一種制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001](一)
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法。
[0002](二)
【背景技術(shù)】
發(fā)菜是生長(zhǎng)在我國(guó)西北部和北部干旱地區(qū)的一種陸生性經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻，具有很高的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。由于其生長(zhǎng)環(huán)境惡劣，常年接受高強(qiáng)度紫外輻射和當(dāng)?shù)佧}堿性土壤的高堿高鹽環(huán)境脅迫，發(fā)菜細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完整的抵抗不良環(huán)境保護(hù)機(jī)制。生長(zhǎng)過(guò)程中形成紫外吸收物質(zhì)類(lèi)菌胞素氨基酸就是發(fā)菜細(xì)胞抵制紫外損傷的有效途徑。
[0003]類(lèi)菌胞素氨基酸(MAAs)是一類(lèi)無(wú)色的，水溶性的低分子量物質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看，MAAs是一類(lèi)環(huán)己烯酮或以環(huán)己烯酮為骨架與氨基酸、氨基醇等含氮物質(zhì)共價(jià)結(jié)合形成的一類(lèi)化合物，平均分子量300Da左右，能夠吸收310-360nm波長(zhǎng)的紫外輻射，有些研宄表明含有高濃度MAAs的細(xì)胞比不含或含量很少的細(xì)胞在抵抗紫外輻射的能力上高大約25%。在N.corniun沖，MAAs在光保護(hù)中有重要作用，因?yàn)樗挥诩?xì)胞外的多糖層，與低聚糖共價(jià)連接，而多數(shù)藍(lán)細(xì)菌的MAAs是位于胞內(nèi)的。除了作為遮光劑，MAAs還起到抗氧化的作用，MAAs的前體是一種比抗壞血酸更強(qiáng)的抗氧化劑。
[0004]我們?cè)谘绣持邪l(fā)現(xiàn)發(fā)菜細(xì)胞中MAAs含量與環(huán)境因素相關(guān)，從發(fā)菜細(xì)胞中提取MAAs具有很好的抗氧化活性。
[0005](三)

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高、產(chǎn)品含量高的制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法，以發(fā)菜單體細(xì)胞為初始培養(yǎng)細(xì)胞菌株，包括如下步驟:
(1)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的光合自養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞置于90mm培養(yǎng)皿中，垂直放置在紫外燈管下，通過(guò)調(diào)節(jié)燈管和培養(yǎng)皿的距離控制紫外輻射強(qiáng)度在l-6W/m2，處理時(shí)間為24-48h，紫外輻射處理后細(xì)胞作為種子液備用；
(2)將步驟(I)中得到的種子液重新接種到含有NaCl的BG-1l培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2d，離心收集細(xì)胞，作為種子液備用；
(3)將步驟(2)中獲得的種子液接種到含有碳源的BG-1l培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15-20天，發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行混合營(yíng)養(yǎng)高密度生長(zhǎng)，收獲發(fā)菜細(xì)胞；
(4)將步驟(3)收獲的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液離心，收集發(fā)菜細(xì)胞，用微波方法破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保溫提取2h，離心，收集上清液，在0-4°C條件下放置24h，然后用濾紙過(guò)濾，收集濾液，濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)溫度為40-50°C，濃縮后加入水和氯仿混合物，去除色素，離心收集水相，真空冷凍干燥后制得粗品。
[0007]本發(fā)明的更優(yōu)技術(shù)方案為:
步驟(2)中，BG-1l培養(yǎng)基中NaCl的質(zhì)量濃度為50-100 mmol/L。
[0008]步驟(4)中，微波破碎細(xì)胞時(shí)，微波功率為300-500W，處理時(shí)間為90s每次，反復(fù)進(jìn)行4次，加入細(xì)胞破碎液的甲醇溶液與培養(yǎng)液的體積比為1:1-1.5 ;水浴保溫溫度為40-500C ;水和氯仿的質(zhì)量比為2-3:7-8。
[0009]采用本發(fā)明的工藝技術(shù)，發(fā)菜細(xì)胞中類(lèi)菌胞素氨基酸含量得到顯著提高，達(dá)到
80-100mg/go
[0010]本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)獲得的發(fā)菜細(xì)胞中類(lèi)菌胞素氨基酸，經(jīng)分離純化后可以用作抗氧化和防紫外輻射的化妝品原料或者抗氧化藥物原料。
[0011](四)
【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例1:一種制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法以發(fā)菜單體細(xì)胞為初始培養(yǎng)細(xì)胞菌株，包括如下步驟:
(1)發(fā)菜單體細(xì)胞的紫外輻射處理:將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的光合自養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞置于90mm培養(yǎng)皿中，垂直放置在紫外燈管下，通過(guò)調(diào)節(jié)燈管和培養(yǎng)皿的距離控制紫外輻射強(qiáng)度在IW/m2，處理時(shí)間為24-48h，紫外輻射處理后細(xì)胞作為種子液備用；
(2)發(fā)菜單體細(xì)胞的低鹽脅迫處理:將步驟(I)中得到的種子液重新接種到含有NaCl(質(zhì)量濃度為50 mmol/L)的BG-1l培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2d，離心收集細(xì)胞，作為種子液備用；
(3 )將步驟(2 )中獲得的種子液接種到含有碳源的BG-1I培養(yǎng)基中，三角瓶光照培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)15天，培養(yǎng)基初始pH控制為9.0，培養(yǎng)基溫度室溫，轉(zhuǎn)速100-200r/min，發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行混合營(yíng)養(yǎng)高密度生長(zhǎng)，收獲發(fā)菜細(xì)胞；
(4)將步驟(3)收獲的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液離心，收集發(fā)菜細(xì)胞，用微波方法破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保溫提取2h，離心，收集上清液，在0-4°C條件下放置24h，然后用濾紙過(guò)濾，收集濾液，濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)溫度為40-50°C，濃縮后加入水和氯仿混合物，去除色素，離心收集水相，真空冷凍干燥后制得粗品，產(chǎn)量為89.07mg/L。
[0012]實(shí)施例2:—種制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法以發(fā)菜單體細(xì)胞為初始培養(yǎng)細(xì)胞菌株，包括如下步驟:
(1)發(fā)菜單體細(xì)胞的紫外輻射處理:將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的光合自養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞置于90mm培養(yǎng)皿中，垂直放置在紫外燈管下，通過(guò)調(diào)節(jié)燈管和培養(yǎng)皿的距離控制紫外輻射強(qiáng)度在5W/m2，處理時(shí)間為48h，紫外輻射處理后細(xì)胞作為種子液備用；
(2)發(fā)菜單體細(xì)胞的低鹽脅迫處理:將步驟(I)中得到的種子液重新接種到含有NaCl(質(zhì)量濃度為100 mmol/L)的BG-1l培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2d，離心收集細(xì)胞，作為種子液備用；
(3)將步驟(2)中獲得的種子液接種到含有碳源的BG-1l培養(yǎng)基中，20L光照反應(yīng)器中培養(yǎng)15天，培養(yǎng)基初始pH控制為9.0，培養(yǎng)基溫度控制25-30°C，轉(zhuǎn)速200-300r/min，發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行混合營(yíng)養(yǎng)高密度生長(zhǎng)，收獲發(fā)菜細(xì)胞；
(4)將步驟(3)收獲的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液離心，收集發(fā)菜細(xì)胞，用微波方法破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保溫提取2h，離心，收集上清液，在0-4°C條件下放置24h，然后用濾紙過(guò)濾，收集濾液，濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)溫度為40-50°C，濃縮后加入水和氯仿混合物，去除色素，離心收集水相，真空冷凍干燥后制得粗品，產(chǎn)量為100.13mg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法，以發(fā)菜單體細(xì)胞為初始培養(yǎng)細(xì)胞菌株，其特征為，包括如下步驟:(I)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的光合自養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞置于90_培養(yǎng)皿中，垂直放置在紫外燈管下，通過(guò)調(diào)節(jié)燈管和培養(yǎng)皿的距離控制紫外輻射強(qiáng)度在l-6W/m2，處理時(shí)間為24-48h，紫外輻射處理后細(xì)胞作為種子液備用；(2)將步驟(I)中得到的種子液重新接種到含有NaCl的BG-1l培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2d，離心收集細(xì)胞，作為種子液備用；(3)將步驟(2)中獲得的種子液接種到含有碳源的BG-1l培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15-20天，發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行混合營(yíng)養(yǎng)高密度生長(zhǎng)，收獲發(fā)菜細(xì)胞；(4)將步驟(3)收獲的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液離心，收集發(fā)菜細(xì)胞，用微波方法破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎液加入甲醇溶液，水浴保溫提取2h，離心，收集上清液，在0-4°C條件下放置24h，然后用濾紙過(guò)濾，收集濾液，濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)溫度為40-50°C，濃縮后加入水和氯仿混合物，去除色素，離心收集水相，真空冷凍干燥后制得粗品O2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于:步驟(2)中，BG-1l培養(yǎng)基中NaCl的質(zhì)量濃度為50-100 mmol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于:步驟(4)中，微波破碎細(xì)胞時(shí)，微波功率為300-500W，處理時(shí)間為90s每次，反復(fù)進(jìn)行4次，加入細(xì)胞破碎液的甲醇溶液與培養(yǎng)液的體積比為1:1-1.5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于:步驟(4)中，水浴保溫溫度為40-50°C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法，其特征在于:步驟(4)中，水和氯仿的質(zhì)量比為2-3:7-8。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，特別公開(kāi)了一種制備發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)類(lèi)菌胞素氨基酸粗品的方法。該方法通過(guò)對(duì)發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行紫外輻射處理，低鹽脅迫處理，處理后發(fā)菜細(xì)胞重新在BG-11培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天，發(fā)菜細(xì)胞內(nèi)MAA含量顯著提高，最后再對(duì)MAAs粗品進(jìn)行提取。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)獲得的發(fā)菜細(xì)胞中類(lèi)菌胞素氨基酸，經(jīng)分離純化后可以用作抗氧化和防紫外輻射的化妝品原料或者抗氧化藥物原料。
【IPC分類(lèi)】A61P39/06, A61Q17/04, A61Q19/08, A61P17/18, A61K36/02, A61K8/99
【公開(kāi)號(hào)】CN104887615
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510328120
【發(fā)明人】于海峰, 劉俊艷, 劉榮, 逄圣慧
【申請(qǐng)人】齊魯工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年6月15日