本發(fā)明涉及一種檢測(cè)結(jié)核感染的抗原組合物及其應(yīng)用，尤其涉及一種新型結(jié)核分枝桿菌抗原表位肽組合物及含其的試劑盒及用于制備結(jié)核感染的檢測(cè)和診斷試劑的用途。
背景技術(shù)：
：在全世界結(jié)核病依然是危害人類健康的主要傳染病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織資料估計(jì)，每年新發(fā)結(jié)核病感染病例接近900多萬，死亡病例一百多萬。中國(guó)的結(jié)核病疫情相當(dāng)嚴(yán)重，報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，全球54％的結(jié)核病例出現(xiàn)在中國(guó)、印度、印度尼西亞。who估算我國(guó)2014年的新發(fā)肺結(jié)核人數(shù)為93萬，位居全球第三位。早期診斷、選擇藥物進(jìn)行治療是控制結(jié)核病的關(guān)鍵。目前，臨床診斷結(jié)核感染的方法有限，結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)(tst)是臨床常用篩查結(jié)核的免疫學(xué)方法，具有操作簡(jiǎn)單，觀察結(jié)果方便的優(yōu)點(diǎn)，但其具有較高的假陽性，所以診斷意義有限；細(xì)菌學(xué)是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度和陽性率低，不利于早期診斷和治療；影像學(xué)作為輔助診斷療法，對(duì)結(jié)核診斷的特異性較差；血清學(xué)檢測(cè)如elisa、金標(biāo)等檢測(cè)抗原或抗體，極難檢測(cè)活性結(jié)核病，具有較高的假陰性和假陽性。結(jié)核菌感染引起t細(xì)胞γ-干擾素釋放試劑(igra)是近年發(fā)展起來的一種新方法，可用于診斷結(jié)核(tb)和潛伏結(jié)核感染(ltbi)，美國(guó)診斷igra可代替結(jié)核菌素皮試(tst)，英國(guó)相關(guān)指南推薦聯(lián)用igra和tst。已研制開發(fā)成功的quantiferon-tbgold和t-spot.b以rd1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原6kd早期分泌靶向抗原(esat-6)和10kd培養(yǎng)濾過蛋白(cfp-10)為刺激源，檢測(cè)外周血中ifn-γ活化的巨噬細(xì)胞分泌的下游趨化因子γ-干擾素，其敏感度僅為80％。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的針對(duì)結(jié)核感染的檢測(cè)方法中以抗原cfp10和esat6為刺激物的檢測(cè)方法敏感度低以及特異性不強(qiáng)等缺陷，提供一種檢測(cè)結(jié)核感染的抗原組合物、含其的檢測(cè)結(jié)核感染的試劑盒及其在制備結(jié)核檢測(cè)與診斷試劑中的應(yīng)用。利用本發(fā)明抗原組合物刺激特異性t細(xì)胞，檢測(cè)t細(xì)胞分泌的趨化因子，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，而且對(duì)于結(jié)核感染尤其是自然感染和卡介苗接種等潛伏感染的診斷也具有較強(qiáng)的特異性。在結(jié)核感染發(fā)生時(shí)，患者體內(nèi)活化的t細(xì)胞被激活、特異的靶分子會(huì)發(fā)生上調(diào)，正是利用該醫(yī)學(xué)常識(shí)對(duì)結(jié)核感染進(jìn)行體外檢測(cè)。本發(fā)明人為此反復(fù)試驗(yàn)和研究，從眾多結(jié)核特異性抗原肽包括cfp10、esat6及其各種抗原表位肽中，意外地發(fā)現(xiàn)了ppe以及ag85a作為新的抗原肽，與原有cfp10、esat6抗原肽及此4種抗原肽各自衍生肽特別是抗原表位肽中的兩種或兩種以上的組合，特別是選擇以cfp10抗原表位肽、esat6抗原表位肽、ppe抗原表位肽以及ag85a表位肽中的三種或者四種的組合物作為刺激源可以顯著提高體外結(jié)核感染檢測(cè)的靈敏度和特異性，減少由于低頻率的單一抗原刺激特異性t細(xì)胞造成的假陰性。本發(fā)明人在特異性和敏感度等方面進(jìn)行平衡，篩選出了最佳地抗原表位肽組合。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之一是：一種用于檢測(cè)結(jié)核感染的抗原組合物，所述抗原組合物由以下(1)～(3)三種多肽或者(1)～(4)四種多肽組成：(1)cfp10抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.1所示；(2)esat6抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.2所示；(3)ppe抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.3所示；(4)ag85a抗原的抗原表位肽；所述抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.4所示。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之二是：一種編碼上述抗原組合物的dna分子。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之三是：一種含有上述dna分子的重組表達(dá)載體；所述表達(dá)載體可以為細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。較佳地，所述載體的骨架為質(zhì)粒pet-28a。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之四是：一種含有上述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或者重組菌。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之五是：一種用于檢測(cè)結(jié)核感染的試劑盒，其包括上述抗原組合物。較佳地，所述試劑盒還包括至少一種反應(yīng)液，所述反應(yīng)液均包括一引物對(duì)和一探針，所述的引物對(duì)和探針針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性t細(xì)胞分泌的下游趨化因子cxcl9、cxcl11或cxcl13的基因序列設(shè)計(jì)；其中，針對(duì)趨化因子cxcl9設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物(引物1)是如seqidno.5所示序列的核酸，反向引物(引物2)是如seqidno.6所示序列的核酸，所述探針(探針1)的核苷酸序列如seqidno.7所示；針對(duì)趨化因子cxcl11設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物(引物3)是如seqidno.8所示序列的核酸，反向引物(引物4)是如seqidno.9所示序列的核酸，所述探針(探針2)的核苷酸序列如seqidno.10所示；或者針對(duì)趨化因子cxcl13設(shè)計(jì)的所述引物對(duì)的正向引物(引物5)是如seqidno.11所示序列的核酸，反向引物(引物6)是如seqidno.12所示序列的核酸，所述探針(探針3)的核苷酸序列如seqidno.13所示。其中，引物1位于人的cxcl9基因序列的197-221位，引物2位于289-265位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為93bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于234-260位；引物3位于人的cxcl11基因序列的113-136位，引物4位于255-230位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為143bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于184-211位；引物5位于人的cxcl13基因序列的199-224位，引物6位于314-293位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為116bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于226-249位。更佳地，為使結(jié)果可靠，抗干擾能力更強(qiáng)，作為表達(dá)量參照，本發(fā)明選用管家基因作為內(nèi)部參照，優(yōu)選人β-globin(β-球蛋白)基因，所述反應(yīng)液均還包括針對(duì)人β-globin基因設(shè)計(jì)的管家基因的一引物對(duì)和一探針；所述引物對(duì)中，正向引物(引物7)是如seqidno.14所示序列的核酸，反向引物(引物8)是如seqidno.15所示序列的核酸，所述探針(探針4)的核苷酸序列如seqidno.16所示。其中，引物7位于人β-globin基因組序列的hbb基因(62137-63742)的62627-62647位，引物8位于62756-62775位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149bp，所對(duì)應(yīng)的探針位于β-globin基因序列反向序列的62731-62755位。所述反應(yīng)液均還可以包括pcr反應(yīng)緩沖液和2’-脫氧核苷三磷酸；所述2’-脫氧核苷三磷酸的濃度優(yōu)選為100mm。本發(fā)明所述的試劑盒優(yōu)選為實(shí)時(shí)熒光定量pcr(fq-pcr)試劑盒。較佳地，所述試劑盒還可以包括普通pcr、熒光pcr、尤其fq-pcr的其他常規(guī)試劑：eztaq混合液和陰性質(zhì)控品等；所述eztaq混合液包括熱啟動(dòng)taq酶，濃度優(yōu)選1-5u/μl。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之六是：上述抗原組合物在制備結(jié)核感染檢測(cè)與診斷試劑中的應(yīng)用；所述結(jié)核感染檢測(cè)優(yōu)選為體外檢測(cè)結(jié)核感染引起的特異性t細(xì)胞免疫反應(yīng)。較佳地，在該應(yīng)用中，人的淋巴細(xì)胞經(jīng)過上述抗原組合物刺激后，檢測(cè)結(jié)核特異性t細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子優(yōu)選為趨化因子cxcl9、cxcl11或者cxcl13。更佳地，所述的結(jié)核感染檢測(cè)與診斷采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr法。根據(jù)本發(fā)明，所述的結(jié)核感染可以為潛伏期結(jié)核感染；換言之，可用于包括潛伏期結(jié)核感染的全病程結(jié)核感染。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明利用三種或者四種抗原衍生的抗原表位肽組成的抗原組合物刺激特異性t細(xì)胞，檢測(cè)t細(xì)胞分泌的趨化因子，降低了現(xiàn)有技術(shù)中以兩種抗原作為刺激源刺激特異性t細(xì)胞時(shí)造成的假陰性，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，而且對(duì)于結(jié)核感染尤其是自然感染和卡介苗接種等潛伏感染的診斷也具有較強(qiáng)的特異性。另外，本發(fā)明將趨化因子cxcl9、cxcl11以及cxcl13的核苷酸序列進(jìn)行分析，特別設(shè)計(jì)適用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，不僅操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)，而且極大地提高了結(jié)核檢測(cè)靈敏度，避免卡介苗或陳舊感染等的干擾導(dǎo)致假陽性而結(jié)果不準(zhǔn)確，降低了模板使用量。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。實(shí)施例1抗原組合物的制備1、抗原表位肽的制備由金斯康科技(南京)有限公司合成序列如seqidno.1所示的cfp10抗原表位肽、序列如seqidno.2所示的esat6抗原表位肽、序列如seqidno.3所示的ppe抗原表位肽以及序列如seqidno.4所示的ag85a抗原表位肽；所得抗原表位肽的存在狀態(tài)為干粉。4種不同的抗原表位肽還可以通過常規(guī)的手段進(jìn)行重組表達(dá)，具體來說：將表位肽的基因片段插入pet-28a載體制備重組質(zhì)粒，進(jìn)而以bl-21de宿主細(xì)菌可控表達(dá)、使用ni-nta鎳柱純化獲得。2、抗原組合物的制備(1)將上述制備的4種不同的抗原表位肽干粉按照摩爾比1:1:1:1進(jìn)行混合得“組合1”。(2)將上述制備的cfp10抗原表位肽、esat6抗原表位肽以及ppe抗原表位肽干粉按照摩爾比1:1:1進(jìn)行混合得“組合2”。實(shí)施例2試劑盒各組成成分的制備以及試劑盒的組裝表1.各組分名稱、濃度以及含量上述反應(yīng)緩沖液選用市售商品(購(gòu)自上海多澤生物科技有限公司)，dntp(購(gòu)自上海兆維科技發(fā)展有限公司)，eztaq酶或混合液(購(gòu)自上海多澤生物科技有限公司)，引物和探針(商業(yè)合成，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司(abi))。(1)制備包括下列組成成份的試劑盒：反應(yīng)液1(650μl/管)1管：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于擴(kuò)增cxcl9的正向引物(引物1)和反向引物(引物2)，寡核苷酸探針為探針1；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴(kuò)增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4。反應(yīng)液2(650μl/管)1管：反應(yīng)液2由如下組分組成：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于cxcl11靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物(引物3)和反向引物(引物4)，寡核苷酸探針為探針2；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴(kuò)增的引物7和引物8，寡核苷酸探針為探針4。反應(yīng)液3(650μl/管)1管：反應(yīng)液3由如下組分組成：pcr反應(yīng)緩沖液、2’-脫氧核苷三磷酸、用于cxcl13靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物(引物5)和反向引物(引物6)，寡核苷酸探針為探針3；用于管家基因人β-globin基因靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物(引物7)和反向引物(引物8)，寡核苷酸探針為探針4。eztaq酶混合液(150μl/管)1管：taq酶。表2eztaq酶混合液組成標(biāo)準(zhǔn)液：陰性質(zhì)控品(80μl/管)：純化水。結(jié)核抗原管(采血管1)：將實(shí)施例1制得的抗原組合物放到采血管中，每支采血管含有抗原組合物20μg(0.5mg/ml)和肝素鈉干粉30iu(900iu/ml)。本底對(duì)照管(采血管2)：采血管中只含有肝素鈉干粉30iu(900iu/ml)。反應(yīng)液1與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管作為體系i；反應(yīng)液2與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管作為體系ii；反應(yīng)液3與eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管作為體系iii。其中，引物1-8構(gòu)成了各體系中的核酸擴(kuò)增體系，探針1-4構(gòu)成了各體系中的熒光檢測(cè)體系；各引物和探針具體組成如下：表3.各引物和探針具體組成引物名稱核苷酸組成序列號(hào)引物15’-ccacctacaatccttgaaagacctt-3’seqidno.5引物25’-tgaactccattcttcagtgtagcaa-3’seqidno.6引物35’-tcaatttcctttcatgttcagcat-3’seqidno.8引物45’-acacaatatcacagccaaggctatag-3’seqidno.9引物55’-gtctttatccctagacgcttcattga-3’seqidno.11引物65’-gggtccacacacacaattgact-3’seqidno.12引物75’-ttcctcctcctgagcagt-3’seqidno.14引物85’-aaggtcataacctggttcatc-3’seqidno.15探針15’-ccaagcccttcctgcgagaaaattgaa-3’seqidno.7探針25’-caccagcagcaacagcaaaaaacaaaca-3’seqidno.10探針35’-cgaattcaaatcttgccccgtggg-3’seqidno.13探針45’-ccctggcgtcgtgattagtgatgatgaac-3’seqidno.16上述探針1～3的5’端連接有報(bào)告基團(tuán)fam，3’端連接有淬滅基團(tuán)bhqmgb；探針4的5’端連接有報(bào)告基團(tuán)vic，3’端連接有淬滅基團(tuán)bhqmgb。(2)試劑盒的組裝根據(jù)需求，可將eztaq酶混合液、標(biāo)準(zhǔn)液等試劑管以及結(jié)核抗原管和本底對(duì)照管分別與裝有上述反應(yīng)液1～3的單個(gè)離心管分隔包裝組成分別測(cè)定趨化因子cxcl9、cxcl11、cxcl13的試劑盒；也可以將上述各試劑管以及采血管和2個(gè)以上分別裝有不同的上述反應(yīng)液1～3的離心管包裝成雙靶點(diǎn)或三靶點(diǎn)的試劑盒。實(shí)施例3試劑盒的使用方法1)抽取樣本血液至本底對(duì)照管和結(jié)核抗原管中樣本采集、運(yùn)送和保存：用一次性真空采血器，無菌操作，取待檢個(gè)體血液樣本，做好標(biāo)示后將獲取的血液樣本置于低溫冰箱(-70℃或-20℃)中冷凍保存。如集中檢驗(yàn)，標(biāo)本需在0℃以下環(huán)境中運(yùn)送并于24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。臨床抽取2ml樣本血液加入本底對(duì)照管中，標(biāo)記為本底對(duì)照樣本；另抽取同一個(gè)體樣本血液2ml，加入含有抗原組合物的結(jié)核抗原管中于35℃下刺激6h后，標(biāo)記為結(jié)核抗原樣本。2)提取本底對(duì)照管和結(jié)核抗原管血液樣本中的rna取兩管中待測(cè)血樣各300μl，用磁珠法同批次提取(提取試劑購(gòu)自深圳市安必勝科技有限公司)血液樣本mrna，使用rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)逆轉(zhuǎn)錄為cdna，用分光光度計(jì)或類似的儀器確認(rèn)cdna的質(zhì)量(od260/280在1.8-2.0之間)。3)將所述cdna加入到反應(yīng)液中，通過核酸擴(kuò)增體系、用實(shí)時(shí)熒光pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，循環(huán)擴(kuò)增待測(cè)樣品中的靶多核苷酸；使所述熒光檢測(cè)體系中的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸序列間接結(jié)合。將逆轉(zhuǎn)錄的每份結(jié)核抗原管cdna和本底對(duì)照管cdna分別置于3個(gè)pcr反應(yīng)管或pcr板的3個(gè)孔中，每孔2μl。然后，在加入同一dna樣本的3個(gè)孔中各加入一種pcr反應(yīng)液(反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3)15μl，再在每個(gè)孔中加入3μl的eztaq酶混合液?；靹螂x心后，將pcr反應(yīng)體系置于自動(dòng)熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀(abi7500)上，選擇fam通道(reporter:fam,quencher:none)收集特異擴(kuò)增信號(hào)；選擇vic通道(reporter:vic,quencher:none)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比熒光(passivereference)設(shè)置為none；設(shè)置samplevolume為20。按照儀器操作說明做好相應(yīng)設(shè)置后開始試驗(yàn)。具體pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系、反應(yīng)條件見表4和表5。表4pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系表5pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件4)通過比較待檢樣本和本底對(duì)照樣本的循環(huán)閾值判定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，從而確定靶多核苷酸的存在。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件，點(diǎn)選儀器的數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)后可查看各個(gè)pcr反應(yīng)體系的結(jié)果，如pcr擴(kuò)增曲線，待檢樣本和本底對(duì)照樣本的ct值等。計(jì)算方法：以擴(kuò)增過程前3～15循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值(threshold)，以熒光值超過閾值的循環(huán)數(shù)為閾值循環(huán)數(shù)(值)ct值。若管家基因ct值＞35，結(jié)果不可靠，請(qǐng)重新測(cè)定或觀察血液本身是否存在問題。若管家基因ct值≦35時(shí)進(jìn)行以下計(jì)算：本底對(duì)照管：△cta＝ct值(目的基因)-ct值(管家基因)結(jié)核抗原管：△ctb＝ct值(目的基因)-ct值(管家基因)結(jié)果判讀：t值＝△ctb–△cta。1.無效結(jié)果判定：與存在于體系ⅰ、ⅱ、ⅲ中的寡核苷酸熒光探針1、探針2、探針3和探針4相關(guān)的擴(kuò)增曲線不呈現(xiàn)“s”型或ct值空白又或ct值＞35的樣本，報(bào)告為無效；2.陽性結(jié)果判定：滿足與體系ⅰ或體系ⅱ或體系ⅲ中的寡核苷酸探針1、探針2、探針3和探針4相關(guān)的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)“s”型且t值≤-1.04，報(bào)告為陽性；3.陰性結(jié)果判定：屬于無效結(jié)果判定和陽性結(jié)果判定以外的情況且t值＞-1.04。則報(bào)告為陰性(陰性對(duì)照品就是沒有出現(xiàn)擴(kuò)增，說明本實(shí)驗(yàn)體系未受到外界污染)。實(shí)施例4使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)200例臨床血液樣本的結(jié)果與分析本研究共涉及經(jīng)過嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)篩選的結(jié)核患者100例，非結(jié)核患者100例。以來自(南京胸科醫(yī)院)的200例血液樣本，對(duì)本發(fā)明所述抗原誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。所述病例樣本篩選標(biāo)準(zhǔn)為：臨床主治醫(yī)生確診的結(jié)核，包括潛伏期和非潛伏期的結(jié)核。非結(jié)核患者篩選標(biāo)準(zhǔn)為：確診的非結(jié)核患者。同時(shí)，結(jié)核病例和非結(jié)核患者年齡在18-60歲之間，性別按照1:1隨機(jī)挑選。本發(fā)明所用血樣為個(gè)體的靜脈外周血，采樣個(gè)體經(jīng)主治醫(yī)師體檢合格后，實(shí)驗(yàn)者告知其具體流程及所需血液的數(shù)量，經(jīng)個(gè)體同意并簽署知情同意書，由臨床醫(yī)生對(duì)志愿者進(jìn)行采血。采血時(shí)使用含有抗凝素的真空采血管，每個(gè)個(gè)體采血12ml。實(shí)驗(yàn)過程：臨床抽取2ml樣本血液至本底對(duì)照管中，標(biāo)記為本底對(duì)照樣本；另抽取2ml血液樣本，加入到含有20μg實(shí)施例1制備的抗原組合物的結(jié)核抗原管中，于35℃刺激6h后，標(biāo)記為結(jié)核抗原樣本。將待檢測(cè)血樣取300μl，用磁珠法同批次提取血液樣本mrna，購(gòu)買市售rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cdna，用分光光度計(jì)或類似的儀器確認(rèn)cdna的質(zhì)量(od260/280在1.8-2.0之間)，將逆轉(zhuǎn)錄的每份待檢樣本cdna和本底對(duì)照樣本cdna分別置于3個(gè)pcr反應(yīng)管或pcr板的3個(gè)孔中，每孔2μl。然后，在加入同一dna樣本的3個(gè)孔中各加入一種pcr反應(yīng)液(反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3)15μl，再在每個(gè)孔中加入3μl的eztaq酶混合液。具體pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見表4、5?；靹螂x心后，將pcr反應(yīng)體系置于自動(dòng)熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀上，選擇fam通道(reporter:fam,quencher:none)收集特異擴(kuò)增信號(hào)；選擇vic通道(reporter:vic,quencher:none)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比熒光(passivereference)設(shè)置為none；設(shè)置samplevolume為20。按照儀器操作說明做好相應(yīng)設(shè)置后開始試驗(yàn)。本試劑盒的所使用的反應(yīng)條件(如表5所示)是：(1)95℃預(yù)變性5分鐘；(2)95℃15秒；(3)58℃35秒；(4)72℃20秒；步驟(2)-(4)循環(huán)40次。其中，抗原組合物為實(shí)施例1制備得到的兩種抗原組合物，結(jié)果如下表所示：表6抗原組合物檢測(cè)結(jié)果分組對(duì)照組陽性率％組合1陽性率％組合2陽性率％結(jié)核疾病組75(75/100)80(82/100)76(76/100)非結(jié)核疾病組10(10/100)8(8/100)9(9/100)其中，陽性率的計(jì)算方法為：結(jié)核疾病組中的：陽性數(shù)/病例數(shù)×100％，特異性的計(jì)算方法為：特異性為非結(jié)核疾病組中的：(病例數(shù)-陽性數(shù))/病例數(shù)×100％；對(duì)照組所用抗原組合物來自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司的t-sport試劑盒，該抗原組合物由cfp10和esat6兩種抗原組成。結(jié)果顯示，組合1和2檢測(cè)結(jié)核的特異性分別為92％和91％，均高于對(duì)照組抗原組合物的特異性——90％；組合1和2抗原檢測(cè)結(jié)核的靈敏度(陽性率)分別為80％和76％，均高于對(duì)照組抗原組合物的靈敏度——75％；組合1和2抗原檢測(cè)結(jié)核的假陽性率分別為8％和9％，均低于對(duì)照組抗原組合物的假陽性率——10％。對(duì)比例樣本血液的采集和處理，以及檢測(cè)方法(包括rna的提取和熒光實(shí)時(shí)定量pcr反應(yīng)等)均同上述實(shí)施例；不同之處在于本對(duì)比例采用的抗原組合物不同于上述實(shí)施例，下述組合中不同表位肽之間的摩爾比為1:1:1或者1:1，具體如下：組合3：cfp10、esat6以及ag85a抗原表位肽；組合4：cfp10、ppe以及ag85a抗原表位肽；組合5：esat6、ppe以及ag85a抗原表位肽；組合6：cfp10和ag85a抗原表位肽；組合7：cfp10和ppe抗原表位肽；組合8：esat6和ag85a抗原表位肽；組合9：esat6和ppe抗原表位肽；組合10：ppe和ag85a抗原表位肽。檢測(cè)結(jié)果見表7和8。表7含3種抗原表位肽的抗原組合物檢測(cè)結(jié)果分組對(duì)照組陽性率％組合3陽性率％組合4陽性率％組合5陽性率％結(jié)核疾病組75(75/100)75(75/100)72(72/100)71(71/100)非結(jié)核疾病組10(10/100)10(10/100)11(11/100)13(13/100)表8含2種抗原表位肽的抗原組合物檢測(cè)結(jié)果其中，陽性率的計(jì)算方法為：結(jié)核疾病組中的：陽性數(shù)/病例數(shù)×100％，特異性的計(jì)算方法為：特異性為非結(jié)核疾病組中的：(病例數(shù)-陽性數(shù))/病例數(shù)×100％；對(duì)照組所用抗原組合物來自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司的t-sport試劑盒，該抗原組合物由cfp10和esat6兩種抗原組成。結(jié)果顯示：組合3～10檢測(cè)結(jié)核的特異性分別為90％、89％、87％、84％、86％、84％、84％和83％，除對(duì)照3以外均低于對(duì)照組抗原組合物的特異性——90％；且組合3～10中，僅組合3的陽性率以及假陽性率與對(duì)照組相同，其余組合的靈敏度均低于對(duì)照組，且假陽性率均高于對(duì)照組。<110>蘇州創(chuàng)瀾生物科技有限公司<120>一種用于檢測(cè)結(jié)核感染的抗原組合物及其應(yīng)用<130>p1611498c<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>12<212>prt<213>artificialsequence<220><223>cfp10抗原表位肽<400>1glnglyglntrpargglyalaalaglythralaala1510<210>2<211>6<212>prt<213>artificialsequence<220><223>esat6抗原表位肽<400>2gluleuasnasnalaleu15<210>3<211>20<212>prt<213>artificialsequence<220><223>ppe抗原表位肽<400>3alaglytrpglnthrleuseralaalaleuaspalaglnalavalglu151015leuthralaarg20<210>4<211>13<212>prt<213>artificialsequence<220><223>ag85a抗原表位肽<400>4arghisvallysprothrglyseralavalvalglyleu1510<210>5<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物1<400>5ccacctacaatccttgaaagacctt25<210>6<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物2<400>6tgaactccattcttcagtgtagcaa25<210>7<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針1<400>7ccaagcccttcctgcgagaaaattgaa27<210>8<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物3<400>8tcaatttcctttcatgttcagcat24<210>9<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物4<400>9acacaatatcacagccaaggctatag26<210>10<211>28<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針2<400>10caccagcagcaacagcaaaaaacaaaca28<210>11<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物5<400>11gtctttatccctagacgcttcattga26<210>12<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物6<400>12gggtccacacacacaattgact22<210>13<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針3<400>13cgaattcaaatcttgccccgtggg24<210>14<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物7<400>14ttcctcctcctgagcagt18<210>15<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物8<400>15aaggtcataacctggttcatc21<210>16<211>29<212>dna<213>artificialsequence<220><223>探針4<400>16ccctggcgtcgtgattagtgatgatgaac29當(dāng)前第1頁12