專利名稱：一種固定化豬胰脂肪酶載體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于固定化酶載體的制備技術領域，特別涉及一種固定化豬胰脂肪 酶載體及其制備方法。
背景技術：
酶是生物催化劑，具有專一性強、催化效率高和作用條件溫和等顯著特點。 因而其應用很廣泛，可用在輕工、食品、伺料、醫(yī)藥、化工、環(huán)保與能源、分 析檢測等多個領域。但是由于自由酶存在與產(chǎn)物難分離且易失活的缺點，人們 嘗試了通過各種方法對酶分子進行修飾，其中方法之一就是固定化酶的研究， 從而改變酶的某些特性和功能，使其克服自由酶的缺點。固定化酶的研究始于
上世紀50年代，經(jīng)過50多年的研究和發(fā)展，在酶的固定化方面，先后開發(fā)了 性能多樣的載體材料和固定化方法，然而真正投入工業(yè)化應用的固定化酶卻不 多，其原因是酶固定化使用的試劑和載體成本高、固定化效率低、穩(wěn)定性差等。 在我國大力倡導建立資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會的今天，進一步開發(fā)性能更 加優(yōu)異而價廉的載體材料，使酶的固定化更簡便、更實用，讓更多的固定化酶 獲得工業(yè)規(guī)模的應用，仍是現(xiàn)今追求的目標。
在酶固定化載體材料方面，主要包括無機載體材料、有機載體材料和高 分子載體材料等，其中高分子載體材料是較為重要的載體材料。高分子載體材 料又分為天然高分子載體材料和合成高分子載體材料。合成高分子載體材料是 目前研究最為活躍的固定化酶載體材料，也是目前應用和報道得最多的一類固 定化酶載體材料，主要是由合成高分子載體材料的化學穩(wěn)定性高、機械性能好、 與酶的固定化擔載量大決定的。
酶的固定化方法主要包括包埋法、交聯(lián)法和載體結合法三種；其中的載體 結合法又包括離子結合法、物理吸附法和共價結合法。對于合成高分子載體材 料與酶的固定化，主要是共價結合法。共價結合法是酶蛋白分子上的官能團和固相支持物表面上的活潑基團之間形成化學共價鍵連接(酶蛋白的非必需基團 通過共價鍵和載體形成不可逆的連接)，從而固定酶的方法。由于酶與載體間 連接牢固，不易發(fā)生酶脫落，有良好的穩(wěn)定性和重復使用性，是目前研究最為 活躍的一類酶固定化方法。
對酶的共價結合法研究而言，載體固定化酶時要求載體中含有能與酶分子 中的某一基團(如氨基、羧基、巰基、羥基、酚基、咪唑基等的其中一種基團) 反應的活潑基團，而活潑基團與酶分子反應后又不破壞酶分子的活性中心。這 些活潑基團通常包括重氮基團、迭氮基團、亞氨碳酸基團、二氯-均三嗪基團、 環(huán)氧基團等。
目前，在合成高分子載體材料方面，國外最具代表性的包括Kotha等以 環(huán)己醇為致孔劑、二乙烯苯為交聯(lián)劑制得GM-三丙烯酸三甲醇基丙烷酯共聚物，
Ponmthnam等研究大孔交聯(lián)甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)共聚物載體的制備， 德國的ROM公司生產(chǎn)EupergitC等含環(huán)氧基團的固定化酶載體等。而在國內， 從事這方面研究的主要包括華東理工大學的盧冠忠及其弟子烏云高娃、薛屏 等人合成含環(huán)氧基團的固定化酶載體，烏云高娃等選用反應性單體甲基丙烯酸 縮水甘油酯(GMA)、以N，N'-亞甲基雙(丙烯酰胺)(MBAA)為交聯(lián)劑、甲酰胺 為致孔劑，用反相懸浮聚合方法制得一系列珠狀共聚物載體；薛屏等選用含有 活性環(huán)氧基團的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和親水性的N-乙烯吡咯烷酮(NVP) 兩種單體，以N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、甲醇水溶液作致孔劑、 液體石蠟為主介質，通過反相懸浮聚合技術成功地合成了親水性大孔GMA-NVP -MBAA三元共聚物載體(G麗)，另設計反相懸浮聚合體系，制備了聚甲基丙烯酸 縮水甘油酯(GMA)-甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA) -N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 親水性磁性聚合物GHM微球，并且還制備了含鈷MCM-48和MCM-41等的介孔分 子篩用作酶固定化的載體；南開大學的黃家賢等人合成含環(huán)碳酸酯基團的固定 化酶載體，此合成載體是以乙烯撐碳酸酯(VCA)為反應性單體、親水性N，N '-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑，分別選用N-乙烯基吡咯垸酮(NVP) 和丙烯酸-0-羥乙酯(HEMA)兩種親水性共單體為合成酶載體的成分，首次以二甲基甲酰胺和線型高分子聚乙二醇400為復合致孔劑，同時還通過反相懸浮
聚合，以液體石蠟為介質、VCA為反應性單體、甲基丙烯酸-3-羥乙酯(HE^0 及丙烯酸羥丙酯(HPA)為親水性共聚單體，合成出一系列交聯(lián)樹脂聚合物作為 固定化酶載體；河北大學李源勛等以丙烯酸反應性單體和二乙烯基苯為交聯(lián) 劑、石油醚為致孔劑，通過懸浮聚合制備固定化酶的載體；除此以外，還有其 他研究者對于固定化酶載體都作了不同層面的研究。
從以上這些合成高分子載體材料來看，其中的活潑基團主要是環(huán)氧基團， 環(huán)碳酸酯基團等活潑基團。
脂肪酶(lipase, E.C.3.1.1.3)也可定義為羧酸酯酶，它催化長鏈脂酰 甘油水解為甘油、游離脂肪酸和單、雙甘油酯。可用于酶所能應用的各個領域， 如用于食品加工和品質改良，作面包改進劑，用于奶酪增香等；在紡織加工中 用于脫脂處理，作為洗滌劑的添加劑可以達到更好的去污目的；更重要的還可 用于生產(chǎn)生物柴油，生物柴油是生物質能的一種形式，具有綠色、可再生、能 耗低等優(yōu)點，與普通柴油相比，具有環(huán)境友好的特點，其柴油車尾氣中有毒有 機物排放量僅為10%，顆粒物為20%， C02和C0排放量僅為10%，據(jù)分析，對整 個大氣的影響，生物柴油排放的C02要比礦物柴油少約50%，可見，將固定化 脂肪酶用于生產(chǎn)生物柴油將是一項很有前途的事業(yè)，能夠緩解石油即將枯竭和 環(huán)境污染對人類造成的危機。
關于脂肪酶的固定化和應用等的研究報道，主要包括國外有印度喜馬偕 爾邦大學的.Kanwar合成丙烯酸類載體固定化脂肪酶研究，馬來西亞博特拉大 學的Yimas用聚(甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸甲酯，二乙烯基苯)微球固定化 脂肪酶，MahiranBasri用疏水有機載體固定脂肪酶，日本京都大學的Toshio Hayashi將脂肪酶固定到多孔聚乙烯醇珠、聚丙烯醛珠上進行研究；國內有中
國科學院蘭州化學物理研究所的辛嘉英等，中國科學院微生物研究所的寇秀 芬，南開大學的徐慧顯用丙烯酸類載體固定化脂肪酶，江蘇石油化工學院的盛
梅，北京化工大學譚天偉及其弟子彭立鳳等對脂肪酶的固定化及其應用研究。
豬胰脂肪酶作為脂肪酶中的一種，從結構上也同樣具有脂肪酶的結構特
6點， 一是都包括同源區(qū)段:His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W- Gly (X、 Y、 W、 Z是可變的氨基酸殘基)；二是活性中心為絲氨酸殘基，正常情況 下受一個a-螺旋蓋保護。從性質上同時具有酶的優(yōu)缺點，也有很多具體的應用， 如可以催化以己二酸二乙烯酯與1， 4-丁二醇為代表的非手性羧酸衍生物聚合 反應，也可以催化手性羧酸衍生物的聚合，Dafha.Knani等以豬胰脂肪酶(PPL) 作催化劑，進行光活性側取代羥基酯的聚合，結果得到具有光學活性的低聚體。 目前，對于合成高分子載體對豬胰脂肪酶的固定化及應用方面的研究還并 不多，巴西圣保羅大學的Arieva V Paula將豬胰脂肪酶固定于聚硅氧烷-乙烯 醇上制備生物柴油，武漢大學的賀楓、南開大學的謝志東等對豬胰脂肪酶的固 定化也進行過研究。
但到目前為止，還未有可實現(xiàn)商品化的固定化豬胰脂肪酶上市。主要原因 正如前面所談到的，由于制備方法復雜、反應條件苛刻、成本高等缺點，致使 其難以達到工業(yè)化的要求，制得的產(chǎn)品酶固定化的效率低，且固定化酶活性保 持的穩(wěn)定性差。
本發(fā)明的目的是提供一種新的固定化豬胰脂肪酶載體，其固定化豬胰脂肪 酶的效率高，且固定化酶活性保持的穩(wěn)定性好。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法， 可克服現(xiàn)有技術中存在的載體制備復雜、反應條件苛刻、成本高、難工業(yè)化等 缺點。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是
一種固定化豬胰脂肪酶載體，它是一種含琥珀酰亞胺酯基基團的大孔珠狀 交聯(lián)聚合物，具有下述通式I所表示的結構

發(fā)明內容
通式I其中，[B是以丙烯酸(AA)為反應性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 為交聯(lián)劑形成的高聚物中除羧基以外的部分。
上述固定化豬胰脂肪酶載體，可通過下述方法制備以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復合分散劑、煤油為分散相、丙烯酸(AA)為反應性 單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙二醇為致孔劑，采用反 相懸聚合技術制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活 化，即制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。
Span40禾口 Span80的HLB值(Hydrophily and Lipophilyty Balance,親
水親油平衡值)分別為6.7和4.3，在本發(fā)明上述固定化豬胰脂肪酶載體的制 備方法中作為復合分散劑時，將二者混合后的HLB值調節(jié)至4.5 6即可，以 此控制Span40和Span80 二者的用量比例；復合分散劑的總用量可按分散相煤 油質量的10% 30%計算。
交聯(lián)劑N， N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)的質量可優(yōu)選為單體丙烯酸(AA) 質量的40% 60%;
致孔劑乙二醇的用量可為單體丙烯酸(AA)質量的70% 100%;
此外，本發(fā)明上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法中，還可加入過硫酸 銨(AP)作為自由基反應的催化劑，催化劑AP的加入量可為單體丙烯酸(AA) 質量的1.5% 4%;同時還可加入四甲基乙二胺(TMEDA)作為加速AP產(chǎn)生自由 基的加速劑(由于TMEDA本身容易產(chǎn)生自由基從而加速AP產(chǎn)生自由基發(fā)生反 應，所以TMEDA的加入量與實際的反應有關，只要能使反應發(fā)生便可，結合成 本等進行考慮，可按催化劑AP質量的7 10倍計算)。
上述制備方法可優(yōu)選包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
將Span40和Span80組成的復合分散劑溶解于有機分散相煤油中，混勻； 再加入四甲基乙二胺(TMEDA)，混勻，構成油相；
(2) 、制備水相-
將丙烯酸(AA)、 N，N、-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于水中(按體積比計算，水的用量可為丙烯酸體積的1 4倍)，加入過硫酸銨(AP)，混 勻，構成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
以0.5 2d/s的速度將(2)步制得的水相滴加(可用滴液漏斗或其它方 式滴加，以保證滴加進入油相的水相液滴大小基本相似)于(1)步制得的油 相中進行分散(其中油相與水相的體積比控制在^4即可，從節(jié)約成本考慮， 可以4:1 10:1為佳)，控制攪拌速度為100 350r/min;在氮氣保護下10 3CTC的室溫進行反應，反應時間1 2小時；
反應結束后，回收上層溶液(可通過傾倒上層液體等方式回收)，向反應 產(chǎn)物中加入體積濃度》65%的乙醇(其用量以浸沒產(chǎn)物即可)，混勻后靜置5小 時以上(考慮生產(chǎn)周期的問題，可靜置5 24小時)，除去上層乙醇溶液；再 反復用水洗至無煤油味和酒精味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥 箱中35 6(TC烘干至恒重，得未活化載體備用；
(4) 、制備活化載體
取(3)步干燥至恒重的未活化載體，在四氫呋喃(THF)作溶劑的條件下， 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作脫水劑，與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在10 30 T反應2 4小時，反應過程中不斷攪拌(因為這是一個放熱反應，攪拌的目 的是散熱)；反應結束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中35 6(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為本 發(fā)明上述固定化豬胰脂肪酶載體(一種含琥珀酰亞胺酯基基團的大孔珠狀交聯(lián) 聚合物)。
上述步驟(4)制備活化載體過程中，反應物(未活化載體、NHS)、與脫 水劑DCC的用量可按未活化載體中反應性單體:N-羥基琥珀酰亞胺:二環(huán)己基碳 二亞胺(摩爾比)二1:(1 1.2):(1 1.2)計算(未活化載體中反應性單體的摩 爾量可根據(jù)反應率計算)；NHS與DCC可稍過量，以保證未活化載體中的羧基充 分反應；溶劑THF的用量以能溶解DCC、 NHS即可。
上述制備方法的反應過程中，所發(fā)生的主要化學反應式如下所示<formula>formula see original document page 10</formula>
本發(fā)明上述制備方法中合成大孔珠狀交聯(lián)聚合物與豬胰脂肪酶的固定化 方法為共價結合法。
根據(jù)豬胰脂肪酶的結構特點，本發(fā)明以丙烯酸(AA)為反應性單體、N，N' -亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙二醇為致孔劑，以煤油為有機分散 相，采用反相懸浮聚合技術合成水不溶性支持物交聯(lián)丙烯酸多孔微球，以N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化此聚合物而引入琥珀酰亞胺酯活性基團，此活性 基團在室溫下就可與豬胰脂肪酶中的氨基酸殘基反應而不破壞活性中心達到 固載酶的目的。
本發(fā)明固定化豬胰脂肪酶載體在固定化豬胰脂肪酶時，上述活化載體通過 琥珀酰亞胺酯活性基團與豬胰脂肪酶中的H2N-基團反應，達到固定化豬胰脂肪 酶的作用。
上述固定化豬胰脂肪酶載體，除可作為豬胰脂肪酶的固定化載體外，還可 作為其它脂肪酶、中性蛋白酶、a-淀粉酶等的固定化載體。
在固定化豬胰脂肪酶等的過程中，其主要反應式可表示如下<formula>formula see original document page 10</formula>
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明固定化豬胰脂肪酶載體，通過以丙烯酸為反應性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑形成高聚物，同時引入了琥珀酰亞胺酯活性基團，使其 固定化豬胰脂肪酶等所需的時間較短，僅需1小時，且固定化效率高，固定化
酶活性保持的穩(wěn)定性好；其固定化酶表觀活性高，可達750U/g及以上。而且， 除了可用于固定化豬胰脂肪酶，還可用于固定化其它脂肪酶、中性蛋白酶、a -淀粉酶等。
此外，本發(fā)明提供的上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法，可克服現(xiàn)有 技術中存在的載體制備復雜、反應條件苛刻、成本高、難工業(yè)化等缺點，其主
要優(yōu)點如下
第一，原料價廉易得，且都為低毒或是無毒的試劑，成本較低； 第二，反應條件溫和，在我國南方常年根本不須加熱，操作簡單； 第三，所需裝置簡單，可進一步降低成本；
第四，反應時間短，可縮短生產(chǎn)周期，保證年產(chǎn)量高，提高經(jīng)濟效益。 綜合上述優(yōu)點，該制備方法操作簡單、反應條件溫和、且成本低、年產(chǎn)量 高，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)濟效益好。


圖1是本發(fā)明實施例1步驟(3)所制得未活化載體的紅外圖譜。 圖2是本發(fā)明實施例1步驟(4)所制得活化載體的紅外圖譜。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。
實施例l
本實施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體
以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(AA)為反應性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。
ii所用的原料包括
反應性單體丙烯酸(AA) 5mL (約5.3g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 2. lg (為AA質量的約40%)， 致孔劑乙二醇4.0mL (約4.5g，為AA質量的約85。/。)， 分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調節(jié)至5進 行控制，其總用量為12g， 分散相煤油100mL，
催化劑過硫酸銨(AP) 0. lg (為AA質量的約1.9%)， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) lmL (約0.77g，為AP質量的約7. 7倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體2g (其中反應性單體約為0. 02摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 2. 2g (0.02摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 3.9g (0.02摩爾)。 具體制備方法包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
先用小燒杯稱量Span40和Span80組成的復合分散劑，向燒杯中加入少量 有機分散煤油，由于Span40是固體，需要稍微加熱使之溶解，然后轉入四口 瓶中，再用煤油洗滌燒杯2次轉移至四口瓶，攪拌并通氮氣混合均勻；再加入 四甲基乙二胺(TMEDA)，混勻，構成油相；
(2) 、制備水相
將丙烯酸(AA)、 N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于10ml 水中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以ld/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得的 油相中進行分散，控制攪拌速度為250r/min;在氮氣保護下約18'C進行反應， 反應時間1小時；反應結束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應產(chǎn)物中加入95%乙醇 100ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復用水洗至無煤油味和酒
精味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中40 45'C烘干至恒重， 得未活化載體共5. 92g，計算反應率，約為80%，備用；
發(fā)明人采用KBr壓片方法(參照汪昆化，羅傳秋，周嘯.聚合物近代儀器分 析[M].北京清華大學出版社，1991:20 44)對此未活化載體進行了檢測， 獲得了如圖1所示的紅外(IR)圖譜；從圖1中可以看出，3431. 9處為一寬峰， 說明有-C00H存在，同時在1172. 7和1115. 1出現(xiàn)丙烯酸發(fā)生交聯(lián)聚合的特征 峰，1721. 5為-C00H中-0=0的峰；1650. 2和1452為MBAA中酰胺鍵的特征峰， 1650. 2為-C=0的峰，1452為C-N鍵的振動峰；其余的為骨架振動峰，從IR 分析圖譜中可以得出AA與MBAA確實發(fā)生了交聯(lián)聚合得到PAA-MBAA聚合物。 (4)、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (3.9g， 0.02摩爾) 與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (2. 2g， 0. 02摩爾)，(THF用量分別為40mL、 20mL)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(2g，其中反應性單體約為0. 02mol)， 加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約18'C反應2.5 小時，反應過程中不斷攪拌(反應過程在磁力攪拌器上進行，采用磁力攪拌子 攪拌)；反應結束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲(DCU)， 抽濾，于真空干燥箱中40 45t:烘干至恒重，制得活化載體，即為所述的固定 化豬胰脂肪酶載體。
發(fā)明人采用前述KBr壓片方法對此活化載體進行了檢測，獲得了如圖2所 示的紅外(IR)圖譜；從圖2中可以看出，圖譜中3000以上為尖峰，說明己 無-COOH的存在；而在1738.2， 1208.8， 1075. 9出現(xiàn)了酯基的特征峰，證明有 活性酯的生成；同時在1820.7， 1782.3新出現(xiàn)了NHS上的-C二0的峰，說明確 實是NHS參與反應生成的酯。
外，發(fā)明人還采用橄欖油乳化液法測定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測定結果為850U/g (以載體干重表示)。
實施例2
本實施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體
以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(M)為反應性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。
所用的原料包括
反應性單體丙烯酸(AA) 10mL (約10.5g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA) 6.2g (為AA質量的約59%)， 致孔劑乙二醇6.7mL (約7.5g，為AA質量的約7P/。)， 分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調節(jié)至4. 5 進行控制，其總用量為8g， 分散相煤油100mL，
催化劑過硫酸銨(AP) 0. 16g (為AA質量的約1.5%)， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) 2mL (約1. 5g，為AP質量的約9. 4倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體5g (其中反應性單體約為0.047摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 5.5 g (0.048摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 9.9g (0.048摩爾)。 具體制備方法包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
將Span40和Span80組成的復合分散劑加入有機分散相煤油中，適當加熱 溶解，加入裝有導氣管和攪拌器的四口瓶中，攪拌并通氮氣混合均勻；再加入 四甲基乙二胺(TMEDA)，混勻，構成油相；
(2) 、制備水相將丙烯酸(AA)、 N,N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于25ml 水中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以ld/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得的 油相中進行分散，控制攪拌速度為350r/min;在氮氣保護下約3(TC進行反應， 反應時間2小時；
反應結束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應產(chǎn)物中加入65%乙醇 220ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復用水洗至無煤油味和酒 精味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中55 6(TC烘干至恒重， 得未活化載體共12.86g，計算反應率，約為77%，備用；
(4) 、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (9. 9g， 0. 048摩爾) 與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(5. 5g， 0. 048摩爾)，(THF用量分別為70ml、30ml)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(5g，其中反應性單體約為0.047 摩爾)，加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約30。C 反應4小時，反應過程中不斷攪拌(反應過程在磁力攪拌器上進行，采用磁力 攪拌子攪拌)；反應結束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中55 6(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為所 述的固定化豬胰脂肪酶載體。
同樣，發(fā)明人采用橄欖油乳化液法測定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對 橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測定結果為750U/g (以載體干重表示)。
實施例3
本實施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體 以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(AA)為反應性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。 所用的原料包括-
反應性單體丙烯酸(AA) 2.5mL (約2.6g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺MBAA) 1.3g (為AA質量的約50%)， 致孔劑乙二醇2. 3mL (約2. 6g，為AA質量的約100%)， 分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調節(jié)至6進 行控制，其總用量為24g， 分散相煤油100mL，
催化劑過硫酸銨(AP) O.lg (為AA質量的約3.890， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) lmL (約0.77g，為AP質量的約7. 7倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體lg (其中反應性單體約為0. 01摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 1.3g (O.Oll摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 2.3g (O.Oll摩爾)。 具體制備方法包括下述主要步驟
(1) 、制備油相
將復合分散劑Span40和Span80加入有機分散相煤油中，適當加熱溶解， 加入裝有導氣管和攪拌器的四口瓶中，攪拌并通氮氣混合均勻；再加入四甲基 乙二胺(TMEDA)，混勻，構成油相；
(2) 、制備水相
將丙烯酸(AA)、 N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于10ml 水中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以2d/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得的 油相中進行分散，控制攪拌速度為100r/min;在氮氣保護下約l(TC進行反應， 反應時間2小時；反應結束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應產(chǎn)物中加入70%乙醇 80ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復用水洗至無煤油味和酒精
味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，得 未活化載體共3. 16g，計算反應率，約為80.9%，備用；
(4)、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (2. 3g， 0. 011摩爾) 與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(l. 3g， 0. 011摩爾)，(THF用量分別為40mL、20mL)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(lg，其中反應性單體約為0.01摩 爾)，加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約l(TC反 應2小時，反應過程中不斷攪拌(反應過程在磁力攪拌器上進行，采用磁力攪 拌子攪拌)；反應結束后回收溶劑，再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為所 述的固定化豬胰脂肪酶載體。
同樣，發(fā)明人采用橄欖油乳化液法測定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對 橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測定結果為830U/g (以載體干重表示)。
實施例4
本實施例為通過下述方法制得的固定化豬胰脂肪酶載體 以表面活性劑Span (司盤)40和Span80為復合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸(AA)為反應性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)為交聯(lián)劑、乙 二醇為致孔劑，采用反相懸聚合技術制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)活化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體。 所用的原料包括
反應性單體丙烯酸(AA) 5mL (約5.3g)，
交聯(lián)劑N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺MBAA) 2. lg (為AA質量的約40%)，
致孔劑乙二醇4. 6mL (約5. 2g，為AA質量的約100%)，
分散劑Span40和Span80的用量比例以將二者混合后的HLB值調節(jié)至5進
17行控制，其總用量為5.4g，
分散相煤油45mL,
催化劑過硫酸銨(AP) 0. llg (為AA質量的約20/0)， 加速劑四甲基乙二胺(TMEDA) lmL (約0. 77g，為AP質量的7倍)； 此外，制備活化載體過程中，反應物(未活化載體、N-羥基琥珀酰亞胺) 與脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺的用量分別為
未活化載體2g (其中反應性單體約為0.02摩爾)， N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 2.8g (0.024摩爾)， 脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 5.0g (0.024摩爾)。 具體制備方法包括下述主要歩驟
(1) 、制備油相
將復合分散劑Span40和Span80加入有機分散相煤油中，適當加熱溶解， 加入裝有導氣管和攪拌器的四口瓶中，攪拌并通氮氣混合均勻；再加入四甲基 乙二胺(頂EDA)，混勻，構成油相；
(2) 、制備水相
將丙烯酸(AA)、 N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)、乙二醇溶解于5ml水 中，加入過硫酸銨(AP)，混勻，構成水相；
(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物
采用滴液漏斗，以0.5d/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)制得 的油相中迸行分散，控制攪拌速度為250r/min;在氮氣保護下約l(TC進行反 應，反應時間2小時；
反應結束后，采用傾倒方式回收上層溶液，向反應產(chǎn)物中加入95%乙醇 80ml，混勻后靜置過夜，除去上層乙醇溶液；再反復用水洗至無煤油味和酒精 味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，得 未活化載體共5. lg，計算反應率，約為68.7%，備用；
(4) 、制備活化載體
取四氫呋喃(THF)分別溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (5.0g， 0.024摩爾)
18與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(2. 8g， 0. 024摩爾)，(THF用量分別為60mL、20mL)， 得到DCC溶液與NHS溶液；
另取(3)步干燥至恒重的未活化載體(2g，其中反應性單體約為0.02摩 爾)，加入上述NHS溶液，再滴加上述DCC溶液；在密閉圓底燒瓶中約l(TC反 應2小時，反應過程中不斷攪拌(反應過程在磁力攪拌器上進行，采用磁力攪 拌子攪拌)；反應結束后回收溶劑，再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲 (DCU)，抽濾，于真空干燥箱中35 4(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為所 述的固定化豬胰脂肪酶載體。
同樣，發(fā)明人采用橄欖油乳化液法測定了此活化載體固定化豬胰脂肪酶對 橄欖油乳化液水解的的表觀活性，測定結果為800U/g (以載體干重表示)。
上述各實施例中，測定固定化豬胰脂肪酶載體表觀活性的橄欖油乳化液 法，均是釆用文獻(趙亞華主編.生物化學實驗技術教程[M].廣州華南理工 大學出版社，2000:157-159)記載的經(jīng)典橄欖油乳化液法。根據(jù)上述測定結果 可知，其表觀活性均可達750U/g或750U/g以上(以載體干重表示)。
權利要求
1. 一種固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法，其特征在于它是一種含琥珀酰亞胺酯基基團的大孔珠狀交聯(lián)聚合物，具有下述通式I所表示的結構通式I，其中是以丙烯酸為反應性單體、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑形成的高聚物中除羧基以外的部分。
2. —種權利要求l所述的固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法，其特征在于該制備方法以表面活性劑Span40和Span80為復合分散劑、煤油為分散相、 丙烯酸為反應性單體、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑、乙二醇為致孔劑， 采用反相懸聚合技術制得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，再通過N-羥基琥珀酰亞胺活 化，制得所述的固定化豬胰脂肪酶載體；具體包括下述主要步驟(1) 、制備油相將Span40和Span80組成的復合分散劑溶解于有機分散相煤油中，混勻； 再加入四甲基乙二胺，混勻，構成油相；(2) 、制備水相將丙烯酸、N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺、乙二醇溶解于水中，加入過硫酸銨， 混勻，構成水相；(3) 、制備大孔珠狀交聯(lián)聚合物以0. 5 2d/s的速度將(2)步制得的水相滴加于(1)步制得的油相中進 行分散，控制攪拌速度為100 350r/min;在氮氣保護下10 3(TC進行反應， 反應時間1 2小時；反應結束后，回收上層溶液，向反應產(chǎn)物中加入體積濃度>65%的乙醇， 混勻后靜置5 24小時，除去上層乙醇溶液；再反復用水洗至無煤油味和酒精 味，抽濾，得大孔珠狀交聯(lián)聚合物，于真空干燥箱中35 6(TC烘干至恒重，得未活化載體備用；(4)、制備活化載體取(3)步干燥至恒重的未活化載體，在四氫呋喃作溶劑的條件下，二環(huán) 己基碳二亞胺作脫水劑，與N-羥基琥珀酰亞胺在10 3(TC反應2 4小時，反 應過程中不斷攪拌；反應結束后回收溶劑；再用無水乙醇溶解除去副產(chǎn)物二環(huán) 己脲，抽濾，于真空干燥箱中35 6(TC烘干至恒重，制得活化載體，即為本發(fā) 明上述固定化豬胰脂肪酶載體。
3. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述的復合分散劑中，Span40 和Span80的比例按照二者混合后的HLB值為4. 5 6進行調節(jié)；復合分散 劑的總用量為分散相煤油質量的10% 30%。
4. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑N，N，-亞甲 基雙丙烯酰胺的質量為單體丙烯酸質量的40% 60% 。
5. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的致孔劑乙二醇的用 量為單體丙烯酸質量的70% 100% 。
6. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的過硫酸銨的加入量 為單體丙烯酸質量的1.5% 4%;所述的四甲基乙二胺的加入量為過硫酸銨 質量的7 10倍。
7. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中，水的 用量為丙烯酸體積的1 4倍。
8. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中，油相 與水相的體積比為4:1 10:1。
9. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)中，未活 化載體、N-羥基琥珀酰亞胺、與二環(huán)己基碳二亞胺的用量按未活化載體中 反應性單體:N-羥基琥珀酰亞胺二環(huán)己基碳二亞胺摩爾比=1" 1. 2:1 1. 2計算；溶劑THF的用量以能溶解DCC、 NHS即可。
10. 權利要求l所述的固定化豬胰脂肪酶載體的應用，將其作為豬胰脂肪酶、 其它脂肪酶、中性蛋白酶、a-淀粉酶的固定化載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化豬胰脂肪酶載體，它是一種含琥珀酰亞胺酯基基團的大孔珠狀交聯(lián)聚合物，具有通式I所表示的結構。該載體通過以丙烯酸為反應性單體、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑形成高聚物，同時引入了琥珀酰亞胺酯基活性基團，使其固定化豬胰脂肪酶所需的時間較短，僅需1小時，且固定化效率高，固定化酶活性保持的穩(wěn)定性好；其固定化酶表觀活性高，可達750U/g及以上。本發(fā)明還公開了一種上述固定化豬胰脂肪酶載體的制備方法和應用。
文檔編號C08F220/56GK101531732SQ20091005837
公開日2009年9月16日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權日2009年2月19日
發(fā)明者粟慧君, 莉 蔡, 趙仕林 申請人:四川師范大學