本發(fā)明涉及干細胞技術領域，尤其是涉及一種脫落乳牙干細胞的分離與體外增殖方法，通過人脫落乳牙干細胞進行分離，然后利用有限稀釋法克隆純化人脫落乳牙干細胞，并使人脫落乳牙干細胞得到增殖。

背景技術：

干細胞是一種具有多分化潛能和自我復制功能的早期未分化細胞。根據細胞來源可將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞是最原始的干細胞，它位于個體發(fā)育的頂端，能夠分化為組成機體的所有類型的細胞，進而形成機體的任何組織和器官，具有發(fā)育的全能性。但是胚胎干細胞的研究利用牽涉到一定的倫理問題。成體干細胞是成體組織中具有自我更新能力和定向分化潛能的細胞，其存在使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。大量研究表明成體干細胞已經可以從多種組織器官中分離培養(yǎng)出來，其多向分化潛能及可塑性也得到了公認。

隨著干細胞研究的進一步發(fā)展，人們發(fā)現成體干細胞還存在于口腔組織的牙髓、牙周膜、牙胚、口腔上皮等組織。這些組織來源的成體干細胞同樣具有多向分化潛能，可以向骨、軟骨、脂肪等組織分化，但在細胞生物學特性以及分化潛能上又存在一定區(qū)別。其中，人脫落乳牙干細胞具有離成熟細胞近、可塑性強、免疫排斥小以及高度增殖能力和多向分化的潛能。

人脫落乳牙干細胞作為一種有很大潛能的干細胞，在牙髓干細胞的研究中有較大的應用前景。因此，人脫落乳牙組織的分離和體外增殖成為干細胞分化的基礎，如何有效得獲得人脫落乳牙干細胞成為研究的關鍵。

為了解決上述問題，選擇并收集6-10歲健康兒童因滯留而拔除的，無牙 體牙髓疾病的乳牙，使用酶消化分離法得到原代人脫落乳牙干細胞，再利用有限稀釋克隆法分離純化，最終獲得純化后的人脫落乳牙干細胞。有益效果是：通過此方法獲得純化的人脫落乳牙干細胞，在一定條件下可向特定的細胞類型包括成骨細胞、成脂肪細胞、神經細胞等分化，為牙髓干細胞的研究提供更廣闊的空間。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種脫落乳牙干細胞的分離與體外增殖方法。

為實現上述方法，本發(fā)明提供如下技術方案：

脫落乳牙干細胞的分離與體外增殖方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟a，選擇并收集6-10歲健康兒童因滯留而拔除的，無牙體牙髓疾病的乳牙。拔除后立即放入裝有含pbs試劑的試管中保存?zhèn)溆?，?小時內進行取材；

步驟b，取出所述乳牙，無菌條件下沿牙齒長軸劈開牙冠，取出冠根部牙髓，在超凈臺內切除根尖部的牙髓組織，置于含有不完全培養(yǎng)液的ep管內，用無菌pbs反復洗滌后放入培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿中用眼科剪將牙髓組織剪成小塊，并置于無菌離心管中；

步驟c，將所述牙髓組織消化，離心分離，再經培養(yǎng)獲得原代人脫落乳牙干細胞；

步驟d，采用有限稀釋法克隆純化所述原代人脫落乳牙干細胞，使所述原代人脫落乳牙干細胞增殖。

所述步驟c中還包括以下分步驟：

分步驟1，在所述無菌離心管中加入3mg/mli型膠原酶和4mg/mldispase酶各1ml，將所述無菌離心管置入恒溫(37℃)水浴箱中消化。多次搖晃，直 至所述牙髓組織呈絮狀；

分步驟2，所述牙髓組織經消化后，在所述無菌離心管中以1000r/min離心10分鐘,使用所述pbs試劑洗滌2次且每次離心2分鐘，棄上清液從而洗凈消化酶得到沉淀；

分步驟3，用培養(yǎng)液將所述沉淀充分混勻，反復吹打以離散細胞團塊，通過高壓滅菌后的細胞篩網，獲得單細胞懸液；

分步驟4，將所述單細胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶中，在37℃,5％co2等溫箱標準條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48-72小時后，棄去培養(yǎng)液，用所述pbs試劑洗滌三次，以去除未貼壁的細胞；

分步驟5,對上述細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換完全培養(yǎng)液一次。用倒置顯微鏡觀察細胞，記錄細胞形態(tài)及生長情況并拍照；

分步驟6，當細胞90％長滿瓶底時，使用濃度為0.25％的胰蛋白酶室溫消化3-5分鐘,在所述離心管中以1000r/min離心5分鐘，棄上清液得到原代人脫落乳牙干細胞。

所述步驟d中還包括以下分步驟：

分步驟01，取所述原代人脫落乳牙干細胞中處于對數生長期的細胞，用特定培養(yǎng)基倍比稀釋，調整細胞濃度并充分吹打混勻，接種于96孔培養(yǎng)板；

分步驟02，經24小時后，在所述96孔培養(yǎng)板中標記單個細胞孔，每2-3天更換所述培養(yǎng)液。待80-90％長滿所述96孔培養(yǎng)板的孔底后，使用所述濃度為0.25％的胰蛋白酶消化，擴大培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果是：通過本方法獲得純化的人脫落乳牙干細胞，在一定條件下可向特定的細胞類型包括成骨細胞、成脂肪細胞、神經細胞等分化，為牙髓干細胞的研究提供更廣闊的空間。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1的整體流程示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例1的消化，離心分離，培養(yǎng)的過程示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例1中原代人脫落乳牙干細胞在顯微鏡下的示意圖；

圖4是本發(fā)明實施例1中使用有限稀釋法克隆純化原代人脫落乳牙干細胞的過程示意圖。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

參照圖1所示脫落乳牙干細胞的分離與體外增殖方法，該方法包括以下步驟：選擇并收集6-10歲健康兒童因滯留而拔除的，無牙體牙髓疾病的乳牙1。拔除后立即放入裝有含pbs試劑2的試管3中保存?zhèn)溆茫?小時內進行取材。之后取出所述乳牙1，無菌條件下沿牙齒長軸劈開牙冠，取出冠根部牙髓4，在超凈臺5內切除根尖部的牙髓組織6，置于含有不完全培養(yǎng)液的ep管7內，用無菌pbs試劑2反復洗滌后放入培養(yǎng)皿8中。在培養(yǎng)皿8中用眼科剪9將牙髓組織剪成小塊，并置于無菌離心管10中。然后將所述牙髓組織消化，離心分離，再經培養(yǎng)獲得原代人脫落乳牙干細胞11。采用有限稀釋法克隆純化所述原代人脫落乳牙干細胞11，使所述原代人脫落乳牙干細胞11增殖。

參照圖2所示所述牙髓組織消化，離心分離，再經培養(yǎng)獲得原代人脫落乳牙干細胞的過程還包括以下步驟：

在所述無菌離心管10中加入3mg/mli型膠原酶和4mg/mldispase酶各1ml，將所述無菌離心管10置入恒溫(37℃)水浴箱12中消化。多次搖晃，直至所述牙髓組織呈絮狀；

所述牙髓組織6經消化后，在所述無菌離心管10中以1000r/min離心10分鐘,使用所述pbs試劑2洗滌2次且每次離心2分鐘，棄上清液從而洗凈消化酶得到沉淀13；

用培養(yǎng)液將所述沉淀充分混勻，反復吹打以離散細胞團塊，通過高壓滅菌后的細胞篩網14，獲得單細胞懸液15；

將所述單細胞懸液15接種于塑料培養(yǎng)瓶16中，在37℃,5％co2等溫箱標準條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48-72小時后，棄去培養(yǎng)液，用所述pbs試劑洗滌三次，以去除未貼壁的細胞；

對上述細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換完全培養(yǎng)液一次。參照圖3所示用倒置顯微鏡觀察細胞，記錄細胞形態(tài)及生長情況并拍照；

當細胞90％長滿瓶底時，使用濃度為0.25％的胰蛋白酶室溫消化3-5分鐘,在所述離心管10中以1000r/min離心5分鐘，棄上清液得到原代人脫落乳牙干細胞11。

參照圖4所示有限稀釋法克隆所述原代人脫落乳牙干細胞的過程包括以下步驟：

取所述原代人脫落乳牙干細胞11中處于對數生長期的細胞，用特定培養(yǎng)基17倍比稀釋，調整細胞濃度并充分吹打混勻，接種于96孔培養(yǎng)板18；

經24小時后，在所述96孔培養(yǎng)板18中標記單個細胞孔，每2-3天更換所述培養(yǎng)液。待80-90％長滿所述96孔培養(yǎng)板的孔底后，使用所述濃度為0.25％的胰蛋白酶19消化，擴大培養(yǎng)。

對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。