專利名稱：沙拉沙星的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種喹諾酮類抗生素的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用，尤其涉及一種沙拉沙星(sarafloxacin)的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的下列名稱適用于整個(gè)說明書和權(quán)利要求書BSA＝牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司產(chǎn)品PBS＝磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-G75＝葡聚糖凝膠，Sigma公司產(chǎn)品Sarafloxacin-EDC＝沙拉沙星與碳二亞胺形成的活性中間體Glutar＝(Glutaraldehyde)戊二醛，上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品透析膜美國(guó)聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品沙拉沙星(sarafloxacin)屬于喹諾酮類抗生素。這類抗生素由于其抗菌譜廣，殺菌能力強(qiáng)，是繼土霉素之后在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用的藥物。這類藥物可以有效地預(yù)防和治療家禽細(xì)菌和霉形體疾病。沙拉沙星是其中最常用最有效的藥物之一。但人們通過研究逐漸發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類抗生素在動(dòng)物源食品中的殘留對(duì)人體有毒害。作為一種人畜共用藥，喹諾酮類抗生素在食品中的殘留通過食物鏈對(duì)人體健康危害很大。新英格蘭明尼蘇達(dá)州衛(wèi)生署的KIRK E SMITH為首的研究小組發(fā)現(xiàn)，家禽使用喹諾酮類藥物使彎曲桿菌產(chǎn)生了耐藥性。根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心的調(diào)查，一種由食品引起疾病的彎曲桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性由1998年的13.6％上升到1999年的17.6％。而我國(guó)尚未頒布動(dòng)物源食品中殘留的喹諾酮類藥物的檢測(cè)方法和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)由于考慮到這類藥物的交叉感染，已經(jīng)開始在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中禁用喹諾酮類抗生素。我國(guó)雖尚未在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中禁用喹諾酮類抗生素，但有嚴(yán)格的停藥期規(guī)定。隨著人民生活水平的提高及我國(guó)加入WTO，對(duì)動(dòng)物源食品的品質(zhì)要求也越來(lái)越高，食品中藥物殘留的檢測(cè)必將法制化，常規(guī)化。因此，研究喹諾酮類藥物在食品中的殘留限量和檢測(cè)方法是非常必要的。
在抗生素藥物殘留的檢測(cè)中，儀器法如液相色譜和質(zhì)譜以及液相質(zhì)譜聯(lián)用是應(yīng)用最廣泛的方法。這些方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法。但儀器法價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，且造成有機(jī)溶劑污染，需要大型儀器設(shè)備，需要專門的技術(shù)人員，所以難于用于現(xiàn)場(chǎng)操作。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)易，不需要專門人員操作等優(yōu)點(diǎn)，這使得ELISA法成為一種理想的，可用于常規(guī)掃描的檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的核心是需要高質(zhì)量的抗體。大多數(shù)抗生素包括喹諾酮類藥物都是小分子有機(jī)化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，必須把這些化合物轉(zhuǎn)變成能引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。但是，據(jù)我們所知，現(xiàn)在世界上尚未有關(guān)于沙拉沙星的免疫原的合成及其抗體制備的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種沙拉沙星的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用，利用本發(fā)明提供的沙拉沙星的偶聯(lián)物可以作為免疫原，引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)沙拉沙星有特異反應(yīng)的抗體，從而獲得相應(yīng)的抗體。
本發(fā)明的沙拉沙星(Sarafloxacin)的偶聯(lián)物，由沙拉沙星半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)偶聯(lián)構(gòu)成，所述載體物質(zhì)優(yōu)選為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽或半合成多肽。
上述的沙拉沙星的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)優(yōu)選是牛血清蛋白。
本發(fā)明所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的沙拉沙星的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9Kda。
上述沙拉沙星的偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體(2)紫外吸收光譜280，323，331nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547上述沙拉沙星的偶聯(lián)物，優(yōu)選n為整數(shù)1～10，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
上述沙拉沙星的偶聯(lián)物的制備方法是將沙拉沙星與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
上述沙拉沙星的偶聯(lián)物的制備方法具體由如下步驟組成(1)溶液A的制備將沙拉沙星，羥基琥珀酰亞胺，碳二亞胺鹽溶液，以摩爾比1∶3～5∶5～7溶解在二甲基甲酰胺中，反應(yīng)4～6小時(shí)，生成沙拉沙星與碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)溶液B的制備把上述BSA溶于磷酸緩沖溶液中，配成9.5～15mg/ml的溶液，備用；(3)在20℃～30℃條件下，以不斷攪拌方式，把溶液A逐漸加入到溶液B中，反應(yīng)4～6小時(shí)，得到溶液C；(4)將溶液C用磷酸緩沖液透析70～78小時(shí)，每10～12小時(shí)更換一次透析液；(5)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液C，取上清液；(6)凍干上清液，得到沙拉沙星的偶聯(lián)物粗品；(7)用葡聚糖凝膠層析作純化分離，PBS緩沖溶液為洗脫液，收集沙拉沙星的偶聯(lián)物純品，再經(jīng)凍干得到白色固體粉末狀的，具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的沙拉沙星免疫原偶聯(lián)物。
其中，步驟(1)所述沙拉沙星，羥基琥珀酰亞胺，碳二亞胺鹽的摩爾比為1∶4∶6。
其中，所述溶液C中沙拉沙星與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比為6∶1。
其中，所述的磷酸緩沖液pH為7.40，濃度為0.01M；所述的葡聚糖凝膠層析采用Sephadex-G75。
上述沙拉沙星的偶聯(lián)物作為免疫原在制備沙拉沙星特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
利用本發(fā)明的技術(shù)方案可以成功地把半抗原沙拉沙星與載體蛋白特別是牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)起來(lái)，從而合成了能夠在動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完全免疫原。利用此免疫原對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，可以制得對(duì)半抗原沙拉沙星有特異反應(yīng)的抗體。
經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定，利用本發(fā)明方法所合成的沙拉沙星-牛血清蛋白偶合物(Sarafloxacin-BSA Conjugate)對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫后，其抗血清效價(jià)達(dá)到1∶51200。這為沙拉沙星的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法中所用檢測(cè)試劑的開發(fā)以及制備沙拉沙星的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒提供了廣闊的應(yīng)用空間。在實(shí)際應(yīng)用中，只需把該抗體鍍?cè)谖⒖妆P內(nèi)，就可以用來(lái)檢驗(yàn)動(dòng)物源食品中沙拉沙星的殘留。由于上述方法具有簡(jiǎn)易，快速，特異，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，所以可以用于食品檢驗(yàn)檢疫中的初步掃描檢測(cè)之用。這樣不但可以節(jié)省大量的檢驗(yàn)時(shí)間，還可以便于現(xiàn)場(chǎng)操作，從而彌補(bǔ)了儀器法費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，需要大型儀器設(shè)備支持，需要專門的技術(shù)人員操作，難于用于現(xiàn)場(chǎng)的不足。所以，半抗原沙拉沙星與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物的合成及抗血清的成功制備為這種快速檢驗(yàn)法奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中，加入沙拉沙星13.9mg(0.042mmol)，羥基琥珀酸亞胺(NHS)19.33mg(0.168mmol)，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)48.3mg(0.252mmol)，溶解于10ml二甲基甲酰胺(DMF)中。反應(yīng)4小時(shí)。得到溶液A。備用。
(2)溶液B的制備在100ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，將476mg BSA加入50ml PBS(pH＝7.4，0.01M)中。得到溶液B。備用。
(3)制備沙拉沙星免疫原偶聯(lián)物在20℃和攪拌下，逐步把溶液A加入到溶液B中。反應(yīng)4小時(shí)。得到沙拉沙星免疫原溶液。用PBS緩沖液透析三天，每12小時(shí)更換一次透析液。高速離心(20,000g)30分鐘。凍干上清液，得到412mg白色固體粉末，即為沙拉沙星免疫原粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進(jìn)行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.4)為洗脫液。收集沙拉沙星偶合物純品。凍干得到沙拉沙星免疫原偶合物固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的偶聯(lián)和偶聯(lián)率。結(jié)果為紫外吸收光譜280，323，331nm紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547實(shí)施例2(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中，加入沙拉沙星20.0mg(0.060mmol)，羥基琥珀酸亞胺(NHS)19.33mg(0.240mmol)，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)69.0mg(0.360mmol)，溶解于15ml二甲基甲酰胺(DMF)中。反應(yīng)4小時(shí)。得到溶液A。備用。
(2)溶液B的制備在100ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，將685mg BSA加入60ml PBS(pH＝7.4，0.01M)中。得到溶液B。備用。
(3)制備沙拉沙星免疫原偶聯(lián)物在25℃和攪拌下，逐步把溶液A加入到溶液B中。反應(yīng)4小時(shí)。得到沙拉沙星免疫原溶液。用PBS緩沖液透析78小時(shí)，每12小時(shí)更換一次透析液。高速離心(20,000g)30分鐘。凍干上清液，得到482mg白色固體粉末，即為沙拉沙星免疫原粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進(jìn)行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.4)為洗脫液。收集沙拉沙星偶合物純品。凍干得到沙拉沙星免疫原偶合物固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的偶聯(lián)和偶聯(lián)率。
實(shí)施例3(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中，加入沙拉沙星40.0mg(0.120mmol)，羥基琥珀酸亞胺(NHS)38.66mg(0.480mmol)，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)138.0mg(0.720mmol)，溶解于15ml二甲基甲酰胺(DMF)中。反應(yīng)6小時(shí)。得到溶液A。備用。
(2)溶液B的制備在100ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，將1.2g BSA加入80ml PBS(pH＝7.4，0.01M)中。得到溶液B。備用。
(3)制備沙拉沙星免疫原偶聯(lián)物在30℃和攪拌下，逐步把溶液A加入到溶液B中。反應(yīng)6小時(shí)。得到沙拉沙星免疫原溶液。用PBS緩沖液透析70小時(shí)，每10小時(shí)更換一次透析液。高速離心(20,000g)30分鐘。凍干上清液，得到762mg白色固體粉末，即為沙拉沙星免疫原粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進(jìn)行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.4)為洗脫液。收集沙拉沙星偶合物純品。凍干得到沙拉沙星免疫原偶合物固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的偶聯(lián)和偶聯(lián)率。
實(shí)施例4取沙拉沙星-牛血清蛋白偶合物純品，以濃度為0.01M、pH為7.40的磷酸緩沖液稀釋為100mg/ml，按每千克體重100mg的量對(duì)4只新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，間隔1～2月，如此重復(fù)1～2次，取新西蘭大白兔血清，檢測(cè)針對(duì)沙拉沙星有特異反應(yīng)的抗體，經(jīng)ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定，其抗血清效價(jià)為1∶51200。
權(quán)利要求
1.一種沙拉沙星的偶聯(lián)物，由沙拉沙星半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)偶聯(lián)構(gòu)成，所述載體物質(zhì)為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽或半合成多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)是牛血清蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的沙拉沙星的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9Kda。上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體(2)紫外吸收光譜280，323，331nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547。
4.如權(quán)利要求3所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物，其中n為整數(shù)1～10，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是，將沙拉沙星與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
6.如權(quán)利要求5所述沙拉沙星的偶聯(lián)物的制備方法，該方法步驟如下(1)溶液A的制備將沙拉沙星，羥基琥珀酰亞胺，碳二亞胺鹽溶液，以摩爾比1∶3～5∶5～7溶解在二甲基甲酰胺中，反應(yīng)4～6小時(shí)，生成沙拉沙星與碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)溶液B的制備把上述BSA溶于磷酸緩沖溶液中，配成9.5～15mg/ml的溶液，備用；(3)在20℃～30℃條件下，以不斷攪拌方式，把溶液A逐漸加入到溶液B中，反應(yīng)4～6小時(shí)，得到溶液C；(4)將溶液C用磷酸緩沖液透析70～78小時(shí)，每10～12小時(shí)更換一次透析液；(5)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液C，取上清液；(6)凍干上清液，得到沙拉沙星的偶聯(lián)物粗品；(7)用葡聚糖凝膠層析作純化分離，PBS緩沖溶液為洗脫液，收集沙拉沙星的偶聯(lián)物純品，再經(jīng)凍干得到白色固體粉末狀的，具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的沙拉沙星免疫原偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求6所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是，步驟(1)所述沙拉沙星，羥基琥珀酰亞胺，碳二亞胺鹽的摩爾比為1∶4∶6。
8.如權(quán)利要求6所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是，所述溶液C中沙拉沙星與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比為6∶1。
9.如權(quán)利要求6所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是，所述的磷酸緩沖液pH為7.40，濃度為0.01M；所述的葡聚糖凝膠層析采用Sephadex-G75。
10.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的沙拉沙星的偶聯(lián)物作為免疫原在制備沙拉沙星特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通式(I)的沙拉沙星的偶聯(lián)物，由沙拉沙星半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)優(yōu)選牛血清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的沙拉沙星的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20，BSA為牛血清蛋白，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa。本發(fā)明還公開了所述的偶聯(lián)物的制備方法，即將沙拉沙星與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，快速，特異，用制備的沙拉沙星偶聯(lián)物免疫大白兔，其抗血清效價(jià)達(dá)1∶51200，為進(jìn)一步制備沙拉沙星的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1740792SQ20051004406
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2005年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日
發(fā)明者郗日沫, 盧圣欣, 張玉蘭 申請(qǐng)人:山東大學(xué)