專利名稱：：用于生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)EC24.1.19，并涉及γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法及應(yīng)用。通常情況下，環(huán)糊精是由淀粉或淀粉樣底物制備而得的。在這種制備過程中，CGTase被用作為催化劑，將淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精(CD)。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到熱動力學(xué)平衡狀態(tài)時(CD產(chǎn)量最大)，由于熱動力學(xué)的原因，不論反應(yīng)中用的CGTase為何種類型，淀粉都將主要被轉(zhuǎn)化為β-CD。然而在起始階段，即淀粉轉(zhuǎn)化反應(yīng)剛剛開始時，使用不同類型的轉(zhuǎn)移酶會使初級階段產(chǎn)物混合物在組成上有所不同。依據(jù)此起始階段中所產(chǎn)生的CD主要是α-，β-，還是γ-類型的，分別將對應(yīng)的CGTase劃分成α-，β-，和γ-類型。這些酶適用于、并已經(jīng)用于CD的工業(yè)化生產(chǎn)。迄今為止，只在細(xì)菌中檢測到有這些酶的存在。到目前為止，α-CGTase僅在軟化芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、和Klebsiellaoxytoca中得到鑒定。在環(huán)狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、Bacillusohbensis、微球菌、以及未精確分類的嗜堿性芽孢桿菌如芽孢桿菌38-2，17-1，1011或1-1中，都已檢測到β-CGTase。有報道說，在枯草芽孢桿菌313，芽孢桿菌A1-6和芽孢桿菌290-3中具有能在初始階段催化γ-CD形成的高活性的天然轉(zhuǎn)移酶。由于環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)過程中所用的CGTase總是將淀粉轉(zhuǎn)化成多種環(huán)糊精的混合物，因而，人們發(fā)展出了各種方法以分離純化環(huán)糊精(α-、β-或γ-型的)。這些方法描述如下通過色譜法，例如根據(jù)其分子量的差異(US-A-4,808,232)可從反應(yīng)產(chǎn)物混合物中分離出特定的CD來。通常，在將淀粉以酶學(xué)方法轉(zhuǎn)化成環(huán)糊精時，可在反應(yīng)體系中加入只與某一特定的CD發(fā)生反應(yīng)的配位劑，從而使該種CD形成不溶性的配合物。然后，可以用物理學(xué)的方法，從反應(yīng)混合物體系中將其分離出來。接著再將該配合物溶解以純化出均一的CD(參見EP0291067)。如果采用的是γ-CGTase，在反應(yīng)混合物體系中加入有機(jī)溶劑，如乙醇，可使產(chǎn)物的組成向γ-CD的方向轉(zhuǎn)移。(參見J.Ferm.Bioeng.(1990)70(3)，pp.150-154)如果要制備某一種類型的純化CD，則在生產(chǎn)的每一個過程中都應(yīng)對所使用的CGTase進(jìn)行最優(yōu)化選擇，以使所形成的初始產(chǎn)物中該類型的CD盡可能地多。關(guān)于α-和β-CGTase特異性的現(xiàn)有知識已足以進(jìn)行相應(yīng)的環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。相比而言，沒有一個已知的天然γ-CGTase的產(chǎn)物特異性能允許進(jìn)行相應(yīng)規(guī)模的γ-CD的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，要制備γ-CD，建議參照CA115157165，通過添加γ-CD特異性的配位劑糖基化甘草甜，麥芽糖和一種CGTase，可將α-和/或β-環(huán)糊精酶促轉(zhuǎn)化為γ-CD。制備γ-CD的另一種選擇方案是通過對β-CGTase的特定氨基酸殘基進(jìn)行置換以增強(qiáng)它的γ-CD特異性，從而使該突變后的轉(zhuǎn)移酶所產(chǎn)生的γ-CD比例增加，以便能夠進(jìn)行工業(yè)化規(guī)模的γ-CD的生產(chǎn)。已知可行的誘變方案參見DE4324650A1(相應(yīng)于US-A-5,474917)，Biochemistry(1994)33(33)，pp.9929-9936，Biochemistry(1995)34(10)，pp.3368-3376，和J.Biotech.(1994)32，pp.283-288。通過對β-CGTase進(jìn)行誘變所獲得的這種CGTase衍生物對γ-CD的特異性增加，依據(jù)其產(chǎn)物類型分布的情況，理論上是適用于進(jìn)行γ-CD的工業(yè)化生產(chǎn)的。但它的一個不足之處是引入相應(yīng)的突變之后，會使酶的比活下降。根據(jù)所引入的氨基酸殘基的不同，誘變后的酶對γ-CD的特異性雖然都提高了，但催化CD生成的活性只有原型轉(zhuǎn)移酶的25％到59％(Biochemistry(1994)33(33)，pp.9929-9936，Biochemistry(1995)34(10)，pp.3368-3376)。本發(fā)明的目的在于提供這樣的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)，其在將淀粉或淀粉樣底物轉(zhuǎn)化為CD時，能形成更高比例的γ-CD，并且其比活不低于原型轉(zhuǎn)移酶的60％。本發(fā)明的另一個目的在于提供制備所述CGTase的方法。本發(fā)明的再一個目的在于提供生產(chǎn)γ-CD的方法。上述的第一個目的是如下實現(xiàn)的使已知CGTase的第155位至195位(包括195位)區(qū)域的氨基酸序列缺失至少1個氨基酸以獲得具有不同氨基酸序列的CGTase；此處所指的蛋白質(zhì)序列的第1位是信號肽起始位點，這種缺失誘變增加了該蛋白的γ-CGTase活性。本發(fā)明的含義中，γ-CGTase的活性提高的含義為在使用CGTase催化淀粉或淀粉樣底物所得到的產(chǎn)物混合物中本發(fā)明的CGTase的優(yōu)選的氨基酸序列是在已知CGTase的第155位-195位氨基酸之間的區(qū)域缺失4到8個氨基酸殘基，此處所指的蛋白質(zhì)序列的第1位是CGTase信號肽的起始位點，這種缺失突變增加了該蛋白的γ-CGTase活性。本發(fā)明的CGTase的特別優(yōu)選的氨基酸序列是在已知CGTase的第155位-195位氨基酸之間的區(qū)域缺失6個氨基酸殘基，此處所指的蛋白質(zhì)序列的第1位是CGTase信號肽的起始位點，這種缺失突變增加了該蛋白的γ-CGTase活性。在本申請中，其它各處提及到氨基酸位置的情況時，其第1位都是指CGTase信號肽的起始位點。此外，有幾種CGTase是特別優(yōu)選的，其氨基酸序列與表1中所列的CGTase序列的不同之處至少在于缺失了以粗體字母所表示的氨基酸殘基，其余的氨基酸序列則與表1中所列的同源，其CGTase活性與未缺失的原型CGTase一致。本發(fā)明的CGTase的實例是經(jīng)由表1所列的CGTase誘變而得，或是由其他CGTase通過在第155位到195位區(qū)域缺失特定的氨基酸殘基而獲得的。在此區(qū)域中缺失4到8個殘基的氨基酸殘基的CGTase較為優(yōu)選。特別優(yōu)選的是根據(jù)表1所列，在此區(qū)域中缺失了6個以粗體字母表示的氨基酸殘基后所獲得的CGTase。本發(fā)明的CGTase的其它實例是在序列中缺失與表1所指定的氨基酸相同的殘基，而其CGTase活性仍與未經(jīng)缺失的一致。進(jìn)一步，本發(fā)明的CGTase實例是在轉(zhuǎn)移酶序列的155位到195位區(qū)域缺失表1以粗體字母表示的氨基酸殘基，其余的氨基酸序列與表1所列的微生物來源的CGTase氨基酸序列同源，這些經(jīng)缺失突變的轉(zhuǎn)移酶具有CGTase活性。表1β-CGTase的來源位置氨基酸序列Bacillusohbensis160-PNHSSPALETDPSYAENGAVYNDG-(SEQIDNO.1)軟化芽孢桿菌165-PNHTSPADRDNPGFAENGGMYDNG-(SEQIDNO.2)芽孢桿菌1-1160-PNHSSPALETNPNYVENGAIYDNG-(SEQIDNO.3)環(huán)狀芽孢桿菌#8172-PNHTSPAMETDTSFAENGRLYDNG-(SEQIDNO.4)意外的是本發(fā)明的CGTase較用來制備它們的原型CGTase而言，具有更高的γ-CD特異性，同時，突變后的酶同原型酶相比在CGTase總比活上僅有微小的降低。在轉(zhuǎn)化淀粉或淀粉樣底物時，本發(fā)明的CGTase所產(chǎn)生的CDs在產(chǎn)物種類分布上其γ-CD除以α-CD與β-CD之和的商值，大于經(jīng)由各種未經(jīng)誘變的原型CGTase所得到的產(chǎn)物的商值。表1舉例列出了幾種CGTase，說明了普遍存在于CGTase中的同源氨基酸序列區(qū)域，以及此區(qū)域中對產(chǎn)物特異性有影響作用的6個氨基酸殘基。表1中所列的每一個氨基酸序列的第一個氨基酸的數(shù)字是標(biāo)識其位置，在此，各特定CGTase序列信號肽的第一個氨基酸被記作第1位。利用周知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以在所有的CGTase中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的序列區(qū)域。例如，這可以通過計算各種序列對比的算法規(guī)則來達(dá)到?？蓮纳虡I(yè)來源獲得的Wisconsin序列分析軟件包(GeneticComputerGroup，Madison)中的序列分析程序，即是一個適宜的計算機(jī)算法規(guī)則。通過誘變CGTase上述區(qū)域的方法，本發(fā)明的酶可用已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從任何CGTase中制備而來，正如本申請實施例中所述。因此，通常編碼某種CGTase的基因按此種方法誘變，從而得到編碼本發(fā)明的CGTase的基因。因此，本發(fā)明也涉及制備編碼本發(fā)明的CGTase的突變基因的方法，其中通過周知的誘變方法，使編碼原型CGTase的DNA序列發(fā)生誘變，從而使得由誘變的基因所編碼第155到第195位區(qū)域的氨基酸序列與由未誘變的基因編碼的氨基酸序列相比，至少缺失了1個氨基酸殘基。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中，編碼原型CGTase的基因的DNA序列通過已知的誘變方法誘變，從而使突變基因的DNA序列所編碼的氨基酸序列與由未突變的基因的DNA編碼的氨基酸序列相比，缺失了第155到195位區(qū)域中的4至8個氨基酸殘基。更優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中，編碼原型CGTase的基因的DNA序列通過已知的誘變方法誘變，從而使突變基因的DNA序列所編碼的氨基酸序列與由未突變的基因的DNA編碼的氨基酸序列相比，缺失了第155到195位區(qū)域中的6個氨基酸殘基。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及制備γ-CGTase的方法，其中至少一種所述的DNA序列于某一種微生物中得到表達(dá)。所有的CGTase(原型CGTase)基因均適合制備本發(fā)明的CGTase。原型CGTase可以是所有天然CGTase，也可以是經(jīng)突變獲得的CGTase。例如那些產(chǎn)物類型分布發(fā)生改變，但其突變方式又不同于本發(fā)明的CGTase。(如DE4324650A1，對應(yīng)于US-A-5,474,917)。優(yōu)選的原型CGTase是那些產(chǎn)物類型分布已發(fā)生改變，但其誘變方式又不同于本發(fā)明的CGTase。(參見DE4324650A1)。編碼原型CGTase的基因經(jīng)已知方法分離出，而本發(fā)明所述的突變則是經(jīng)“體內(nèi)”或“體外”誘變方法引人。這些方法在本領(lǐng)域也是周知的?！绑w內(nèi)”誘變方法可特定地理解為在某些微生物的染色體或附加體上已存在編碼CGTase的基因，它們經(jīng)誘變劑、紫外線、亞硝基胍、乙基甲基磺酸酯以非特異的方式發(fā)生突變。這些方法在如下資料中有闡述，如，MillerJ.H(1972)的“分子遺傳學(xué)實驗”，ColdSpringHarborLaboratory；ColdSpringHarbor，N.Y.。隨后，用已知方法如Sanger等在PNAS74(1977)5463-5467中所闡述的鏈終止序列分析法，鑒定CGTase中至少一個編碼氨基酸的密碼子的缺失，這類缺失是在該CGTase的第155到195位區(qū)域中引入的。優(yōu)選的突變體是按本發(fā)明在所指定區(qū)域中缺失了4至8個密碼子。特別優(yōu)選的突變體是缺失了6個密碼子，最優(yōu)選的突變體是編碼如表1中粗體表示的氨基酸殘基的6個密碼子的缺失，或是編碼其它CGTase中與這些同源的氨基酸殘基的6個密碼子發(fā)生缺失。按本發(fā)明的含義，“體外”誘變方法是指分離出的CGTase基因或其片段以已知的方法加以修飾，使得該基因編碼的CGTase在第155到195位區(qū)域中至少一個編碼氨基酸殘基的密碼子缺失。優(yōu)選的突變體是指經(jīng)修飾后在所指定區(qū)域中缺失了4至8個密碼子。特別優(yōu)選的突變體是缺失了6個密碼子。特別是，最優(yōu)選的突變體是經(jīng)修飾后在所指定的區(qū)域內(nèi)缺失了編碼如表1中粗體表示的氨基酸殘基的6個密碼子，或是編碼其它CGTase中與這些同源的氨基酸殘基的6個密碼子發(fā)生缺失。本發(fā)明因而還涉及編碼本發(fā)明γ-CGTase的DNA序列。本領(lǐng)域所熟知的“體外”誘變方法的實例是用“PCR”技術(shù)進(jìn)行特異的(生物技術(shù)BioTechniques(1992)13(3)，pp.342-346)或非特異的(生物技術(shù)BioTechniques(1989)1(1)，PP.11-15)誘變方法。也可以用合成的寡核苷酸片段以定點方式將突變引入目的基因。這一方法可按所謂的“單鏈法”(AusubelF.M.等(1987)，分子生物學(xué)現(xiàn)有技術(shù)，GreenPublishingAssociates)進(jìn)行，或按“雙鏈法”(Promega1992-1993Catalogue，150)進(jìn)行，還可以按其它描述的方法，如在“遺傳學(xué)年度綜述”Ann.Rev.Genet.(1985)19，pp.423-462所述的方法。本發(fā)明的CGTase的主要應(yīng)用領(lǐng)域是其在從淀粉中分離γ-CD中的應(yīng)用。本發(fā)明的CGTase可根據(jù)現(xiàn)有的制備方法用作此目的。本發(fā)明進(jìn)而還涉及利用CGTase轉(zhuǎn)化淀粉制備γ-CD的方法，其中所使用的CGTase至少為權(quán)利要求1至權(quán)利要求4中所述的CGTase的一種。例如，在以下文獻(xiàn)中對目前生產(chǎn)γ-CD的制備方法作了描述，其中本發(fā)明的CGTases可以用來替代這些方法中指定的CGTases—發(fā)酵和生物工程雜志(1990)70(3)，pp.190-192利用來自芽孢桿菌AL-6的生成β-和γ-CD的CGTases，在乙醇存在時制備γ-CD，結(jié)果提高了γ-CD的產(chǎn)量。—CA10757466描述了利用來自芽孢桿菌313的γ-CGTase制備γ-CD?！狤P291,067用來自軟化芽孢桿菌的CGTase制備γ-CD。γ-CD產(chǎn)物特異性通過加入一種配位劑，如環(huán)十六-8-內(nèi)-1-酮獲得?！狣E4009822(相應(yīng)于US-A-5,409,824)利用來自芽孢桿菌290-3的γ-CGTase生產(chǎn)γ-CD。與α-CD和β-CD相比較，γ-CD具有特殊的優(yōu)勢，使其成為一系列應(yīng)用中唯一可能或最適合的CD。與由6個葡萄糖單位組成的α-CD相比較，由8個葡萄糖單位組成的γ-CD具有更大的疏水孔穴，使其可以與由于空間原因不能與α-CD配合的客體分子形成配位物。與β-CD(室溫下在水中的溶解度約18.5g/L)相比較，γ-CD具有更高的可溶性(室溫下約232.0g/L)，因而比β-CD更適合于水溶液中的配合反應(yīng)。與β-CD和β-CD衍生物相比，γ-CD的另一個優(yōu)點是其低毒性。在動物模型中，無論是口服或是靜脈注射，α-CD衍生物和β-CD衍生物都比γ-CD更具有毒性。以下的實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明。實施例1環(huán)狀芽孢桿菌#8(DSM10559)CGTase的誘變按照熟練技術(shù)人員已知的方法，缺失CGTase結(jié)構(gòu)基因中編碼相應(yīng)氨基酸殘基的堿基三聯(lián)密碼，得到了來源于環(huán)狀芽孢桿菌#8(參見表1；保藏在Braunschweig的DSMZ(德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)，入藏號為DSM10559)的β-CGTase的155-195位氨基酸殘基間的區(qū)域中的任何氨基酸殘基的缺失，特別是179-184位的六個氨基酸殘基METDTS(SEQIDNO.5)的缺失。為了便于誘變，來自環(huán)狀芽孢桿菌#8的β-CGTase基因首先克隆人商業(yè)化的E.coli載體pUC19(BoehringerMannheim)。為達(dá)此目的，按AusubelF.M.，分子生物學(xué)通用方案，1卷；GreenePublishingAssociates&Wiley-InterscienceN.Y.所描述的方法從環(huán)狀芽孢桿菌#8中分離染色體DNA，用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI(Boehringer，Mannheim.)酶切，分離2至5kb大小的片段，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI(Boehringer，Mannheim.)酶切的pUC19DNA在T4連接酶作用下，于16℃共孵育12小時。連接混合物用已知方法轉(zhuǎn)化E.coliK12感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，從在含淀粉的指示平板上形成淀粉降解圈的E.coli細(xì)胞中分離出攜帶相應(yīng)于環(huán)狀芽孢桿菌#8的β-CGTase基因的重組質(zhì)粒(Maniatis，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室(1982)N.Y.pp86-92)。利用Amersham(Braunschweig)出售的并基于Eckstein開發(fā)的方法(核酸研究，1986，14，pp9679-9698，核酸研究，1988，16pp791-802)的2.1版寡核苷酸指導(dǎo)的體外誘變系統(tǒng)，進(jìn)行基因誘變，誘變完全按照Amersham誘變系統(tǒng)所附的方案進(jìn)行。方法概括如下，詳細(xì)內(nèi)容可從該誘變體系的方案手冊獲得?？寺≡趐UC19中的環(huán)狀芽孢桿菌#8的β-CGTase基因中編碼本發(fā)明所指的CGTase第155-195位氨基酸殘基間的區(qū)域的部分片段，利用商購可得的酶如限制性內(nèi)切酶和T4連接酶(Boehringer，Mannheim.)，克隆入商業(yè)化的E.coli載體M13(NewEnglandBiolabs)。一條1.6kbAccI片段就是這類片段中的一個，該片段克隆人AccI切割的M13載體。根據(jù)Amersham提供的實驗方案與上述的誘變系統(tǒng)，從接納了重組M13載體的E.coli宿主細(xì)胞中分離出單鏈重組M13DNA(初始DNA)。為了精確的誘變，合成了化學(xué)精制的誘變寡核苷酸，在每種情況下都含有目的序列。這種寡核苷酸可以例如，從MWG(Ebersherg)購得。誘變寡核苷酸序列的選擇應(yīng)使其堿基順序與初始DNA核苷酸序列的某一部分反向互補(bǔ)，該部分初始DNA位于準(zhǔn)備缺失的環(huán)狀芽孢桿菌#8的β-CGTase基因的三聯(lián)密碼的上游15個堿基和下游15個堿基。表2描述了所用的誘變寡核苷酸。表25’-CACACCTCTCCAGCGTTTGCCGAAAATGGC-3’(SEQIDNO.6)表2所描述的誘變寡核苷酸的使用結(jié)果產(chǎn)生了一個編碼缺失六個氨基酸殘基METDTS(序列號IDNO.5)的氨基酸片段的β-CGTase基因片段。利用T4多核苷酸激酶和ATP(Amersham)對誘變寡核苷酸5’端磷酸化。磷酸化的誘變寡核苷酸與初始DNA同源區(qū)相結(jié)合。為此，5μg的單鏈初始DNA與大約4pmol的磷酸化誘變寡核苷酸在70℃共同孵育3分鐘，再于37℃孵育30分鐘。這樣以結(jié)合在初始DNA的誘變寡核苷酸作為合成起始點，以初始DNA作為合成突變DNA的模板，合成了除了缺失的核苷酸外與初始DNA互補(bǔ)的DNA鏈。合成本身是在加入了DNA聚合酶Klenow片段(Amersham)、T4DNA連接酶和核苷酸混合物，在16℃作用15小時進(jìn)行的。其中的核苷酸混合物含有dATP，dGTP，dTTP和代替dCTP的硫代核苷酸dCTPS(Amersham)。殘留的單鏈初始DNA分子從合成混合物中除去。為此，混合物用NaCl處理，并用一特異結(jié)合單鏈DNA的硝酸纖維素濾膜(Amersham)過濾。保留在濾過液中的雙鏈雜合DNA通過乙醇沉降濃縮去鹽。雜合DNA與NciI(Amersham)(一種識別核苷酸序列CC(G/C)GG但僅作用于天然DNA鏈而不切割含有核苷酸類似物dCTPS的DNA鏈的限制性內(nèi)切酶)在合適的孵育緩沖液(Amersham)中于37℃作用90分鐘。該處理只導(dǎo)致非誘變鏈(初始DNA)的斷裂。初始DNA隨后用從自由末端降解DNA鏈的核酸外切酶III在37℃處理30分鐘除去。核酸外切酶熱失活后(70℃，15分鐘)剩下的單鏈誘變DNA鏈與DNA聚合酶I(Amersham)、T4DNA連接酶和核苷酸dATP，dCTP，dTTP及dGTP在16℃共同孵育3小時。這使誘變的單鏈DNA變成雙鏈DNA。進(jìn)一步用乙醇沉降純化后，誘變的DNA轉(zhuǎn)化入E.coli.K12感受態(tài)細(xì)胞中。通過轉(zhuǎn)化所得5個克隆的重組DNA的相關(guān)區(qū)域的序列分析，檢測誘變過程的成功。將最初為了誘變克隆入M13的DNA片段用限制性內(nèi)切酶XhoI和NdeI從確證具有突變的載體中切下。隨后，相應(yīng)的未誘變的XhoI/NdeI的片段從表達(dá)環(huán)狀芽孢桿菌#8β-CGTase的pUC19質(zhì)粒中去除，用T4DNA連接酶替換上誘變的片段。實施例2芽孢桿菌1-1β-CGTase的誘變用表3所述的寡核苷酸，以類似與實施例1所描述的方法，使編碼相應(yīng)于CGTase167-172位的氨基酸殘基LETNPN(序列號ID.No.7)(參見表1)的芽孢桿菌Bacillussp.1-1β-CGTase基因中的六個密碼子缺失(見實施例8，比較2，A))。相同的缺失還被用于導(dǎo)入DE4324650A1所描述的該CGTase衍生物中，與野生型酶相比較，通過一個氨基酸替換(Tyr---＞Trp)(見實施例8，比較2，B))增強(qiáng)了其γ-CD的特異性。表35’-CATTCATCACCGGCATATGTTGAAAATGGG-3’(SEQIDNO.8)實施例3在E.coli中生產(chǎn)環(huán)狀芽孢桿菌#8β-CGTase及其根據(jù)本發(fā)明的衍生物將實施例1所述的基于pUC19的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人分泌型E.coli菌株以生產(chǎn)環(huán)狀芽孢桿菌#8β-CGTase，及其根據(jù)實施例1所述制備的衍生物。E.coliWCM105用作分泌型E.coli.菌株，該菌株是用EP338410所述的E.coliDS410制備的。因此，為了生產(chǎn)環(huán)狀芽孢桿菌#8β-CGTase或其衍生物，將攜帶適當(dāng)?shù)腃GTase表達(dá)質(zhì)粒的E.coliWCM105細(xì)胞在含10g/l乳糖和0.1g/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(Maniatis，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室(1982)N.Y.)中于30℃水浴搖蕩72小時(250/rpm轉(zhuǎn)速)。細(xì)胞隨后經(jīng)5000×g離心分離除去。無細(xì)胞的培養(yǎng)液上清含β-CGTase或其衍生物。實施例4在E.coli.中生產(chǎn)芽孢桿菌1-1β-CGTase及其根據(jù)本發(fā)明的衍生物用實施例2所述的表達(dá)質(zhì)粒，以類似實施例3的方法實現(xiàn)生產(chǎn)目的。實施例5利用載體結(jié)合的β-環(huán)糊精吸附純化CGTase以特異性的和溫和的方式，利用Sepharose偶聯(lián)的β-CD分子親和純化CGTase。用3×10mlH2O和1×5ml0.1NNaOH先洗滌1g環(huán)氧基活化的Sepharose6B(Sigma)，Sepharose6B隨后懸浮于2ml溶于0.1NNaOH的2.8％(W/V)的β-CD溶液，在45℃孵育20小時，同時溫和搖蕩。含有β-CD和Sephadex6B的偶聯(lián)產(chǎn)物用2×5mlH2O洗滌，洗滌后的物質(zhì)懸浮于2.5％(W/V)葡萄糖水溶液中，懸浮液于室溫孵育1小時以飽和殘余的自由偶聯(lián)位點。偶聯(lián)產(chǎn)物依次用2×5mlH2O，2×5ml0.1M硼酸鹽緩沖液(pH8.0)，2×5ml0.1M乙酸鹽緩沖液(pH4.0)和2×2ml20mM三乙醇胺/ClpH7.2洗滌。偶聯(lián)產(chǎn)物用0.2ml20mM三乙醇胺/ClpH7.2(終體積約2-2.5ml)處理，于4℃保存?zhèn)溆?。為了使CGTase特異性結(jié)合到Sepharose6B偶聯(lián)的β-CD(CD-Sepharose)上，將實施例3或4獲得的無細(xì)胞的含有CGTase的培養(yǎng)液上清用0.2mlCD-Sepharose處理，在4℃孵育1.5小時，同時溫和搖蕩，在這期間，酶與CD-Sepharose相結(jié)合。酶/CD-Sepharose復(fù)合物通過離心分離(4000×g，5分鐘)，并用2×10ml20mM三乙醇胺/ClpH7.2洗滌。CGTase酶隨后通過將復(fù)合物與2ml1％β-CD的溶液在4℃共孵育1.5小時加以洗脫。最后一次離心(5min4000×g)之后，上清中含有純化的CGTase。在以這種方法純化的CGTase進(jìn)行定性前，溶液中所含的β-CD和用于洗脫的β-CD還有待除去。為此，用35ml20mMTris/HClpH7.2和5mMCaCl2(TC緩沖液)平衡商購的PD-10柱(SephadexG-25M；Pharmacia)。含β-CD的溶液用TC緩沖液配制成2.5ml并上柱。隨后用3.5mlTC緩沖液洗脫柱。這一方法獲得的洗脫液含純化的無β-CD的CGTase。實施例6淀粉到環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化利用Eur.J.Biochem.(1990)191，pp.177-185所描述的方法測定CGTase活性。不同含量的待測CGTase溶液與在由20mMTris/HClpH7.2和5mMCaCl2組成的緩沖液中的5％可溶淀粉(Merch，Darmstadt)溶液，于45℃共同孵育一定時間。然后，加入1.5倍體積的甲醇終止反應(yīng)。未反應(yīng)的殘留淀粉在4℃孵育1小時沉降，再離心分離除去(10分鐘，12000g)。所得產(chǎn)物以已確定的環(huán)糊精(Sigma，Mnich)作為標(biāo)準(zhǔn)，用Nucleosil10-NH2柱(Macherey&Nagel，Duren)經(jīng)HPLC測定。1個單位(1U)的定義為在所述條件下每分鐘由淀粉合成1μM環(huán)糊精所需的酶量。實施例7純化的CGTase的CGTase總比活的測定純化的CGTase的CGTase總比活定義為單位數(shù)量蛋白質(zhì)的體積活性(U/mg)。一種酶樣品的CGTase體積活性(U/mg)按實施例6所述的方法確定。純化的CGTase溶液的蛋白含量(mg/ml)用M.Bradford(“分析生化”(1976)72，pp.248ff)所述的方法確定。為此目的所需的化學(xué)試劑來自Bio-Rad。下面為環(huán)狀芽孢桿菌#8、芽孢桿菌1-1和來源于它們的缺失突變(如實施例1和實施例2中所述)的CGTase總比活(比活)的測定結(jié)果酶相對活性(％)比活(U/mg)來自環(huán)狀芽孢桿菌#8的野生型CGTase100106其缺失突變體7782來自芽孢桿菌1-1的野生型CGTase100120其缺失突變體6578芽孢桿菌1-1的CGTase的突變衍生物10023(TyrTrp)其缺失突變體7317實施例8利用來源于環(huán)狀芽孢桿菌#8、芽孢桿菌1-1和實施例3和4所述制備的衍生物的非突變β-CGTase轉(zhuǎn)化淀粉為了比較非突變CGTase和實施例3、4所述通過缺失誘變而得到的衍生物的產(chǎn)物范圍，采用相同的酶活性轉(zhuǎn)化淀粉(實施例6)。在一定時間里，按所述的方法檢測產(chǎn)物組成。下面為所得的結(jié)果比較1環(huán)狀芽孢桿菌#8</tables>比較2芽孢桿菌1-1A)</tables>B)</tables>序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名電化學(xué)工業(yè)有限公司(國際)(B)街道Zielstattstrasse20(C)城市慕尼黑(D)聯(lián)邦州巴伐利亞州(E)國家Germany德國(F)郵政編碼81379(G)電話049-89-74844-0(H)電傳049-89-74884-350(ii)發(fā)明名稱用于生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(iii)序列數(shù)目8(iv)計算機(jī)閱讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)類型IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentINRelase#1.0#1.30版(EPO)(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(v)片段類型內(nèi)部片段(vi)最初來源(A)有機(jī)體Bacillusohbensis(xi)序列描述SEQIDNO1ProAsnHisSerSerProAlaLeuGluThrAspProSerTyrAlaGlu151015AsnGlyAlaValTyrAsnAspGly20(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(v)片段類型內(nèi)部片段(vi)最初來源(A)有機(jī)體軟化芽孢桿菌(xi)序列描述SEQIDNO2ProAsnHisThrSerProAlaAspArgAspAsnProGlyPheAlaGlu151015AsnGlyGlyMetTyrAspAsnGly20(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(v)片段類型內(nèi)部片段(vi)最初來源(A)有機(jī)體芽孢桿菌1-1(xi)序列描述SEQIDNO3ProAsnHisSerSerProAlaLeuGluThrAsnProAsnTyrValGlu151015AsnGlyAlaIleTyrAspAsnGly20(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(v)片段類型內(nèi)部片段(vi)最初來源(A)有機(jī)體環(huán)狀芽孢桿菌#8(xi)序列描述SEQIDNO4ProAsnHisThrSerProAlaMetGluThrAspThrSerPheAlaGlu151015AsnGlyArgLeuTyrAspAsnGly20(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQIDNO5MetGluThrAspThrSer15(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(viii)基因組中位置(C)單位bp(xi)序列描述SEQIDNO6CACACCTCTCCAGCGTTTGCCGAAAATGGC30(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQIDNO7LeuGluThrAsnProAsn15(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成”(iii)假設(shè)無(iv)反義否(viii)基因組中位置(C)單位bp(xi)序列描述SEQIDNO8CATTCATCACCGGCATATGTTGAAAATGGG30權(quán)利要求1.一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其在將淀粉或淀粉樣底物轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精時產(chǎn)生的γ-環(huán)糊精量在一定程度上有所提高，同時，與用于制備其的原型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶相比較，其環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶總比活仍顯示出至少60％的活性，該環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列與已知的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的區(qū)別在于第155位至包括第195位氨基酸在內(nèi)的區(qū)域中，至少有1個氨基酸缺失，這種缺失導(dǎo)致蛋白的γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶活性的提高，此處，蛋白質(zhì)序列的第1位為環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的信號肽的起始位點。2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其中其蛋白質(zhì)序列的第155到第195位氨基酸區(qū)域中有4至8個氨基酸殘基被缺失，這樣的缺失導(dǎo)致蛋白的γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶活性的提高，此處，蛋白質(zhì)序列的第1位為環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的信號肽的起始位點。3.如權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其中其蛋白質(zhì)序列的第155到第195位氨基酸區(qū)域中有6個氨基酸殘基被缺失，這樣的缺失導(dǎo)致蛋白的γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶活性的提高，此處，蛋白質(zhì)序列的第1位為環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的信號肽的起始位點。4.如權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其氨基酸序列不同于表1中所列環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列之處在于至少分別缺失了表1中以粗體字母表示的氨基酸殘基，而本發(fā)明的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的其余的氨基酸序列與表1所列的各種微生物來源的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列同源，所述序列所顯示的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶活性與未缺失的原型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶相同。5.一種制備編碼本發(fā)明的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的突變基因的方法，其中通過周知的誘變方法，使編碼原型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列發(fā)生突變，從而使得由突變基因的DNA序列所編碼的第155到第195位區(qū)域的氨基酸序列與由未誘變的基因的DNA編碼的氨基酸序列相比，至少缺失了1個氨基酸殘基。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中通過周知的誘變方法，使編碼原型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列發(fā)生突變，從而使得由突變基因的DNA序列所編碼的第155到第195位區(qū)域的氨基酸序列與由未誘變的基因的DNA編碼的氨基酸序列相比，缺失了4至8個氨基酸殘基。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中通過周知的誘變方法，使編碼原型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列發(fā)生突變，從而使得由突變基因的DNA序列所編碼的第155到第195位區(qū)域的氨基酸序列與由未誘變的基因的DNA編碼的氨基酸序列相比，缺失了6個氨基酸殘基。8.一種編碼如權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列。9.一種制備γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其中將至少一種如權(quán)利要求8所述的DNA序列在微生物中表達(dá)。10.一種利用環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶通過轉(zhuǎn)化淀粉來制備γ-環(huán)糊精的方法，其中采用至少一種如權(quán)利要求1至4中所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶作為環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。全文摘要在將淀粉或淀粉樣底物轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精時，本發(fā)明的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的γ-環(huán)糊精量在一定程度上有所提高，同時，與用于制備其的原型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶相比較，其環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶總比活仍顯示出至少60％的活性，這些環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列與已知的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的區(qū)別在于第155位至包括第195位氨基酸在內(nèi)的區(qū)域中，至少有1個氨基酸缺失，這種缺失導(dǎo)致蛋白的γ-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶活性的提高，此處，蛋白質(zhì)序列的第1位為環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的信號肽的起始位點。文檔編號C07H21/04GK1162641SQ9710034公開日1997年10月22日申請日期1997年1月9日優(yōu)先權(quán)日1996年4月18日發(fā)明者格奧爾格·E·舒爾茨,格茨·帕西格拉,安東·坎杜西奧,岡特·維希申請人:電化學(xué)工業(yè)股份有限公司(國際)