用于增強pcr特異性的新穎組合物、方法和試劑盒的制作方法
【專利說明】用于増強PCR特異性的新穎組合物、方法和試劑盒
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請根據(jù)35U.S.C. 119(e)要求2012年12月20日提交的美國臨時專利申請第 61/740, 242號的權(quán)益，和根據(jù)35U.S.C. 119(e)要求2012年11月2日提交的美國臨時專利 申請第61/721，968號的權(quán)益，所述申請中的每一個在此以全文引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明大體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及適用于檢測并且區(qū)分 核酸的新穎引物。
【背景技術(shù)】
[0004] 能夠檢測樣品中的特定核酸分子的存在并對其進(jìn)行定量的分析在法醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)、 流行病學(xué)和公共衛(wèi)生中相當(dāng)重要。所述分析可以用于例如鑒別傳染病的病因，預(yù)測個體將 患上遺傳疾病的可能性，測定飲用水或牛奶的純度，或鑒別組織樣品。提高所述分析的效用 和適用性的愿望通常因分析靈敏度而受阻。因此，非常希望研發(fā)出更靈敏的檢測分析。
[0005] 核酸檢測分析可以基于核酸分子的任何特征，例如其大小、序列，并且如果是DNA， 那么還可以基于通過限制性核酸內(nèi)切酶消化的易感性。所述分析的靈敏度可以通過改變向 觀察者報告或發(fā)信號通知檢測結(jié)果的方式來提高。因此，舉例來說，可以通過使用可檢測地 標(biāo)記的試劑來提高分析靈敏度。出于此目的，已經(jīng)使用了多種多樣的所述標(biāo)記。可檢測標(biāo) 記包括例如放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和酶標(biāo)記。
[0006] 雖然使用高度可檢測標(biāo)記的試劑可以改善核酸檢測分析的靈敏度，但是所述分析 的靈敏度仍然受到一些因素的限制，所述因素包括（但不限于）非特異性反應(yīng)，所述非特異 性反應(yīng)增加了背景信號和區(qū)分相差一個或幾個核苷酸的序列的限制。針對這些問題，已經(jīng) 研發(fā)出了使用DNA擴增的各種檢測和定量方法。
[0007] 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴增DNA使用引物對，所述引物的序列決定了擴增的 特異性。然而，在引發(fā)區(qū)以外的擴增子序列對擴增特異性的貢獻(xiàn)極少或無貢獻(xiàn)。在典型的 PCR反應(yīng)中，使用正向和反向引物優(yōu)先靶向并且擴增相關(guān)DNA序列。在TaqManli分析中，還 提供了從擴增子序列內(nèi)選取的探針來選擇性地檢測并且監(jiān)控擴增產(chǎn)物。目標(biāo)序列中在引物 和探針區(qū)以外的其余部分不采用。仍然需要提高擴增反應(yīng)的特異性，尤其是對于相差一個 或幾個核苷酸的樣品的擴增來說。所述分析的實例包括（但不限于）基因分型、稀有等位 基因檢測和突變體序列的預(yù)擴增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本文中提供了用于檢測目標(biāo)核酸分子的組合物、方法和試劑盒。
[0009] 一方面，提供寡核苷酸（本文中稱為"STAR(目標(biāo)特異性擴增限制）引物"或"* 引物"），其包含（i)序列標(biāo)簽，本文中稱為"STAR標(biāo)簽序列"和（ii)某一序列，所述序列與 目標(biāo)核酸雜交并且引物從其延伸，拷貝目標(biāo)核酸，產(chǎn)生延伸產(chǎn)物。STAR標(biāo)簽序列與STAR引 物的延伸產(chǎn)物3'的部分互補，延伸產(chǎn)物的互補部分在本文中被稱作STAR標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)區(qū)。當(dāng) STAR引物雜交到目標(biāo)核酸并且延伸時，延伸產(chǎn)物包含在5'端的STAR標(biāo)簽序列和在延伸產(chǎn) 物的3'區(qū)中的STAR標(biāo)簽序列的互補序列（即，STAR標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)區(qū)）。因此，STAR引物延伸 產(chǎn)物可以回折自退火，由此形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0010] 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列在STAR引物的5'端或在STAR引物的5'端附近。 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列與用于在擴增反應(yīng)中擴增延伸產(chǎn)物的另一個引物序列的結(jié) 合位點的全部或一部分互補。
[0011] 一方面，提供包含STAR引物的組合物。在某些實施例中，提供包含第一寡核苷酸 引物和第二寡核苷酸引物的組合物，其中第一引物包含與第二引物的目標(biāo)核酸雜交序列的 全部或一部分相同的STAR標(biāo)簽序列。在某些實施例中，第一和第二引物是正向和反向擴增 引物對。
[0012] 在某些實施例中，提供正向和反向擴增引物對，其中在所述對中的至少一個中包 含與另一個引物的目標(biāo)核酸雜交序列的全部或一部分相同的STAR標(biāo)簽序列。在某些實施 例中，所述對的兩個引物均包含STAR標(biāo)簽序列。
[0013] 一方面，提供多核苷酸延伸產(chǎn)物，其包含在5'端的STAR標(biāo)簽序列和與STAR標(biāo)簽 序列的3'側(cè)的STAR標(biāo)簽序列互補的序列，其中所述STAR標(biāo)簽序列和所述互補序列使得延 伸產(chǎn)物能夠形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0014] 另一方面，STAR引物可以用作用于增強PCR特異性的通用又便利的工具。
[0015] 在某些實施例中，提供用于抑制或?qū)嵸|(zhì)上減少目標(biāo)核酸的不當(dāng)擴增的方法，所述 方法包含使目標(biāo)核酸與一或多個STAR引物接觸，其中所述STAR引物包含5' STAR標(biāo)簽序 列；并且延伸STAR引物以形成延伸產(chǎn)物，借此延伸產(chǎn)物抑制或?qū)嵸|(zhì)上減少了目標(biāo)核酸的不 當(dāng)擴增。
[0016] 在某些實施例中，提供用于檢測一或多個目標(biāo)核酸分子的方法，所述方法包含使 一或多個目標(biāo)核酸分子與一或多個STAR引物雜交，其中所述STAR引物包含5' STAR標(biāo)簽序 列；延伸STAR引物以形成一或多個延伸產(chǎn)物；擴增延伸產(chǎn)物以形成一或多個擴增產(chǎn)物；以 及檢測存在或不存在至少一個擴增產(chǎn)物，由此檢測一或多個目標(biāo)核酸分子。
[0017] 在某些實施例中，提供用于檢測一或多個目標(biāo)核酸分子的方法，所述方法包含使 一或多個目標(biāo)核酸分子與一或多個STAR引物雜交，其中所述STAR引物包含5' STAR標(biāo)簽序 列；延伸STAR引物以形成一或多個延伸產(chǎn)物；在存在檢測器探針的情況下擴增延伸產(chǎn)物以 形成一或多個擴增產(chǎn)物，其中所述檢測器探針包含STAR引物的至少一個核苷酸；以及檢測 存在或不存在至少一個擴增產(chǎn)物，由此檢測一或多個目標(biāo)核酸分子。
[0018] 在某些實施例中，提供用于區(qū)分甲基化與非甲基化目標(biāo)核酸的方法。在某些實施 例中，提供用于從單一雜交反應(yīng)檢測兩個或兩個以上不同目標(biāo)核酸的方法。在某些實施例 中，提供用于區(qū)分目標(biāo)核酸樣品中的兩個不同等位基因的方法。
[0019] 在某些實施例中，提供組合物，其中所述組合物包含一或多個核酸分子和至少一 個寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含STAR標(biāo)簽序列并且其中所述寡核苷酸是本發(fā)明寡核 苷酸。在某些實施例中，所述組合物進(jìn)一步包含核酸聚合酶。在某些實施例中，所述組合物 進(jìn)一步包含正向或反向引物。在某些實施例中，所述組合物進(jìn)一步包含檢測器探針。
[0020] 在某些實施例中，提供試劑盒，所述試劑盒可以用于使用本文中所述的寡核苷酸 進(jìn)行雜交、延伸和擴增反應(yīng)。在某些實施例中，提供用于檢測或測量核酸合成或擴增產(chǎn)物的 試劑盒，所述試劑盒包含一或多種本文中所公開的寡核苷酸，包括STAR引物。
[0021] 本文中提供了本傳授內(nèi)容的這些和其它特征。
【附圖說明】
[0022] 圖1示意性地描繪根據(jù)本文中所公開的某些實施例的STAR引物的設(shè)計。
[0023] 圖2示意性地描繪STAR引物的替代性設(shè)計和應(yīng)用：圖2A描繪替代性STAR引物設(shè) 計；圖2B描繪在甲基化檢測中使用STAR引物；以及圖2C描繪使用STAR引物用通用探針進(jìn) 行基因分型。
[0024] 圖3示意性地描繪與目標(biāo)序列上的引物結(jié)合位點具有不同重疊長度的STAR引物。
[0025] 圖4以圖形方式表示具有不同重疊長度的STAR引物對目標(biāo)序列和脫靶序列的擴 增遏制：含完全匹配（PM) STAR標(biāo)簽的目標(biāo)序列（菱形線）、含PM STAR標(biāo)簽的脫靶序列（正 方形線）、含錯配（MM) STAR標(biāo)簽的目標(biāo)序列（三角形線）和含麗STAR標(biāo)簽的脫靶序列（圓 形線）。
[0026] 圖5示意性地描繪下一代TaqManlf miRNA分析工作流的實施例，使用了 5'和3' 連接銜接子（或連接子）、5'和3'連接夾板以及STAR引物。
[0027] 圖6以圖形方式表示相比于對照引物，在使用STAR引物的情況下，銜接子（連接 子）擴增減少。
[0028] 圖7以圖形方式表示相比于對照引物，使用STAR引物使目標(biāo)miRNA的qPCR檢測 的靈敏度增加。
[0029] 圖8示意性地描繪用于區(qū)分人類let_7c和let_7b miRNA的分析，使用了標(biāo)準(zhǔn)正 向引物并且使用了 STAR正向引物。
【具體實施方式】
[0030] 本文中提供了用于檢測目標(biāo)核酸的組合物、方法和試劑盒。
[0031] 通過PCR擴增DNA需要引物對，所述引物的序列決定了擴增的特異性。然而，在構(gòu) 造引物或探針序列的過程中通常不使用在引發(fā)區(qū)以外的擴增子序列。當(dāng)引物特異性有限 時，尤其當(dāng)所要目標(biāo)和不需要的目標(biāo)僅僅是其內(nèi)部序列不同時，兩者均可以通過相同的引 物對擴增。因此，需要采用內(nèi)部擴增子序列進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。為此目的，設(shè)計并測試了本文 中所公開的序列靶向擴增限制性（STAR)引物，用于選擇性地擴增所要目標(biāo)同時同步抑制 不需要的擴增產(chǎn)物的形成。
[0032] STAR引物寡核苷酸（也稱為引物"）包含⑴含STAR標(biāo)簽序列的部分和（ii) 含某一序列的部分，所述序列與目標(biāo)核酸雜交并且引物從其延伸，拷貝目標(biāo)核酸，產(chǎn)生延伸 產(chǎn)物。STAR標(biāo)簽序列與STAR引物的延伸產(chǎn)物3'的部分互補，延伸產(chǎn)物的互補部分在本文 中被稱作STAR標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)區(qū)。當(dāng)STAR引物雜交到目標(biāo)核酸并且延伸時，延伸產(chǎn)物包含在5' 端的STAR標(biāo)簽序列和在延伸產(chǎn)物的3'區(qū)中的STAR標(biāo)簽序列的互補序列（即，STAR標(biāo)簽 目標(biāo)區(qū)）。因此，STAR引物延伸產(chǎn)物可以回折自退火，由此形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。STAR引物被 設(shè)計成具有能夠在延伸產(chǎn)物中形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的5'STAR標(biāo)簽序列并且可以針對引物區(qū)、探 針區(qū)或延伸產(chǎn)物的任何擴增子內(nèi)部序列設(shè)計STAR標(biāo)簽序列，為具有挑戰(zhàn)性的應(yīng)用提供優(yōu) 良的設(shè)計靈活性。
[0033] 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列在STAR引物的5'端或在STAR引物的5'端附近。 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列不與STAR引物的目標(biāo)延伸識別序列重疊。在某些實施例 中，STAR標(biāo)簽序列部分地，但不完全地與STAR引物的目標(biāo)延伸識別序列重疊。目標(biāo)延伸識 別序列是指STAR引物中雜交到目標(biāo)核酸并且引物從其延伸以形成延伸產(chǎn)物的部分。在某 些實施例中，目標(biāo)延伸識別序列對目標(biāo)核酸具有特異性。在某些實施例中，目標(biāo)延伸識別序 列是針對通用序列，例如在連接到目標(biāo)核酸末端的常見銜接子中。在某些實施例中，目標(biāo)延 伸識別序列包含Poly(T)序列，用于例如雜交到聚腺苷酸化目標(biāo)核酸。
[0034] 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列與用于在擴增反應(yīng)中擴增延伸產(chǎn)物的另一個引物 序列的結(jié)合位點的全部或一部分互補（參看例如圖1)。當(dāng)STAR引物被延伸時，延伸產(chǎn)物可 以自身回折，由此在延伸產(chǎn)物的5'端處的STAR標(biāo)簽序列與延伸產(chǎn)物的3'區(qū)中的STAR標(biāo) 簽序列的互補序列之間形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。通過STAR引物延伸產(chǎn)物形成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)不包 括用于擴增目標(biāo)分子的另一個引物的退火，由此抑制了不需要的目標(biāo)的擴增。
[0035] 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列與一部分?jǐn)U增子內(nèi)部序列互補。在某些實施例中， STAR標(biāo)簽序列與一部分內(nèi)部擴增子序列互補并且與另一個引物序列的結(jié)合位點互補。通過 這種STAR引物的延伸產(chǎn)物形成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)阻斷了另一個引物的退火或通過DNA聚合酶 延伸，由此阻斷了延伸產(chǎn)物的任何進(jìn)一步擴增。
[0036] 在某些實施例中，擴增反應(yīng)中的正向引物是STAR引物。在某些實施例中，擴增反 應(yīng)中的反向引物是STAR引物。在某些實施例中，擴增反應(yīng)中的正向和反向引物均是STAR 引物。
[0037] 在某些實施例中，提供一種STAR引物，其包含與所述STAR引物所靶向的核酸中的 序列相同的STAR標(biāo)簽序列。舉例來說，在一些實施例中，STAR引物包含與所靶向的核酸中 的引物雜交序列相同的STAR標(biāo)簽序列。在某些實施例中，STAR引物包含與所靶向的核酸 的一部分相同的STAR標(biāo)簽序列，所述部分是所靶向的核酸中引物雜交序列的3'。在某些 實施例中，STAR引物包含與引物雜交序列的全部或一部分和所靶向的核酸的一部分相同的 STAR標(biāo)簽序列，所述部分是所靶向的核酸中引物雜交序列的3'。在所述實施例中，通過雜 交到目標(biāo)核酸的STAR引物延伸經(jīng)過目標(biāo)核酸的另一個引物雜交序列形成的延伸產(chǎn)物具有 兩個互補序列部分，其允許延伸產(chǎn)物形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0038] 在某些實施例中，提供一種多核苷酸延伸產(chǎn)物，其包含在5'端的STAR引物和與 STAR引物的STAR引物3'的STAR標(biāo)簽序列互補的序列以使得延伸產(chǎn)物能夠使用所述互補 序列形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實施例中，基于STAR引物的延伸產(chǎn)物能夠在PCR延伸溫度下 形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在某些實施例中，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中基于STAR引物的延伸產(chǎn)物不包括不同引 物到延伸產(chǎn)物的退火。
[0039] 在某些實施例中，STAR引物可以被設(shè)計成包含5' STAR標(biāo)簽序列，其可以在引物延 伸之后在PCR延伸溫度下形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)（參看圖2A)?？梢赃x擇與用于擴增目標(biāo)分子的 另一個引物完全或部分地重疊的STAR標(biāo)簽序列以排除另一個引物的退火。不希望受特定 理論束縛，似乎莖-環(huán)的形成比引物退火到目標(biāo)分子要快并且由于熵有利，所以莖-環(huán)結(jié)構(gòu) 更穩(wěn)定。因此，STAR引物有效地阻止了另一個引物的退火和延伸，促使PCR效率大大降低。
[0040] 在某些實施例中，提供STAR引物寡核苷酸，其中STAR標(biāo)簽序列被設(shè)計成用于在 PCR中回環(huán)并延伸（參看例如圖2A)。在某些實施例中，STAR引物中的5'最末端序列被設(shè) 計在用于靶向擴增子內(nèi)所含的特定序列（參看圖2A中引物和擴增子中的"X"）的引發(fā)結(jié)構(gòu) 域的相同鏈中。在第二輪PCR中，所述序列可以從另一個引物延伸，借此其回折并且當(dāng)完全 匹配時自我復(fù)制5'序列，由此使得延伸產(chǎn)物不可用于擴增。STAR引物的5'端可以被設(shè)計 成與目標(biāo)相同用于遏制擴增。含與STAR標(biāo)簽序列錯配的目標(biāo)核酸正常擴增。
[0041] 在某些實施例中，提供一種組合物，其包含第一和第二引物，其中第一引物包含與 第二引物的目標(biāo)結(jié)合序列的全部或一部分相同的STAR標(biāo)簽序列。在某些實施例中，組合物 中的第一和第二引物之間共用的相同序列的長度介于約3與約15個核苷酸之間。在某些 實施例中，共用序列的長度是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。
[0042] 在某些實施例中，提供擴增引物對，其中在所述引物中的至少一個中包含STAR標(biāo) 簽序列，其中STAR標(biāo)簽序列包含另一個引物的目標(biāo)結(jié)合序列的全部或一部分。在某些實施 例中，包含STAR標(biāo)簽序列的引物是正向引物并且另一個引物是反向引物。在某些實施例 中，包含STAR標(biāo)簽序列的引物是反向引物并且另一個引物是正向引物。在某些實施例中， 擴增引物對的兩個引物均包含STAR標(biāo)簽序列。
[0043] 在某些實施例中，STAR引物長度介于約20-60個核苷酸之間。在某些實施例中， STAR引物的長度是約20到約50個核苷酸。在某些實施例中，STAR引物的長度是約20到 約45、約25到約50、約25到約45或約30到約40個核苷酸。在某些實施例中，STAR引物 的長度是約 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45 個核苷酸。
[0044] 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列的長度是約10到約40個核苷酸。在某些實施例 中，STAR標(biāo)簽序列長度介于約30-35個核苷酸之間。在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列的長 度是約10到約30、約10到約35、約10到約20、約15到約30、約15到約25、約20到約40、 約20到約25或約30到約40個核苷酸。
[0045] 在某些實施例中，STAR引物是正向引物。在某些實施例中，STAR引物是反向引物。 在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列完全包含在第二引物結(jié)合區(qū)內(nèi)。在某些實施例中，STAR標(biāo) 簽序列完全包含在第二引物結(jié)合區(qū)的目標(biāo)序列下游內(nèi)（即，在有待擴增的目標(biāo)核酸的區(qū)域 中）。在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列橋接第二引物結(jié)合區(qū)與有待擴增的目標(biāo)核酸。在某些 實施例中，STAR標(biāo)簽序列與第二引物結(jié)合區(qū)的重疊可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12或13個核苷酸。優(yōu)選地，這個重疊是11、12或13個核苷酸。在特定實施例中，STAR標(biāo) 簽序列與第二引物結(jié)合區(qū)的重疊是12個核苷酸。在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列與第二引 物結(jié)合區(qū)的目標(biāo)序列下游的重疊可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個核苷酸。 優(yōu)選地，這個重疊是11、12或13個核苷酸。在特定實施例中，STAR標(biāo)簽序列與第二引物結(jié) 合區(qū)的目標(biāo)序列下游的重疊是12個核苷酸。在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列與目標(biāo)核酸 完全匹配。在某些實施例中，STAR標(biāo)簽序列含有與目標(biāo)核酸的錯配。
[0046] 在某些實施例中，STAR引物可以用作用于增強PCR特異性的通用又便利的工具。 STAR引物可以廣泛適用于基因分型、單核苷酸多態(tài)性（SNP)檢測、稀有等位基因檢測、突變 體序列的預(yù)擴增、稀有突變體檢測、DNA甲基化分析、不需要的背景DNA的選擇性遏制、文庫 扣除等中。另外，STAR引物可以用于在銜接子連接的miRNA的預(yù)擴增中所連接的連接銜接 子的選擇性擴增遏制和同源miRNA的TaqMan^+析區(qū)分（參看2012年11月2日提交的 共同擁有共同未決的美國臨時專利申請第61/721，968號，和與此并行地提交的名稱為"小 RNA 捕獲、檢測和定量（Small RNA Capture, Detection and Quantif