專利名稱：形成水凝膠、凍干物的熱固性中和的殼聚糖組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在高于5x:的溫度下形成無磷酸鹽、透明水凝膠的含 水熱固性中和的殼聚糖組合物和它的制備方法。
此外，本發(fā)明涉及通過將本發(fā)明的熱固性中和的殼聚糖組合物凍 干而獲得的凍干物和它的制備方法。
背景技術(shù)：
水凝膠對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是有吸引力的。
此外，顯示隨溫度而增加其粘度的特定能力的水凝膠(也稱作"熱 敏性/熱響應(yīng)性/假熱固性/熱膠凝性水凝膠")證明具有便利的應(yīng)用連 同在應(yīng)用部位具有增加的停留時間，并因此可以有利地用于藥物遞送 或組織填充。
如從0. Felt等人在Encyclopedia of Controlled Drug Delivery 1999中獲知的那樣，所述熱敏性水凝膠可以有利地基于天然來源的聚 合物，例如基于殼聚糖，殼聚糖是可商購的衍生自殼多糖(纖維素之后 第二最豐富的多糖(polysaccharide))的廉價聚合物。
殼聚糖稱為殼多糖衍生物，該殼多糖衍生物是通過殼多糖的部分 至大部分堿性N-脫乙?；@得的，該殼多糖是天然產(chǎn)生的還稱為聚 (N-乙?；?D-葡糖胺)的生物聚合物。
殼聚糖包含游離胺(-NH2)基并且可以根據(jù)N-乙?；?D-葡糖胺單 元和D-葡糖胺單元的比例表征，并且該比例表示為完全乙?；酆衔?殼多糖的脫乙?；?DD)。
殼聚糖的影響重要性能例如溶解度和粘度的參數(shù)是脫乙?；?(DD)和分子量(Mw)，該脫乙?；?DD)可以被理解為表示脫乙酰單體
的百分率。
已知?dú)ぞ厶鞘强缮锝到?、生物相容、生物粘合、抑菌的，并?還促進(jìn)傷口愈合、藥物吸收和組織重構(gòu)。
由于其上述固有性能，殼聚糖已知具有許多化妝品和藥物活性， 并且也已經(jīng)被廣泛地探究用于通過凝膠的各種應(yīng)用。
因此，考慮到殼聚糖的有利的性能，仍需要改進(jìn)已知的熱敏性殼 聚糖水凝膠的性能，所述殼聚糖水凝膠仍視為對于寬范圍的生物醫(yī)學(xué) 應(yīng)用是非常有前途的。
WO-A-99/07416 (BIOSYNTHEC)公開了一種pH值依賴性溫度控制的 殼聚糖水凝膠，其在中性pH值下具有熱敏性能以致它在低溫下具有低 粘度而在體溫下膠凝。
這種熱敏性殼聚糖水凝膠是通過用尤其由p -甘油磷酸鹽(P -GP) 示例的多元醇或糖的一磷酸二代鹽中和脫乙?；葹榇蠹s80%的商業(yè) 殼聚糖而制備的。
然而，水凝膠中存在^-GP導(dǎo)致以下缺點(diǎn)。
P-GP是帶負(fù)電的實(shí)體，其可以與帶正電的生物活性組分反應(yīng)， 導(dǎo)致其沉淀或干擾其從水凝膠的釋放。
因此，P -GP的存在致使殼聚糖/ P -GP水凝膠不適合與許多藥物 一起使用。
此外，這種水凝膠的性能，例如膠凝時間和粘度取決于P-GP的 濃度并且因此受P-GP的溶解度限制。
具體來說，要求P-GP的高濃度以具有低的膠凝時間，從而避免 在水凝膠施用之后其迅速消除。
然而，P -GP的高濃度還使水凝膠的機(jī)械性能降低。
因此，膠凝時間必須與水凝膠的稠度平衡，并且不可能獲得兼?zhèn)?低膠凝時間和高粘度的凝膠，而該低膠凝時間和高粘度將是合乎需要 的特性組合。
此外，P -GP的過高濃度可能促使水凝膠在其施用部位沉淀。 此外，發(fā)現(xiàn)所述熱敏性殼聚糖/e-GP水凝膠是渾濁的，從而致使
它們不適合用于特定的應(yīng)用例如眼睛或局部施用。
此外，含磷酸鹽的材料在生物相容性方面可能是不適合的(G. Molinaro等人，脅/zz"eWaM 23:2717-2722 (2002))。
為了克服殼聚糖/P-GP水凝膠的缺點(diǎn)，WO-A-2005/097871 (UNIVERSITE DE GENEVE)提出了在高于5X:的溫度下形成無磷酸鹽透 明水凝膠的熱固性中和的殼聚糖組合物，所述組合物包含用羥基化堿 中和的均勻重乙酰化殼聚糖，其具有不小于200kDa的分子量和30-60%的脫乙?；取?br> WO-A-2005/097871還公開了所述組合物還可以包含1， 3-丙二醇 以調(diào)節(jié)水凝膠的粘彈性質(zhì)。
然而，1， 3-丙二醇既沒有被提及為"公認(rèn)安全，，(GRAS)，又沒被 接受為美國藥典、歐洲藥典或日本藥典中提及的添加劑以致其使用限 于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
此外，含1， 3-丙二醇的熱固性中和的殼聚糖組合物在凍干時損失 了它們的熱響應(yīng)性性能。
鑒于持續(xù)需要提供用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的改進(jìn)的熱敏性殼聚糖水凝 膠，本發(fā)明人進(jìn)行了持續(xù)研究以克服已知的熱敏性水凝膠的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是提供形成無磷酸鹽透明水凝膠的含水熱固性中和 的殼聚糖組合物，所述水凝膠具有改進(jìn)的性能并且是為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用 可接受的。
本發(fā)明的另一個目的是提供含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其 可以容易地存儲并且在存儲之后保留其熱膠凝性能。
本發(fā)明的又一個目的是提供含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其 具有便利的應(yīng)用，例如通過使用針或最低侵入技術(shù)的注射。
這些目的由本發(fā)明達(dá)到。
發(fā)明概述
根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供獨(dú)立權(quán)利要求1和其從屬權(quán)利要求 2-11中限定的含水熱固性中和的殼聚糖組合物(在此，還稱作"本發(fā)
明的組合物")。
根據(jù)第二個方面，本發(fā)明提供如獨(dú)立權(quán)利要求12限定的根據(jù)所述 第 一個方面的含水熱固性組合物的凍干物。
根據(jù)第三個方面，本發(fā)明提供如獨(dú)立權(quán)利要求13和其從屬權(quán)利要
求14-15限定的根據(jù)所述第一個方面的含水熱固性中和的殼聚糖組
合物的制備方法。
根據(jù)第四個方面，本發(fā)明提供如獨(dú)立權(quán)利要求16限定的根據(jù)所述
第二個方面的凍干物的制備方法。
根據(jù)第五個方面，本發(fā)明提供如獨(dú)立權(quán)利要求17 - 20限定的根據(jù) 所述第一個方面的組合物，或根據(jù)所述第二個方面的凍干物的用途。
根據(jù)本發(fā)明，將選自多糖(polyose)和衍生自多糖(polyose)的多 元醇的絡(luò)合劑添加到指定殼聚糖組合物中有利地允許提供具有改進(jìn)性 能的無磷酸鹽透明水凝膠，該水凝膠可為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用所接受并且可 以容易地存儲。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)將在以下描述中出現(xiàn)。
現(xiàn)將按更詳細(xì)的方式描述本發(fā)明。
附圖簡述


圖1示出了測量本發(fā)明組合物的注射能力的設(shè)備。
圖2示出了實(shí)施例1中獲得的含海藻糖的透明水凝膠與相同但沒 有海藻糖的水凝膠相比當(dāng)溫度從4t:增加到37C時彈性模量G'(儲能 模量)和粘性模量G〃 (損耗模量)根據(jù)時間的演變。
圖3示出了實(shí)施例1中獲得的含海藻糖的透明水凝膠在制備(A) 和解凍(B)之后當(dāng)溫度從4匸增加到37t;時彈性模量G'(儲能模量)和 粘性模量G''(損耗模量)根據(jù)時間的演變。
圖4示出了實(shí)施例1中獲得的含海藻糖的透明水凝膠，在凍干和 重構(gòu)之后，與相同但沒有海藻糖的水凝膠相比當(dāng)溫度從41C增加到37 x:時彈性模量G'(儲能模量)和粘性模量G''(損耗模量)根據(jù)時間的演 變。200580052497.0
說明書第5/16頁
圖5示出了實(shí)施例4中獲得的含海藻糖的透明水凝膠與相同但沒 有海藻糖的水凝膠相比當(dāng)溫度從4C增加到37"C時彈性模量G'(儲能 模量)和粘性模量G''(損耗模量)根據(jù)時間的演變。
圖6示出了實(shí)施例5(對比)中獲得的含1，3-丙二醇的透明水凝膠 在制備(A)之后和在凍干和重構(gòu)(B)之后當(dāng)溫度從4 "C增加到3 7 'C時彈 性模量G'(儲能模量)和粘性模量G〃 (損耗模量)根據(jù)時間的演變。
圖7示出了實(shí)施例6中獲得的含甘露糖醇的透明水凝膠在凍干和 重構(gòu)后當(dāng)溫度從41C增加到371C時彈性模量G'(儲能模量)和粘性模量 G''(損耗模量)根據(jù)時間的演變。
圖8示出了實(shí)施例7中獲得的含甘油的透明水凝膠當(dāng)溫度從4匸 增加到37'C時彈性模量G'(儲能模量)和粘性模量G〃 (損耗模量)根據(jù) 時間的演變。
本發(fā)明的詳細(xì)描迷
應(yīng)指出的是，在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求中，與本發(fā)明組合物相 連的表述"熱固性，，是指溫度不促使組合物的凝膠化而是充當(dāng)催化劑， 其當(dāng)升高時顯著地縮短膠凝時間。
還應(yīng)指出的是，在本說明書中，表迷"水凝膠"或"本發(fā)明的水 凝膠，，當(dāng)適當(dāng)時用來代替"本發(fā)明組合物"。
仍應(yīng)指出的是，在本說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語"中和的"是指 6. 7 - 7. 1的pH值。
根據(jù)本發(fā)明，在高于5t:的溫度下形成無磷酸鹽透明水凝膠的含
水熱固性中和的殼聚糖組合物包含用羥基化堿中和的重乙?；瘹ぞ厶?和選自多糖和衍生自多糖的多元醇的絡(luò)合劑。
包含在本發(fā)明組合物中的重乙?；瘹ぞ厶堑钠骄肿恿?Mw)通常 不低于100kDa。
殼聚糖的分子量可以通過與多角度光散射(MALS)聯(lián)接的不對稱流 動場流分級(AFFF)測定，例如B. Wittgren和K.-G. Wahlund在 Journal of Chromatography A 760: 205-215 (1997)中所報道的那樣。
9Mw通常不低于100kDa的重乙?；瘹ぞ厶怯绕溥m合用于本發(fā)明， 原因在于它允許形成牢固水凝膠的熱固性組合物的形成。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的重乙?；瘹ぞ厶蔷哂胁坏陀?00kDa的Mw。
用于本發(fā)明的重乙?；瘹ぞ厶堑腗w的上限取決于包含在本發(fā)明 組合物中的重乙?；瘹ぞ厶堑牧坎⑶矣墒┯玫娜菀仔詻Q定，該容易性 取決于所選定的應(yīng)用。
用于本發(fā)明的重乙酰化殼聚糖必須具有40 - 70%的脫乙酰化度， 這是指該殼聚糖分別包含40 - 70% D-葡糖胺單元和60 - 30%中性N-乙. 酰基-D-葡糖胺單元。
殼聚糖的脫乙?；瓤梢酝ㄟ^核磁共振測定，例如Lavertu等人 的文獻(xiàn) J"ournal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32:1149-1158 (2003)中所述那樣。
如果重乙?；瘹ぞ厶堑拿撘阴；鹊陀?0%，則該重乙?；瘹ぞ?糖變成接近于殼多糖的聚合物，該聚合物不溶于酸性條件并因此不可 用于本發(fā)明。
如果重乙酰化殼聚糖的脫乙?；雀哂?0%,則該重乙?；瘹ぞ?糖不允許制備形成無磷酸鹽透明水凝膠的組合物。
優(yōu)選地，包含在本發(fā)明組合物中的重乙?；瘹ぞ厶堑拿撘阴；?為45 - 65%.
用于本發(fā)明的分子量通常不小于lOOkDa且脫乙?；葹?0 - 70% 的重乙?；瘹ぞ厶强梢岳绺鶕?jù)WO-A-2005/097871中公開的方法制 備或可以從Novamatrix(Oslo, Norway)獲得。
包含在本發(fā)明組合物中的重乙?；瘹ぞ厶堑牧勘仨殲?.1-5.0w/w%,基于總組合物。
重乙?；瘹ぞ厶堑牧康陀?. lw/wy。不允許水凝膠形成并且重乙酰 化殼聚糖的量高于5. Ow/w^促使形成難到不能注射的組合物。
包含在本發(fā)明組合物中的重乙?；瘹ぞ厶堑牧繉⒏鶕?jù)殼聚糖的 Mw和目標(biāo)應(yīng)用進(jìn)^f亍選擇。
優(yōu)選地，包含在本發(fā)明組合物中的重乙?；瘹ぞ厶堑牧繛?.5-3. Ow/w%,基于總組合物。
包含在本發(fā)明組合物中的絡(luò)合劑的量基于總組合物必須為1 -30w/w%,并且將取決于重乙?；瘹ぞ厶堑臐舛群头肿恿恳约叭Q于水 凝膠的需要的膠凝時間和稠度。
包含在本發(fā)明組合物中的絡(luò)合劑的量優(yōu)選為5-15w/w%，基于總 組合物。
包含在本發(fā)明組合物中的選自多糖和衍生自多糖的多元醇的所述 絡(luò)合劑允許調(diào)制水凝膠的性能，例如水凝膠的膠凝時間和粘度。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以用于本發(fā)明的絡(luò)合劑是多 糖，更優(yōu)選選自單糖和二糖的多糖。
作為可以用于本發(fā)明的單糖的優(yōu)選實(shí)例，可以舉例D-葡萄糖(還 稱作葡萄糖)、果糖和塔格糖，它們根據(jù)歐洲、美國或日本藥典稱為藥 物組合物的賦形劑。
作為可以用于本發(fā)明的二糖的優(yōu)選實(shí)例，可以舉例海藻糖、蔗糖、 麥芽糖和乳糖，它們根據(jù)歐洲、美國或日本藥典稱為藥物組合物的賦 形劑，其中海藻糖是尤其優(yōu)選的。
作為可以用于本發(fā)明的多糖的其它實(shí)例，可以舉例選自聚葡萄糖 (polydextose)和直鏈淀粉的多糖(polysaccharide)， 它們稱為藥物 組合物的賦形劑。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以用于本發(fā)明的絡(luò)合劑 是衍生自多糖的多元醇(還稱作糖醇)，其選自甘油、甘露糖醇、山梨 糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、乳糖醇和麥芽糖醇，它們根據(jù)歐洲、美國 或日本藥典稱為藥物組合物的賦形劑，其中甘油是尤其優(yōu)選的。
它們的使用之前必須在4匸下解凍。
此外，本發(fā)明的組合物(除了包含甘油作為絡(luò)合劑的那些)可以有 利地加以凍干以獲得凍千物以便幫助存儲和分配，并且可以在它們的 使用之前通過在4X:下在攪拌下將冷卻水添加到該凍千物中來進(jìn)行重 構(gòu)，同時保留它們的熱膠凝性能。
本發(fā)明的組合物可以根椐形成為本發(fā)明一部分的方法制備。
在所述方法的步驟a)中，將分子量通常不小于100kDa，優(yōu)選不小 于200kDa，脫乙?；葹?0 - 70%,優(yōu)選45 - 65°/。的重乙?；瘹ぞ厶?溶解在含水HC1介質(zhì)中并且在殼聚糖的完全溶解后，將殼聚糖溶液的 溫度冷卻降至小于51C的溫度，例如在冰浴中冷卻。
然后，在所述方法的步驟b)中，如下中和冷卻的殼聚糖溶液的pH 值直至pH值6. 7-7. 1，優(yōu)選pH值6. 8:在攪拌下在低于5"的溫度 下，逐滴添加要求量的預(yù)先冷卻到小于51C的溫度的含幾基化堿的水 溶液。
更高的pH值是不合適的，因為可能引起殼聚糖的沉淀。 根據(jù)所述方法，用于中和的羥基化堿優(yōu)選是NaOH。 不充分的攪拌或含水羥基化堿的過快添加引起殼聚糖的沉淀。 在所述方法的步驟c)中，在溶解步驟a)期間或之后，或在中和步
驟b)之前、期間或之后添加選自多糖和衍生自多糖的多元醇的絡(luò)合劑。
應(yīng)指出，涉及與本發(fā)明組合物相聯(lián)系的殼聚糖、絡(luò)合劑和其量的 描述也適用于與本發(fā)明方法相聯(lián)系。
如果需要，本發(fā)明組合物的制備方法還可以包括在溶解的步驟a) 之前將重乙?；瘹ぞ厶菧缇牟襟E。為獲得無菌水凝膠，在無菌條件 下(例如在層流下)進(jìn)行制備并且每一添加的溶液預(yù)先濾過0. 22 n m過 濾器或加以蒸汽滅菌。
例如，可以通過輻射或理想地通過懸浮在水中的重乙?；瘹ぞ厶?的蒸汽滅菌進(jìn)行滅菌，如Yen(YenS.F.等人，1998, US-A-5， 773， 608) 所述那樣。
如果需要，本發(fā)明組合物的制備方法還可以包括冷凍所述組合物 的步驟以方便存儲。
在這種情況下，在其使用之前必須在4x:下將該冷凍的組合物解凍。
在一個尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法可以通過進(jìn)一
外)來完成，以獲得形成為本發(fā)明一部分的凍干物。
所述凍干物可以適宜地存儲并分配用于醫(yī)學(xué)用途，并且可以通過
在4x:下在攪拌下添加冷水來重構(gòu)。
當(dāng)提高本發(fā)明的熱固性中和的殼聚糖組合物的溫度時，例如在施 用之后，熱膠凝發(fā)生，導(dǎo)致形成無磷酸鹽的透明牢固水凝膠。該溫度 越高，膠凝時間越短。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物可以有利地用作藥物遞送系統(tǒng)并且 鑒于其特定性能，可以有利地用于制備可注射制劑。
此外，因為本發(fā)明的凍干物在重構(gòu)之后保留其熱膠凝性能，所以 它可以有利地用于制備藥物遞送系統(tǒng)和制備可注射制劑。
為了證實(shí)本發(fā)明的無磷酸鹽透明殼聚糖水凝膠的改進(jìn)的彈性，除 非另有說明，根據(jù)以下方法對根據(jù)本發(fā)明的各種水凝膠和對比水凝膠 進(jìn)行流變性測量。
在水凝膠的制備之后使用Rheostress l(Haake， Karlsruhe, Germany)立即測定水凝膠的粘彈性質(zhì)，該Rheostress l使用錐/板設(shè) 備(直徑60mm,角度4° )。釆用與該流變儀連接的恒溫浴Haake DC 30 和冷卻i殳備Haake K10(Haake， Karlsruhe, Germany)控制溫度。將水 凝膠放置在錐和板之間(在4C下冷卻下來)并在10分鐘之后測量。在 線性粘彈性范圍中進(jìn)行所有測量并且在恒定變形下(Y = 0. 05)在 1. OOHz下測定『(儲能模量)和G〃 (損耗模量)180分鐘。于第一個5 分鐘內(nèi)以6. 6X:/min將溫度從4X:提高到37*0,并且于隨后的175分 鐘內(nèi)維持在37'C。通過利用包圍該錐/板設(shè)備的蓋子使導(dǎo)致水凝膠干
燥的水蒸發(fā)最小化。
試驗了以下水凝膠
(1) 實(shí)施例1中獲得的本發(fā)明水凝膠，包含2w/w^從Novamatrix 獲得的殼聚糖(DD-47。y4)和8w/wl海藻糖，和沒有海藻糖的對比水凝膠 (見圖2);
(2) 實(shí)施例1中獲得的本發(fā)明水凝膠，包含2w/wW從Novamatrix
獲得的殼聚糖(DD- 47°/。)和8w/w。/。海藻糖，根據(jù)實(shí)施例2在制備之后和 在冷凍-解凍之后(見圖3A和3B);
(3) 實(shí)施例1中獲得的本發(fā)明水凝膠，包含2w/w。/。從Novamatrix 獲得的殼聚糖(DD-47。/。)和8w/w。/。海藻糖，根據(jù)實(shí)施例3在凍干和重構(gòu) 之后，和沒有海藻糖的對比水凝膠(見圖4);
(4) 實(shí)施例4中獲得的本發(fā)明水凝膠，包含O. 9。/。w/w根據(jù)制備實(shí) 施例l獲得的殼聚糖(DD-61。/。)和5w/wy。海藻糖，和沒有海藻糖的對比 水凝膠(見圖5);
(5) 實(shí)施例5 (對比)中獲得的對比水凝膠，包含lw/V/。根據(jù)制備實(shí) 施例2獲得的殼聚糖(DD 47%)和10w/w% 1，3-丙二醇，在制備之后和 在凍干和重構(gòu)之后(見圖6A和6B);
(6) 實(shí)施例6中獲得的本發(fā)明水凝膠，包含0. 9w/w財艮據(jù)制備實(shí) 施例1獲得的殼聚糖(DD-61。/。)和5w/w^甘露糖醇，在凍干和重構(gòu)之后 (見圖7);
(7) 實(shí)施例7中獲得的本發(fā)明水凝膠，包含2w/w。/。從Novamatrix 獲得的殼聚糖(DD 47%)和10%甘油，和沒有甘油的對比水凝膠(見圖8)。
圖2-8示出了試驗水凝膠當(dāng)溫度從4匸增加到37X:時彈性模量 G'(儲能模量)和粘性模量G〃 (損耗模量)根據(jù)時間的演變。凝膠網(wǎng)絡(luò) 的起初形成的開始(其限定膠凝時間)由G'和G〃的交叉時間給出。
如圖2所示，根據(jù)本發(fā)明添加多糖例如海藻糖與相同但沒有海藻 糖的水凝膠相比增加水凝膠的G'和G"值。
圖3A示出了在水凝膠的剛好制備后該水凝膠的粘彈性質(zhì)(如圖2 報道)，而圖3B示出了相同水凝膠在冷凍和解凍后的粘彈性質(zhì)。
如圖3B所示，本發(fā)明組合物的熱膠凝性能在冷凍和解凍后得到維持。
圖4示出了圖2報道的水凝膠在凍干和重構(gòu)后的粘彈性質(zhì)。 如圖4所示，本發(fā)明組合物的熱膠凝性能在凍干和重構(gòu)后得到維持。
如圖5所示，本發(fā)明的含海藻糖的組合物顯示30分鐘的凝膠化點(diǎn)，
而不包含海藻糖的相同制劑在150分鐘后形成凝膠。
如圖6A和6B所示，含1， 3-丙二醇的對比組合物當(dāng)在其制備后測 量粘彈性質(zhì)時形成水凝膠(圖6A)但是如圖6B中不存在凝膠化點(diǎn)所指 示的那樣在凍干和重構(gòu)后不保留其熱膠凝性能。
如圖7所示，本發(fā)明的含甘露糖醇的組合物如存在凝膠化點(diǎn)所指 示的那樣在凍干和重構(gòu)后保留其熱膠凝性能。
如圖8所示，本發(fā)明的含甘油的組合物形成水凝膠，如存在凝膠 化點(diǎn)所指示的那樣，然而不包含甘油的相同制劑在180分鐘后不顯示 凝膠化點(diǎn)。
以下實(shí)施例將旨在說明本發(fā)明。然而，它們在任情況下不能認(rèn)為 限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例
在以下實(shí)施例中，殼聚糖的脫乙酰化度通過核磁共振(NMR)測定， 例如Lavertu等人在文獻(xiàn)Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32: 1149-1158 (2003)中所述那樣。
殼聚糖的分子量通過與多角度光散射(MALS)聯(lián)接的不對稱流動場 流分級(AFFF)如下測定
在與Eclipse F系統(tǒng)(Wyatt Technology Europe, Dernbach， Germany)連接的26.5cm長350 iim高的梯形溝道中進(jìn)行殼聚糖溶液 (2mg/ml，在乙酸酯緩沖物中，pH值4. 5)的分級。用具有10kDa截止 的再生纖維素膜(Microdyn-Nadir GmbH， Wiesbaden, Germany)襯里 該溝道的底部。洗脫介質(zhì)由乙酸酯緩沖物構(gòu)成，pH值4，5。將溝道流 量設(shè)置到lml/min并將注入流量設(shè)置到0. 2ml/min。該分離以3分鐘 的lml/min集中流開始并且繼之以15分鐘的0. 2ml/min交叉流。將 Dawn EOS多角度光散射檢測器(Wyatt Technology, Santa Barbara, USA)和折射指數(shù)(RI)檢測器(Waters差示折光計，Milford， MA， USA) 在線與該場流分級溝道連接。該光散射檢測器安裝有GaAs激光器(波 長690nm)和十八個檢測器。在14 - 163度之間的角度下收集散射光。
用氯化鈉校準(zhǔn)該RI檢測器。收集數(shù)據(jù)并采用As t ra版本4. 90. 08軟件， 使用0. 153ml/g的折光指數(shù)增值(dn/dc)進(jìn)行分析。
在以下實(shí)施例中，采用由1.0ml Iuer鎖型注射器和盤組成，該注 射器填充有在3'C下的水凝膠，該盤被擱在該注射器的活塞上，如圖1 所示。27G1/2xO. 5英寸的針固定在該注射器上，該注射器置于載體中。 將重物(500g或lkg)放置在該盤上并測量組合物從該注射器排出所必 需的時間。
在以下實(shí)施例1- 3和7中，用于制備水凝膠的重乙酰化殼聚糖是 從Novamatrix獲得的重乙?；瘹ぞ厶?批次FU-507-03),具有47%的 DD (由腿測量)和3600kDa的平均分子量(Mw)(由AFFF-MALS測量)。
在以下實(shí)施例4和6中，用于制備水凝膠的重乙?；瘹ぞ厶鞘歉?據(jù)制備實(shí)施例1制備的重乙酰化殼聚糖。
在以下實(shí)施例5中，用于制備水凝膠的重乙?；瘹ぞ厶鞘歉鶕?jù)制 備實(shí)施例2制備的重乙?；瘹ぞ厶?。
制備實(shí)施例1
根據(jù)WO-A-2005/097871中公開的方法制備DD為61%的重乙?；?殼聚糖"Fagal Lot 21"
將25. 5g殼聚糖薄片(Sigma-aldrich， Saint Louis, Missouri, USA,產(chǎn)品號碼41,941-9，批次14418LB)溶于1升乙酸10%和甲醇 (50/50的溶液中保持在攪拌下一小時。添加550ffll甲醇。在2小時攪 拌后，讓混合物濾過100pm過濾器以排除不溶性顆粒。然后相對于去 離子水滲析(Spectra/Po, 1滲析膜6， 000 - 8， 000MWCO， n。 132665， Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez， USA)該粘性溶液72小 時，其中每天換水。然后讓溶液濾過5jum過濾器。
在攪拌下，添加400ml NH40H 0. 2M/甲醇(50/50)以引起沉淀。在 l小時攪拌后，讓懸浮液濾過100pm過濾器。用甲醇洗滌該沉淀物直 至中性。在硅膠存在下，在真空下，在室溫下干燥所獲得的純化殼聚 糖，并避光保存。
將10g這種純化的殼聚糖溶于500ml乙酸10%/甲醇(50/50)。攪 拌該混合物1小時并允許靜置一整夜。添加400ml甲醇。攪拌該溶液 數(shù)小時并允許靜置一整夜。添加150ml甲醇并使用冰浴將該殼聚糖溶 液冷卻至小于5匸的溫度。將由2. 4ml乙酸酐和200ml甲醇構(gòu)成的溶 液冷卻至低于5"C的溫度并在劇烈機(jī)械攪拌下逐滴添加到殼聚糖溶液 中。保持該含均勻重乙酰化殼聚糖的溶液保持在攪拌下在低于51C的 溫度下一小時以確保完全反應(yīng)，并允許在室溫下靜置一整夜。為了排 除在重乙酰化期間產(chǎn)生的鹽并進(jìn)一步排除不溶性顆粒，相對于去離子 水滲析該粘性溶液12天(與上面相同的滲析膜)，其中每天換水。然后 該讓殼聚糖粘性溶液濾過5 jam過濾器。在攪拌下，添加200ml NH4OH 0. 2M/甲醇(50/50)以引起殼聚糖沉淀。在4小時攪拌后，讓該殼聚糖 穿過100Mm過濾器并用甲醇洗滌。最后，在硅膠存在下，在真空下， 在室溫下干燥該均勻重乙酰化的殼聚糖，并避光保存。
所獲得的重乙?；瘹ぞ厶蔷哂?1%的DD (由NMR測量)和7900kDa 的平均分子量(Mw)(由AFFF-MALS測量)。
制備實(shí)施例2
根據(jù)WO-A-2005/097871中公開的方法制備DD為47%的重乙?；?殼聚糖"Fagal Lot 25"
如制備實(shí)施例1中那樣純化殼聚糖薄片(Sigma-aldrich， Saint Louis, Missouri, USA,產(chǎn)品號碼41,941-9，批次14418LB)。根據(jù) 與實(shí)施例制備l中相同的程序采用由2.0ml乙酸酐和200ml甲醇構(gòu)成
的溶液將殼聚糖重乙?；?。
所獲得的重乙?；瘹ぞ厶蔷哂?7%的DD(由醒R測量)。
實(shí)施例1
才艮據(jù)本發(fā)明的組合物的制備，包含2°/。w/w由Novamatrix提供的重 乙酰化殼聚糖(DD - 47%隱)和8w/w^海藻糖
將700mg由Novainatrix提供的DD為47% (由RMN測量)的重乙酰
化殼聚糖(批次FU-507-03)在水中在懸浮狀態(tài)下在4。/。(w/w)的濃度下 高壓蒸氣處理。添加145jLil HC1并保持該懸浮液在攪拌下在室溫下 18h以允許完成殼聚糖溶解。將3. 09g海藻糖溶解在6. 5ml NaOH 0. 15M 中。在水浴中冷卻這種溶液并在攪拌下逐滴添加到冷卻的殼聚糖溶液 中。然后通過逐滴添加冷卻的稀NaOH將凝膠的pH值調(diào)節(jié)到6.8。最 后，添加冷水而獲得35g的總質(zhì)量。所獲得的透明水凝膠在37X:下跟 隨時間顯示其粘彈性性能的提高，如圖2和圖3A所示，并且具有l(wèi)ll 分鐘的膠凝時間。注射能力測量在一千克重物下為30秒。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1中獲得的水凝膠冷凍-解凍
在液氮中將10g實(shí)施例1的制劑冷凍并保持在-20X:。然后在4*C 下將它解凍，然后測定其流變性。如圖3B所示，熱膠凝性能得到維持。
實(shí)施例3
將實(shí)施例1中獲得的水凝膠凍千
在液氮中將10g實(shí)施例1的制劑冷凍并保持在-20X:下，然后釆用 Edwards Modulyo冷凍干燥器(平臺，在-50"C下，10_1毫巴的真空)凍
干24小時。通過在攪拌下在4x:下添加冷水將所獲得的凍干物重構(gòu)。
如圖4所示，熱膠凝性能得到維持。 實(shí)施例4
根據(jù)本發(fā)明的組合物的制備，該組合物包含0. 9。/。w/w根據(jù)制備實(shí) 施例1獲得的重乙?；瘹ぞ厶?Fagal lot 21" (DD = 61%薩)和5w/w% 海藻糖
在室溫下將270mg根據(jù)制備實(shí)施例1制備的具有61%的DD(由R匪 測量)的重乙酰化殼聚糖溶解在15ml HC1 0. 1N中在攪拌下保持18小 時。將1. 66g海藻糖二水合物溶解在8ml NaOH 0. 15M中。在冰浴中冷 卻這種溶液并在攪拌下逐滴添加到冷卻的殼聚糖溶液中。然后通過逐
滴添加冷卻的稀NaOH將凝膠的pH值調(diào)節(jié)到6. 8。最后，添加冷水以 獲得30g的總質(zhì)量。如圖5中所示，所獲得的透明水凝膠顯示在 下跟隨時間其粘彈性性能提高。含海藻糖的制劑在30分鐘后顯示凝膠 化點(diǎn)，而不包含海藻糖的制劑在150分鐘后形成凝膠。注射能力測量 在500g重物下為30秒。
實(shí)施例5 (對比)
對比組合物的制備，其包含1。/。w/w根據(jù)制備實(shí)施例2獲得的重乙 ?；瘹ぞ厶?Fagal lot 25" (DD - 47%躍)和10w/w% 1， 3-丙二醇
在室溫下將200mg根據(jù)制備實(shí)施例2制備的具有47°/。的DD(由RMN 測量)的重乙?；瘹ぞ厶侨芙庠?0ml HC1 0. 1N中在攪拌下保持18小 時。將2g冷卻的1， 3-丙二醇添加到該溶解的殼聚糖中。然后通過逐 滴添加冷卻的稀NaOH將凝膠的pH值調(diào)節(jié)到6. 8。最后，添加冷水以 獲得20g的總質(zhì)量。如圖6A中所示，所獲得的透明水凝膠顯示在37 'C下跟隨時間其粘彈性性能提高。
當(dāng)冷凍(在-80'C)，凍千(保持24小時)和釆用冷水在攪拌下在4 匸下重構(gòu)時，所獲得的制劑在注射能力測量試驗中不再可注射(27G"2， 一千克重物)。此外，如圖6B所示，不呈現(xiàn)任何熱膠凝性能。
實(shí)施例6
根據(jù)本發(fā)明的組合物的制備，該組合物包含0. 9。/。w/w根據(jù)制備實(shí) 施例1獲得的重乙?；瘹ぞ厶?Fagal lot 21" (DD = 61%酬)和5w/w% 甘露糖醇
在室溫下將630mg根據(jù)制備實(shí)施例1獲得的重乙酰化殼聚糖溶解 在35ml HC1 0. 1N中在攪拌下保持18小時。將該殼聚糖溶液冷卻至大 約5匸，然后添加3.5g甘露糖醇。然后通過逐滴添加冷卻的稀NaOH 將凝膠的pH值調(diào)節(jié)到6. 8。最后，添加冷水以獲得70的總質(zhì)量。在 液氮中將10g該制劑冷凍并保持在-20t:下，然后采用Edwards Modulyo冷凍干燥器(平臺，在-50X:下，l(r毫巴的真空)凍干24小時。
通過在攪拌下在4"C下添加冷水將所獲得的凍干物重構(gòu)。如圖7所示， 所獲得的透明水凝膠在37C下顯示跟隨時間其粘彈性性能的提高，其 中膠凝時間為1小時。
實(shí)施例7
才艮據(jù)本發(fā)明的組合物的制備，包含2%w/w由Novamatrix提供的重 乙酰化殼聚糖(DD = 47%隨)和10w/w。/。甘油
將700mg從Novamatrix獲得的重乙?；瘹ぞ厶窃谒性趹腋顟B(tài) 下在4。/。(w/w)的濃度下高壓蒸氣處理。在室溫下冷卻該懸浮液后，添 加145 ja 1 HC1并保持該混合物在攪拌下18h以允許完成殼聚糖溶解。 使用冰浴將該殼聚糖溶液冷卻至大約5'C并添加3. 5g冷卻的甘油。然 后通過逐滴添加冷卻的稀NaOH將凝膠的pH值調(diào)節(jié)到6.8。最后，添 加冷水以獲得35g的總質(zhì)量。如圖8所示，包含甘油的透明水凝膠在 37。C下顯示跟隨時間其粘彈性性能的提高，其中膠凝時間為135分鐘， 而不包含甘油的制劑在180分鐘后不顯示凝膠化點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.在高于5℃的溫度下形成無磷酸鹽透明水凝膠的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，所述組合物包含基于總組合物，0.1-5.0w/w％用羥基化堿中和的分子量不小于100kDa且脫乙酰化度為40-70％的重乙?；瘹ぞ厶牵突诳偨M合物，1-30w/w％選自多糖和衍生自多糖的多元醇的絡(luò)合劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其中基于 總組合物，該重乙?；瘹ぞ厶堑暮繛?. 5 - 3. Ow/w%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其中 該重乙酰化殼聚糖的脫乙?；葹?5 - 65%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 - 3中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組合 物，其中該重乙?；瘹ぞ厶堑姆肿恿坎恍∮?00kDa。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組合 物，其中基于總組合物，該絡(luò)合劑的含量為5-15w/w%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 - 5中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組合 物，其中該絡(luò)合劑是多糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其中該多 糖選自單糖和二糖。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其中該多 糖是選自D-葡萄糖、果糖和塔格糖的單糖。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其中該多 糖是選自海藻糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的二糖。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，其中該 二糖是海藻糖。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組 合物，其中該絡(luò)合劑是選自甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤 藻糖醇、乳糖醇和麥芽糖醇的衍生自多糖的多元醇。
12. 通過將除包含甘油作為絡(luò)合劑的組合物之外的權(quán)利要求l-11中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組合物凍干而獲得的凍千物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-11中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組 合物的制備方法，該方法包括以下步驟a) 將合適量的分子量不小于100kDa且脫乙?；葹?0 - 70%的 重乙酰化殼聚糖溶解在含水HC1介質(zhì)中并將所述酸性殼聚糖溶液冷卻 到低于5r的溫度；b) 如下將步驟a)中獲得的冷卻的殼聚糖溶液中和將預(yù)先冷卻 到低于5。C的溫度的含水輕基化堿添加到該冷卻的殼聚糖溶液中直至 該冷卻的殼聚糖溶液顯示6. 7 - 7， 1的pH值；c) 在溶解步驟a)期間或之后，或在中和步驟b)之前、期間或之 后添加合適量的選自多糖和衍生自多糖的多元醇的絡(luò)合劑，和d) 任選地，冷凍所獲得的含水熱固性中和的殼聚糖組合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，還包括在溶解步驟a)之前將該重 乙?；瘹ぞ厶菧缇牟襟E。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中在步驟b)中，羥基化堿 是NaOH。
16. 權(quán)利要求12的凍干物的制備方法，該方法包括將通過根據(jù)權(quán) 利要求13-15中任一項的方法獲得的含水熱固性中和的殼聚糖組合 物凍干，前提條件是該組合物不包含甘油作為絡(luò)合劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求l-ll中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組 合物作為藥物遞送系統(tǒng)的用途。
18. 根據(jù)權(quán)利要求l-11中任一項的含水熱固性中和的殼聚糖組 合物用于制備可注射制劑的用途。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12的凍干物用于制備藥物遞送系統(tǒng)的用途。
20. 根據(jù)權(quán)利要求12的凍干物用于制備可注射制劑的用途。
全文摘要
在高于5℃的溫度下形成無磷酸鹽透明水凝膠的含水熱固性中和的殼聚糖組合物，基于總組合物包含0.1-5.0w/w％用羥基化堿中和的分子量不小于100kDa且脫乙?；葹?0-70％的重乙酰化殼聚糖，和1-30w/w％選自多糖和衍生自多糖的多元醇的絡(luò)合劑。所述組合物可用于制備可注射制劑。
文檔編號C08B37/00GK101360479SQ200580052497
公開日2009年2月4日 申請日期2005年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日
發(fā)明者O·喬丹, R·古爾尼, V·卡拉提-比森, Y·舒茨 申請人:梅迪多姆實(shí)驗室股份有限公司