專利名稱：環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶的新用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的新用途，特別是一種藥用 用途。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes mellitus)是一種近年來世界范圍內(nèi)較為流行和具有高死 亡率的內(nèi)分泌一代謝疾病。它是一種慢性非傳染性疾病，并且患病率逐年升高， 死亡率呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢，其特點為由于胰島素的絕對或相對不足和革巴細 胞對胰島素的敏感性降低，引起碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、電解質(zhì)和水的代 謝紊亂。目前臨床上以血糖升高至一定水平作為糖尿病的診斷標準，而通常采 用藥物來控制血糖在一定范圍以防治糖尿病，現(xiàn)階段的各類口服或注射的降血 糖藥物的作用機理主要是影響胰島素分泌或是減少葡萄糖的吸收、促進葡萄糖
環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶(CGTase， EC2.4丄19)是一種重要的胞外酶，可以水 解淀粉生成環(huán)糊精和寡糖?，F(xiàn)有報道示很多細菌可以產(chǎn)生環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶， 如芽孢桿菌屬、短桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、棒狀桿菌屬、克氏桿菌屬和微球菌 屬等(CN00819858.6)。由于CGTas的產(chǎn)生受染色體上一段基因控制，該酶基 因可從30多種細菌中分離獲得，故利用基因工程也可以制得重組的 CGTase，如本發(fā)明人曾對來源于嗜堿性芽孢桿菌N-227菌株染色體上一段 編碼環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶基因進行克隆分析、誘導表達并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中 [王蔭榆，王媛，張紅發(fā)，任大明，郭本恒.來源嗜堿性芽孢桿菌N-227 e-環(huán)糊精 葡基轉(zhuǎn)移酶基因分析及在大腸桿菌種的誘導表達.工業(yè)微生物，2007, 37(3):1-4]，發(fā)酵后通過分離純化得到重組的CGTase[王媛，王蔭榆，郭本恒,
張紅發(fā).表達環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶基因的重組大腸桿菌發(fā)酵條件的研究.工業(yè)微
生物，2007,37(3):10-14;王媛，王蔭榆，張紅發(fā)，郭本恒.P-環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶 的分離純化及酶學性質(zhì)的研究.工業(yè)微生物,2007, 37(6)]。 CGTase現(xiàn)已廣泛用 于食品、洗滌用品等行業(yè)，如用于面包生產(chǎn)、釀酒以及洗衣粉的添加劑，但目 前CGTase尚無藥用報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的一種新的 用途，特別是藥用用途。
本發(fā)明人根據(jù)文獻通過四氧嘧啶來誘發(fā)小鼠糖尿病以作為試驗動物模型 (鄭建仙，功能性食品[M].北京，中國輕工業(yè)出版社，1999. 486-487)。本 實驗結(jié)果表明，將環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶采用腹腔注射對試驗小鼠給藥時，可以明 顯降低高血糖小鼠的血糖值，與對照值相比具有顯著性差異；樣品注射組的小 鼠在經(jīng)過10天的給藥治療后多飲、多食、多尿和體重減輕的"三多一少"癥 狀有所緩解，體重有所增加。
可見，糊精葡基轉(zhuǎn)移酶有望于制備成控制血糖或防治糖尿病的藥物。其中， 控制血糖是指將高血糖降低至正常范圍，并進一步將血糖保持在正常范圍不反 彈。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。 試驗實施例1糊精葡基轉(zhuǎn)移酶的降血糖作用 1.實驗方法 1.1實驗材料 l丄l動物
昆明種小白鼠，雌雄各半，雄性小鼠22 30g，雌性小鼠18 25g，由中
科院上海動物實驗中心提供。 l丄2受試樣品
環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶純品(上海寶豐生化有限公司產(chǎn)品)，用生理鹽水溶解 后配制成一定濃度的溶液，過濾后注射給藥。
l丄3其他藥品
胰島素注射液，100IU/mL，丹麥諾和諾德公司，避光^C保存，用時生理 鹽水稀釋；
四氧嘧啶(Alloxan), sigma公司產(chǎn)品。冰上配制，用冰的生理鹽水溶解、 稀釋。
l丄4主要儀器
血糖測定儀羅氏血糖儀，Roche活力型血糖試紙，羅氏診斷產(chǎn)品(上海) 有限公司。
1.2實驗方法
1.2.1腹腔注射給藥對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖和體重的影響 取小白鼠80只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)2 3天，正常飼養(yǎng)2 3天，選取 10只作為注射空白對照組，試驗前24h禁食不禁水，腹腔注射2w/wX的四氧 嘧啶溶液，給藥劑量為150mg/kg。 72h后經(jīng)尾靜脈取血測定空腹血糖值(測血 糖前禁食12h)，并記錄為零時血糖值。血糖值高于13mmol/L的小鼠隨機分成 6組空白對照組和模型對照組注射生理鹽水；環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶注射組分3 組，劑量分別為1.0mg/kg， 10mg/kg和40mg/kg;陽性胰島素對照組6U/kg。 連續(xù)注射10天，第l、 4、 7、 10天注射lh后測定空腹血糖值，每次測定血糖 值前稱量小鼠重量。 1.3統(tǒng)計學分析
測量值以平均值±標準方差(X土SD)表示，采用One-Way ANOVA統(tǒng)計分析。
2.結(jié)果
2丄1腹腔注射給藥對糖尿病小鼠血糖、體重的影響
注射樣品第l、 4、 7、 10次給藥后測定空腹血糖值，采用分析結(jié)果見表l。 表l 注射樣品對DM小鼠血糖(mmol/L)的影響
組別劑量 mg/kg014710
空白照 組8.23±0.957.55±1.147.45±1.296.50±0.846.78±0.75
模型對 照組25.9±3.3423.5±2.6121.85±3.4521.3 ±2.8621.88±3.65
1.023.02±4.3820.23±5.1120.85士8.0218.18±6.79,#11.22±3.23，
樣品組10 4025.90±4.44 23.64±2.8621.43±5.10 22.04±4.3916.77±5.94*# 20.43±7.2912.30±7.95*， 18.46±5.92,#12.13±4.84*'** 13.16±5.89，
胰島素 組6U/kg29.2±7.1422.95±4.3212.57±5.42*#10.93士8.85'柳15.05±11.58，
注與零時值差異*p<0.05， **p<0.01;與模型對照組差異#p<0.05，
p<0.01。
結(jié)果表明，與正常組相比，模型組及樣品組給藥前血糖均明顯升高，說明
模型成立；腹腔注射不同劑量組的血糖值自第七次注射后出現(xiàn)差異，在第10 次注射給藥后lh測得的空腹血糖值明顯降低，與給藥前相比具有顯著性差異， 降低百分率分別為51.2%、 53.2%、 44.3%;與模型對照組相比也存在顯著差異； 給藥環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶血糖降低幅度超過胰島素組。腹腔注射結(jié)果說明環(huán)糊精 葡基轉(zhuǎn)移酶腹腔注射給藥效果明顯。
通過治療，測定各組的小鼠體重數(shù)據(jù)見表2，空白組小鼠隨著時間的增加 體重明顯增加，與初始體重存在顯著性差異；高血糖模型組在注射四氧嘧啶之 后，體重下降明顯，在治療的過程中只注射生理鹽水，其體重值基本保持穩(wěn)定 趨勢；樣品治療組不同劑量在給藥期間體重均有所增加，但同一時間點與空白
對照組相比增加不明顯，具有顯著性差異，這可能是因為建立高血糖模型時機 體中的組織器官發(fā)生變化在短期內(nèi)沒有恢復到正常水平。
表2注射樣品對DM小鼠體重(g)的影響
組別初始體重014710
空白組25.35±2.7329.0±4.76b30.3±4.16b30.2±4.58b32.15±4.56b32.9±4.26b
模型組28.67±3.9627.42±4.38a27.25±2.68a27.92士2.9r27.42±2.78ab27.25±2.23ab
樣1.027.92±2.8926.5±2.28a26.42±2.04a28.5±2.43a28.83±1.54abc29.42±2.08abc
品 1026.75±2.9825.5±3.95a25.67±4.29a27.25±4.13a29.17±4.12abc29.75±3.37abc
組 4027.21±4.124.86±4.02a26.29±4.46a27.0±3.89a29.07±4.15abc29.57±3.82abc
胰島素 組26.58±3.2324.67±3.24a27.08±2.87a27.33±2.71a28.17±2.54abc29.42±2.89abc
注a代表與空白對照組有顯著性差異；b代表與初始體重有顯著性差異;
c代表與注射Alloxan后體重有顯著性差異。
2.1.2小鼠情況觀察
小白鼠注射四氧嘧啶后，與空白對照組相比，毛色變得灰暗，精神狀況變 差，略有焦躁不安，體重變輕，同時伴有多飲、多食、多尿的典型癥狀。注射 酶樣品和胰島素組的小鼠較高血糖模型組的小鼠相比，精神逐漸轉(zhuǎn)好，體重略 微增加，尿量相對減少，毛色也逐漸恢復。
權(quán)利要求
1、環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶在制備控制血糖藥物中的應用。
2、 環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶在制備防治糖尿病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了環(huán)糊精葡基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的降血糖用途，可用于制備控制血糖藥物和防治糖尿病的藥物。
文檔編號A61K38/43GK101391101SQ200710046239
公開日2009年3月25日 申請日期2007年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日
發(fā)明者王蔭榆, 艾連中, 郭本恒, 龔廣予 申請人:光明乳業(yè)股份有限公司