芽胞桿菌生物被膜形成能力評(píng)估方法及應(yīng)用的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及芽胞桿菌生物被膜形成能力評(píng)估領(lǐng)域，具體地說是涉及評(píng)估和研究芽胞桿菌是否具有生物被膜形成能力以及形成能力強(qiáng)弱的方法及所應(yīng)用的培養(yǎng)基，為篩選促進(jìn)生物被膜形成能力的物質(zhì)以及進(jìn)一步開發(fā)這一類型的芽胞桿菌用于生物農(nóng)藥和生物肥料提供支持。
【背景技術(shù)】
[0002]生物被膜(b1film)指細(xì)胞通過胞外基質(zhì)緊密結(jié)合在一起形成的群體。生物被膜為細(xì)菌提供保護(hù)，使細(xì)菌防御各種環(huán)境因子及其組合、形形色色的抗生素、捕食者和人類的免疫系統(tǒng)。
[0003]芽胞桿菌是一種廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可以產(chǎn)生內(nèi)生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同時(shí)還是植物體內(nèi)常見的一種內(nèi)生菌，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境。它生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，在植物的表面易于存活、定殖和與繁殖，而且生產(chǎn)芽胞桿菌制劑的工藝簡(jiǎn)單，制劑穩(wěn)定，施用方便，存儲(chǔ)期長(zhǎng)，是一種理想的生防微生物。由于自然界獲得的芽胞桿菌還需要在實(shí)驗(yàn)室開展進(jìn)一步的評(píng)估，其中用于土傳病害治理的芽胞桿菌要想發(fā)揮良好的防效，還需要具備良好的土壤和植物根際定殖能力。而芽胞桿菌能在土壤和植物根際良好定殖的關(guān)鍵是其生物被膜形成能力的強(qiáng)弱，因此評(píng)估芽胞桿菌類生防菌株生物被膜形成能力的強(qiáng)弱對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)芽胞桿菌用于生物農(nóng)藥或生物肥料的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)具有重要意義。此外，一些針對(duì)土傳病害的生物農(nóng)藥，由于施用時(shí)需要接種到土壤中，待其萌發(fā)并在土壤中定殖才能進(jìn)一步發(fā)揮作用，而土壤環(huán)境條件復(fù)雜，不合適的土壤理化因素如pH、鹽度、營(yíng)養(yǎng)源以及微生物因素如病原菌分泌毒素的存在等，都會(huì)影響到芽胞的萌發(fā)并最終發(fā)揮效果。篩選和尋找促進(jìn)芽胞桿菌在土壤和植物根際快速形成生物被膜的物質(zhì)，有助于提高這一類生物農(nóng)藥或生物制劑的田間應(yīng)用效果及其穩(wěn)定性。
[0004]在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，枯草芽胞桿菌的生物被膜形成研究成為模式和典范?？莶菅堪麠U菌最著名的特點(diǎn)是在饑餓和高種群密度時(shí)形成感受態(tài)和芽胞，除此之外，還發(fā)現(xiàn)許多枯草芽胞桿菌能夠在固體平板上形成復(fù)雜具褶皺的菌落，并在液體表面形成薄皮，這種在固體表面或液體表面形成的結(jié)構(gòu)即生物被膜?？莶菅堪麠U菌生物被膜形成及其基因調(diào)控得到了深入的研究。
[0005]目前被深入研究生物被膜形成機(jī)制的枯草芽胞桿菌菌株為NCIB3610菌株?？莶菅堪麠U菌生物被膜的形成涉及到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其中最核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是SinR、SinI和兩種新鑒定的蛋白，YlbF和YmcA。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SinR是控制枯草芽胞桿菌生物被膜形成轉(zhuǎn)換的主調(diào)控因子。SinR在枯草芽胞桿菌細(xì)胞中組成型表達(dá)，并在運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞中抑制控制基質(zhì)產(chǎn)生基因的轉(zhuǎn)錄，間接促進(jìn)細(xì)胞之間保持分開和運(yùn)動(dòng)。當(dāng)條件有利于生物被膜形成時(shí)，SinR的活性受到措抗。SinI和兩種新鑒定的蛋白(YlbF和YmcA)，直接和/或間接措抗SinR的活性，SinR活性降低后導(dǎo)致細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力喪失，細(xì)胞之間形成鏈狀并開始分泌胞外基質(zhì)，并最終形成穩(wěn)定的具有三維結(jié)構(gòu)的生物被膜。胞外基質(zhì)由胞外多糖(EPS)和蛋白質(zhì)TasA組成。
[0006]目前在微觀水平對(duì)枯草芽胞桿菌生物被膜的研究依賴超薄切片技術(shù)和高放大倍數(shù)熒光顯微鏡技術(shù)。在宏觀水平對(duì)枯草芽胞桿菌生物被膜形成的研究則依賴于枯草芽胞桿菌在不同液培養(yǎng)基表面形成的薄皮或固體培養(yǎng)基表面形成的菌落。目前常用的幾種培養(yǎng)基配方如下:
[0007](I)DSM培養(yǎng)基:Hamon and Lazazzera(2001)報(bào)道了評(píng)估和研究枯草芽胞桿菌生物被膜形成的方法，在該文章中，作者使用了PVC材質(zhì)的96孔微量滴定板作為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基配方(DSM)為:LB培養(yǎng)基加0.15M的硫酸銨、10mM的磷酸鉀(pH7)、34mM梓檬酸鈉、ImM硫酸錳和0.1%的葡萄糖。其測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)芽胞桿菌生物被膜形成強(qiáng)度時(shí)采用了結(jié)晶紫染色的方法，將微量滴定板中未粘附成膜的游離細(xì)胞去除，并用緩沖液(0.15M硫酸銨、10mM磷酸鉀(pH7)、34mM梓檬酸鈉、ImM硫酸錳)清洗。粘附到微孔中的細(xì)菌使用1%的結(jié)晶紫染色20min，多余的結(jié)晶紫去除并用水漂洗。結(jié)晶紫染色后的細(xì)胞用200yL由80%和20%丙酮組成的洗脫液溶解，并測(cè)定溶解液OD57q的讀數(shù)，用于評(píng)估生物被膜厚度。這個(gè)方法非常適合與測(cè)定芽胞桿菌形成薄皮的能力。
[0008](2)MSgg培養(yǎng)基:Branda et al.(2004)在研究枯草芽胞桿菌生物被膜時(shí)提出了液體MSgg培養(yǎng)基，具體配方為5mM磷酸鉀(pH7.0)、10mM磷酸丙基嗎啉(pH7.0)、2mM氯化鎂、700μΜ氯化鈣、50μΜ氯化錳、50μΜ氯化鐵、ΙμΜ氯化鋅、2μΜ硫胺素、0.5%甘油、0.5%谷氨酸、50yg/mL色氨酸、50yg/mL苯丙氨酸。固體MSgg培養(yǎng)基在液體MSgg培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊月旨。培養(yǎng)容器為培養(yǎng)皿。枯草芽胞桿菌在液體MSgg上能夠形成穩(wěn)定的具有皺褶的薄皮，在固體MSgg培養(yǎng)基上則形成具有三維結(jié)構(gòu)的菌落。
[0009](3)LB+Mn+甘油:Shemesh and Chai (2013)研究甘油和Mn促進(jìn)枯草芽胞桿菌生物被膜形成研究時(shí)使用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中加入I % (v/v)甘油和0.1mM硫酸錳。
[0010](4)MSN培養(yǎng)基:Beauregard et al.(2013)研究植物多糖對(duì)枯草芽胞桿菌薄皮形成影響時(shí)采用的培養(yǎng)容器為24孔微量滴定板，采用的培養(yǎng)基為MSN，配方為5mM磷酸鉀(pH7.0)、0.1M磷酸丙基嗎啉(pH7.0)，2mM氯化鎂、0.05mM氯化錳、ΙμΜ氯化鋅、2μΜ硫胺素、700μΜ氯化鈣、0.2%氯化銨。用于測(cè)定芽胞桿菌根際定殖能力時(shí)，在其中加入0.05%的甘油，或加入0.0 5 %的植物多糖用于測(cè)定薄皮的形成。該培養(yǎng)基從MSgg培養(yǎng)基演變而來(lái)。由于培養(yǎng)基中未提供芽胞桿菌生長(zhǎng)所需的碳源，芽胞桿菌接入上述培養(yǎng)基中不能形成薄皮，加入芽胞桿菌能夠使用的碳源后，芽胞桿菌將會(huì)在微量滴定板中形成薄皮。
[0011]上述4種培養(yǎng)基均可以用于定性或定量研究枯草芽胞桿菌生物被膜形成，其中DSM培養(yǎng)基比較適合研究薄皮，制備成固體培養(yǎng)基后，枯草芽胞桿菌不能生長(zhǎng)出具有褶皺的菌落。MSgg培養(yǎng)基既適合薄皮也適合菌落的生長(zhǎng)。LB+Mn+甘油的培養(yǎng)基也適合薄皮和菌落的生長(zhǎng)。MSN培養(yǎng)基適合評(píng)估碳源與枯草芽胞桿菌薄皮形成關(guān)系。也可以用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)出薄皮后，利用結(jié)晶紫染色的方法對(duì)菌株的生物被膜形成能力進(jìn)行定量評(píng)估。但是，除了 MSN培養(yǎng)基屬于專門設(shè)計(jì)用于評(píng)估生物被膜促進(jìn)因子研究的培養(yǎng)基外，其它培養(yǎng)基因其本身就具備促進(jìn)芽胞桿菌生物被膜形成能力，不適合用于生物被膜形成能力及促進(jìn)因子的評(píng)估。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種快速便捷評(píng)估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養(yǎng)基組合。
[0013]本發(fā)明的該目的是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的:
[0014]—種評(píng)估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括:
[0015]第一液體培養(yǎng)基，所述第一液體培養(yǎng)基包含的溶質(zhì)及濃度為，10mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，ImM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3%牛肉膏，0.5% NaCl，1%胰蛋白胨，0.1 %葡萄糖;在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調(diào)整PH為7.0;所述第一液體培養(yǎng)基的最終pH為7.0;
[0016]第二液體培養(yǎng)基，所述第二液體培養(yǎng)基包含的溶質(zhì)及濃度為，10mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，ImM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3%牛肉膏，0.5% NaCl，I %細(xì)菌學(xué)蛋白胨，
0.1%葡萄糖;在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調(diào)整pH為7.0;所述第二液體培養(yǎng)基的最終pH為7.0。
[0017]由于第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基中使用蛋白胨的不同，芽胞桿菌接入第一液體培養(yǎng)液和第二液體培養(yǎng)基后會(huì)經(jīng)歷的生長(zhǎng)抑制時(shí)間不同，通過觀察在第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基形成薄皮的形態(tài)、時(shí)間長(zhǎng)短就可以判斷出芽胞桿菌生物被膜形成能力。
[0018]本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速便捷評(píng)估芽胞桿菌生物被膜形成能力的方法。
[0019]本發(fā)明的該目的是通過如下方案實(shí)現(xiàn)的:
[0020]—種應(yīng)用前述培養(yǎng)基評(píng)估芽胞桿菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，
[0021]將待測(cè)菌株用固體LB平板劃線，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，在37°C下以180rpm的速度振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，使菌液的OD6qq值達(dá)到0.8以上；
[0022]然后用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋菌液，使菌液的OD6qq達(dá)到0.02，用作待測(cè)菌種液，要求待測(cè)菌種液中芽胞桿菌的濃度達(dá)到106CFU/mL;
[0023]將滅菌后的第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基分別加入無(wú)菌平板中，將待測(cè)菌種液按照0.08 %?0.1 %的接種量滴加在2種培養(yǎng)基的表面，蓋上皿蓋后30°C靜置培養(yǎng)，分別在1211、2411、4811、7211觀察薄皮的形成；
[0024]如果能夠在第一液體培養(yǎng)基中形成完整的薄皮，但不能在第二液體培養(yǎng)基中形成完整薄皮的菌株，判定為屬于生