專利名稱：粗品肝素鈉精制生產(chǎn)新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種粗品肝素鈉精制生產(chǎn)工藝，特別是一種用生物酶催化裂解除蛋白 與調(diào)酸除蛋白提純，再用低溫離心分離技術(shù)結(jié)合一次氧化處理與超濾分級精制肝素鈉的新 工藝。
背景技術(shù)：
肝素是1916年麥克倫在研究凝血時(shí)，從狗的肝臟中發(fā)現(xiàn)的天然生物活性粘多糖物質(zhì)。十多年后，歐美發(fā)達(dá)國家便從牛肺中發(fā)現(xiàn)和提取，再后來又發(fā)現(xiàn)豬、羊小腸粘膜中含 量極為豐富，并開始進(jìn)行醫(yī)藥臨床研究。1940年肝素正式列入美國藥典，并廣泛應(yīng)用于抗凝 血、防止血栓形成，治療心腦血管疾病等。我國于70年代開始引進(jìn)生產(chǎn)，至今已有近40年 歷史了，目前市場供應(yīng)的主要是從豬小腸粘膜或動(dòng)物肺臟中提取的粗品肝素鈉(肝素和大 多數(shù)粘多糖一樣，在體內(nèi)多以與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物的形式存在)。在提取過程中由于肝 素解離不完全，使得粗品肝素中總存在一定數(shù)量的蛋白質(zhì)，不能直接用于制藥或出口，因此 需要進(jìn)一步純化精制。精制后的肝素鈉作為抗凝血原料藥物普遍受到世界各國醫(yī)藥界的重 視，同時(shí)也是我國出口創(chuàng)匯的主要生化產(chǎn)品之一。肝素的精制過程主要是對粗品肝素鈉進(jìn)行除蛋白提純和脫色，達(dá)到國家藥典標(biāo)準(zhǔn) 要求。在我國肝素的精制多采用高錳酸鉀和過氧化氫兩步氧化法或過氧化氫分次加入的二 次氧化法生產(chǎn)工藝；同時(shí)也有資料報(bào)道，采用酶解結(jié)合氧化法精制肝素的記載。但是上述幾 種工藝都存在不足；第一種高錳酸鉀和過氧化氫兩步氧化法存在二氧化錳吸食肝素，使肝 素活性損失大，回收率低；過濾困難，生產(chǎn)周期長，色澤不好，質(zhì)量差等缺點(diǎn)；第二種過氧化 氫分次加入的二次氧化法工藝，因產(chǎn)品色澤較好，目前被普遍采用。但該工藝主要存在二次 氧化氫處理對肝素結(jié)構(gòu)造成破壞，難以得到較高效價(jià)的精品肝素產(chǎn)品的不足；第三種酶解 結(jié)合氧化法工藝，雖有報(bào)道但未被廣泛采用，同時(shí)存在酶解條件、氧化條件與結(jié)合運(yùn)用生物 制品萃取、分離、純化技術(shù)等工藝設(shè)計(jì)優(yōu)選問題的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)生物制品萃取、分離、純化等技術(shù)原理，自主研發(fā)、優(yōu)選設(shè)計(jì)對粗品肝 素鈉精制的工藝條件及步驟。其目的是提供一種用生物酶催化裂解蛋白與調(diào)酸除蛋白，結(jié) 合一次性氧化處理，同時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)的低溫離心和超濾膜分級、濃縮等手段，對粗品肝素 鈉進(jìn)行精制生產(chǎn)的新工藝。它具有以下特點(diǎn)本發(fā)明根據(jù)生物制品萃取、分離、純化等技術(shù)原理，自主研發(fā)、優(yōu)選設(shè)計(jì)對粗品肝 素鈉精制的工藝條件及步驟。其目的是提供一種用生物酶催化裂解蛋白質(zhì)與調(diào)酸除蛋白 質(zhì)，結(jié)合一次性氧化處理，同時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)的低溫離心和超濾膜分級、濃縮等手段，對粗 品肝素鈉進(jìn)行精制生產(chǎn)的新工藝。它具有以下特點(diǎn)1、自制生物酶粉活性高、用量少、成本低、使用簡便；2、優(yōu)化酶解與調(diào)酸除蛋白條件，裂解溫和完全，肝素活性損失小，產(chǎn)品回收率高；
3、運(yùn)用低溫離心和超濾膜分級、濃縮，生產(chǎn)周期短，分離迅速徹底，產(chǎn)品精確純度 好，效價(jià)高；4、優(yōu)選氧化與干燥條件，(原輔料用量、時(shí)間、溫度等)，產(chǎn)品色澤好、質(zhì)量好；5、肝素與低分子肝素一次性分離為兩種功能與用途不同的產(chǎn)品；6、本工藝穩(wěn)定性好，規(guī)?；a(chǎn)操作性強(qiáng)，勞動(dòng)強(qiáng)度低，原輔料能耗小。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)，其生產(chǎn)工藝包括以下步驟1)生物酶粉的配制；
①生物鈣(氫氧化鈣)溶液的配制將生石灰與水按1 1-8的比例混合攪勻，沉 淀取上清液待用；②將新鮮(冷凍解凍)豬胰臟除去結(jié)締組織、油脂、雜質(zhì)后絞碎成糊狀；③將沉淀的生物鈣溶液與絞碎的豬胰臟糊，按1 1-3的比例混合后，再按混合物 總質(zhì)量的0. 1-0. 3%加入抑菌劑、香料等攪拌均勻；④用30-40%的氫氧化鈉溶液調(diào)PH值8-10，經(jīng)1_5小時(shí)活化后，濃縮、干燥、粉碎 即得可以使用的生物酶粉。2)粗品肝素鈉溶液的配制①將所得的粗品肝素鈉分析測定其含量后分等級存放；②將食用氯化鈉與水按1 1-8的比例混合溶解，配制成氯化鈉溶液待用；③將已知含量的粗品肝素鈉與配制好的氯化鈉溶液，按1 1-10的比例混合溶 解，配制成一定濃度的粗品肝素鈉溶液；④過濾粗品肝素鈉溶液，除去不溶物，收集過濾液移入反應(yīng)罐中待用。3)酶解除蛋白①將收集過濾的粗品肝素鈉溶液用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值7-10，加熱升溫至 30-40°C，并按酶解液總質(zhì)量的0. 01-0. 05%的比例加入事先配制待用的生物酶粉催化裂 解。繼續(xù)加熱升溫至40-60°C時(shí)停止加熱，保溫4-6h ；②將保溫結(jié)束的酶解液過濾，收集過濾液，并移入另一儲(chǔ)罐中迅速冷卻待用；4)調(diào)酸除蛋白①將冷卻后的酶解液用30-40%的鹽酸溶液調(diào)PH值1. 0-3. 0，并加入溶液總質(zhì)量 0. 1-0. 3%的保護(hù)劑攪拌均勻待用；②即刻對調(diào)酸后的料液進(jìn)行快速低溫離心分離除去蛋白，收集清液用于氧化處 理；收集沉淀物用于制備飼料蛋白粉。5) 一次性氧化①將收集的無蛋白清液移入氧化罐中，加入清液總質(zhì)量1-3%的過氧化氫溶液，調(diào) PH值8-10，并進(jìn)行一次性氧化8-12h ； ②氧化過程中料溫應(yīng)控制在20-30°C之間，氧化結(jié)束即刻過濾，收集氧化液。6)高低分子分級濃縮①將收集的氧化液經(jīng)6000-10000分子量的超濾膜進(jìn)行超濾、分級、濃縮，分別收 集超濾液和排放液；②將收集的大分子超濾液進(jìn)行沉淀、脫水、干燥、粉碎，即得精品肝素鈉；③將收集的超濾排放液再用1000-2000分子量超濾膜進(jìn)行超濾、濃縮，收集超濾液，排放水棄去；④將收集的小分子超濾液進(jìn)行沉淀、脫水、干燥、粉碎，即得低分子精品肝素鈉。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例①實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備紫外分光光度計(jì)(上海精科)、離心機(jī)(上海安亭)、攪拌器、反應(yīng)釜、真空干燥箱、 分析天平、電子天平、PH計(jì)、移液槍、試管、燒杯等器具。②材料粗品肝素鈉(申請人自產(chǎn))，肝素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品鑒定所)，羊血漿或 豬血漿(自采收集)，過氧化氫(分析純成都化學(xué)試劑公司)，生物酶粉(申請人自制)，其 它試劑等均為分析純。③效價(jià)測定羊血漿法與光度法。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝包括以下步驟1)生物酶粉的配制；①生物鈣(氫氧化鈣)溶液的配制將生石灰與水按1 1-8的比例混合攪勻，沉 淀取上清液待用；②將新鮮(冷凍解凍)豬胰臟除去結(jié)締組織、油脂、雜質(zhì)后絞碎成糊狀；③將沉淀的生物鈣溶液與絞碎的豬胰臟糊，按1 1-3的比例混合后，再按混合物 總質(zhì)量的0. 1-0. 3%加入抑菌劑、香料等攪拌均勻；④用30-40%的氫氧化鈉溶液調(diào)PH值8-10，經(jīng)1_5小時(shí)活化后，濃縮、干燥、粉碎 即得可以使用的生物酶粉。2)粗品肝素鈉溶液的配制①將所得的粗品肝素鈉分析測定后分等級存放；②將食用氯化鈉與水按1-8%的比例混合溶解，配制成氯化鈉溶液待用；③將申請人自產(chǎn)效價(jià)為91u/mg的粗品肝素鈉5kg，投入塑鋼桶中與配制好的氯化 鈉溶液按照1 1-10的比例混合溶解(自溶為宜，也可以加溫溶解)配制成一定濃度的粗 品肝素鈉溶液；④待溶解完全時(shí)過濾，除去不溶物，收集過濾液投入反應(yīng)罐中待用。3)酶解除蛋白①將投入到反應(yīng)罐中的粗品肝素鈉過濾液用30-40%氫氧化鈉溶液調(diào)PH值7-10，加熱升溫至30-40°C時(shí)，按酶解液總量的0. 01-0. 05%的比例加入事先配制好的生物酶粉， 進(jìn)行催化裂解蛋白質(zhì)。并繼續(xù)加熱升溫至40-60°C時(shí)停止加熱升溫并保溫4-6h ；②對保溫結(jié)束的酶解液過濾，收集過濾液并移入塑鋼桶中迅速冷卻待用；4)調(diào)酸除蛋白①將移入塑鋼桶中冷卻后的酶解液用30-40%的鹽酸溶液調(diào)PH值1. 0-3. 0，并按 料液總質(zhì)量的0. 1-0. 2%加入亞硫酸氫鈉溶液的保護(hù)劑攪勻待用；②即刻對調(diào)酸后的料液快速進(jìn)行低溫離心分離除去蛋白，收集上層清液用于氧化處理；收集沉淀物用于制備飼料蛋白粉。5) 一次性氧化①將收集的無蛋白清液移入氧化罐中，加入清液總質(zhì)量1-3%的過氧化氫溶液，調(diào)PH值8-10攪勻，并加熱升溫至20-30°C之間，進(jìn)行一次性氧化8_12h。6)高低分子分級濃縮①將收集的氧化液用6000-10000分子量的超濾膜進(jìn)行超濾、分級、濃縮，分別收 集超濾液和排放液；②將收集的超濾排放液用1000-2000分子量的超濾膜再次進(jìn)行超濾濃縮，收集超 濾液，排放水棄去；7)沉淀、脫水、干燥①將收集的大分子超濾液用無水乙醇沉淀，收集上清液用于回收乙醇；收集沉淀 物用丙酮脫水后經(jīng)真空干燥，即得精品肝素鈉；②將收集的小分子超濾液用無水乙醇沉淀，收集上清液用于回收乙醇；收集沉淀 物用丙酮脫水后經(jīng)真空干燥，即得精品低分子肝素鈉。8)粉碎、包裝、儲(chǔ)藏①將干燥后的精品和低分子肝素鈉粉碎后，用IOOOg的棕色玻璃瓶密封包裝，并 于涼暗處保存。9)實(shí)例產(chǎn)品經(jīng)分析測定的結(jié)果是①效價(jià)156u/mg②回收率96.5%③色澤白④PH 值6. 5⑤吸光度260nm 0. 151⑥吸光度280nm0. 11⑦粘度Pa. S0. 28⑧干燥失重％4.7⑨熾灼殘?jiān)?31.6 10)


(說明書附圖)
圖1是自制生物酶粉工藝流程圖； 圖2是粗品肝素鈉精制生產(chǎn)工藝流程圖。
權(quán)利要求
一種粗品肝素鈉精制生產(chǎn)新工藝，其特征在于其精制生產(chǎn)工藝包括以下步驟1)生物酶粉的配制；①生物鈣(氫氧化鈣)溶液的配制將生石灰與水按1∶1-8的比例混合攪勻，沉淀取上清液待用；②將新鮮(冷凍解凍)豬胰臟除去結(jié)締組織、油脂、雜質(zhì)后絞碎成糊狀；③將沉淀的生物鈣溶液與絞碎的豬胰臟糊，按1∶1-3的比例混合后，再按混合物總質(zhì)量的0.1-0.3％加入抑菌劑、香料等攪拌均勻；④用30-40％的氫氧化鈉溶液調(diào)PH值8-10，經(jīng)1-5小時(shí)活化、濃縮、干燥、粉碎即得可以使用的生物酶粉。2)粗品肝素鈉溶液的配制①將所得的粗品肝素鈉分析測定其含量后分等級存放；②將食用氯化鈉與水按1∶2-8的比例混合溶解，配制成氯化鈉溶液待用；③將已知含量的粗品肝素鈉與配制好的氯化鈉溶液，按1∶1-10的比例混合溶解，配制成一定濃度的粗品肝素鈉溶液；④過濾粗品肝素鈉溶液，除去不溶物，收集濾液移入反應(yīng)罐中待用。3)酶解除蛋白①將收集配好過濾的粗品肝素鈉溶液用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值7-10，加熱升溫至30-40℃，并按酶解液總質(zhì)量的0.01-0.05％的比例加入事先配制待用的生物酶粉催化裂解。加熱升溫至40-60℃時(shí)停止加熱，保溫4-6h；②將保溫結(jié)束的酶解液過濾，收集過濾液，并移入另一儲(chǔ)罐中迅速冷卻待用；4)調(diào)酸除蛋白①將冷卻后的酶解液用30-40％的鹽酸溶液調(diào)PH值1.0-3.0，并加入溶液總質(zhì)量0.1-0.3％的保護(hù)劑攪拌均勻待用；②即刻對調(diào)酸后的料液進(jìn)行快速低溫離心分離除去蛋白，收集清液用于氧化處理；收集沉淀物用于制備飼料蛋白粉。5)一次性氧化①將收集的無蛋白清液移入氧化罐中，加入清液總質(zhì)量1-3％的過氧化氫溶液，調(diào)PH值8-10，并進(jìn)行一次性氧化8-12h；②氧化過程中料溫應(yīng)控制在20-30℃之間，氧化結(jié)束即刻過濾，收集氧化液。6)高低分子分級濃縮①將收集的氧化液經(jīng)6000-10000分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，分別收集超濾液和排放液；②將收集的大分子超濾液進(jìn)行沉淀、脫水、干燥、粉碎，即得精品肝素鈉；③將收集的超濾排放液再用1000-2000分子量超濾膜進(jìn)行超濾，收集超濾液，排放水棄去；④將收集的小分子超濾液進(jìn)行沉淀、脫水、干燥、粉碎，即得低分子精品肝素鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗品肝素鈉精制生產(chǎn)新工藝，其特在于1)所述生物酶粉是申請人自主研發(fā)的高活力胰蛋白水酶粉。2)所述抑菌劑是苯酚或高錳酸鉀或三氯鉀烷。3)所述保護(hù)劑是亞硫酸氫鈉。4)所述低溫離心分離技術(shù)是4-8°C低溫下進(jìn)行離心分離。 3.工藝流程如圖1和圖2所示。
全文摘要
本發(fā)明為一種粗品肝素鈉精制生產(chǎn)新工藝。首先制作生物酶粉——豬胰蛋白水解酶粉，然后將自產(chǎn)已知含量的粗品肝素鈉與氯化鈉溶液配制成一定比例的粗品肝素鈉溶液。通過催化裂解、調(diào)酸、氧化除蛋白，再通過低溫離心分離、超濾分級、濃縮、沉淀、脫水、干燥等步驟和生物技術(shù)手段，即得肝素鈉精品。本發(fā)明具有生產(chǎn)周期短、原輔料能耗低；產(chǎn)品回收率高、純度好；效價(jià)高、質(zhì)量好的特點(diǎn)。產(chǎn)品回收率效價(jià)在150-160u/mg時(shí)，可達(dá)到96％以上，其它指標(biāo)均可達(dá)到國家藥典標(biāo)準(zhǔn)要求。
文檔編號C08B37/10GK101831008SQ200910058568
公開日2010年9月15日 申請日期2009年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者秦平 申請人:四川茂森生物科技有限公司