本發(fā)明涉及一種化合物，具體涉及一種能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性的化合物。

背景技術(shù)：

流感病毒由于能夠在人畜間不斷地傳播、重組和突變，已成為人類公共健康的重要威脅。由于流感疫苗的局限性，即從新爆發(fā)病毒的鑒定到針對該病毒的疫苗的臨床應(yīng)用至少會有6個月的滯后?？共《舅幬镆呀?jīng)成為人類應(yīng)對流感爆發(fā)的重要手段，這種優(yōu)勢在流感暴發(fā)和流行的初期尤為明顯。兩類抗病毒藥物已批準在臨床治療使用，即m2通道蛋白抑制劑(金剛烷胺和金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶(na)抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。然而，耐藥菌株的出現(xiàn)，如季節(jié)性h3n2，2009年甲型h1n1，h5n1和h7n9高致病性禽流感等，很大程度上削弱了這兩類藥物的臨床使用價值。所以，新開發(fā)的能夠在不同流感病毒亞型間提供交叉保護作用的抗病毒新藥備受關(guān)注。流感病毒蛋白的生物學和結(jié)構(gòu)功能學研究已在廣泛地開展，這也為新藥篩選提供了更多的靶點。需要特別指出的是，流感病毒rna聚合酶中相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)已被成功解析。由于這些蛋白在不同流感亞型之間相當保守。因此，針對rna聚合酶的功能結(jié)構(gòu)域設(shè)計抑或是篩選的藥物更有機會對流感產(chǎn)生廣譜的抗病毒效果。

流感病毒的rna聚合酶復(fù)合體(rdrp)負責病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，該復(fù)合體由pb1、pb2和pa三個亞基組成。在一個被稱為“偷帽”(cap-snatching)的過程中，病毒信使rna(mrna)轉(zhuǎn)錄所需要的起始引物，是通過pa亞基的核酸內(nèi)切酶活性(endonucleaseactivity)從宿主細胞的前體mrna上切割而來的。晶體結(jié)構(gòu)研究揭示pa亞基的氨基末端結(jié)構(gòu)域(以下簡稱pan)擁有核酸內(nèi)切酶活性位點。該結(jié)構(gòu)域在不同的甲型流感病毒亞型間高度保守，同時能夠在原核表達系統(tǒng)中功能性表達。重要的是，相關(guān)研究已經(jīng)證實，替換pan結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸位點將顯著減少病毒毒力。所以，針對pan核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域篩選而來的抗病毒藥物所誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥毒株的可能性會大大降低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種化合物，所述化合物能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性，本發(fā)明還提供了所述化合物的用途。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性的化合物，所述化合物為式(ⅰ)、式(ⅱ)或式(ⅲ)所示的化合物，所述式(ⅰ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

所述式(ⅱ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

所述式(ⅲ)所示的化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

將上述所述式(ⅰ)所示的化合物命名為pa-30，將上述所述式(ⅱ)所示的化合物命名為pa-30-a-1，將上述所述式(ⅱ)所示的化合物命名為pa-30-a-2，本發(fā)明所述式(ⅰ)和式(ⅱ)所示的化合物均對多個亞型的甲型流感病毒，包括甲型h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9和h9n2具有廣譜的抗病毒療效。扎那米韋和pa-30-a-1在細胞水平的聯(lián)合治療產(chǎn)生協(xié)同抗流感病毒作用。balb/c小鼠在感染致命劑量的h1n1流感病毒后接受pa-30-a-1的鼻腔給藥后，能夠顯著提高的存活率并減少肺組織中的病毒量。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括扎那米韋和上述所述的化合物。

優(yōu)選地，所述扎那米韋和權(quán)利要求1所述的化合物的摩爾比為1:10～10:1。

本發(fā)明提供了上述所述的化合物在制備抗流感病毒的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型、乙型和丙型流感病毒中的至少一種。

本發(fā)明提供了上述所述的藥物組合物在制備抗流感病毒的藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述流感病毒為甲型、乙型和丙型流感病毒中的至少一種。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種化合物，所述化合物為式(ⅰ)、式(ⅱ)或式(ⅲ)所示的化合物，所述化合物均能夠抑制流感病毒pa蛋白核酸內(nèi)切酶活性，具有抗流感病毒的功能。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中pa-30-a-1及pa-30在多周期病毒生長試驗中的抗病毒作用圖；

圖2為本發(fā)明實施例1中pa-30-a-1和pa-30的體外抗病毒效果圖；

圖3為本發(fā)明實施例1中pa-30-a-1和pa-30的體內(nèi)抗病毒效果圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

1材料和方法

1.1細胞、病毒及小分子化合物

犬腎細胞(mdck)在包含有10％熱滅活胎牛血清(fbs)，50單位/毫升青霉素和50微克/毫升鏈霉素(p/s)的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。mdck在病毒感染后，在含有1微克/毫升的tpck胰蛋白酶但不含有胎牛血清的mem中培養(yǎng)?？偣灿?株/6種亞型的流感病毒株，即a/hk/415742/09(h1n1)、a/hongkong/1/1968(h3n2)、a/shenzhen/406h/2006(h5n1)、a/hongkong/156/97(h5n1)、a/vietnam/1194/2004(h5n1)、a/netherlands/219/2003(h7n7)、a/anhui/1/2013(h7n9)和a/hk/1073/1999(h9n2)分別在mdck細胞中增殖并在本研究中使用。此外，還有一株在balb/c小鼠體內(nèi)多次傳代獲得的小鼠致死性流感病毒株a/hk/415742md/09(h1n1)，是在雞胚中增殖并應(yīng)用于本次研究的動物實驗的。病毒的滴度通過空斑試驗(plaqueassay)測定后，分裝并保存在-80攝氏度。所有與活病毒相關(guān)試驗是在生物安全2級或3級設(shè)施中進行的。

1.2選擇性指數(shù)

選擇性指數(shù)(selectivityindex)是通過50％的細胞毒性濃度(cc50)除以50％的病毒抑制濃度(ic50)計算而來的，該指標數(shù)值越高則指示該藥物擁有越好的臨床應(yīng)用前景。我們通過mtt法測定了每種小分子化合物的cc50，再通過空斑減數(shù)試驗確定ic50值，最終得到了每個候選化合物的選擇性指數(shù)。

1.3多周期病毒生長試驗

mdck細胞在接種了感染復(fù)數(shù)(moi)為0.002的流感h1n1病毒后，在含有20微摩的小分子化合物以及1微克/毫升tpck胰蛋白酶的mem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。感染0、6、21、25、32、47和54小時后，收集病毒上清液并使用空斑法測定病毒滴度。

1.4交叉保護力試驗

本發(fā)明所述化合物針對多個亞型的流感病毒，包括甲型h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9和h9n2的抗病毒效果也進行了測試。簡單地說，mdck細胞在接種0.002個moi的流感病毒后1小時，用pbs洗去未進入細胞的病毒粒子，并將培養(yǎng)基置換成新鮮的含有不同濃度(20、5、1.25、0.31微摩)本發(fā)明所述化合物的mem培養(yǎng)基。病毒接種24小時候后，收集細胞上清液，并采用反轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(rt-qpcr)技術(shù)測定病毒的滴度。

1.5本發(fā)明所述化合物的協(xié)同抗病毒效果評估

在細胞水平，我們評估了本發(fā)明所述化合物pa-30-a-1和扎那米韋潛在的協(xié)同抗病毒作用。首先，mdck細胞接種0.002個moi的流感病毒，然后采用5種不同的藥物組合進行測定。37℃培養(yǎng)24小時后，收集不同組合方案的上清液并采用空斑法測定病毒滴度。在本試驗中，我們對pa-30-a-1和扎那米韋的在ic50比率為10:1，5:1，1:1，1:5和1:10這5種情形進行了評估。在每個組合中，藥物從初始濃度開始進行6次兩倍的倍比稀釋以繪制劑量抑制曲線，并通過該曲線計算在此情況下藥物的ic50值。藥物間的協(xié)同抗病毒效果通過分級抑制濃度指數(shù)(fractionalinhibitoryconcentrationindex，簡稱fici)進行評估。fici通過[(聯(lián)合使用時pa-30-a-1的ic50)/(單獨使用時pa-30-a-1的ic50)]+[(組合使用時扎那米韋的ic50)/(單獨使用時扎那米韋的ic50)].fici<0.5被認為兩種藥物間具有顯著的協(xié)同抗病毒效果。

1.6化合物體內(nèi)抗病毒療效評估

本實驗采用6-8周齡的balb/c雌性小鼠作為實驗動物。所有實驗遵循生物安全2級動物設(shè)施標準作業(yè)程序并得到香港大學動物倫理委員會的批準。麻醉后,共56只小鼠(14只/組)經(jīng)鼻腔接種80％致死量(ld80)的流感h1n1病毒株a/hk/415742md/09。藥物在病毒接種6小時后由鼻腔途徑給藥，每日2次，共3天。第一組的小鼠接受20微升1毫克/毫升的pa-30-a-1(即1毫克/千克體重)。第二組的小鼠經(jīng)鼻腔接受20微升1毫克/毫升的pa-30。第三組的小鼠經(jīng)鼻腔接受20微升1毫克/毫升的扎那米韋作為陽性對照。最后一組小鼠經(jīng)鼻腔注射以20微升pbs作為陰性對照。動物的生命體征總共監(jiān)測21天或直至死亡(處于動物福利及倫理考慮，小鼠體重下降25％以上處死)。在病毒接種后的第4天，隨機從每組小鼠中選取四只處死后收集肺部組織。一半的肺組織碾磨后取上清采用空斑法和rt-qpcr法測定病毒滴度，另一半肺組織立即被固定在10％福爾馬林中進行的組織病理學分析。

1.7抗病毒機理的研究

為了確定病毒生命周期中的哪個階段被pa-30-a-1干擾，mdck細胞首先接種2個moi的流感h1n1病毒。此后，pa-30-a-1(20微摩)分別在病毒進入細胞時(-1小時)或在感染后1h后添加入培養(yǎng)基。對于前者(即-1小時)，病毒、細胞與pa-30-a-1共孵育1小時后替換以新鮮的不含化合物的培養(yǎng)基；對于后者，pa-30-a-1一直存在于培養(yǎng)基中。病毒接種細胞6小時后，利用rt-qpcr技術(shù)檢測細胞內(nèi)及上清液中的病毒含量。此外，我們還檢測了病毒在rna復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平上的變化，即細胞內(nèi)mrna及病毒基因組rna(vrna)的數(shù)量。簡單地說，mdck在接種2個moi的流感病毒后，往培養(yǎng)基中添加20微摩的pa-30-a-1。分別在感染后3小時和6小時，采用組織rna提取試劑盒(購自qiagen)提取細胞內(nèi)總rna用于rt-qpcr分析。在實驗中，扎那米韋(100微摩)被用于病毒釋放抑制劑的陽性對照。小分子化合物對流感病毒rna聚合酶活性的抑制功能是通過微型-復(fù)制子試驗(mini-repliconassay)驗證的。293t細胞經(jīng)過lipo3000轉(zhuǎn)染試劑(購自invitrogen公司)同時轉(zhuǎn)染各50納克phw2k-pb1,phw2k-pb2,phw2k-pa,phw2k-np,pires-egfp質(zhì)粒以及100納克ppoli-fluc質(zhì)粒。五小時后，吸出含有轉(zhuǎn)染液的細胞培養(yǎng)液取代以溶液dmem的不同濃度的小分子化合物(分別為50，25,12.5,6.25,3.125及0微摩)。24小時后，采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)(購自promega公司)，裂解細胞后測量讀數(shù)。

2結(jié)果

我們測定了小分子化合物pa-30及其類似物pa-30-a-1和pa-30-a-2的半數(shù)最大效應(yīng)濃度(ic50)以及半數(shù)細胞毒性濃度(cc50),并通過選擇性指數(shù)(selectivityindex＝cc50/ic50)對它們進行綜合評價(表1)。表1結(jié)果顯示，具有pa-30母核結(jié)構(gòu)的一組小分子化合物具有較高的選擇性指數(shù)和臨床應(yīng)用前景。

表1pa-30-a-1與pa-30的選擇性指數(shù)

緊接著，我們通過多周期病毒生長試驗比較了pa-30和pa-30-a-1的抗病毒療效。正如圖1顯示，在細胞感染流感病毒后，這兩種化合物可以顯著降低(即100-1000倍)上清液里的病毒滴度，而pa-30-a-1相比pa-30則表現(xiàn)出更高的選擇性指數(shù)(表1)。于是，我們進一步評價了這兩種小分子化合物在不同亞型流感病毒間的保護效果。

2.1pa-30-a-1提供廣譜的抗甲型流感病毒作用

因為pan的氨基酸序列在不同流感病毒株之間高度保守，我們評估了pa-30-a-1在h1n1、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9以及h9n2這些不同亞型的流感病毒間的交叉保護作用。如圖2a所示，pa-30-a-1能夠以劑量依賴的方式抑制所有測試所用的流感毒株的復(fù)制。20微摩的pa-30-a-1可以抑制所有測試病毒復(fù)制的99.9％以上；然而，不同亞型的流感毒株對pa-30-a-1表現(xiàn)出不同的敏感性。同樣的，pa-30也能夠抑制所有測定的病毒生長，并表現(xiàn)出和pa-30-a-1類似的抗病毒敏感度(圖2b)。

2.2pa-30-a-1抑制病毒在體內(nèi)的生長

為了評估pa-30-a-1和pa-30在體內(nèi)的抗病毒作用，試驗小鼠先經(jīng)過1個ld80的h1n1病毒感染，6小時之后再通過滴鼻的方式接受pa-30-a-1或pa-30的藥物治療。如圖3a所示，接受到1毫克/千克體重的pa-30-a-1或扎那米韋滴鼻治療的小鼠全部存活；接受到1毫克/千克體重的pa-30治療的小鼠80％存活，而只接受pbs治療的小鼠有80％死亡。在感染過后的第4天，我們在每個組中隨機挑選4只小鼠取肺并通過空斑試驗和rt-qpcr測定肺組織中的病毒含量。如圖3b結(jié)果表明，pa-30-a-1以及pa-30的治療都能夠顯著減少肺組織中的病毒量(p<0.05)。此外，如圖3c的組織病理學檢查進一步表明，經(jīng)過pa-30-a-1和pa-30治療的小鼠，肺組織間質(zhì)炎性細胞浸潤及肺泡損傷亦得到改善。我們的結(jié)果表明pa-30-a-1能有效抑制流感病毒在體內(nèi)的復(fù)制。

2.3pa-30-a-1和扎那米韋體外協(xié)同抗病毒作用

因為pa-30-a-1的抗病毒機制有別于常用的抗流感處方藥扎那米韋，我們進一步研究了兩個藥物之間潛在的協(xié)同抗病毒作用。分級抑制濃度指數(shù)(fici)常用于鑒定兩種或多種藥物之間是否存在協(xié)同作用。該指數(shù)假設(shè)藥物本身存在相加作用(即fici值為1)，而fici值小于或大于1則意味著協(xié)同作用或拮抗作用。相對應(yīng)的，這意味著需要更少(fici<1)或者更多(fici>1)的藥物才能達到相同的抗病毒效果。如表2所示，我們測試了五種不同比例的藥物組合。所有組合的分級抑制濃度指數(shù)均<0.5，提示pa-30-a-1和扎那米韋的確存在協(xié)同抗病毒作用。例如，當0.8微摩pa-30-a-1和0.05微摩扎那米韋聯(lián)合使用時，此時的ic50比值為1:1，其分級抑制濃度指數(shù)為0.24。

表2抗病毒藥物的聯(lián)合治療結(jié)果

等效ic50濃度＝(聯(lián)合使用時該藥物的ic50)/(單獨使用時該藥物的ic50)]；

b分級抑制濃度指數(shù)是pa-30-a-1和扎那米韋在每種組合中等效ic50的相加值；

*分級抑制濃度指數(shù)<0.5就被認為是顯著的協(xié)同作用。

最后所應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。