改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶及其工業(yè)生產(chǎn)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種可在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)的編碼改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA、由該DNA編碼的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶、以及利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建所述DNA和廣譜核酸內(nèi)切酶的方法；本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的工業(yè)發(fā)酵方法。利用該工業(yè)發(fā)酵方法，使所述編碼改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA在真核宿主酵母細(xì)胞中表達(dá)，所生產(chǎn)的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶比活性高且產(chǎn)率高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)率低、純化困難的問(wèn)題。此外，本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶不含細(xì)菌內(nèi)毒素，可有利地用于醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。同時(shí)，本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶還可被制備為凍干粉劑型，從而使得產(chǎn)品的運(yùn)輸、保存和工業(yè)化應(yīng)用更為便利。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶及其工業(yè)生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA、由該DNA編碼的廣譜核酸內(nèi)切酶、以 及利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)所述DNA和廣譜核酸內(nèi)切酶進(jìn)行構(gòu)建的方法；本發(fā)明 還涉及生產(chǎn)該廣譜核酸內(nèi)切酶的工業(yè)發(fā)酵方法。具體而言，本發(fā)明涉及編碼改進(jìn)的靈桿菌 核酸酶的DNA、由該DNA編碼的改進(jìn)的靈桿菌核酸酶、以及利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù) 對(duì)所述DNA和靈桿菌核酸酶進(jìn)行構(gòu)建的方法；本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該改進(jìn)的靈桿菌核酸酶的 工業(yè)發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈桿菌核酸酶作為一種廣譜核酸內(nèi)切酶，是一種來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens，又稱(chēng)靈桿菌）的非限制性廣譜核酸內(nèi)切酶，可被靈桿菌分泌至胞外，非特異性 地切割核酸中的磷酸二酯鍵。與其它廣譜核酸內(nèi)切酶類(lèi)似，靈桿菌核酸酶對(duì)核酸堿基序列 無(wú)特異性要求，可在核酸鏈內(nèi)的任意核苷酸間進(jìn)行切割；并且，它可切割任意形式的核酸 (單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀或超螺旋形式的DNA、RNA);此外，它對(duì)核酸的消化效率遠(yuǎn)高于其它 核酸酶，其活性是牛胰DNase I的34倍、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus)核酸酶 的6倍。
[0003] 天然的靈桿菌核酸酶由266個(gè)氨基酸組成，包括21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽及245個(gè)氨 基酸的成熟核酸酶（SEQ ID NO. l，SwisS-Pr〇t:P13717. 2)。由于其出色的切割效率，可將 靈桿菌核酸酶用作降低細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞裂解液粘度的首選酶制劑。在疫苗工業(yè)以 及基于蛋白類(lèi)和多糖類(lèi)產(chǎn)品的制藥工業(yè)中，應(yīng)用靈桿菌核酸酶可使這些產(chǎn)品中的核酸污染 降低到皮克（picogram，pg)量級(jí)。2010年，中國(guó)藥監(jiān)局參考國(guó)外生物疫苗和重組蛋白質(zhì)新 藥的申報(bào)標(biāo)準(zhǔn)，頒布了每劑疫苗的核酸殘留不得超過(guò)l〇pg的新標(biāo)準(zhǔn)。由于其它方法很難實(shí) 現(xiàn)該核酸殘留技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用靈桿菌核酸酶去除具有潛在致癌性的核酸成為必然選擇。因 此，采用靈桿菌核酸酶消化核酸并通過(guò)層析進(jìn)行純化已成為國(guó)內(nèi)外企業(yè)在制備生物疫苗和 重組蛋白質(zhì)新藥等產(chǎn)品的過(guò)程中的通用做法。
[0004] 然而，靈桿菌是一種致病菌，在對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)的過(guò)程中存在較大風(fēng) 險(xiǎn)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外商品化的靈桿菌核酸酶均是利用大腸桿菌作為宿主發(fā)酵生產(chǎn)的。目前 市場(chǎng)上的主導(dǎo)產(chǎn)品為由Merck公司開(kāi)發(fā)的商品名為Benzonase的靈桿菌核酸酶。Benzonase 同樣是以大腸桿菌作為宿主，由其表達(dá)天然序列的靈桿菌核酸酶而獲得。目前該產(chǎn)品已通 過(guò)美國(guó)FDA的使用許可，廣泛用于去除生物制品中的核酸。然而，由于Benzonase對(duì)大腸桿 菌宿主細(xì)胞具有毒性且純化方法復(fù)雜，因此產(chǎn)量低且價(jià)格高。每1百萬(wàn)單位（相當(dāng)于約1 毫克蛋白）國(guó)外產(chǎn)品的售價(jià)高達(dá)3至8萬(wàn)元人民幣（Sigma及Merck)，國(guó)產(chǎn)類(lèi)似產(chǎn)品的售價(jià) 也高于1萬(wàn)元，如此高昂的價(jià)格限制了靈桿菌核酸酶的廣泛應(yīng)用。此外，由于不易將原核表 達(dá)系統(tǒng)自身的細(xì)菌內(nèi)毒素從制得的靈桿菌核酸酶產(chǎn)品中去除，限制了靈桿菌核酸酶在工業(yè) 生產(chǎn)中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺點(diǎn)，發(fā)明人借助基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，在DNA 水平對(duì)編碼天然靈桿菌核酸酶的基因序列（SEQ ID N0. 2,編碼成熟靈桿菌核酸酶的DNA序 列）進(jìn)行優(yōu)化，使得本發(fā)明的改進(jìn)的靈桿菌核酸酶能夠在真核酵母細(xì)胞中高效表達(dá)、正確 折疊，獲得了產(chǎn)率和活性均十分出色的改進(jìn)的靈桿菌核酸酶（在本文中，本發(fā)明的改進(jìn)的 靈桿菌核酸酶也可稱(chēng)為"廣譜核酸內(nèi)切酶"、"Binuclease"或"SMnuclease"）。
[0006] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種可在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶 的DNA，該DNA的序列為在進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)后通過(guò)用酵母的偏好密碼子替換天然靈桿菌核酸 酶基因中的相應(yīng)密碼子而獲得，其特征在于，所述編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA的序列如SEQ ID N0. 3 所示：
[0007]
[0008] 為提高純化效率和收率等，還可進(jìn)一步在所述編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA末端連 接附加序列，所述附加序列包括編碼純化標(biāo)簽的DNA序列和編碼間隔序列的DNA序列，還包 括編碼將廣譜核酸內(nèi)切酶從宿主細(xì)胞中分泌出的分泌信號(hào)肽的DNA序列。
[0009] 在第二方面，本發(fā)明提供了由第一方面所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA在酵母 細(xì)胞中表達(dá)而得到的廣譜核酸內(nèi)切酶，該廣譜核酸內(nèi)切酶的比活性可提高至天然靈桿菌核 酸酶的2. 1倍。
[0010] 在第三方面，本發(fā)明提供了包含第一方面所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA的表 達(dá)載體。
[0011] 在第四方面，本發(fā)明提供了導(dǎo)入第三方面所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0012] 在第五方面，本發(fā)明提供了利用第四方面所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā) 明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的方法。
[0013] 在第六方面，本發(fā)明提供了利用第五方面所述的方法獲得的廣譜核酸內(nèi)切酶制 劑。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶不但在功能上保持了天然靈桿菌核酸酶降解各 種形式的DNA和RNA (單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀或超螺旋形式的DNA和RNA)的能力，而且，成 熟的酶能夠分泌到細(xì)胞外，避免了對(duì)宿主胞內(nèi)核酸的消化，從而大大降低了對(duì)宿主細(xì)胞的 毒性，并由此提高了產(chǎn)量。同時(shí)，由于使用真核生物酵母作為宿主，本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核 酸內(nèi)切酶不具有細(xì)菌內(nèi)毒素，在用于醫(yī)藥產(chǎn)品的中間處理步驟時(shí)更加安全。
[0016] 此外，本發(fā)明的生產(chǎn)方法可用于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵，廉價(jià)高效地獲得本發(fā)明的 改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶，該方法的生產(chǎn)成本可以降到同類(lèi)產(chǎn)品的1% -10%，產(chǎn)量則可以達(dá) 到使用原核細(xì)胞宿主時(shí)的100-500倍；與天然靈桿菌核酸酶的市售產(chǎn)品（Merck)相比，本發(fā) 明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶產(chǎn)品的比活性可提高至2. 1倍。同時(shí)，本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核 酸內(nèi)切酶不僅可被制備為傳統(tǒng)的液體劑型，還可被制備為凍干粉劑型，從而使得產(chǎn)品的運(yùn) 輸、保存和工業(yè)化應(yīng)用更為便利。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下文將詳細(xì)闡述本發(fā)明。
[0018] 編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA及由其得到的廣譜核酸內(nèi)切酶
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明第一方面所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA 可進(jìn)一步在其末端連接有編碼純化標(biāo)簽的DNA序列，所述編碼純化標(biāo)簽的DNA序列包括但 不限于編碼組氨酸（His)標(biāo)簽或谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST)標(biāo)簽的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明 的另一些實(shí)施方式，還可利用編碼間隔序列的DNA序列將所述編碼純化標(biāo)簽的DNA序列連 接至所述編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA。
[0020] 在涉及本發(fā)明第一方面所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA的各種實(shí)施方式中，就 術(shù)語(yǔ)"在其末端連接有"而言，當(dāng)提及"在其3'端連接有"時(shí)，是指在其3'端的終止密碼子 前添加所需序列；當(dāng)提及"在其5'端連接有"時(shí)，是指在其5'端前添加所需序列。
[0021] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA(SEQ ID N0. 3)可 進(jìn)一步在其3'端連接有編碼六聚組氨酸（6XHis)標(biāo)簽的DNA序列，如SEQ ID NO. 4所示：
[0022]
[0023] 由SEQ ID NO. 4所示的DNA序列表達(dá)所得到的廣譜核酸內(nèi)切酶在其C端帶有六聚 組氨酸（6XHis)標(biāo)簽，因而下文也可將其稱(chēng)為Binuclease-6XHis，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0024] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA(SEQ ID NO. 3) 可進(jìn)一步在其5'端連接有編碼六聚組氨酸（6XHis)標(biāo)簽的DNA序列、并利用編碼甘氨 酸-絲氨酸（GS)間隔序列的DNA序列連接所述編碼六聚組氨酸（6XHis)標(biāo)簽的DNA序列 與所述編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA，如SEQ ID N0. 6所示：
[0025]
[0026] 由SEQ ID NO. 6所示的DNA序列表達(dá)所得到的廣譜核酸內(nèi)切酶在其N(xiāo)端帶有六聚 組氨酸（6XHis)標(biāo)簽和間隔序列GS，因而下文也可將其稱(chēng)為6XHis-Binuclease，其氨基酸 序列如SEQ ID N0. 7所示。
[0027] 在上述實(shí)施方式中，通過(guò)使本發(fā)明的編碼改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA在真核宿 主酵母細(xì)胞中表達(dá)，所得到的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶具有提高的比活性，可達(dá)到天然靈桿 菌核酸酶比活性的約2. 1倍；同時(shí)，通過(guò)在本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的末端（C端或 N端）加入六聚組氨酸^XHis)標(biāo)簽，可簡(jiǎn)化蛋白純化過(guò)程，而表達(dá)和純化策略的改進(jìn)能夠 使得產(chǎn)率提高100倍至500倍；另外，間隔序列GS的加入還可使得本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核 酸內(nèi)切酶的廣率進(jìn)一步提尚。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，為了使本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶在表達(dá)過(guò)程 中更好地分泌至胞外，可用宿主細(xì)胞特異的分泌信號(hào)肽序列替換靈桿菌核酸酶的天然信號(hào) 肽序列。本發(fā)明可使用的宿主細(xì)胞特異的分泌信號(hào)肽包括但不限于α因子信號(hào)肽、酸性磷 酸酶（ΡΗ05)信號(hào)肽和鹿糖酶（SUC2)信號(hào)肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的分泌信 號(hào)肽可為釀酒酵母的α因子信號(hào)肽。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)化學(xué)合成的方式獲得本發(fā)明的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的 DNA(帶有或不帶有編碼純化標(biāo)簽的DNA序列及任選的編碼間隔序列的DNA序列）。
[0030] 表達(dá)載體
[0031] 本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體是用于在酵母細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜 核酸內(nèi)切酶的載體。根據(jù)本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方式，可將控制DNA表達(dá)的啟動(dòng)子序列可 操作地連接至本發(fā)明第一方面所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA序列的上游；此外，還可 將終止子序列可操作地連接至本發(fā)明第一方面所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA序列的 下游。
[0032] 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種酵母細(xì)胞表達(dá)載體，包括但不限于pPICZ、 pPICZa、pGAPZ、pGAPZa、pGAPZa A和pPIC9K。從拷貝數(shù)和穩(wěn)定性的角度來(lái)看，優(yōu)選 pPIC9K〇
[0033] 根據(jù)本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方式，可將用于挑選重組子的選擇標(biāo)記基因或用于檢 測(cè)導(dǎo)入基因表達(dá)的報(bào)告基因插入本發(fā)明的表達(dá)載體中。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括但不限于 潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。報(bào)告基因的實(shí)例包括但不限 于β-葡糖醛酸酶（⑶S)基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)基因、熒光素酶（LUC)基因和綠色 熒光蛋白（GFP)基因。
[0034] 轉(zhuǎn)化細(xì)胞及篩選
[0035] 本發(fā)明第四方面所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是導(dǎo)入本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)載體的細(xì)胞， 該細(xì)胞能表達(dá)本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶。該轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是原核細(xì)胞、或可以是真 核細(xì)胞，但從表達(dá)效率和產(chǎn)物活性等多方面考慮，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞。
[0036] 所述真核細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于酵母細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式， 所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述酵母細(xì)胞為畢赤酵母（Pichia)細(xì)胞、假絲酵母 (Candida)細(xì)胞、多型漢遜酵母（Hansenula polymorpha)細(xì)胞、球擬酵母（Torulopsis)細(xì) 胞、裂殖酵母（Schizosaccharomyces)細(xì)胞和克魯維酵母（Kluyveromyces)細(xì)胞。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方式，所述酵母細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞。由于目前 對(duì)畢赤酵母的發(fā)酵條件有著更深入的研究，且畢赤酵母細(xì)胞在發(fā)酵制備中成本最低，能夠 滿足技術(shù)需求和產(chǎn)品市場(chǎng)化的需求，因而畢赤酵母細(xì)胞被認(rèn)為是廣譜核酸內(nèi)切酶生產(chǎn)中最 為優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0038] 可根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的類(lèi)型適當(dāng)選擇將表達(dá)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。這些方法都是 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可通過(guò)以下方法獲得畢赤酵母轉(zhuǎn)化子：采用電擊轉(zhuǎn) 化的方法，將線性化的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中。隨后將菌體懸液涂布于平 板上，該平板含有魚(yú)精DNA并加有0. 01 %的甲基綠，顯示為藍(lán)色。成功導(dǎo)入并表達(dá)廣譜核酸 內(nèi)切酶的畢赤酵母能夠?qū)⒑怂崦阜置诘脚囵B(yǎng)基中并消化其周?chē)腄NA，從而導(dǎo)致藍(lán)色消失 并在培養(yǎng)平板上的菌落周?chē)霈F(xiàn)大小不一的透明圈。透明圈直徑越大，表明該菌落分泌核 酸酶的能力越強(qiáng)，選擇直徑大的透明圈里的菌落作為下一步篩選的目標(biāo)。
[0040] 利用轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)廣譜核酸內(nèi)切酶的方法
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可在實(shí)驗(yàn)室條件下用搖瓶篩選高效表達(dá)本發(fā)明的改 進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的基因工程菌株，過(guò)程如下：
[0042] 挑取酵母單菌落至Yro培養(yǎng)基（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L) 中培養(yǎng)。離心收集菌體。用MM培養(yǎng)基（13.4g/L酵母基礎(chǔ)氮源（YNB)，4X10 4g/L生物素， 0.5% (v/v)甲醇）重懸菌體后振蕩培養(yǎng)，開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)。每約24小時(shí)向誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵 液中補(bǔ)加終濃度為0.5% (v/v)的甲醇。在誘導(dǎo)表達(dá)的不同時(shí)間取樣，測(cè)定發(fā)酵液上清（培 養(yǎng)基上清液）中廣譜核酸內(nèi)切酶的含量，選取表達(dá)量最高的菌株作為工業(yè)化培養(yǎng)的基因工 程菌株。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，在30升發(fā)酵罐水平進(jìn)行工程菌株培養(yǎng)基配方、培養(yǎng) 時(shí)間、溶氧、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑用量?jī)?yōu)化等試驗(yàn)，找到適合工業(yè)生產(chǎn)放大的條件，從而在發(fā) 酵罐中高密度培養(yǎng)篩選出的菌株，高效表達(dá)本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶。隨后，對(duì)高密 度發(fā)酵菌體和發(fā)酵液分離、微濾澄清發(fā)酵液、超濾濃縮發(fā)酵液及發(fā)酵液脫色、以及隨后的精 細(xì)純化技術(shù)進(jìn)行選擇。經(jīng)過(guò)多次正交試驗(yàn)和層析介質(zhì)（金屬螯合層析和陽(yáng)離子交換層析）、 條件的篩選，得到可行純化方案。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶可以制成液體制劑 或凍干粉制劑。在凍干粉制劑的實(shí)施方式中，通過(guò)尋找合適的低溫冷凍保護(hù)劑的組成和凍 干曲線，獲得酶活性合格的成品酶凍干粉制劑。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可將30升發(fā)酵罐得到的技術(shù)方案移植到5噸自動(dòng)發(fā) 酵罐生產(chǎn)線。通過(guò)對(duì)各個(gè)發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行修正，適應(yīng)5噸工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備條件下的高密度發(fā) 酵要求，調(diào)整生產(chǎn)工藝使重組酶產(chǎn)量和酶活高于中試水平。產(chǎn)品下游處理工藝放大至4噸 級(jí)發(fā)酵液處理水平，擴(kuò)大相應(yīng)的微濾、超濾、親和柱層析和離子交換柱層析規(guī)模，制備出純 品液體酶制劑和固體凍干粉酶制劑。
【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖1是市售酵母表達(dá)載體pPIC9K載體的圖譜。
[0047] 圖2示出了插入有本發(fā)明的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA的酵母表達(dá)載體 pPIC9K-SMnuclease質(zhì)粒中編碼6XHis-Binuclease 的DNA序列（SEQ ID N0.6)的測(cè)序結(jié)果， 該編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA在其5'端連接有編碼六聚組氨酸（6XHis)標(biāo)簽的DNA序列、 并利用編碼甘氨酸-絲氨酸（GS)間隔序列的DNA序列連接所述編碼六聚組氨酸（6XHis) 標(biāo)簽的DNA序列與所述編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA。
[0048] 圖3示出了插入有本發(fā)明的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA的酵母表達(dá)載體 pPIC9K-SMnuclease 質(zhì)粒中編碼 Binuclease-6XHis 的 DNA 序列（SEQ ID N0.4)的測(cè)序結(jié) 果，該編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA在其3'端連接有編碼六聚組氨酸^XHis)標(biāo)簽的DNA序 列。
[0049] 圖 4 不出對(duì)表達(dá) 6XHis_Binuclease 的 GS115/pPIC9K_SMnuclease 酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn) 行菌落PCR鑒定、并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。其中，第1泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)， 第2-4泳道分別為#1至#3克隆。
[0050] 圖5示出利用SDS-PAGE對(duì)本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶（6XHis-Binuclease)在搖瓶 條件下的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
[0051] 圖6示出利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)在搖瓶條件下獲得的本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶 (6XHis-Binuclease)消化XDNA的能力進(jìn)行定性檢測(cè)的結(jié)果。
[0052] 圖7示出利用SDS-PAGE對(duì)本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶6XHis-Binuclease(圖7a) 和Binuclease-6XHis (圖7b)在30L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件下的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
[0053] 圖8示出利用SDS-PAGE對(duì)經(jīng)兩步層析純化后的本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶 (6XHi s-Binuc 1 ease)的液體酶制劑和固體酶制劑的純度進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。
[0054] 圖9a和圖9b分別示出利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)經(jīng)兩步層析純化后的本發(fā)明的廣譜 核酸內(nèi)切酶（6XHi S-BinuCleaSe)消化XDNA、質(zhì)粒DNA和RNA的能力進(jìn)行定性檢測(cè)的結(jié)果。
[0055] 實(shí)施例
[0056] 借助于下述實(shí)施例可更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，不 應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0057] 在以下實(shí)施例中，所有基因操作均可根據(jù)Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))的教導(dǎo)進(jìn)行。
[0058] 實(shí)施例中所使用的溶液及培養(yǎng)基成分如下所示。
[0059] 麗液體培養(yǎng)基：
[0060] 酵母基礎(chǔ)氮源13. 4g/L，
[0061] 生物素 0.4mg/L，
[0062] 甲醇 0.5% (v/v)。
[0063] 麗平板用固體培養(yǎng)基：
[0064] 酵母基礎(chǔ)氮源（YNB) 13.4g/L， 屮物素 0.4mg/L， 甲醇 0.5% (v/v)， 瓊脂 15g/L。
[0065] Yro液體培養(yǎng)基：
[0066] 酵母提取物10g/L，
[0067] 蛋白胨 20g/L，
[0068] 葡萄糖 20g/L。
[0069] 配制1L YH)液體培養(yǎng)基時(shí)，首先加入酵母提取物10g、蛋白胨20g，加水定容至900 毫升，115°C滅菌20min?？墒孪扰渲?0X葡萄糖溶液（200g/L)，無(wú)菌過(guò)濾，4°C保存。接種 前無(wú)菌取用100毫升，加入900毫升YP培養(yǎng)基中，得到Y(jié)H)培養(yǎng)基。
[0070] ΡΤΙ^微量元素溶液：
[0071] CuS04-5H,0 6.0g/L? ΚΙ ().08g/L, MnS04-H20 3.0g/L, Na,Mo04-2H.,0 0.2g/L, H?BO? 0.02g/L, CoCl2 0.5g/L, ZnCl2 20.0g/L,
[0072] FeS〇4 7H20 65.0g/L, 生物素 0.2g/L， H2S〇4 5.0mL/L,
[0073] 混勻過(guò)濾除菌，4°C避光保存。
[0074] BSM無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：
[0075] H3P〇4 26.7mL/L； CaS04 0.93g/L； K2S04 18,2g/L； MgS047H>0 14,9g/L； KOH 4.13g/L； 甘油 40.0g/L (31.71mL/L): (NH4)2S〇4 1 Og/L
[0076] 加濃氨水將pH調(diào)節(jié)至4~5,115°C滅菌20min。滅菌后接種前加入4. 35mL/L的 PTMi微量元素溶液，接種前用氨水將pH調(diào)節(jié)至5. 0。
[0077] 甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基：50%的甘油115°C滅菌20min后，加入4. 35mL/L的PTMi微量元 素溶液。
[0078] 甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)基：100%的甲醇，加入4. 35mL/L的量元素溶液后，過(guò)濾除 菌。
[0079] 實(shí)施例1 :廣譜核酸內(nèi)切酶表達(dá)載體pPIC9K-SMnuclease質(zhì)粒的構(gòu)建
[0080] 通過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)，將天然（野生型）靈桿菌核酸酶的DNA編碼序列（SEQ ID N0. 2) 替換為由畢赤酵母的偏好密碼子組成的DNA序列（SEQ ID NO. 3)。同時(shí)，進(jìn)一步在其Υ端 的終止密碼子TAA前添加編碼六聚組氨酸標(biāo)簽的DNA序列（SEQ ID N0. 4);或者，進(jìn)一步在 其5'端添加編碼六聚組氨酸標(biāo)簽的DNA序列、并在兩者間加入編碼甘氨酸-絲氨酸（GS) 間隔序列的DNA序列（SEQ ID N0. 6)。隨后，在上述帶有六聚組氨酸標(biāo)簽編碼序列和任選的 間隔序列編碼序列的廣譜核酸內(nèi)切酶（SMnuclease)編碼序列SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 6 的Y端添加 EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC，并在其Υ端的終止密碼子TAA后添加 Not I酶切 位點(diǎn)GCGGCCGC，用化學(xué)方法合成這些DNA序列。
[0081] 將合成的DNA序列用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，并連接至同樣 進(jìn)行雙酶切的PUC57載體的EcoR I和Not I位點(diǎn)之間，得到攜帶SMnuclease編碼序列的 pUC57-SMnuclease質(zhì)粒，擴(kuò)增該質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，將 pUC57_SMnuclease中的SMnuclease編碼序列切下，連接至同樣進(jìn)行雙酶切的pPIC9K載體 (美國(guó)Invitrogen公司）。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，擴(kuò)增質(zhì)粒，并用 EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切鑒定。
[0082] 通過(guò)上述步驟，將編碼本發(fā)明的改進(jìn)的廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA片段（帶有編碼 六聚組氨酸標(biāo)簽的DNA序列和任選的編碼間隔序列的DNA序列）克隆至酵母表達(dá)載體 PPIC9K(如圖1所示）中，從而得到廣譜核酸內(nèi)切酶表達(dá)載體pPIC9K-SMnuclease質(zhì)粒。
[0083] 測(cè)序結(jié)果表明，在其V端連接有編碼6XHis純化標(biāo)簽和間隔序列GS的DNA 序列（圖2)以及在其:T端連接有編碼6XHis純化標(biāo)簽的DNA序列（圖3)的編碼廣 譜核酸內(nèi)切酶的DNA片段均已分別被正確插入pPIC9K載體中，從而獲得了分別攜帶 有編碼6XHis-Binuclease的DNA片段和編碼Binuclease-6XHis的DNA片段的重組 pPIC9K_SMnuclease 質(zhì)粒。
[0084] 實(shí)施例2 :轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115/pPIC9K-SMnuclease的獲得
[0085] 本實(shí)施例中所述的轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115/pPIC9K_SMnuclease為導(dǎo)入實(shí)施例1中所 得到的表達(dá)載體pPIC9K_SMnuclease的畢赤酵母GS 115菌株，所述pPIC9K_SMnuclease攜 帶有編碼6XHis-Binuclease的DNA片段或編碼Binuclease-6XHis的DNA片段。
[0086] 用限制性內(nèi)切酶Sal I對(duì)實(shí)施例1中得到的重組pPIC9K_SMnuclease質(zhì)粒進(jìn)行酶 切，使之線性化，用TE緩沖液（pH 8. 0)將質(zhì)粒濃度調(diào)整為1 μ g/ μ L，取20 μ L質(zhì)粒與畢赤 酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)移至冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯（兩極間隙0.1cm)中，冰浴5min。采 用電轉(zhuǎn)的方法，利用電轉(zhuǎn)儀預(yù)設(shè)的畢赤酵母轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行電穿孔，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢 赤酵母GS 115感受態(tài)細(xì)胞中。
[0087] 電轉(zhuǎn)完畢后，迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入lmL冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液，輕輕混勻，轉(zhuǎn)至 1. 5mL EP管中。將菌體懸浮液涂布于添加有0. 2g/L魚(yú)精DNA和0. 01 %甲基綠的MM平板 上，每塊平板涂布500 μ L菌液。由于該平板含有魚(yú)精DNA并加有0. 01 %的甲基綠，顯示為 藍(lán)色。導(dǎo)入有本發(fā)明的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA序列并正確表達(dá)廣譜核酸內(nèi)切酶的畢赤 酵母轉(zhuǎn)化子能夠?qū)㈧`桿菌核酸酶分泌到培養(yǎng)基中，消化周?chē)鶧NA，從而藍(lán)色將消失、并在培 養(yǎng)平板上的菌落周?chē)霈F(xiàn)大小不一的透明圈，透明圓圈直徑越大，表明該菌落分泌靈桿菌 核酸酶的能力越強(qiáng)。選擇周?chē)该魅Υ蟮木溥M(jìn)行進(jìn)一步篩選。
[0088] 在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入編碼6XHis_Binuclease的DNA片段的轉(zhuǎn)化子和導(dǎo) 入編碼Binucl eaSe-6XHis的DNA片段的轉(zhuǎn)化子周?chē)耐该魅Χ己苊黠@，但是導(dǎo)入 編碼Binuclease-6XHis的DNA片段的轉(zhuǎn)化子所形成的透明圈直徑相比導(dǎo)入編碼 6XHis_Binuclease的DNA片段的轉(zhuǎn)化子而言明顯小許多，提示導(dǎo)入編碼Binuclease_6XHis 的DNA片段的轉(zhuǎn)化子所分泌的酶的活性低于導(dǎo)入編碼6XHis-Binuclease的DNA片段的轉(zhuǎn) 化子。后續(xù)測(cè)量?jī)煞N酶的表達(dá)量和比活也證明了這點(diǎn)。
[0089] 圖4顯示了對(duì)經(jīng)透明圈大小篩選獲得的導(dǎo)入編碼6XHis_Binuclease的DNA片段 的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定的結(jié)果，該結(jié)果表明，目的片段確實(shí)已經(jīng)正確插 入表達(dá)載體中。
[0090] 實(shí)施例3具有N端6XHis標(biāo)簽和間隔序列GS的廣譜核酸內(nèi)切酶 (6XHis_Binuclease)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)和檢測(cè)
[0091] 對(duì)于具有N端6XHis標(biāo)簽和間隔序列GS的廣譜核酸內(nèi)切酶，將實(shí)施例2中通過(guò) 透明圈大小篩選獲得的分泌該廣譜核酸內(nèi)切酶能力最強(qiáng)的GS115/pPIC9K-SMnuclease的 單菌落接種于10mL YH)培養(yǎng)基中，于30°C在250rpm培養(yǎng)24h。1500g離心收集菌體，并用 10mL MM培養(yǎng)基重懸菌體。隨后在1L搖瓶中以1:1000的比例接種畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，于30°C 在250rpm誘導(dǎo)表達(dá)。每天至少一次從培養(yǎng)基中取樣離心，得到不同誘導(dǎo)時(shí)間的含有廣譜核 酸內(nèi)切酶的上清液，保存于_70°C以備檢測(cè)。適時(shí)向誘導(dǎo)液中補(bǔ)加終濃度為0.5% (v/v)的 甲醇，共連續(xù)培養(yǎng)120小時(shí)。
[0092] 利用SDS-PAGE對(duì)培養(yǎng)基上清液中廣譜核酸內(nèi)切酶的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并檢 驗(yàn)上清液中的廣譜核酸內(nèi)切酶消化λ DNA的活性，選出廣譜核酸內(nèi)切酶表達(dá)水平最高的 GS115/pPIC9K-SMnuclease 轉(zhuǎn)化子。
[0093] 1. SDS-PAGE檢測(cè)廣譜核酸內(nèi)切酶的表達(dá)水平
[0094] 依照如下實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)：
[0095] 1. 1 制備 SDS-PAGE 凝膠：
[0096] 1. 1. 1分離膠的制備：
[0097]
[0098] 在小燒杯中依次加入所需溶液成分，灌入預(yù)先裝配好的雙層玻璃板的間隙中，室 溫放置20min以上，直至凝膠聚合完全。
[0099] 1.1. 2濃縮膠的制備：
[0100]
[0101] 在小燒杯中依次加入所需溶液成分，灌入雙層玻璃板間已凝聚的分離膠上方的間 隙，室溫放置20min以上，直至凝膠聚合完全。
[0102] 1. 2將分別得到的GS115/pPIC9K-SMnuclease的培養(yǎng)基上清液由-70°C取出，冰 上融化后以沸水浴處理lOmin。12, 000g離心lmin，吸取上清加入到如上制備的凝膠的加 樣孔道中，上樣量為20yL。同時(shí)加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Unstained Protein Molecular Weight Marker，F(xiàn)ermentas)〇
[0103] L 3 200V 恒壓電泳 L 5h。
[0104] 1. 4卸下凝膠。按下表所示配制染色液和脫色液，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，觀察樣品 中的目的蛋白條帶。
[0105]
[0106] 結(jié)果如圖5所示。對(duì)于表達(dá)具有N端6XHis標(biāo)簽和間隔序列GS的廣譜核酸內(nèi)切酶 的轉(zhuǎn)化子，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的第8小時(shí)即可在發(fā)酵液上清（培養(yǎng)基上清液）中觀察到明顯的 目的蛋白條帶；誘導(dǎo)表達(dá)2天（約53小時(shí)）后表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量逐漸下降；3天后， SDS-PAGE檢測(cè)不到目的蛋白條帶。
[0107] 圖5中，各泳道中的樣品如下：
[0108] 第1道：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；
[0109] 第2道：誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0110] 第3道：誘導(dǎo)表達(dá)21小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0111] 第4道：誘導(dǎo)表達(dá)29小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0112] 第5道：誘導(dǎo)表達(dá)35小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0113] 第6道：誘導(dǎo)表達(dá)53小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0114] 第7道：誘導(dǎo)表達(dá)59小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0115] 第8道：誘導(dǎo)表達(dá)69小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0116] 第9道：誘導(dǎo)表達(dá)77小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0117] 第10道：誘導(dǎo)表達(dá)93小時(shí)的培養(yǎng)基上清液。
[0118] 其中，第1道中的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（Unstained Protein Molecular Weight Marker，F(xiàn)ermentas)的 13 條蛋白條帶分別表示 200kD、150kD、120kD、100kD、85kD、70kD、 60kD、50kD、40kD、30kD、25kD、20kD 及 15kD 的蛋白大小。
[0119] 2.由廣譜核酸內(nèi)切酶消化λ DNA的定性實(shí)驗(yàn)確證其活性
[0120] 用按照本實(shí)施例的方式對(duì)GS115/pPIC9K-SMnuclease轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)所獲 得的培養(yǎng)基上清液消化λ?ΝΑ，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0121] 具體步驟如下：
[0122] 在 10μ1 反應(yīng)體系中，加入2yg DNA、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、lmM MgCl2，lyL搖 瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基上清液。37°C水浴令其反應(yīng)3min。反應(yīng)完畢后立即置于冰上，并加入lyL 0. 5M EDTA。再加入2 yL 5X上樣緩沖液，全部上樣于1%瓊脂糖凝膠，80V電泳30min。
[0123] 如圖6所示，在λ DNA中加入含有本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶的GS115/ pPIC9K-SMnuCleaSe轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵培養(yǎng)基上清液后，觀測(cè)到DNA的有效降解。與圖5中的 SDS-PAGE結(jié)果示出的表達(dá)水平相對(duì)應(yīng)地，在約80小時(shí)的誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)，酶表達(dá)量越高，DNA降 解越徹底；3天后，則觀測(cè)不到明顯的DNA降解。未加入培養(yǎng)基上清液的對(duì)照中DNA未降解。 其中，各泳道中的樣品如下：
[0124] 第1道：加入誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0125] 第2道：加入誘導(dǎo)表達(dá)21小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0126] 第3道：加入誘導(dǎo)表達(dá)29小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0127] 第4道：加入誘導(dǎo)表達(dá)35小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0128] 第5道：加入誘導(dǎo)表達(dá)53小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0129] 第6道：加入誘導(dǎo)表達(dá)59小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0130] 第7道：加入誘導(dǎo)表達(dá)69小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0131] 第8道：加入誘導(dǎo)表達(dá)77小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0132] 第9道：加入誘導(dǎo)表達(dá)93小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0133] 第10道：加入誘導(dǎo)表達(dá)120小時(shí)的培養(yǎng)基上清液的反應(yīng)樣品；
[0134] 第11道：未加入培養(yǎng)基上清液。
[0135] 上述結(jié)果表明，本發(fā)明的具有N端6XHis標(biāo)簽和間隔序列GS的廣譜核酸內(nèi)切酶 (6XHiS-BinuCleaSe)可在酵母細(xì)胞中有效表達(dá)，且獲得的廣譜核酸內(nèi)切酶粗制品具有明顯 的DNA酶活性。
[0136] 通過(guò)本輪篩選獲得的畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-SMnuclease，其廣譜核酸內(nèi)切 酶表達(dá)量超過(guò)500mg/L發(fā)酵液（搖瓶條件）。
[0137] 實(shí)施例4具有C端6XHis標(biāo)簽的廣譜核酸內(nèi)切酶（Binuclease_6XHis)在酵母細(xì) 胞中的表達(dá)和檢測(cè)
[0138] 對(duì)于具有C端6XHis標(biāo)簽的廣譜核酸內(nèi)切酶，采用與實(shí)施例3相同的方法，利 用SDS-PAGE對(duì)培養(yǎng)基上清液中廣譜核酸內(nèi)切酶的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并檢驗(yàn)上清液中 的廣譜核酸內(nèi)切酶消化λ DNA的活性，選出該廣譜核酸內(nèi)切酶表達(dá)水平最高的GS115/ pPIC9K_SMnuclease 轉(zhuǎn)化子。
[0139] 實(shí)施例5廣譜核酸內(nèi)切酶的大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)及檢測(cè)
[0140] 將實(shí)施例3中篩選出的廣譜核酸內(nèi)切酶表達(dá)量最高的GS115/pPIC9K-SMnuclease 菌株用于進(jìn)行中試放大試驗(yàn)。參考美國(guó)Invitrogen公司的畢赤酵母培養(yǎng)方案（www. invitrogen. com)，在30升發(fā)酵罐水平進(jìn)行基因工程菌株最佳培養(yǎng)條件探索，包括培養(yǎng)基 配方、溶氧量、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑甲醇的用量等。本實(shí)施例采用與搖瓶發(fā)酵中相同的培養(yǎng) 基。
[0141] 具體發(fā)酵培養(yǎng)步驟如下：
[0142] 1.種子培養(yǎng)階段
[0143] 將實(shí)施例3篩選得到的高效表達(dá)本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶的GS115/ pPIC9K-SMnuCleaSe菌株接種至加入了種子培養(yǎng)基（YH)液體培養(yǎng)基）的搖瓶中，在30°C于 250rpm振蕩培養(yǎng)20h后，得到種子。
[0144] 2.甘油分批培養(yǎng)階段
[0145] 按5%~10%的比例將上述種子接種至裝有10L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐（已預(yù) 先在115°C滅菌20min)中，將參數(shù)設(shè)定為攪拌轉(zhuǎn)速300rpm、一定通氣量、發(fā)酵溫度30°C、pH 5. 0,開(kāi)始發(fā)酵培養(yǎng)。通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量、罐壓等措施使DO維持在20 %~35 %左 右，當(dāng)D0陡然上升接近100%時(shí)，說(shuō)明培養(yǎng)基中甘油已經(jīng)消耗殆盡，此時(shí)菌體濃度達(dá)到90~ 150g/L。本階段持續(xù)約15~20h。
[0146] 在甘油分批培養(yǎng)階段，每4h取樣一次，測(cè)定酵母菌發(fā)酵液的光密度和菌體濕重。
[0147] 3.甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段
[0148] 甘油分批培養(yǎng)階段實(shí)現(xiàn)菌體擴(kuò)增后，進(jìn)行短時(shí)間的甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段。
[0149] 在發(fā)酵罐中慢速流加甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)通過(guò)提高攪拌速度、通氣量、罐壓等措 施使D0維持在20 %~35 %左右。至菌體濕重增加到180~220g/L時(shí)，停止補(bǔ)加甘油，觀 察D0值上升至100%后，繼續(xù)維持"甘油饑餓"狀態(tài)0. 5h。本階段持續(xù)約5~10h。
[0150] 在甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段，每2h取樣一次，測(cè)定酵母菌發(fā)酵液的光密度和菌體濕 重。
[0151] 4.甲醇補(bǔ)料分批誘導(dǎo)表達(dá)階段
[0152] 甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段實(shí)現(xiàn)菌體擴(kuò)增后，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段。誘導(dǎo)過(guò)程中流 加氨水維持pH恒定，同時(shí)氨水也用作氮源。
[0153] "饑餓"期間調(diào)溫度至28°C，pH維持5.0,先以lmL/h/L維持低速流加甲醇補(bǔ)料培 養(yǎng)基4h，使工程菌適應(yīng)以甲醇作為唯一碳源的環(huán)境，再根據(jù)溶氧的變化提高甲醇流加速度， 并通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量、罐壓等措施使DO值維持在20%~35%左右，此時(shí)菌體濃度 達(dá)到 350 ~450g/L。
[0154] 開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)后，每4h取樣一次，測(cè)定酵母菌發(fā)酵液的光密度0D_和菌體濕重， 并留上清用于蛋白分析。
[0155] 為檢測(cè)蛋白表達(dá)的目的，在30L發(fā)酵罐水平下，用甲醇誘導(dǎo)187小時(shí)，溶氧量控 制在30%，控制發(fā)酵罐中誘導(dǎo)劑甲醇的濃度為1% (v/v)，誘導(dǎo)后每隔約8小時(shí)取樣，通過(guò) SDS-PAGE分析酶蛋白表達(dá)量。
[0156] 圖7a顯示了檢測(cè)30L發(fā)酵罐水平下不同誘導(dǎo)時(shí)間時(shí)培養(yǎng)基上清液中廣譜核酸內(nèi) 切酶（具有N端6XHis標(biāo)簽和間隔序列GS的廣譜核酸內(nèi)切酶6XHi S-BinuCleaSe)含量的 SDS-PAGE 結(jié)果。
[0157] 可以看出，發(fā)酵罐條件下的蛋白表達(dá)量比搖瓶條件下明顯提高，在誘導(dǎo)約94小時(shí) 時(shí)達(dá)到最高峰。
[0158] 圖7a中各泳道的樣品如下：
[0159] 1. Thermo 26614# 蛋白 marker ;
[0160] 2.誘導(dǎo)前的培養(yǎng)基上清液；
[0161] 3.誘導(dǎo)24h的培養(yǎng)基上清液；
[0162] 4.誘導(dǎo)46. 5h的培養(yǎng)基上清液；
[0163] 5.誘導(dǎo)73h的培養(yǎng)基上清液；
[0164] 6.誘導(dǎo)93. 5h的培養(yǎng)基上清液；
[0165] 7.誘導(dǎo)117. 5h的培養(yǎng)基上清液；
[0166] 8.誘導(dǎo)140h的培養(yǎng)基上清液；
[0167] 9.誘導(dǎo)163h的培養(yǎng)基上清液；
[0168] 10.誘導(dǎo)187h的培養(yǎng)基上清液。
[0169] 同樣地，根據(jù)本實(shí)施例中的發(fā)酵培養(yǎng)方法，將實(shí)施例4中篩選出的廣譜核酸內(nèi)切 酶表達(dá)量最高的GS115/pPIC9K-SMnu CleaSe菌株用于進(jìn)行中試放大試驗(yàn)。結(jié)果如圖7b所 示?？梢钥闯?，對(duì)于表達(dá)具有C端6XHis標(biāo)簽的廣譜內(nèi)切酶Binuclease-6XHis的轉(zhuǎn)化子， 在30L發(fā)酵罐的中試水平下，也可有效實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。
[0170] 圖7b中各泳道的樣品如下：
[0171] 第1道：誘導(dǎo)前的培養(yǎng)基上清液；
[0172] 第2道：誘導(dǎo)前的培養(yǎng)基上清液；
[0173] 第3道：誘導(dǎo)24小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0174] 第4道：誘導(dǎo)24小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0175] 第5道：誘導(dǎo)48小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0176] 第6道：誘導(dǎo)48小時(shí)的培養(yǎng)基上清液；
[0177] 第 7 道：蛋白 marker。
[0178] 上述結(jié)果表明，本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶不僅可在搖瓶條件下高效表達(dá)，還可在 發(fā)酵罐水平下高效表達(dá)，具備大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的潛能。
[0179] 實(shí)施例6廣譜核酸內(nèi)切酶的分離和純化
[0180] 1.層析純化過(guò)程
[0181] 由實(shí)施例3-實(shí)施例5可以看出，本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶能夠被成功分泌到培養(yǎng) 基的上清液中。因此，培養(yǎng)完成后經(jīng)過(guò)離心、微濾得到澄清液體，隨后經(jīng)過(guò)兩步層析（金屬 螯合層析和SP陽(yáng)離子交換層析柱層析），便可以從培養(yǎng)基上清液得到純化的酶蛋白。具體 步驟如下：
[0182] 首先進(jìn)行金屬螯合層析，層析過(guò)程參照Qiagen公司產(chǎn)品手冊(cè)進(jìn)行。
[0183] 金屬螯合層析所使用的試劑和材料如下：
[0184]
[0185] 收集洗脫峰，經(jīng)過(guò)透析除鹽后，進(jìn)行第二步SP陽(yáng)離子交換層析柱層析。SP陽(yáng)離子 交換層析柱層析的操作過(guò)程參照GE公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所使用的試劑和材料如下：
[0186]
[0187] 2.液體酶制劑的制備
[0188] 將由上述SP陽(yáng)離子交換層析柱層析過(guò)程收集到的洗脫峰通過(guò)透析除鹽。使用截 留分子量為10KD的透析袋，將其在ImM EDTA溶液中煮沸30min，用ddH20清洗后裝入需要 透析的洗脫組分。所使用的透析液為20mM Tris-HCl，pH7. 5。在4°C環(huán)境中，透析液每8小 時(shí)換液一次，連續(xù)換液三次以上。
[0189] 透析完成后，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度、電泳純度和酶活性，然后過(guò)濾除菌，添加甘油至濃 度 50%，-20°C保存。
[0190] 3.固體酶制劑（凍干粉）的制備
[0191] 在經(jīng)過(guò)透析的液體酶制劑的基礎(chǔ)之上，加入凍干保護(hù)劑20mM Tris-HCl (pH7. 4)、 10 %海藻糖（也可使用山梨醇或甘露糖）和ImM CaCl2，使得廣譜核酸酶的終濃度為 2-10%。-55°C冷凍干燥過(guò)夜。該凍干粉形式的固體酶制劑為現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中首次開(kāi)發(fā)， 可極大促進(jìn)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。
[0192] 利用SDS-PAGE對(duì)純化后的本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶的液體酶制劑和固體酶制劑 (6XHis-Binuclease)的純度進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖8可以看出，在兩步層析純化后， 無(wú)論是液體酶制劑、還是固體酶制劑，SDS-PAGE電泳均呈現(xiàn)單一蛋白條帶。
[0193] 將兩步層析純化制備的酶（6XHis-Binuclease)稀釋2000倍后，取1微克XDNA 加入1微升經(jīng)過(guò)稀釋的酶中，分別在37°C消化2分鐘和5分鐘，然后進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)。觀察底物λ DNA的消化情況，結(jié)果見(jiàn)圖9a。
[0194] 圖9a中各泳道的樣品如下：
[0195] 1.未加酶的反應(yīng)樣品；
[0196] 2.消化2分鐘的反應(yīng)樣品；
[0197] 3.消化5分鐘的反應(yīng)樣品。
[0198] 另外，為檢測(cè)本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶對(duì)其它類(lèi)型核酸的消化作用，將兩步層析 純化制備的酶（6XHis-Binuclease)稀釋2000倍后，取1微克質(zhì)粒DNA和酵母RNA，分別加 入1微升經(jīng)過(guò)稀釋的酶中，在37°C消化30分鐘，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。觀察 底物質(zhì)粒DNA和酵母RNA的消化情況，結(jié)果見(jiàn)圖％。
[0199] 圖9b中各泳道的樣品如下：
[0200] 1.未加酶的質(zhì)粒DNA樣品；
[0201] 2.經(jīng)本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶消化后的質(zhì)粒DNA樣品；
[0202] 3.未加酶的酵母RNA樣品；
[0203] 4.經(jīng)本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶消化后的酵母RNA樣品。
[0204] 可見(jiàn)，根據(jù)本發(fā)明的純化方法獲得的廣譜核酸內(nèi)切酶純度高（圖8)且對(duì)各種類(lèi)型 的核酸樣品均顯示出明顯的核酸酶活性（圖9a_圖9b)。
[0205] 實(shí)施例7廣譜核酸內(nèi)切酶比活性的定量檢測(cè)
[0206] 通過(guò)如下方法檢測(cè)實(shí)施例6中經(jīng)兩步層析純化后的本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶的 液體酶制劑和固體酶制劑的比活性。
[0207] 檢測(cè)所采用的試劑及配制方法如下：
[0208] 溶液A :50mM Tris-HCl+lmM氯化鎂和0. 1% (w/v)牛血清蛋白（pH 8. 0)。根據(jù)終 濃度在去離子水中加入1'1^211^1^86(5181]^，產(chǎn)品編號(hào)1'-1503)、六水合氯化鎂（5181]^，產(chǎn) 品編號(hào)M-0250)、牛血清蛋白（Sigma，產(chǎn)品編號(hào)A-4503)。在37°C用1M HC1調(diào)節(jié)pH到8.0， 定容至100mL。
[0209] 溶液B :0. 1 % (w/v)鮭魚(yú)精DNA鈉鹽。根據(jù)終濃度，用如上配制的溶液A溶解鮭 魚(yú)精DNA鈉鹽（Sigma，產(chǎn)品編號(hào)D-1626)，定容至25mL。
[0210] 溶液C :4% HC104。根據(jù)終濃度用去離子水配制10mL(Sigma，產(chǎn)品編號(hào)24425-2)。
[0211] 溶液D :本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶溶液（約40U/mL)。基于實(shí)施例6中經(jīng)兩步層析 純化后的本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶的液體酶制劑和固體酶制劑，在臨用時(shí)用預(yù)冷的溶液A 配制和稀釋而得。
[0212] 檢測(cè)步驟如下：
[0213] 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管，分別標(biāo)注為測(cè)試管（T)和空白管（B)。分別將2. 50mL溶液B加入 測(cè)試管和空白管中，在37°C放置30min后，在測(cè)試管中加入0. 125mL溶液D，在空白管中加 入0. 125mL溶液A，顛倒混勻，37°C恒溫孵育30min后，從測(cè)試管和空白管中各吸取0. 5mL， 加入含有〇. 5mL溶液C的EP管中，冰上放置60min。隨后12000rpm 4°C離心5min，用分光 光度計(jì)（光程lcm)在260nm分別測(cè)定T和B上清的吸光度A2MnJ和Α 2ΜηηιΒ，用溶液A作為 對(duì)照。
[0214] 廣譜核酸內(nèi)切酶的酶活性計(jì)算公式為：
[0215]
[0216] 式中，分析總體積為2. 625mL，df為稀釋倍數(shù)，分析用上清體積為0. 5mL，所用酶的 體積為〇· 125mL。
[0217] 根據(jù)該檢測(cè)方法，一個(gè)酶活性單位定義為在2. 625mL的反應(yīng)體系中，在37°C、pH 8. 0的條件下，在30min內(nèi)產(chǎn)出的寡核苷酸能夠使260nm處的吸光度值變化1. 0的量。
[0218] 在2. 625mL反應(yīng)體系中，加入了終濃度為50mM的Tris-HCl、ImM的氯化鎂、0. 1 % (w/v)的牛血清蛋白、0. 095 %的鮭魚(yú)精DNA鈉鹽和5U的本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶，所測(cè)得 的酶活性和比活性如表1所示。
[0219] 表1本發(fā)明的廣譜核酸內(nèi)切酶的酶活性和比活性測(cè)定
[0220]
[0221] 可見(jiàn)，由本發(fā)明的具有N端6XHis標(biāo)簽和間隔序列GS的廣譜核酸內(nèi)切酶制得的液 體酶制劑和固體酶制劑的靈桿菌核酸酶比活性均好于商購(gòu)的Benzonase產(chǎn)品；由本發(fā)明的 具有C端6XHis標(biāo)簽的廣譜核酸內(nèi)切酶制得的液體酶制劑的靈桿菌核酸酶比活性也顯示出 可接受的水平。
[0222] 工業(yè)實(shí)用性
[0223] 本發(fā)明利用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的結(jié)合，構(gòu)建出在真核酵母細(xì)胞中高效表 達(dá)且具有高比活性的廣譜核酸內(nèi)切酶。與天然靈桿菌核酸酶分子相比，本發(fā)明的改進(jìn)的廣 譜核酸內(nèi)切酶的比活性可提高至天然靈桿菌核酸酶的約2. 1倍。同時(shí)，由于采用改進(jìn)的 真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和優(yōu)化的工業(yè)培養(yǎng)技術(shù)，宿主細(xì)胞中的酶蛋白表達(dá)水平提高了 100-500 倍，從每升發(fā)酵液表達(dá)幾毫克大幅提升至幾百毫克。進(jìn)而，通過(guò)在下游純化處理過(guò)程中引入 金屬螯合層析技術(shù)，提高了產(chǎn)品回收率，將相應(yīng)生產(chǎn)成本降低至現(xiàn)有工藝的10%以下。此 外，最終產(chǎn)品除了傳統(tǒng)液體劑型，還可制備為凍干粉劑型，應(yīng)用范圍更廣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA，所述編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA的序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 如權(quán)利要求1所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA，其特征在于，所述編碼廣譜核酸 內(nèi)切酶的DNA進(jìn)一步在其3'端連接有編碼六聚組氨酸標(biāo)簽的DNA序列，所得DNA的序列如 SEQ ID NO. 4 所示。3. 如權(quán)利要求1所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA，其特征在于，所述編碼廣譜核酸 內(nèi)切酶的DNA進(jìn)一步在其5'端連接有編碼六聚組氨酸標(biāo)簽的DNA序列、并利用編碼甘氨 酸-絲氨酸間隔序列的DNA序列連接所述編碼六聚組氨酸標(biāo)簽的DNA序列與所述編碼廣譜 核酸內(nèi)切酶的DNA，所得DNA的序列如SEQ ID NO. 6所示。4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA，其特征在于，所述編碼 廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA進(jìn)一步連接有編碼分泌信號(hào)肽的DNA序列； 優(yōu)選地，所述分泌信號(hào)肽為釀酒酵母的α因子信號(hào)肽。5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA在酵母細(xì)胞中表達(dá)而得 到的廣譜核酸內(nèi)切酶。6. 用于表達(dá)如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的DNA的表達(dá)載體， 其特征在于，所述表達(dá)載體包含如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的編碼廣譜核酸內(nèi)切酶的 DNA的序列； 優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自于 pPICZ、pPICZ a、pGAPZ、pGAPZ a、pGAPZ α Α 和 pPIC9K ; 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為PPIC9K。7. 導(dǎo)入如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞為畢赤酵母（Pichia)細(xì)胞、假絲酵母（Candida)細(xì)胞、多 型漢遜酵母（Hansenula polymorpha)細(xì)胞、球擬酵母（Torulopsis)細(xì)胞、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)細(xì)胞和克魯維酵母（Kluyveromyces)細(xì)胞； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞。8. 生產(chǎn)如權(quán)利要求5所述的廣譜核酸內(nèi)切酶的工業(yè)發(fā)酵方法，其特征在于，所述工業(yè) 發(fā)酵方法包括利用如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行種子培養(yǎng)、甘油分批培養(yǎng)、甘油補(bǔ)料 分批培養(yǎng)、甲醇補(bǔ)料分批誘導(dǎo)表達(dá)的步驟；以及對(duì)表達(dá)得到的廣譜核酸內(nèi)切酶進(jìn)行分離純 化的步驟； 優(yōu)選地，所述分離純化的步驟通過(guò)金屬螯合層析繼以SP陽(yáng)離子交換層析柱層析而進(jìn) 行。9. 如權(quán)利要求8所述的工業(yè)發(fā)酵方法獲得的廣譜核酸內(nèi)切酶制劑，其特征在于，所述 廣譜核酸內(nèi)切酶制劑為凍干粉固體酶制劑或液體酶制劑。10. 如權(quán)利要求9所述的廣譜核酸內(nèi)切酶制劑，其特征在于，所述廣譜核酸內(nèi)切酶制劑 為凍干粉固體酶制劑，所述凍干粉固體酶制劑的凍干保護(hù)劑為20mM pH為7. 4的Tris-HCl、 1〇%海藻糖和1禮〇&(：12。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK105985968SQ201510058203
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日
【發(fā)明人】安海謙, 方華明, 魯剛偉, 冉波, 任玉珍, 張貴財(cái)
【申請(qǐng)人】金普諾安生物科技（蘇州）有限公司