專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高核酸內(nèi)切酶v切割位置特異性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高通量DNA序列分析方法，特別是指一種快速低成本高通量DNA測(cè)序方法。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸(如DNA)包含著所有生物機(jī)體的藍(lán)圖，對(duì)核酸序列的研究對(duì)生命科學(xué)至關(guān)重要。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃和各種模式生物基因組計(jì)劃的開(kāi)展和完成，使人類(lèi)步入了后基因時(shí)代，對(duì)當(dāng)代的生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了巨大的影響，分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科得到了迅猛的發(fā)展。從基因水平上認(rèn)識(shí)生命的差異，疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。就基因序列分析而言，后基因時(shí)代的重點(diǎn)已由全基因組序列測(cè)定轉(zhuǎn)移到了對(duì)基因組中個(gè)體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。在基礎(chǔ)研究方面，研究疾病基因的遺傳規(guī)律，克隆致病基因；在應(yīng)用方面，直接尋找疾病的易感基因突變位點(diǎn)通過(guò)對(duì)于大量某一特定疾病的基因組樣本中突變基因型進(jìn)行大規(guī)模鑒定和檢測(cè)，可以獲得有關(guān)與該疾病相關(guān)基因型的信息。通過(guò)基因組DNA序列的測(cè)定可以為理解生命的起源、疾病發(fā)生、以及個(gè)體化醫(yī)療等提供有用的相關(guān)核酸序列信息。 目前，新一代DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為國(guó)際上一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)十分激烈的研究領(lǐng)域。新一代DNA測(cè)序技術(shù)，與現(xiàn)有的基于電泳的Sanger測(cè)序技術(shù)不同，主要采用延伸法和連接法測(cè)序等非電泳技術(shù)。即先用已知標(biāo)記物標(biāo)記的單體或者引物延伸(連接)，以形成的標(biāo)記物確定第一次測(cè)序中的堿基序列，然后將第一次測(cè)序中的標(biāo)記物清除，再進(jìn)行下一次序列的測(cè)定，由此循環(huán)完成對(duì)模板序列的所有測(cè)定。因此標(biāo)記物的有效清除就顯得非常重要，因?yàn)闃?biāo)記物清除不徹底將導(dǎo)致標(biāo)記物量的累積，給后續(xù)標(biāo)記物量的確定帶來(lái)困難，影響測(cè)序的長(zhǎng)度和正確性；同時(shí)對(duì)標(biāo)記物清除過(guò)程中是否對(duì)模板或者測(cè)序引物造成破壞也將大大影響測(cè)序的長(zhǎng)度和正確性。 本發(fā)明將提出一種新的連接測(cè)序方法，即采用核酸內(nèi)切酶V切割方法來(lái)清除雜交鏈接序列中熒光標(biāo)記部分的方法。 核酸內(nèi)切酶V是在E. coli中發(fā)現(xiàn)的一種DNA修復(fù)酶。它識(shí)別DNA中的脫氧次黃核苷，即脫氧腺苷的去氨基產(chǎn)物。核酸內(nèi)切酶V，也稱(chēng)為脫氧次黃核苷3'內(nèi)切酶，識(shí)別含脫氧次黃苷(無(wú)論配對(duì)與否)的雙鏈或單鏈DNA。也可識(shí)別含脫堿基(AP)位點(diǎn)或尿素、堿基錯(cuò)配、插入/缺失錯(cuò)配、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、未配對(duì)loop環(huán)、折疊fl即s和類(lèi)-Y型結(jié)構(gòu)的DNA，但是識(shí)別后者的能力不如前者。核酸內(nèi)切酶V可以在距錯(cuò)配脫氧次黃苷第二個(gè)或第三個(gè)磷酸二酯鍵的3'端進(jìn)行切割，切割第二個(gè)磷酸二酯鍵的效率是95%，第三個(gè)磷酸二酯鍵的效率是5%，產(chǎn)生一個(gè)3'羥基、5'磷酸的切口。利用該切口，進(jìn)行后續(xù)的雜交連接反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)堿基的測(cè)定。 由于核酸內(nèi)切酶V所識(shí)別DNA中的脫氧次黃核苷切割第二個(gè)磷酸二酯鍵的效率是95%，第三個(gè)磷酸二酯鍵的效率是5%。在測(cè)序過(guò)程中將會(huì)引入測(cè)序堿基位置的誤差，并使測(cè)序的度受到很大的限制。提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性將會(huì)極大地提高DNA測(cè)序的正確性和測(cè)序長(zhǎng)度。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，由于重新雜交后的高通量引物是通過(guò)非常成熟的固相DNA方法合成并純化得到，因此該方法沒(méi)有錯(cuò)誤延伸的累積效應(yīng)，能夠維持DNA模板和測(cè)序引物的量，序列的測(cè)定正確可靠，不存在測(cè)序長(zhǎng)度的限制；另外，該方法按照流行的分子生物學(xué)方法進(jìn)行，不存在技術(shù)難點(diǎn)。同時(shí)該方法具有雙重糾正錯(cuò)誤的能力。 技術(shù)方案本發(fā)明的目的就是通過(guò)在前述能被切割的磷酸二酯鍵引入硫代修飾，從而達(dá)到抵制核酸內(nèi)切酶V對(duì)該位置切割作用，使得核酸內(nèi)切酶V切割位置的唯一性。含有該特點(diǎn)的測(cè)序引物，采用雜交_酶連接_酶切割的高通量測(cè)序技術(shù)。為全基因組DNA序列分析提供一種新方法，建立快速，準(zhǔn)確，便宜的基因組序列測(cè)定技術(shù)。
本發(fā)明的提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法為在DNA探針中引入含有核酸內(nèi)切酶V的識(shí)別位點(diǎn)脫氧次黃核苷dl和DNA鏈中一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵上的氧被硫代修飾的位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸DNA片段，并且核酸內(nèi)切酶V的識(shí)別位點(diǎn)和硫代修飾位點(diǎn)的相隔距離為二個(gè)或二個(gè)以上的堿基，該方法可以用于分析未知DNA即待分析的模板DNA的序列信息。 單鏈寡核苷酸DNA片段上標(biāo)記有熒光基團(tuán)。 單鏈寡核苷酸DNA片段的使用方法為，將該片段與未知單鏈DNA模板即待分析的模板DNA雜交、與待分析的模板DNA上引物進(jìn)行連接反應(yīng)，并清除未連接的寡核苷酸序列片段，然后利用核酸內(nèi)切酶V對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行切割。 單鏈寡核苷酸DNA片段被硫代修飾的磷酸二酯鍵可以一個(gè)或兩個(gè)氧分別被硫取代。 單鏈寡核苷酸DNA片段序列中含有至少1個(gè)確定的堿基即在確定位置上分別含有A、 G、 C、 T四種堿基之一，或者不同堿基的任意組合和若干個(gè)隨機(jī)組合的能跟任意目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的簡(jiǎn)并堿基N即每個(gè)位置均包含能夠與四個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)的堿基組合構(gòu)成。
單鏈寡核苷酸DNA片段，若干個(gè)簡(jiǎn)并堿基可用能夠與正常堿基形成氫鍵的其它堿基或者堿基類(lèi)似物構(gòu)成。 待分析的模板DNA，通過(guò)化學(xué)或者物理方法固定在平面基片、"96、384孔板"或者
各種修飾的珠子等載體上；未知單鏈DNA模板可以通過(guò)常規(guī)的PCR，滾環(huán)擴(kuò)增、固相擴(kuò)增、橋
式擴(kuò)增以及固相酶連接反應(yīng)的方法增加其分析用數(shù)量，擴(kuò)增是單重的，即一次擴(kuò)增一個(gè)目
的片斷，或是多重的，即一次擴(kuò)增多個(gè)目的片斷。 有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn) 1.本發(fā)明的最大優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了 DNA序列測(cè)定的標(biāo)記物的定點(diǎn)有效切除，由于采用硫代修飾，使得核酸內(nèi)切酶V切割位置準(zhǔn)確、切割效率高，對(duì)模板和測(cè)序引物影響少，序列的測(cè)定正確可靠。 2.本發(fā)明的高通量測(cè)序引物由于確定的堿基可以置于任定的方法來(lái)增加序列測(cè)定的閱讀長(zhǎng)度。此外，該發(fā)明均按照流行的分子生物學(xué)方法何已知的位置，因此可以通過(guò)改變測(cè)序定位引物的方法先將某些特定位置堿基序列確進(jìn)行 容易在現(xiàn)有的技術(shù)上實(shí)施。
以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷DNA鏈及其酶切割位置示意圖。
圖中1為含脫氧次黃嘌呤(I)及硫代修飾(s)核苷的DNA鏈，2為能與該修飾核苷的DNA鏈互補(bǔ)的一條DNA鏈。由于硫代修飾可抵制內(nèi)切切酶V的切割，所以第一個(gè)脫氧次黃嘌呤主要切割位置(第二和第三個(gè)堿基之間)不能發(fā)生切割反應(yīng)，而第二個(gè)脫氧次黃嘌呤次要切割位置(第四和第五個(gè)堿基之間)也不能發(fā)生切割反應(yīng)，能發(fā)生切割反應(yīng)的位置是第三和第四個(gè)堿基之間，切割產(chǎn)物是5'磷酸要(P)，從而達(dá)到切割位置唯一性的目的。
圖2是本發(fā)明兩組標(biāo)記的含雙硫代核苷的寡核苷酸(測(cè)序引物)示意圖。
圖中寡核苷酸序列中的上標(biāo)s表示硫代修飾的磷酸二酯鍵，I表示脫氧次黃嘌呤，F(xiàn)1、F2、F3、F4分別表示4種不同標(biāo)記物(如Texas Red, Cy5， Cy3， Fam等)。堿基N表示四個(gè)堿基混合，nl，n2為自然數(shù)，最佳為3-12。在這兩組(四個(gè))硫代核苷測(cè)序引物中，除明確的堿基A(或者G、或者C、或者T)位置需要與模板序列中相應(yīng)的堿基配對(duì)外，其余堿基均能與模板序列的堿基配對(duì)。 圖3是本發(fā)明的序列測(cè)定方法示意圖。圖中有測(cè)序定位引物l，未知DNA模板序列2，含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物3。測(cè)序定位引物(1)與固定的單鏈DNA模板(2)完成雜交，加入標(biāo)記的一組含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物(3)完成雜交(a)，在連接酶的作用下，緊鄰測(cè)序定位引物(2)的完全配對(duì)的含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物3-l與測(cè)序定位引物2完成連接反應(yīng)(b)，通過(guò)清除未連接的含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物(3-2， 3-3)，并掃描記錄DNA模板本次雜交_連接列后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的一個(gè)堿基T (第1個(gè)堿基)的測(cè)定(c)。重復(fù)上述過(guò)程，進(jìn)行下一個(gè)堿基(第5個(gè)堿基、...)的測(cè)定(e)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷寡核苷酸片段(測(cè)序定位引物，或簡(jiǎn)稱(chēng)為引物)及其用于DNA序列測(cè)定方法。當(dāng)測(cè)序定位引物與未知DNA模板完成雜交后，一組標(biāo)記的含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷引物與所有未知DNA模板雜交，通過(guò)硫代核苷引物與測(cè)序定位引物的連接反應(yīng)，同時(shí)清除未連接的硫代核苷引物，掃描記錄該次不同位置上未知DNA模板給出的標(biāo)記物信號(hào)，便可確定未知DNA模板上對(duì)應(yīng)的堿基序列。由于該次連接的這段寡核苷酸序列中至少含有一個(gè)含硫代核苷，這個(gè)核苷在某些對(duì)正常核苷進(jìn)行切割的酶的作用下不會(huì)被切割。利用這個(gè)特點(diǎn)可以將標(biāo)記寡核苷酸序列選擇性的切割將標(biāo)記物清除以實(shí)現(xiàn)對(duì)下一個(gè)堿基的序列測(cè)定。 重復(fù)上述過(guò)程，每增加一次硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列的雜交、連接，將增加DNA模板序列的一個(gè)堿基的閱讀長(zhǎng)度。 本發(fā)明是一種含硫代核苷引物及其用于DNA序列測(cè)定方法，DNA測(cè)序引物實(shí)際上是一組寡核苷酸序列，這組序列是所有測(cè)序模板的測(cè)序引物是一組含硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，當(dāng)這組序列與未知單鏈DNA模板高通量平行雜交、連接反應(yīng)，并清除未連接的標(biāo)記寡核苷酸序列后實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的一個(gè)堿基測(cè)定，然后利用酶對(duì)正常核苷的切割、對(duì)含雙硫代核苷的作用實(shí)現(xiàn)對(duì)含雙硫代核苷標(biāo)記寡核苷酸序列的標(biāo)記物切割；重復(fù)上述過(guò)
5程，每增加一次含硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列的雜交、連接，將增加DNA模板序列的一個(gè) 堿基的閱讀長(zhǎng)度。 所述的含硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，這段寡核苷酸序列中至少含有一個(gè)含硫 代核苷的，這個(gè)核苷在某些對(duì)正常核苷進(jìn)行切割的酶的作用下不會(huì)被切割。利用這個(gè)特點(diǎn) 可以將標(biāo)記寡核苷酸序列選擇性的切割將標(biāo)記物清除以實(shí)現(xiàn)循環(huán)序列測(cè)定。
所述的含雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，這段序列中含有一個(gè)明確的堿基和若 干個(gè)簡(jiǎn)并堿基以N表示(既是每個(gè)N位置均包含能夠與四個(gè)堿基雜交的堿基)構(gòu)成，這樣 通過(guò)一組(一個(gè)明確的堿基的位置上分別含有A、G、C、T)含雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序 列，每個(gè)確定的堿基標(biāo)記一種特定的標(biāo)記物，即通過(guò)4次合成將得到4X4N條標(biāo)記序列，滿 足與所有未知DNA模板雜交的連接測(cè)序引物要求。 所述的含硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，硫代核苷在這段序列中的位置位于一個(gè) 明確堿基位置之后，即酶切割不會(huì)切割到該堿基的位置。 所述的含硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，若干個(gè)堿基N的數(shù)目應(yīng)盡可能小，最好 一般為3-5個(gè)，這樣可以提高測(cè)序引物的濃度。同時(shí)為了確保引物雜交的特異性，堿基N可 以由除正常四個(gè)堿基(A、G、G、T)夕卜、能與正常堿基形成氫鍵的其它堿基或者堿基類(lèi)似物基 團(tuán)構(gòu)成，如脫氧肌苷(I)、脫氧核糖、核糖、次黃嘌呤、甲基腺嘌呤、甲基鳥(niǎo)嘌呤等。
當(dāng)高通量含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物實(shí)際上是一組(四個(gè)或者十六條) 寡核苷酸序列，這組序列是所有測(cè)序模板的測(cè)序引物。當(dāng)測(cè)序定位引物與未知DNA模板完 成雜交后，加入標(biāo)記的這組硫代核苷測(cè)序引物與未知DNA模板雜交，并在連接酶的作用下， 將緊鄰測(cè)序定位引物的，完全配對(duì)的含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物與測(cè)序定位引物 完成連接，然后通過(guò)變性、清除未連接的含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物，并掃描記錄 DNA模板本次雜交-連接列后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的一個(gè)堿基的測(cè)定。重 復(fù)上述過(guò)程，每加入一組含脫氧次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物就實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的下 一個(gè)堿基的測(cè)定。 實(shí)例1 :雜交-連接熒光標(biāo)記序列法測(cè)定包含人全基因組。 將人基因組用酶切割(或者超聲破碎)成大小為50-1000堿基的片斷，并在連接 酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對(duì)通用連接子進(jìn)行連接(假定均為20個(gè)堿基)，其 中的一個(gè)通用連接子的寡核酸序列與擴(kuò)增引物的序列完全互補(bǔ)，而另一個(gè)連接子的寡核酸 序列與測(cè)序定位引物的相同。 將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補(bǔ)序列到微珠進(jìn)行乳液并 行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段化的人全基因組。并將這些微珠固定到平板基片上，通過(guò)酶切或者變 性得到人全基因組測(cè)序模板。 參照附圖1、圖2和圖3，將測(cè)序定位引物與人全基因組測(cè)序模板雜交，然后將標(biāo)記 不同顏料的5'Cy3-IIsNNsNNAN 3'、5'Cy5—IIsNNsNNAN 3'、5'Texas Red—IIsNNsNNAN 3'、 5'Fam-IIsNNsNNAN 3'與人全基因組測(cè)序模板完成雜交_連接，并在清除未連接的含脫氧 次黃嘌呤及硫代核苷測(cè)序引物后，進(jìn)行掃描分析，確定哪些位置的模板進(jìn)行了哪些堿基的 連接反應(yīng)，從而確定基因組序列上第5個(gè)位置上堿基的序列。用內(nèi)切酶V切處理，切除若干 個(gè)堿基及熒光分子。重復(fù)上述過(guò)程，每重復(fù)一次便增加一個(gè)堿基的序列測(cè)定，直到因每個(gè)堿 基的延伸效率導(dǎo)致不能準(zhǔn)確堿基序列為止，這樣便可以知道位置2、7、12、17.....等位置的
6堿基序列；停止該次測(cè)序，將延伸上述測(cè)定若干個(gè)堿基序列的測(cè)序定位引物變性掉，并重新
雜交3端比原來(lái)少一個(gè)堿基的測(cè)序定位引物，基于同樣的道理可以測(cè)定1、6、11、16.....等
位置的堿基序列；依上述原理進(jìn)行便可以將未知DNA模板的序列確定。
權(quán)利要求
一種提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，其特征在于在DNA探針中引入含有核酸內(nèi)切酶V的識(shí)別位點(diǎn)脫氧次黃核苷dI和DNA鏈中一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵上的氧被硫代修飾的位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸DNA片段，并且核酸內(nèi)切酶V的識(shí)別位點(diǎn)和硫代修飾位點(diǎn)的相隔距離為二個(gè)或二個(gè)以上的堿基，該方法可以用于分析未知DNA即待分析的模板DNA的序列信息。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，其特征在于單鏈寡核苷酸DNA片段上標(biāo)記有熒光基團(tuán)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，其特征在于單鏈寡核苷酸DNA片段的使用方法為，將該片段與未知單鏈DNA模板即待分析的模板DNA雜交、與待分析的模板DNA上引物進(jìn)行連接反應(yīng)，并清除未連接的寡核苷酸序列片段，然后利用核酸內(nèi)切酶V對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行切割。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，其特征在于單鏈寡核苷酸DNA片段被硫代修飾的磷酸二酯鍵可以一個(gè)或兩個(gè)氧分別被硫取代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，其特征在于單鏈寡核苷酸DNA片段序列中含有至少1個(gè)確定的堿基即在確定位置上分別含有A、 G、 C、 T四種堿基之一，或者不同堿基的任意組合和若干個(gè)隨機(jī)組合的能跟任意目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的簡(jiǎn)并堿基N即每個(gè)位置均包含能夠與四個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)的堿基組合構(gòu)成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，其特征在于單鏈寡核苷酸DNA片段，若干個(gè)簡(jiǎn)并堿基可用能夠與正常堿基形成氫鍵的其它堿基或者堿基類(lèi)似物構(gòu)成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，其特征在于待分析的模板DNA，通過(guò)化學(xué)或者物理方法固定在平面基片、"96、384孔板"或者各種修飾的珠子等載體上；未知單鏈DNA模板可以通過(guò)常規(guī)的PCR，滾環(huán)擴(kuò)增、固相擴(kuò)增、橋式擴(kuò)增以及固相酶連接反應(yīng)的方法增加其分析用數(shù)量，擴(kuò)增是單重的，即一次擴(kuò)增一個(gè)目的片斷，或是多重的，即一次擴(kuò)增多個(gè)目的片斷。
全文摘要
本發(fā)明是一種提高核酸內(nèi)切酶V切割位置特異性的方法，涉及一種高通量DNA序列分析方法，特別是指一種快速低成本高通量DNA測(cè)序方法。在DNA探針中引入含有核酸內(nèi)切酶V的識(shí)別位點(diǎn)脫氧次黃核苷dI和DNA鏈中一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵上的氧被硫代修飾的位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸DNA片段，并且核酸內(nèi)切酶V的識(shí)別位點(diǎn)和硫代修飾位點(diǎn)的相隔距離為二個(gè)或二個(gè)以上的堿基，該方法可以用于分析未知DNA即待分析的模板DNA的序列信息。由于重新雜交后的高通量引物是通過(guò)非常成熟的固相DNA方法合成并純化得到，因此該方法沒(méi)有錯(cuò)誤延伸的累積效應(yīng)，能夠維持DNA模板和測(cè)序引物的量，序列的測(cè)定正確可靠，不存在測(cè)序長(zhǎng)度的限制。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101693918SQ20091014518
公開(kāi)日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日
發(fā)明者李燕強(qiáng), 肖鵬峰, 陸祖宏 申請(qǐng)人:東南大學(xué);