專利名稱：：產(chǎn)大環(huán)糊精4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：產(chǎn)大環(huán)糊精4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，屬于酶工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：大環(huán)糊精是區(qū)別于常見環(huán)糊精，聚合度從9到幾百不等的環(huán)狀葡聚糖。由于大環(huán)糊精具有高水溶性、低黏度和不回生等特性，可以廣泛地用于食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、制藥工業(yè)中。大環(huán)糊精主要是糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的。國外對產(chǎn)大環(huán)糊精的糖基轉(zhuǎn)移酶的研究已經(jīng)進(jìn)行了幾十年，而國內(nèi)僅近幾年有人開始進(jìn)行研究，在生產(chǎn)常見環(huán)糊精方面取得了巨大的成就，但是對于產(chǎn)大環(huán)糊精酶的研究成果很少。本發(fā)明涉及的產(chǎn)大環(huán)糊精的4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶是在韓國首爾大學(xué)樸教授的幫助下構(gòu)建的基因工程菌(DH一5a-TA保藏編號CGMCCNo.3093)表達(dá)產(chǎn)生的。粗酶酶液顏色淺，無需脫S處理，可通過70'C保溫10min處理對酶進(jìn)行初步純化，提高目標(biāo)酶的含量。從基因工程菌中分離得到的酶與環(huán)境微生物中提取得到的酶相比，具有更高的耐熱性能，分離純化步驟簡便易行，為實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了很好的基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)大環(huán)糊精4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌(&A^7'C^""/0，己保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.3093。一種產(chǎn)大環(huán)糊精4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，以大腸埃希氏菌(&c/2en'c/n'"co/OCGMCCNo.3093為出發(fā)菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵制備種子培養(yǎng)基、發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)、收集菌體，超聲破壁提取粗酶、純化得到純酶4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶，步驟為1)單菌落挑選以接菌環(huán)從基因工程菌種CGMCCNo.3093中蘸取少量菌液劃含100嗎/mL氨卞青霉素鈉的LB平板，將平板放置在生化培養(yǎng)箱中37°C恒溫培養(yǎng)12小時；2)種子培養(yǎng):挑取單菌落接種于50mL含氨卞青霉素鈉100^ig/mL的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶固定在恒溫?fù)u床上37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)8h制成種子培養(yǎng)基；3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)基接種至含氨卞青霉素鈉100(xg/mL的3L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)溫度37'C、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘、pH為7.5，通氣量為10L/h，接種量為10%，添加10mL/L豆油作為消泡劑，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)7h;4)收集菌體、超聲破壁提取粗酶將上述發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至250mL離心杯中，4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘，收集沉淀即為濕菌體；將濕菌體放入事先預(yù)冷的pH7.5、0.05mol/L、20mLTris-HCl緩沖溶液中，400W超聲3s、間隔2s、冰浴超聲10分鐘；將經(jīng)過超聲破壁處理的菌液4"C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液，即為粗酶液；5)酶的純化將粗酶液70。C保溫10min，然后于4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液即為經(jīng)初步純化的酶液；用5倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、20mM咪唑的潤洗緩沖液平衡Ni-NTA親和柱；將經(jīng)初步純化的酶液全部注入潤洗后的Ni-NTA親和柱；先用50倍柱體積的潤洗緩沖液進(jìn)行洗脫，除去不被親和柱保留的雜蛋白，然后用2倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液，內(nèi)含目標(biāo)蛋白；將含目標(biāo)蛋白的洗脫液裝至分子量1000Da的透析袋，透析袋兩端扎口后放入去離子水浴中透析脫鹽，水浴室溫攪拌12h，每隔4h更換一次去離子水，脫鹽完成后將透析袋放于含聚乙二醇2萬的大燒杯中進(jìn)行濃縮，4h后收集濃縮液即得純酶液。本發(fā)明的有益效果從基因工程菌中分離得到的酶與環(huán)境微生物中提取得到的酶相比，具有更高的耐熱性能，分離純化步驟簡便易行，為實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了很好的基礎(chǔ)。該酶的最適溫度為75°C，最適pH為7.5，經(jīng)初步純化并冷凍干燥得到的4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的活力可達(dá)700010000U/g。4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶能夠作用直鏈淀粉產(chǎn)生大環(huán)糊精，還能夠?qū)χф湹矸圻M(jìn)行修飾生成慢消化淀粉，改變淀粉的流變學(xué)特性和抗性，從而能夠促進(jìn)淀粉在更廣范圍內(nèi)大規(guī)模的應(yīng)用，該酶可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，具有巨大的潛在商業(yè)價值。生物材料樣品保藏大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.3093，保藏日期2009年6月8日。圖l4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的電泳圖。圖中M表示標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；Gl表示經(jīng)過層析后得到目標(biāo)酶；G2表示經(jīng)過層析和透析后的目標(biāo)酶；G3表示經(jīng)過加熱處理后的粗酶液；G4表示粗酶液。圖2葡萄糖標(biāo)樣、麥芽糖標(biāo)樣、麥芽四糖混合物的HPLC圖。圖中5號線是葡萄糖標(biāo)樣，4號線是麥芽糖標(biāo)樣，1、2、3號線是麥芽四糖混合物圖3以葡萄糖為底物反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC圖。圖4以麥芽糖為底物反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC圖。根據(jù)保留時間定性，以麥芽糖為底物反應(yīng)后生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖及葡萄糖圖5麥芽四糖混合物為底物反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC圖。根據(jù)保留時間定性，以麥芽四糖混合物為底物反應(yīng)后生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖及葡萄糖具體實施例方式實施例l、4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備及純化1、酶的制備1)單菌落挑選以接菌環(huán)從基因工程菌種中蘸取少量菌液劃含IOO)ig/mL氨卞青霉素鈉的LB平板，將平板放置在生化培養(yǎng)箱中37t恒溫培養(yǎng)12小時；2)種子培養(yǎng)挑取單菌落接種于50mL含氨卞青霉素鈉100pg/mL的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶固定在恒溫?fù)u床上37i:、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)8h制成種子培養(yǎng)基；3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)基接種至含氨卞青霉素鈉100pg/mL的3L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)溫度37。C、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘、pH為7.5，通氣量為10L/h，接種量為10%，添加10mL/L豆油作為消泡劑，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)7h;4)收集菌體、超聲破壁提取粗酶將上述發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至250mL離心杯中，4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘，收集沉淀即為濕菌體；將濕菌體放入事先預(yù)冷的pH7.5、0.05mol/L、20mLTris-HCl緩沖溶液中，400W超聲3s、間隔2s、冰浴超聲10分鐘；將經(jīng)過超聲破壁處理的菌液4'C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液，即為粗酶液；2、酶的純化及純度的鑒定(1)酶的純化1)將粗酶液7(TC保溫10min，然后于4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液即為經(jīng)初步純化的酶液；2)用5倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、20mM咪唑的潤洗緩沖液平衡Ni-NTA親和柱；3)將經(jīng)初步純化的酶液全部注入潤洗后的Ni-NTA親和柱；4)先用50倍柱體積的潤洗緩沖液進(jìn)行洗脫，除去不被親和柱保留的雜蛋白，然后用2倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液，內(nèi)含目標(biāo)蛋白；5)將含目標(biāo)蛋白的洗脫液裝至分子量1000Da的透析袋，透析袋兩端扎口后放入去離子水浴中透析脫鹽，水浴室溫攪拌12h，每隔4h更換一次去離子水，脫鹽完成后將透析袋放于含聚乙二醇2萬的大燒杯中進(jìn)行濃縮，4h后收集濃縮液即得純酶液。(2)酶純度的鑒定1)凝膠制備用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽(不能漏膠)，垂直放置。將配制好的分離膠溶液倒入，滴加入無離子水，待凝膠聚集后，倒出無離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠，再插入梳子。按表1配制10%分離膠和3%濃縮膠。表l分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠10%1%TEMED重蒸餾10%APJt液緩沖液貯液緩沖液SDS(ml)(ml)水(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)10%分離膠6.662.50——0.202.008.540.103%濃縮膠—3.01.250.102.004.600.052)上樣分別取樣品20nL于離心管中，按1/1比例加入樣品緩沖液，沸水浴中加熱35min，取出待用。用微量注射器分別吸取8pL標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽。點樣結(jié)束后，調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA(23mA/em),保持電流穩(wěn)定不變，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到離分離膠底l2cm時，即可停止電泳。3)染色電泳完畢后，取出凝膠板，浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色30min。4)脫色倒掉染色液，加入脫色液24h后，即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。電泳圖如圖l所示。圖中M表示標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；Gl表示經(jīng)過層析后得到目標(biāo)酶；G2表示經(jīng)過層析和透析后的目標(biāo)酶；G3表示經(jīng)過加熱處理后的粗酶液；G4表示粗酶液。從圖可以看出，目標(biāo)酶經(jīng)初步加熱處理，能夠去除部分不耐熱雜蛋白，經(jīng)親和柱層析后得到的酶純度很高。3、酶的性質(zhì)該酶的最適溫度為70。C，最適pH7.5，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，該純酶的分子量約為57000Da。4、酶的轉(zhuǎn)糖基活性4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶是否具有轉(zhuǎn)糖基的能力，決定了4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶能否作用直鏈淀粉生成大環(huán)糊精。采用HPLC法對底物與底物-酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2、圖3、圖4、圖5所示。圖2:葡萄糖標(biāo)樣、麥芽糖標(biāo)樣、麥芽四糖混合物的HPLC圖。圖中5號線是葡萄糖標(biāo)樣，4號線是麥芽糖標(biāo)樣，1、2、3號線是麥芽四糖混合物。表2各保留時間對應(yīng)的組分編號保留時間(min)樣品17.312麥芽五糖27.844麥芽四糖38.578麥芽三糖49.745麥芽糖511.971葡萄糖圖3:以葡萄糖為底物反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC圖。根據(jù)保留時間定性，以葡萄糖為底物反應(yīng)產(chǎn)物沒發(fā)生變化。表31慰萄糖為底物反應(yīng)后產(chǎn)物對應(yīng)的保留時司及峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>圖4:以麥芽糖為底物反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC圖。根據(jù)保留時間定性，以麥芽糖為底物反應(yīng)后生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖及葡萄糖。表4麥芽糖-為底物反應(yīng)后各組分對應(yīng)的保留時司及峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>圖5:以麥芽四糖混合物為底物反應(yīng)后產(chǎn)物的HPLC圖。根據(jù)保留時間定性，以麥芽四糖混合物為底物反應(yīng)后生成了麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖及葡萄糖。表5麥芽四糖混合物為底物反應(yīng)后各組分對應(yīng)的保留時間及峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由圖可以看出，該酶對葡萄糖沒有轉(zhuǎn)糖基活性，最小作用底物是麥芽糖。4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶能夠作用麥芽糖及麥芽四糖混合物生成麥芽七糖、麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖及葡萄糖等，這表明該酶具有良好的轉(zhuǎn)糖基活性。本發(fā)明中的酶純化原理該酶具有一定的耐熱性，7CTC加熱處理能夠使一部分不耐熱的蛋白質(zhì)變性，通過離心即可實現(xiàn)4-d-糖基轉(zhuǎn)移酶與變性蛋白的分離；此外，4-(i-糖基轉(zhuǎn)移酶帶有組氨酸標(biāo)簽，可與填料中N產(chǎn)充分結(jié)合，當(dāng)酶液經(jīng)過Ni-NTA親和柱時，帶有組氨酸標(biāo)簽的4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶將被截留，而其他雜蛋白將被洗脫，這樣就可實現(xiàn)4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶與雜蛋白分離，再采用能與N產(chǎn)結(jié)合的洗脫液洗脫，即可收集4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶。電泳過程中用到的試劑配方(1)分離膠緩沖液(Tris-HCl緩沖液pH8.9):取lmol/L鹽酸48mL，Tris36.3g，用無離子水溶解后定容至100mL。(2)濃縮膠緩沖液(Tris-HCl緩沖液pH6.7):取lmol/L鹽酸48mL,Tris5.98g，用無離子水溶解后定容至100mL。(3)30%分離膠貯液稱丙烯酰胺(Acr)30g及N，N，-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g，溶于重蒸水中，定容至100mL，過濾后置棕色試劑瓶中，4'C保存。(4)10%濃縮膠貯液稱Acrl0g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，過濾后置棕色試劑瓶中，4'C貯存。(5)10MSDS溶液SDS在低溫易析出結(jié)晶，使用前微熱，使其完全溶解。(6)1。/oTEMED;(7)10%過硫酸銨(AP):現(xiàn)用現(xiàn)配。(8)電泳緩沖液(Tris-甘氨酸緩沖液pH8.3):稱取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，SDSl.Og,用無離子水溶解后定容至1L。(9)樣品緩沖液取SDS100mg,巰基乙醇O.lmL，甘油lmL，溴酚藍(lán)2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸緩沖液0.5mL，加重蒸水至10mL。(10)染色液0.25g考馬斯亮藍(lán)G-250,加入454mL50。/。甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。(11)脫色液75mL冰乙酸、875mL重蒸水與50mL甲醇混勻。(12)分離膠制備按表l配制20mL10。/。分離膠，混勻后用細(xì)長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用lmL注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約3-4mm高，以進(jìn)行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。(13)濃縮膠的制備按表1配制10mL3%濃縮膠，混勻后用細(xì)長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合，再放置20-30min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。HPLC分離條件糖柱，柱溫85'C，流動相為超純水，流速0.4mL/min。權(quán)利要求1、一株產(chǎn)4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.3093。2、一種產(chǎn)大環(huán)糊精4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，其特征在于，以大腸埃希氏菌(Esc/^Wc/7/flco//)CGMCCNo.3093為出發(fā)菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵制備種子培養(yǎng)基、發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)、收集菌體、超聲破壁提取粗酶、純化得到純酶4-a-糖基轉(zhuǎn)移酶，步驟為1)單菌落挑選以接菌環(huán)從基因工程菌種CGMCCNo.3093中蘸取少量菌液劃含100嗎/mL氨卞青霉素鈉的LB平板，將平板放置在生化培養(yǎng)箱中37°C恒溫培養(yǎng)12小時；2)種子培養(yǎng)挑取單菌落接種于50mL含氨卞青霉素鈉100pg/mL的LB培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶固定在恒溫?fù)u床上37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)8h制成種子培養(yǎng)基；3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)基接種至含氨卞青霉素鈉100pg/mL的3L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)溫度37°C、攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘、pH為7.5，通氣量為10L/h，接種量為10%，添加10mL/L豆油作為消泡劑，在此條件下發(fā)酵培養(yǎng)7h;4)收集菌體、超聲破壁提取粗酶將上述發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至250mL離心杯中，4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心20分鐘，收集沉淀即為濕菌體；將濕菌體放入事先預(yù)冷的pH7.5、0.05mol/L、20mLTris-HCl緩沖溶液中，400W超聲3s、間隔2s、冰浴超聲10分鐘；將經(jīng)過超聲破壁處理的菌液4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液，即為粗酶液；5)酶的純化將粗酶液70。C保溫10min，然后于4。C、10000rpm離心10分鐘，收集上清液即為經(jīng)初步純化的酶液；用5倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、20mM咪唑的潤洗緩沖液平衡Ni-NTA親和柱；將經(jīng)初步純化的酶液全部注入潤洗后的Ni-NTA親和柱；先用50倍柱體積的潤洗緩沖液進(jìn)行洗脫，除去不被親和柱保留的雜蛋白，然后用2倍柱體積的50mMTris-HClpH7.5、300mMNaCl、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液，內(nèi)含目標(biāo)蛋白；將含目標(biāo)蛋白的洗脫液裝至分子量1000Da的透析袋，透析袋兩端扎口后放入去離子水浴中透析脫鹽，水浴室溫攪拌12h，每隔4h更換一次去離子水，脫鹽完成后將透析袋放于含聚乙二醇2萬的大燒杯中進(jìn)行濃縮，4h后收集濃縮液即得純酶液。全文摘要產(chǎn)大環(huán)糊精4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，屬于酶工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCCNo.3093為出發(fā)菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵制備種子培養(yǎng)基、發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)、收集菌體、超聲破壁提取粗酶、純化得到純酶4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶。該酶的最適溫度為75℃，最適pH為7.5，該酶具有耐高溫、酶活高等特點，經(jīng)初步純化并冷凍干燥得到的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶的活力可達(dá)7000～10000U/g。4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶能夠作用直鏈淀粉產(chǎn)生大環(huán)糊精，還能夠?qū)χф湹矸圻M(jìn)行修飾生成慢消化淀粉，因此該酶可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，具有巨大的潛在商業(yè)價值。文檔編號C12N1/21GK101633900SQ20091003255公開日2010年1月27日申請日期2009年7月2日優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日發(fā)明者徐學(xué)明,晉雪霞,旭曹,王金鵬,謝正軍,金征宇,陳寒青申請人:江南大學(xué)