提示m-csf是大鼠骨髓單核細(xì)胞增殖過程中的必要生長(zhǎng)因子。

綜上所述，通過實(shí)施例1所述方法分離獲得的骨髓單核細(xì)胞，能夠在m-csf的刺激下大量增殖，獲得的細(xì)胞符合單核細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)。說明通過該方法能夠在短時(shí)間、低成本的條件下獲取一批數(shù)量可觀、性狀穩(wěn)定、純度較高的骨髓單核細(xì)胞。

實(shí)施例3骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化

取實(shí)施例1培養(yǎng)的細(xì)胞，采用m-csf和rankl誘導(dǎo)其分化，并通過trap染色、ctr熒光染色鑒定為成熟破骨細(xì)胞。具體操作如下：

將骨髓單核細(xì)胞輕輕吹下，離心重懸后按照1.5×10⁵個(gè)/cm²的密度接種，并在培養(yǎng)基中加入25ng/ml的m-csf、100ng/ml的rankl，隔天半量換液。

誘導(dǎo)培養(yǎng)4～6天后可在鏡下發(fā)現(xiàn)大量融合的多核細(xì)胞，采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tarp)染色，細(xì)胞用4％的多聚甲醛固定10min，再置于以蔡酚as-bi磷酸鹽作為底物的孵育液中37℃孵育40min，去離子水清洗3次，再以蘇木精染液孵育10min，去離子水清洗3次，染色后盡快在倒置顯微鏡下觀察拍照。

結(jié)果如圖5所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)4～6天后的骨髓單核細(xì)胞中出現(xiàn)大量體積較大、粒徑為30-150μm的細(xì)胞，細(xì)胞多呈橢圓形或不規(guī)則性；trap染色后可見胞漿中有紫紅色顆粒，分布均勻，偽足和褶皺清晰可見，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，每個(gè)細(xì)胞中可見大量細(xì)胞核，大部分細(xì)胞呈明顯的trap陽性。而未誘導(dǎo)的骨髓單核細(xì)胞trap染色呈陰性，仍為單核細(xì)胞。

誘導(dǎo)培養(yǎng)4～6天后，同樣將增殖后骨髓單核細(xì)胞按照1.5×10⁵個(gè)/cm²的密度接種，培養(yǎng)6天后將細(xì)胞用預(yù)冷的4％多聚甲醛固定10min，加入含0.3％triton-x100的pbs冰上放置30min，再加入含5％fbs的pbs冰上封閉30min，加入兔抗大鼠ctr抗體(1:100稀釋)后4℃過夜。次日pbs洗3次后，加入alexa-488標(biāo)記的驢抗兔二抗37℃孵育1h后，pbs洗三次。再用hochest33342染液復(fù)染細(xì)胞核10min，pbs洗三次后。熒光顯微鏡下觀察熒光分布范圍及強(qiáng)度。

結(jié)果如圖6所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)后的骨髓單核細(xì)胞免疫熒光染色后細(xì)胞膜和核周細(xì)胞質(zhì)中均呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，hochest33342染色可見誘導(dǎo)后的細(xì)胞的核中呈藍(lán)色熒光，每個(gè)細(xì)胞中基本含有3個(gè)以上的細(xì)胞核。而未誘導(dǎo)的大鼠骨髓單核細(xì)胞中則不存在ctr的表達(dá)。

綜上所述，通過實(shí)施例1所述方法分離獲取的骨髓單核細(xì)胞具有活性高、數(shù)量多、形狀穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)鑒定可被成功誘導(dǎo)為破骨細(xì)胞，能夠?yàn)楣谴x疾病的基礎(chǔ)研究提供可靠的細(xì)胞來源。