一種降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽胞桿菌da9及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一株具有降煙草特有亞硝胺的解淀粉芽孢桿菌。本發(fā)明采用的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)DA9已于2014年6月12日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2014252。本發(fā)明從白肋煙煙葉表面細(xì)菌中篩選到一株能顯著降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽孢桿菌DA9，該菌株的特點(diǎn)為降亞硝酸鹽能力強(qiáng)而降硝酸鹽能力弱，通過(guò)液體發(fā)酵制備菌液，將菌液運(yùn)用于白肋煙晾曬和陳化過(guò)程中，分別比對(duì)照低47.08％和47.57％，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。CCTCC NO: M201425220140612
【專利說(shuō)明】
一種降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽胞桿菌DA9及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體是開發(fā)一種能高效降解亞硝酸鹽而降解硝酸鹽能力 弱的解淀粉芽胞桿菌，通過(guò)液體發(fā)酵制備菌液，將菌液應(yīng)用在煙草晾曬和陳化過(guò)程中，降低 煙草特有亞硝胺含量。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草特有亞硝胺（以下簡(jiǎn)稱TSNA)是一種存在于煙草中的有害物質(zhì)，主要包括四 種N-亞硝基去甲基煙堿（NNN)、4- (N-甲基-亞硝氨）-1- (3-吡啶基）-1- 丁酮（NNK)、N-亞 硝基新煙草堿（NAT)和N-亞硝基假木賊堿（NAB)。早在1962年，國(guó)際上就首次報(bào)道了關(guān)于 煙草特有亞硝胺（TSNA)的潛在致癌作用，導(dǎo)致人類肺部、口腔、食道、胃、胰臟、肝臟等部位 形成腫瘤。因此，降低煙草TSNA對(duì)提高煙草的品質(zhì)和安全性至關(guān)重要，成為近年的研究熱 點(diǎn)。
[0003] 煙草生物堿和亞硝酸鹽是TSNA的前體物質(zhì)，而煙草生物堿的含量是煙草亞硝酸 鹽的成百上千倍，煙草亞硝酸鹽是TSNA形成的限制性因素。TSNA主要在煙草晾曬，儲(chǔ)存和 發(fā)酵過(guò)程中形成，微生物的硝酸鹽還原作用對(duì)其有重要影響。為了降低TSNA的含量，就要 減少煙草亞硝酸鹽的形成，即阻斷亞硝酸鹽的形成途徑，抑制煙葉上有害微生物的硝酸鹽 還原作用。
[0004] 隨著人們對(duì)無(wú)公害化生產(chǎn)和消費(fèi)認(rèn)識(shí)程度的提高，微生物制劑在發(fā)展優(yōu)質(zhì)、無(wú)公 害的煙草產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮了重要作用。目前研究者將能降解硝酸鹽和亞硝酸鹽內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于 煙草種植和調(diào)制期間，但硝酸鹽的降解會(huì)導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程， 不能達(dá)到專一性降解亞硝酸鹽的目的，導(dǎo)致該過(guò)程穩(wěn)定性不足（參見：汪安云.中國(guó)煙草學(xué) 報(bào)，2007,13 (4) :45-49)。本發(fā)明為了在煙草調(diào)制和陳化期間降低亞硝酸鹽和煙草特有亞硝 胺含量，篩選了一株降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)而降解硝酸鹽能力弱的解淀粉芽胞桿菌DA9,專一 性的降解亞硝酸鹽，將其應(yīng)用于低害卷煙制品的生產(chǎn)實(shí)踐中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)而降解硝酸鹽能力弱的解淀粉芽胞 桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9來(lái)降低煙草特有亞硝胺含量，同時(shí)提供一種解淀 粉芽胞桿菌菌液的制備方法，并提供用該菌液在煙葉晾曬和陳化過(guò)程中降低煙草特有亞硝 胺的應(yīng)用方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 發(fā)明人提供了一株解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9,此菌株 能高效降解亞硝酸鹽而降解硝酸鹽能力弱，在煙草環(huán)境中有很好的適應(yīng)生存能力。經(jīng)過(guò)生 理生化鑒定和16S rDNA鑒定，該菌株被鑒定為解淀粉芽胞桿菌，于2014年6月12日保存 于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC N0 : M2014252。
[0008] 本發(fā)明所提供的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9分離方 法如下：取新鮮煙葉，煙草根際土壤及陳化煙葉l〇〇g，加入100mL亞硝酸鹽分離培養(yǎng)基 (NaN0 20. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040 · 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20.0 g/L，瓊脂 15 ~20g/ L，pH7. 2)中，37°C，180r/min，培養(yǎng)2d。倍比稀釋至10 4, 10 5, 10 6涂于固體亞硝酸鹽分離培 養(yǎng)基（NaN020. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ04(λ 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~ 20g/L，pH7. 2)平板上，挑選單菌落劃線接種于LB(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/ L，瓊脂20g/L，pH7. 2~7. 4)斜面上，37°C培養(yǎng)24h，放冰箱保存。通過(guò)菌種活化，將菌種接 種于硝酸鹽培養(yǎng)基（ΚΝ030· 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040· 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/ L，固體培養(yǎng)基瓊脂15~20g/L，pH7. 2)和亞硝酸鹽分離培養(yǎng)基（NaN020. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040 · 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~20g/L，ρΗ7· 2)中，37°C，180r/ min,培養(yǎng)12h，不接種菌株的為對(duì)照。菌液8000r/min離心10min，收集上清液，檢測(cè)上清 液中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，選取能夠高效降解亞硝酸鹽而硝酸鹽降解能力弱的菌株。本 發(fā)明所提供的菌株，有芽胞形成，革蘭氏染色為陽(yáng)性。在LB平板上生長(zhǎng)24h后，觀察菌落形 態(tài)，菌落白色，表面粗糙，呈火山口狀，邊緣形狀不規(guī)則。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株能 利用多種碳源，不能還原硝酸鹽，能液化明膠，淀粉水解呈陽(yáng)性，檸檬酸為陽(yáng)性。將篩選得 到的菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增、純化、測(cè)序后，將16S rDNA序列通過(guò)Blast序列分析，通 過(guò)MEGA4. 0軟件構(gòu)建降煙草亞硝酸鹽菌株和參考菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)形態(tài)特征、 生理生化特性和16S rDNA序列分析方法，將DA9菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)〇
[0009] 本發(fā)明提供的解淀粉芽胞桿菌菌液制備方法包括以下步驟：
[0010] 1、菌種活化：
[0011] 將保藏的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9劃線接種到LB (蛋 白胨 l〇g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，pH7. 2 ~7. 4)固體斜面，37°C培養(yǎng) 24h， 得到活化菌種。
[0012] 2、種子液培養(yǎng)：
[0013] 將活化菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊 脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~L 4)，于 37°C，180r/min 下培養(yǎng) 12h 得種子液。
[0014] 3、發(fā)酵培養(yǎng)：
[0015] 將種子液以2% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖40g/L，玉米漿8g/L， 氯化銨4g/L，硫酸錳0· 01g/L，磷酸二氫鉀1. 0g/L，硫酸鎂0· 3g/L)，37°C，180r/min，培養(yǎng) 24h，8000r/min 離心 10min，收集菌體。
[0016] 將本發(fā)明所提供的解淀粉芽胞桿菌制備濃度為10sCFU/mL的菌液，在20%、30%、 40 %、60 %含水量條件下，將菌液均勻噴灑于煙葉上進(jìn)行發(fā)酵，5d后檢測(cè)亞硝酸鹽和TSNA 含量，以確定該菌株在煙葉上降解煙草亞硝酸鹽和TSNA的效果。
[0017] 將本發(fā)明所提供的解淀粉芽胞桿菌制成的10sCFU/mL菌液，運(yùn)用于白肋煙晾曬和 陳化期間。在煙葉晾曬期間，將菌液均勻噴灑到剛采收的新鮮白肋煙煙葉上，30mL/株，按行 業(yè)標(biāo)準(zhǔn)晾曬45d ;在煙葉陳化期間，以菌液體積（mL):煙葉質(zhì)量（g)為10%的比例均勻噴灑 陳化煙葉，放入自封袋中，于37°C、相對(duì)濕度為80%條件下陳化2d。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1)解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)而 降解硝酸鹽能力弱，從而達(dá)到減少煙草特有亞硝胺形成的目的。
[0020] (2)解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在煙葉表面有很強(qiáng)的生 存能力，能夠在煙草表面微生物群落中占主導(dǎo)地位。
[0021] (3)解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9運(yùn)用于白肋煙瞭曬和陳 化過(guò)程中，能明顯降低亞硝酸鹽和煙草特有亞硝胺各個(gè)組分的含量。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1解淀粉芽胞桿菌DA9的亞硝酸鹽降解能力
[0023] 圖2解淀粉芽胞桿菌DA9的硝酸鹽降解能力
[0024] 圖3解淀粉芽胞桿菌DA9的系統(tǒng)發(fā)育樹
[0025] 圖4不同含水量發(fā)酵煙葉表面菌數(shù)
[0026] 圖5不同晾曬時(shí)期煙葉亞硝酸鹽含量檢測(cè)結(jié)果
[0027] 圖6不同晾曬時(shí)期煙葉TSNA含量檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0029] 實(shí)施例1高效降解亞硝酸鹽而不能降解硝酸鹽的菌株的篩選
[0030] 1、降煙草亞硝酸鹽菌株的分離純化
[0031] 取新鮮煙葉，煙草根際土壤及陳化煙葉100g，加入100mL亞硝酸鹽分離培養(yǎng)基 (NaN0 20. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040 · 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20.0 g/L，瓊脂 15 ~20g/ L，pH7. 2)中，37°C，180r/min，培養(yǎng)2d。倍比稀釋至104，105，106涂于固體亞硝酸鹽分離 培養(yǎng)基（NaN0 20 . 5g/L、MgS04 ·7Η20 0· 2g/L、K2HP040 . 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~ 20g/L，pH7. 2)平板上，37°C培養(yǎng)24h，挑選單菌落劃線接種于LB (蛋白胨10g/L，酵母粉5g/ L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~7. 4)斜面上，37°C培養(yǎng) 24h，放 4°C冰箱保存。
[0032] 2、降煙草亞硝酸鹽菌株的篩選
[0033] 挑取分離保存的菌株接種于液體LB (蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊 脂20g/L，pH7.2~7.4)中，37°C，180r/min，培養(yǎng)12h做種子液。將種子液以2% (V/V)的 接種量接種于硝酸鹽培養(yǎng)基（KN030 . 5g/L、MgS04 · 7H20 0. 2g/L、K2HP040 . 5g/L和酒石酸鉀 鈉20. 0g/L，固體培養(yǎng)基瓊脂15~20g/L，pH7. 2)，和亞硝酸鹽分離培養(yǎng)基（NaN020. 5g/L、 MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040· 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~20g/L，ρΗ7· 2)中， 37°C，180r/min，培養(yǎng)12,不接種菌株的為對(duì)照。菌液8000r/min離心10min，收集上清液， 檢測(cè)上清液中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，選取能夠高效降解亞硝酸鹽而硝酸鹽降解能力弱的 菌株，結(jié)果如圖1、圖2所示，得到效果最佳的菌株為DA9,亞硝酸鹽降解率為30. 36%。DA9 的硝酸鹽降解率最低，為10. 78%，是最符合篩選要求的菌株。
[0034] 3、硝酸鹽檢測(cè)（Cataldo et al 1975)
[0035] 預(yù)處理：稱取煙樣2. 00g，加 40mL 1 %的醋酸，震蕩60min，過(guò)濾，加入5g活性炭， 震蕩30min，過(guò)濾，得到無(wú)色透明的溶液。
[0036] 硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取適量硝酸鈉于烘箱中80°C烘至恒重后，稱取100mg溶 于lOOmL蒸餾水，分別取OmL、l. 00mL、2. 00mL、3. 00mL、4. 00mL、5. OOmL硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn) 移到10mL容量瓶中，用蒸餾水定容。分別取0. 10mL上述硝酸鈉溶液于10mL容量瓶中，加 入0. 40mL5 %水楊酸，室溫下，靜置20min，用8 % NaOH定容，靜置至室溫，在紫外可見分光 光度計(jì)上于420nm波長(zhǎng)下，以空白（即量取標(biāo)準(zhǔn)溶液OmL)為參比液，測(cè)其吸光度（Cataldo et al 1975)〇
[0037] 取0.1〇1^煙液于1〇1^容量瓶，加入0.4〇1^5%水楊酸，室溫下，靜置2〇11^11，用 8 % NaOH定容，靜置至室溫，在紫外可見分光光度計(jì)上于420nm波長(zhǎng)下，測(cè)其吸光度。
[0038] 4、亞硝酸鹽的測(cè)定（Donald Nicholas and Nason 1957)。
[0039] 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取適量NaN02于烘箱中80°C烘至恒重后，稱取lOOmg 溶于100mL蒸餾水，稀釋100倍，NaN02濃度為10 μ g/mL，再分別取0mL、0. 20mL、0. 40mL、 0. 60mL、0. 80mL、1. 00mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，用蒸餾水定容，再分別 取2. 00mL亞硝酸鹽溶液加入4. 00mL 1 %磺胺，再加入4. 00mL 0. 02% α -萘胺，25°C反應(yīng) 30min，在紫外可見分光光度計(jì)上于540nm波長(zhǎng)下，以空白（即量取標(biāo)準(zhǔn)溶液OmL)為參比 液，測(cè)其吸光度。
[0040] 取2. 00mL煙液，加入4. 00mL 1 %磺胺，再加入4. 00mL 0.02% α-萘胺，25°C反應(yīng) 30min，在紫外可見分光光度計(jì)上于540nm波長(zhǎng)下，測(cè)其吸光度。
[0041] 5、TSNA的檢測(cè)方法
[0042] (1)樣品前處理
[0043] 萬(wàn)分一只天平準(zhǔn)確稱取0. 2500g煙末于100mL錐形瓶中，加入0. 2mL濃度為 5000ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液及19. 8mL醋酸銨溶液（0. lmol/L)，回旋振蕩器上150r/min震蕩lh后， 取萃取液過(guò)0. 22 μ m濾膜后收集至色譜瓶中，利用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析（煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)）。
[0044] (2)LC_MS 測(cè)試條件
[0045] 質(zhì)譜條件：ESI離子源，氣體溫度：350°C，流量10L/min霧化氣壓力35psi，電噴霧 電壓：4000V，正離子模式。各種化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。
[0046] 表1 TSNAs及其內(nèi)標(biāo)采集參數(shù)
[0047] Table 1 TSNAs and internal standard acquisition parameters
[0048]
[0049] 液相條件：流動(dòng)相A :0. 1 %醋酸水溶液，流動(dòng)相B :0. 1 %醋酸甲醇溶液，流速： 0. 2mL/min，柱溫箱65°C，進(jìn)樣量：5 μ L。表2為梯度洗脫的條件。
[0050] 表2 UHPLC梯度洗脫條件
[0051] Table 2 UHPLC Gradient elution conditions
[0052]
[0053] 實(shí)施例2降煙草亞硝酸鹽菌株DA9的鑒定
[0054] 1、降煙草亞硝酸鹽菌株DA9形態(tài)特點(diǎn)
[0055] 菌體形狀為桿狀，生長(zhǎng)在LB (蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/ L，pH7. 2~7. 4)固體培養(yǎng)基，菌落白色，表面粗糙，呈火山口狀，邊緣形狀不規(guī)則。
[0056] 2、菌株DA9生理生化特點(diǎn)
[0057] 菌株DA9的生理生化特點(diǎn)如表3所示。
[0058] 表3菌株DA9的生理生化特點(diǎn)
[0059]
[0060] 3、菌株DA9的16S rDNA序列鑒定
[0061] 將篩選得到的菌株DA9的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增、純化、測(cè)序后，將16S rDNA序列通 過(guò)Blast序列分析，結(jié)果顯示與Bacillus amyloliquefaciens(LFB112)同源性達(dá)到99%, 通過(guò)MEGA4. 0軟件構(gòu)建菌株DA9和參考菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。根據(jù)形態(tài)特 征、生理生化特性和16S rDNA序列分析方法，將DA9菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)〇
[0062] 實(shí)施例3解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9菌液制備
[0063] 1、菌種活化：
[0064] 將保藏的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9劃線接種到LB (蛋 白胨 l〇g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，pH7. 2 ~7. 4)固體斜面，37°C培養(yǎng) 24h， 得到活化菌種。
[0065] 2、種子液培養(yǎng)：
[0066] 將活化菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊 月旨20g/L，ρΗ7· 2~7· 4)，于37°C，180r/min下培養(yǎng)12h得種子液。
[0067] 3、發(fā)酵培養(yǎng)：
[0068] 將種子液以2% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖40g/L，玉米漿8g/L， 氯化銨4g/L，硫酸錳0· 01g/L，磷酸二氫鉀1. 0g/L，硫酸鎂0· 3g/L)中，37°C，180r/min，培養(yǎng) 24h，菌液濃度達(dá)到109CFU/mL，8000r/min離心，收集菌體，用無(wú)菌水配制成10sCFU/mL的菌 液。
[0069] 實(shí)施例4解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在白肋煙上降亞硝 酸鹽和TSNA的應(yīng)用
[0070] 1、菌液施用方法
[0071] 將無(wú)菌水配制成10sCFU/mL菌液，均勻噴灑到陳化的白肋煙上，使煙葉濕度達(dá)到 20%、30%、40%和60%，放入自封袋中，于30°C，相對(duì)濕度為80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵5d， 對(duì)照為噴灑與DA9菌液同體積的無(wú)菌水。
[0072] 2、取樣方法
[0073] 在發(fā)酵5d結(jié)束時(shí)取樣立即檢測(cè)生物量。將煙葉45°C烘干至恒重，檢測(cè)亞硝酸鹽和 TSNA四種成分的含量。
[0074] 3、菌數(shù)檢測(cè)
[0075] 發(fā)酵結(jié)束后立即取樣，用稀釋涂布法檢測(cè)煙葉中總菌數(shù)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證解淀粉 芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9(以下簡(jiǎn)稱DA9)在煙葉上的降低亞硝酸鹽和 TSNA的作用效果，在煙葉上噴施DA9后發(fā)酵5d。在20%、30%、40%、60%含水量條件下， DA9菌數(shù)為7. 84、7. 89、8. 00、8. 06(單位：log CFU/g)，說(shuō)明在煙葉環(huán)境中DA9的生長(zhǎng)狀態(tài) 良好，能適應(yīng)煙葉環(huán)境。煙葉經(jīng)過(guò)發(fā)酵后檢測(cè)煙葉上的雜菌數(shù)，結(jié)果如圖4所示，隨著含水 量的增加，菌數(shù)明顯上升，且DA9處理的煙葉雜菌數(shù)低于對(duì)照，說(shuō)明DA9具有一定的抑菌作 用。
[0076] 4、亞硝酸鹽檢測(cè)
[0077] 亞硝酸鹽檢測(cè)結(jié)果如表4所示，將數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS分析得，在20 %、30 %、40 %、60 % 含水量條件下，DA9處理的煙葉的亞硝酸鹽含量分別低于對(duì)照15. 67%、38. 86%、78. 75%、 61. 19%，除了 20%含水量處理組外，其他處理組效果均顯著。
[0078] 表4不同含水量發(fā)酵的煙葉亞硝酸鹽含量
[0079]
[0080] 注：結(jié)果為各處理的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差；表中不同字母代表顯著性水平（P < 0· 05) 〇
[0081] 5、TSNA 檢測(cè)
[0082] 不同含水量發(fā)酵煙葉的TSNA檢測(cè)結(jié)果如表5所示，在20 %、30 %、40 %、60 %含水 量條件下，DA9處理的煙葉的TSNA含量分別低于對(duì)照25. 71 %、55. 70%、18. 26%、66. 49%， 效果顯著。結(jié)果說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中，DA9在煙葉環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，抑制其他有害菌的 生長(zhǎng)和硝酸鹽還原作用，而DA9缺乏降解硝酸鹽的能力，能有效降解亞硝酸鹽，因此能減少 TSNA前體物質(zhì)亞硝酸鹽的形成，進(jìn)而減少TSNA的形成，效果明顯，有很好的應(yīng)用價(jià)值。
[0083] 表5不同含水量發(fā)酵的白肋煙TSNA含量
[0084]
[0085] 注：結(jié)果為各處理的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差；表中不同字母代表顯著性水平（p < 0. 05)
[0086] 實(shí)施例5解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在白肋煙瞭曬的應(yīng) 用
[0087] 1、菌液施用方法
[0088] 將菌液以30mL/株的量均勻噴灑于新鮮采收的白肋煙上，菌液濃度為10sCFU/mL， 按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)晾曬45d，對(duì)照為噴灑與DA9菌液同體積的無(wú)菌水。
[0089] 2、取樣方法
[0090] 分別于變黃期，變褐期，干筋期結(jié)束時(shí)取樣立即檢測(cè)生物量。將煙葉45°C烘干至恒 重，檢測(cè)亞硝酸鹽和TSNA四種成分的含量。
[0091] 3、生物量檢測(cè)同實(shí)施例2(6)
[0092] 晾曬過(guò)程中，DA9的菌數(shù)為8. 18~8.48(單位：log CFU/g)，其他雜菌數(shù)為5. 05~ 5. 97(單位：log CFU/g)，說(shuō)明DA9在煙葉上的適應(yīng)能力良好，在煙葉表面微生物群落中占 絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。
[0093] 4、亞硝酸鹽檢測(cè)
[0094] 煙葉亞硝酸鹽含量檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，晾曬過(guò)程中亞硝酸鹽含量持續(xù)上升，各 個(gè)時(shí)期DA9處理的煙葉亞硝酸鹽含量均低于對(duì)照，晾曬結(jié)束時(shí)，DA9處理煙葉的亞硝酸鹽含 量與對(duì)照相比降低了 32. 13%，差異顯著。
[0095] 5、TSNA 檢測(cè)
[0096] 晾曬過(guò)程中煙葉TSNA含量檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，TSNA含量呈現(xiàn)先上升后下降的 趨勢(shì)，在各個(gè)晾曬過(guò)程中，DA9處理煙葉的TSNA含量均低于對(duì)照，晾曬結(jié)束時(shí)，DA9處理的煙 葉的TSNA比對(duì)照減少了 47. 08%，差異顯著，說(shuō)明在白肋煙晾曬過(guò)程中，DA9是一種很好的 降低TSNA的微生物，具有很好的應(yīng)用前景。
[0097] 實(shí)施例6解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在白肋煙陳化中的 應(yīng)用
[0098] 1、菌液施用方法
[0099] 將煙葉用噴霧器使陳化煙葉回潮，使煙葉水分達(dá)到16~18%，再以菌液體積 (mL):煙葉質(zhì)量（g)為10%的比例均勻噴灑煙葉，對(duì)照為噴灑與DA9菌液同體積的無(wú)菌水， 37°C、相對(duì)濕度為80 %的條件下進(jìn)行陳化。
[0100] 2、取樣方法
[0101] 陳化2d后，立即檢測(cè)生物量，將煙葉45°C烘干至恒重，檢測(cè)亞硝酸鹽和TSNA四種 成分的含量。
[0102] 3、生物量檢測(cè)
[0103] 陳化后煙葉表面DA9的菌數(shù)為7. 33 (單位：log CFU/g)，其他雜菌數(shù)目為4. 48 (單 位：log CFU/g)，表明DA9在煙葉上數(shù)目占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。
[0104] 4、亞硝酸鹽檢測(cè)
[0105] 檢測(cè)煙葉各個(gè)成分的結(jié)果如表6所示，DA9處理的煙葉亞硝酸鹽含量比對(duì)照處理 低10. 46%，效果不顯著。
[0106] 5、TSNA 檢測(cè)
[0107] 如表6所示，DA9處理的煙葉TSNA的四個(gè)成分NNN、NNK、NAT、NAB和總的TSNA分 別比對(duì)照低47.16%、68.47%、45.59%、47.65%和 47.57%，效果顯著（？<0.05)。特別 是對(duì)于具有強(qiáng)致癌性的NNK的降解率達(dá)到68. 47%，在煙葉陳化過(guò)程中，運(yùn)用DA9降低TSNA 有很明顯的效果，具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0108] 表6不同陳化處理的煙葉相關(guān)成分含量
[0109]
[0110] 注：結(jié)果為各處理的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差；表中不同字母代表顯著性水平（P < 0· 05) 〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株能降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) DA9,于2014年6月12日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M2014252。2. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌DA9,其特征在于能高效降解亞硝酸鹽而降解硝 酸鹽能力弱，從而降低煙草特有亞硝胺。3. -種解淀粉芽孢桿菌DA9液體培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 菌種活化： 將保藏的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9劃線接種到LB固體斜 面（蛋白胨 l〇g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~L 4)，37°C培養(yǎng) 24h，得 到活化菌種。 (2) 種子培養(yǎng)： 將活化菌株接種于LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl l〇g/L，瓊脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~L 4)，于 37°C，180r/min 下培養(yǎng) 12h 得種子液。 (3) 發(fā)酵培養(yǎng)： 將種子液以2% (V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，180r/min，培養(yǎng)24h，菌液濃 度達(dá)到I. 2 X 109CFU/mL，8000r/min離心收集菌體。發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖30~40g/L，玉 米漿8~10g/L，氯化銨4~8g/L，硫酸錳0. 01~0. 015g/L，磷酸二氫鉀0. 5~1.0g/L，硫 酸鎂 0· 15 ~0· 3g/L，pH 為 7. 0 ~7. 5,115°C滅菌 30min。4. 權(quán)利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌DA9菌液，其特征在于可用于白肋煙晾曬過(guò)程中 降低煙草特有亞硝胺含量。施用的方法為噴灑；施用時(shí)間是采收前或采收后噴灑，噴灑一 次；施用菌液濃度為IO 8~IO9CFUAiL ;施用菌液量為30~60mL/株，晾曬處理時(shí)間為45~ 55d ;晾曬結(jié)束時(shí)，噴灑DA9菌液的煙葉TSNA比對(duì)照降低了 47. 08%。5. 權(quán)利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌DA9菌液，其特征在于可用于白肋煙陳化過(guò)程中 降低煙草特有亞硝胺含量。菌液濃度為IO8~IO 9CFlVmL ;用噴霧器使陳化煙葉回潮，使煙 葉水分達(dá)到16~18%，再以菌液體積（mL):煙葉質(zhì)量（g)為10%~20%的體積均勻噴灑 煙葉；37°C相對(duì)濕度80%陳化，處理時(shí)間為2~30d ;利用DA9菌液陳化后的煙葉的TSNA比 對(duì)照低了 47. 57%。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK105886417SQ201410548352
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年10月14日
【發(fā)明人】陳守文, 魏雪團(tuán), 陳建剛, 鄧曉霧, 冀志霞, 馬昕, 楊歡
【申請(qǐng)人】湖北大學(xué)