本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法。

背景技術(shù)：

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)由兩個或兩個以上苯環(huán)組成，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難以生物降解的性質(zhì)，是一類普遍存在于環(huán)境中的具有致癌、致畸、致突變的有機污染物，對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了巨大威脅，因此對PAHs的降解是人們關(guān)注的一項重要研究。

對于PAHs，主要是利用微生物如真菌、細(xì)菌、放線菌對其進行降解。PAHs是石油中芳香族化合物的主要成分，而石油污染常常伴隨著鹽堿化環(huán)境的存在，目前能降解PAHs的許多細(xì)菌真菌，在高鹽堿環(huán)境中代謝受到抑制，其降解PAHs的效率降低，因此，篩選出能夠在鹽堿環(huán)境中高效降解PAHs的微生物具有重要的現(xiàn)實意義。

蒽(An)、芘(Pyr)是典型的PAHs，在水中的溶解度為極小，其結(jié)構(gòu)單元在致癌性苯并[a]蒽(Ba[a]A)和苯并[a]芘(Ba[a]P)中同樣存在，經(jīng)常被用作微生物降解PAHs的模型化合物。因此，研究能夠在鹽堿環(huán)境中高效降解蒽、芘的微生物對于構(gòu)建多環(huán)芳烴類物質(zhì)生物降解模型極為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，旨在構(gòu)建多環(huán)芳烴類物質(zhì)生物降解模型，解決鹽堿環(huán)境中微生物活性受抑制，對蒽、芘的降解效率降低的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，包括如下步驟：

1)菌種采集

a.從油田含油土壤中采集土壤樣品于無菌袋中，4℃冰箱密封保存；

b.將上述土壤樣品于選擇性的含蒽、芘的無機鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中進行搖床培養(yǎng)，經(jīng)五代(蒽、芘的初始質(zhì)量濃度從5g·L^-1逐步提升至10g·L^-1)培養(yǎng)后，取適量培養(yǎng)液稀釋并涂布于選擇性固體平板；待有明顯菌落出現(xiàn)時，從中選擇形態(tài)特征相異的各種菌落作進一步的劃線純化工作，5個周期后得到純菌株；將所得各菌制備成菌懸液并重新接至選擇性的含蒽、芘無機鹽培養(yǎng)基進行復(fù)篩，選取降解率較高的菌株作為優(yōu)勢菌株，進一步接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)24h后，保存于營養(yǎng)瓊脂斜面上，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

c.將0.5mL菌懸液與0.5mL保護劑等體積加入5mL安培瓶中振蕩均勻后，置于-80℃下迅速冷凍6h后，用凍干機進行真空冷凍干燥，凍干后直接在凍干艙中壓蓋密封。

2)菌種復(fù)活

取凍干菌種，用75％的酒精棉消毒菌種接種管外壁后，用砂輪在安瓿瓶上三分之一處劃痕，用干燥的無菌紗布包裹安瓿瓶，將安瓿瓶掰開；用吸管將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基0.3mL注入被開啟的菌種安瓿瓶中并振蕩，使安瓿瓶中的凍干菌種溶解成菌懸液。

將安瓿瓶中菌懸液吸出，接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，接種3管斜面，將接種后的營養(yǎng)瓊脂斜面置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察菌苔生長情況，后加入甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

3)菌種擴大

稱取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，加入蒸餾水，121℃下滅菌15min，后接種2接種環(huán)，37℃培養(yǎng)24h備用。

4)蒽、芘降解試驗

a.分別稱取0.5g蒽、芘于兩個反應(yīng)瓶中，然后加入活性炭，加入10.0mL環(huán)己烷溶液溶解振蕩，并常溫?fù)]發(fā)，待環(huán)己烷溶液揮發(fā)完后，加入菌種擴大懸液，塞上瓶塞，分多組試驗在一定溫度下恒溫震蕩培養(yǎng)，之后測定其脫氫酶活性。

b.分別稱取0.5g蒽、芘于兩個反應(yīng)瓶中，然后加入活性炭，分多組試驗加入一定體積的2mol/L的NaCl溶液，并加入10.0mL環(huán)己烷溶液溶解振蕩，常溫?fù)]發(fā)，待環(huán)己烷溶液揮發(fā)完后，加入菌種擴大懸液，塞上瓶塞，35℃溫度恒溫震蕩培養(yǎng)7天，之后測定其脫氫酶活性。

c.分多組稱取一定質(zhì)量的蒽、芘，然后加入活性炭，并加入10.0mL環(huán)己烷溶解振蕩，并常溫?fù)]發(fā)，待環(huán)己烷溶液揮發(fā)完后，加入菌種擴大懸液，塞上瓶塞，35℃溫度恒溫震蕩培養(yǎng)7天，之后測定其脫氫酶活性。

進一步地，所述步驟1)a中采集土壤樣品為距離地面深10cm，選取五個點均勻采樣，每個點的樣品采集范圍為1m²，每個點采集土壤為100g，采集后將五個采集點的土壤混勻，按照四分法將混合土壤逐漸的減少，留取250g的混合土壤樣品于無菌袋中。

進一步地，所述步驟1)b中所述無機鹽培養(yǎng)基：NH₄NO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g/L，CuSO₄ 0.1g/L，無水CaC1₂ 0.01g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.01g/L；無機鹽固體培養(yǎng)基中加入2％瓊脂；

所述含蒽、芘無機鹽培養(yǎng)基：分別用正己烷配制5g/L的蒽、芘溶液，濾膜過濾除菌，取一定量該溶液置于滅菌的錐形瓶中，待正己烷溶液揮發(fā)完畢后加入滅菌的無機鹽培養(yǎng)基；

所述富集培養(yǎng)：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，pH：7.3±0.1；

所述保藏培養(yǎng)：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，瓊脂12.0，pH：7.3±0.1。

進一步地，所述步驟1)c中所述菌懸液是將嗜堿性假單胞桿菌接入富集培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)1天后的培養(yǎng)液，所述保護劑為無菌1.5％NaCl溶液、115℃滅菌30min后的明膠和糖溶液、煮沸滅菌的脫脂乳、經(jīng)0.22μm濾膜過濾后的維生素C溶液。

進一步地，所述步驟1)c中所述冷凍干燥過程分為兩步，第一步冷凍干燥程序真空度為0.100mbar，凍干18h；第二步冷凍干燥程序真空度為0.034mbar，凍干2h。

進一步地，所述步驟2)中接種后的營養(yǎng)瓊脂斜面于培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為72小時。

進一步地，所述步驟4)a、b、c中加入活性炭的質(zhì)量均為5.0g，加入菌種擴大懸液的體積均為5.0mL。

進一步地，所述步驟4)a中多組試驗恒溫震蕩的溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃，培養(yǎng)時間為7天。

進一步地，所述步驟4)b中多組試驗加入NaCl溶液的體積分別為200μL、250μL、300μL、350μL、400μL。

進一步地，所述步驟4)c中稱取蒽、芘的質(zhì)量分別為0.3g、0.5g、0.7g、1.0g。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，從油田含油土樣中分離出的嗜堿性假單胞桿菌能夠在鹽度為0.65％-0.75％的環(huán)境中有效降解蒽、芘。降解蒽模型中優(yōu)化試驗檢測表明，降解溫度為35.7℃，PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)為3.89％，培養(yǎng)5天測定得到脫氫酶量值達140.353±6.43μg；降解芘模型中優(yōu)化試驗檢測表明，降解溫度為34.8℃，PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)為6.39％，培養(yǎng)5天測定得到脫氫酶量值達84.032±0.063μg；本發(fā)明在鹽堿環(huán)境中降解蒽、芘效率高，方法簡單。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽(An)、芘(Pyr)時溫度對降解產(chǎn)生的脫氫酶量的影響。

圖2是本發(fā)明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽(An)、芘(Pyr)時鹽度對降解產(chǎn)生的脫氫酶量的影響。

圖3是本發(fā)明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽(An)、芘(Pyr)時PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)對降解產(chǎn)生的脫氫酶量的影響。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。

本發(fā)明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，包括：

1.實驗部分

1.1嗜堿性假單胞桿菌菌種的培養(yǎng)

1)菌種采集

a.以陜西濟源油田周邊被石油污染的土壤為實驗樣品。采集方法是：用小鐵鍬去掉土地層的土壤，選取五個點均勻采樣，采樣時采集距離地面深10cm處的土壤，每個點的樣品采集范圍為1m²,每個點采集土壤大約為100g，采集完成后將五個采集點的土壤混合在一起，充分混勻，按照四分法將混合土壤逐漸的減少，留取250g的混合土壤樣品裝入無菌袋中帶回實驗室，于4℃冰箱密封保存，用于后期的菌種分離。

b.向上述土壤樣品中加入適量蒸餾水，放置1天，靜止后，取10mL上清液于盛有100L選擇性的含蒽、芘的無機鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中進行搖床培養(yǎng)，經(jīng)5代(蒽、芘的初始質(zhì)量濃度從5g·L^-1逐步提升至10g·L^-1)培養(yǎng)后，取適量培養(yǎng)液稀釋并涂布于選擇性固體平板；待有明顯菌落出現(xiàn)時，從中選擇形態(tài)特征相異的各種菌落作進一步的劃線純化工作，5個周期后得到純菌株；將所得各菌制備成菌懸液并重新接至選擇性的含蒽、芘無機鹽培養(yǎng)基進行復(fù)篩，選取降解率較高的菌株作為優(yōu)勢菌株，進一步接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)24h后，保存于營養(yǎng)瓊脂斜面上，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

無機鹽培養(yǎng)基：NH₄NO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g/L，CuSO₄ 0.1g/L，無水CaC1₂ 0.01g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.01g/L；無機鹽固體培養(yǎng)基中加入2％瓊脂；

含蒽、芘無機鹽培養(yǎng)基：分別用正己烷配制5g/L的蒽、芘溶液，濾膜過濾除菌，取一定量該溶液置于滅菌的錐形瓶中，待正己烷揮發(fā)完畢后加入滅菌的無機鹽培養(yǎng)基；

富集培養(yǎng)：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，pH：7.3±0.1；

保藏培養(yǎng)：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，瓊脂12.0，pH：7.3±0.1。

c.將0.5mL菌懸液(將嗜堿性假單胞桿菌接入富集培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)1天后的吸取量)與0.5mL保護劑(溶劑為無菌1.5％NaCl溶液，115℃滅菌30min后的明膠和糖溶液，煮沸滅菌的脫脂乳，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后的維生素C溶液)等體積加入5mL安培瓶中振蕩均勻后，置于-80℃下迅速冷凍6h后，用凍干機進行真空冷凍干燥，冷凍干燥過程分為兩步，第一步冷凍干燥程序真空度為0.100mbar，凍干18h；第二步冷凍干燥程序真空度為0.034mbar，凍干2h，凍干后直接在凍干艙中壓蓋密封。

2)菌種復(fù)活

取凍干菌種，用75％的酒精棉消毒菌種接種管外壁后，用砂輪在安瓿瓶上三分之一處劃痕，用干燥的無菌紗布包裹安瓿瓶，將安瓿瓶掰開。用吸管將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基0.3mL注入被開啟的菌種安瓿瓶中并振蕩，使安瓿瓶中的凍干菌種溶解成菌懸液。

將安瓿瓶中菌懸液吸出，接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，接種3管斜面，將接種后的營養(yǎng)瓊脂斜面置于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)72小時，觀察菌苔生長情況，后加入甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

3)菌種擴大

稱取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，加入蒸餾水，121℃下滅菌15min，后接種2接種環(huán)，37℃培養(yǎng)24h備用。

1.2蒽單因子試驗

1)溫度單因子試驗

稱取0.5g蒽于反應(yīng)瓶中，加入5.0g活性炭和10.0mL環(huán)己烷溶液溶解振蕩，并常溫?fù)]發(fā)，待環(huán)己烷溶液揮發(fā)完后，加入5.0mL菌種擴大懸液，塞上瓶塞，并根據(jù)試驗設(shè)計溫度25℃、30℃、35℃、40℃恒溫震蕩培養(yǎng)7天，后測定其脫氫酶活性。

2)鹽度單因子試驗

稱取0.5g蒽于反應(yīng)瓶中，加入5.0g活性炭，按照試驗設(shè)計加入200μL、250μL、300μL、350μL、400μL濃度為2mol/L的NaCl溶液，并加入10.0mL環(huán)己烷溶解振蕩，并常溫?fù)]發(fā)，待環(huán)己烷溶液揮發(fā)完后，加入5.0mL菌種擴大懸液，塞上瓶塞。35℃溫度下恒溫震蕩培養(yǎng)7天，后測定其脫氫酶活性。

3)PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)單因子試驗

分別稱取0.3g、0.5g、0.7g、1.0g蒽于反應(yīng)瓶中，加入5.0g活性炭和10.0mL環(huán)己烷溶解振蕩，并常溫?fù)]發(fā)，待環(huán)己烷溶液揮發(fā)完后，加入5.0mL菌種擴大懸液，塞上瓶塞。35℃溫度下恒溫震蕩培養(yǎng)7天，后測定其脫氫酶活性。

4)脫氫酶活性測定

稱取1.0g上述降解后的培養(yǎng)物離心洗滌后置于反應(yīng)瓶中，加入3mL蒸餾水，2.0mL分析純HCl溶液，振蕩均勻后再加入0.5mL紅四氮唑溶液，37℃培養(yǎng)24h后立即取出，滴加2滴濃硫酸終止反應(yīng)，振蕩再加入5.0mL甲苯振蕩分層，4000rpm/min離心，以甲苯為空白對照，取有機層于紫外分光光度計λ＝486nm處測定吸光度值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比計算其脫氫酶活性。

1.3芘單因子試驗

假單胞桿菌對芘的降解單因子試驗其操作與蒽單因子試驗類似，降解條件及各試驗參數(shù)相同。

1.4蒽、芘響應(yīng)面試驗設(shè)計

以溫度、鹽度、PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)百分?jǐn)?shù)為自變量，分別以A、B、C(X1、X2、X3)表示，并以-1、0、+1分別表示自變量低、中、高水平，以脫氫酶活性為響應(yīng)值，分別以Y1、f1表示。進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗因素及因素水平見表1、表2。

表1蒽降解響應(yīng)面試驗因素及水平

表2芘降解響應(yīng)面試驗因素及水平

2.結(jié)果與討論

2.1蒽、芘單因子試驗

1)溫度單因子試驗結(jié)果

如圖1所示，蒽、芘溫度單因子試驗中，對于嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘溫度的影響具有同步性，溫度為30℃時，菌體的生長狀況最好，其次是溫度為35℃、37℃時，當(dāng)溫度為25℃和40℃時，菌體的生長狀況較差；溫度為35℃時，試驗菌降解蒽、芘的脫氫酶量最大。

2)鹽度單因子試驗結(jié)果

如圖2所示，蒽、芘鹽度單因子試驗中，對于嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘鹽度的影響具有同步性，鹽度為0.7％時，試驗菌降解蒽、芘的脫氫酶量最大。

3)PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)單因子試驗結(jié)果

如圖3所示，蒽、芘PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)單因子試驗中，對于嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘物質(zhì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的影響存在差異性，降解蒽的最適的物質(zhì)質(zhì)量百分?jǐn)?shù)因素條件是5％，降解芘的最適的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)因素條件是7％，由蒽、芘化學(xué)結(jié)構(gòu)以及溶解性比較可知，蒽為多環(huán)芳烴組成的三苯戒指表面張力(dyne/cm)為47.9、介電常數(shù)(F/m)為3.08、極化率(10-24cm³)為24.55；而芘為有并四苯結(jié)構(gòu)極化率(10-24cm³)為28.72，非極性吸附劑中蒽被吸附效果較芘好，在較低百分含量的活性炭即可達到較好的吸附效果，而芘在同等條件下被活性炭吸附的效果好。

2.2響應(yīng)面試驗

1)模型建立與分析

試驗采用三因素三水平響應(yīng)面法優(yōu)化嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的因素條件，試驗按照Design-Expert軟件中Box-Behnken Design，試驗設(shè)計與結(jié)果如表3、表4所示。

表3蒽響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果

表4芘響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果

按照Design-Expert軟件中Box-Behnken Design模型對試驗中脫氫酶量的進行回歸分析，得兩條回歸方程，其中蒽、芘物質(zhì)的降解脫氫酶量回歸方程分別為：

Y＝140.35+10.43*A-1.58*B-5.37*C-12.77*A*B+15.19*A*C+9.67*B*C-34.19*A²-25.24*B²-18.97*C²

F＝84.03+5.13X₁+5.15X₂-8.12X₃-5.43X₁X₂-0.049X₁X₃-1.15X₂X₃-25.02X₁²-4.17X₂²-11.40X₃²

式中Y表示嗜堿性假單孢桿菌降解蒽物質(zhì)過程中產(chǎn)生的脫氫酶量，F(xiàn)表示嗜堿性假單孢桿菌降解芘物質(zhì)過程中產(chǎn)生的脫氫酶量，A、B、C、X₁、X₂、X₃分別為表1、表2所示的自變量編碼值，蒽降解回歸方程的R₁²＝0.8792，芘降解回歸方程的R₂²＝0.9675，通過模型的回歸系數(shù)顯著性檢驗分析可得，嗜堿性假單孢桿菌降解蒽過程產(chǎn)生脫氫酶量模型的F值為5.66(F-valμe pro＝0.0016<0.05)，意味著該模型擬合程度是顯著的，僅有1.62％可能模型是由于噪聲，且模型失擬系數(shù)1.584是不顯著的，由模型信噪比檢驗可知道，該模型精密度為6.821(精密度大于4是可取的)，即該模型可以用來設(shè)計空間試驗。同時在三個自變量以及兩兩之間的交互作用對于蒽的物質(zhì)降解產(chǎn)生的脫氫酶量的影響效果不顯著，但在該模型中A²，B²，C²對于蒽的物質(zhì)降解產(chǎn)生的脫氫酶量的影響效果是顯著的。此外該模型的主效應(yīng)影響為：A>C>B。嗜堿性假單孢桿菌降解芘過程產(chǎn)生脫氫酶量模型的F值為23.15(F-Valμe pro＝0.0002<0.01)是極顯著的，該模型僅有0.02％的可能模型F-Valμe是由于噪聲。在該模型中X₁，X₂，X₃，X₁²，X₃²是顯著的模型參數(shù)，同時模型R-Sqμared＝0.9675，為更加準(zhǔn)確的反映降解模型，將該模型的R-Sqμared調(diào)整為0.9257。模型失擬系數(shù)<0.01，可能存在噪聲因素的可能性較大，但是在模型信噪比檢測中精密度為13.837(精密度大于4是可取的)，即該模型可以用來設(shè)計空間試驗，在該模型的主效應(yīng)影響中分別為X₃，X₂，X₁。

2)模型最優(yōu)化試驗參數(shù)

根據(jù)Design-Expert Box-Behnken模型設(shè)計，得出嗜堿性假單胞桿菌對蒽的降解溫度為35.73℃、降解鹽度為0.69％、PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)為3.89％，培養(yǎng)5天測定得到脫氫酶量值為140.353±6.43μg。嗜堿性假單胞桿菌對芘的降解溫度為34.78℃、降解鹽度為0.73％、PAHs/活性炭百分?jǐn)?shù)為6.39％，培養(yǎng)5天測定得到脫氫酶量值為84.032±0.063μg。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。