用于治療代謝疾病的雙功能蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒別包含成纖維細胞生長因子(FGF21)和已知改善施用對象的代謝譜的其他代謝調(diào)節(jié)物的新的蛋白質(zhì)，包括其變體。還公開了用于治療FGF21相關(guān)疾病、GLP-1GLP-1-相關(guān)疾病和毒蜥外泌肽-4-相關(guān)疾病的方法，包括代謝病況。
【專利說明】用于治療代謝疾病的雙功能蛋白
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及包含已知改善施用對象的代謝譜的成纖維細胞生長因子21 (FGF21)和其他代謝調(diào)節(jié)物的新型蛋白質(zhì)。
[0002]發(fā)明背景
[0003]成纖維細胞生長因子(FGF)家族的特征是22種遺傳上有區(qū)別的同源配體，被分為7個亞家族。FGF-21與FGF-19和FGF-23最密切相關(guān)，并形成亞家族。該FGF亞家族調(diào)控多種對經(jīng)典FGF而言不常見的生理學過程，即，能量和膽酸的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、葡萄糖和脂類代謝，以及磷酸鹽和維生素D的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，與其他FGF不同，該亞家族以內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用(Moore, D.D.(2007) Science316, 1436-8) (Beenken 等人(2009)Nature Reviews DrugDiscovery8, 235)。
[0004]FGF21是209個氨基酸的多肽，含有28個氨基酸的前導序列(SEQ ID NO: 132)。人FGF21與小鼠FGF21具有約79%氨基酸同一性，與大鼠FGF21具有約80%氨基酸同一性。成纖維細胞生長因子21(FGF21)被描述為用于治療缺血性血管病、創(chuàng)傷愈合、和與肺、支氣管或肺泡細胞功能喪失相關(guān)的疾病(Nishimura等人(2000)Biochimica et BiophysicaActa, 1492:203-206 ;專利公開 W001/36640 ;和專利公開 W001/18172)。雖然 FGF-21 激活FGF受體和下游信號傳遞分子，包括FRS2a和ERK，但尚未檢測到FGFR與FGF-21的直接相互作用。研究已鑒別了在肝臟、脂肪細胞和胰腺中高表達的β-klotho是FGF-21細胞應答的決定子，也是通過FGFR介導FGF-21信號傳遞的輔助因子(Kurosu，H.等人(2007) J BiolChem282, 26687-95)。FGF21 是 FGFRl (IIIc)、FGFR2 (IIIc)和 FGFR3 (IIIc) β -klotho 信號傳遞復合物的強力激動劑。
[0005]FGF-21已表現(xiàn)出誘導不依賴胰島素的葡萄糖攝入。FGF-21還表現(xiàn)出減輕多種糖尿病嚙齒類模型中的高血糖。此外，發(fā)現(xiàn)過表達FGF-21的轉(zhuǎn)基因小鼠耐受膳食誘導的代謝異常，并且表現(xiàn)出減少的體重和脂肪質(zhì)量，和胰島素敏感性的增強(Badman，M.K.等人(2007)Cell Metab5，426-37)。向糖尿病的非人靈長類施用FGF-21導致空腹血漿葡萄糖、甘油三酯、胰島素和胰高血糖素水平減少，并導致脂蛋白譜的顯著改善，包括HDL膽固醇增加幾乎 80% (Kharitonenkov, A.等人(2007) Endocrinologyl48, 774-81)。目前的研究探討了 FGF21作用的分子機制，已經(jīng)鑒別FGF21是幫助控制適應空腹狀態(tài)的重要內(nèi)分泌激素(Badman 等人(2009)Endocrinology 150，4931) (Inagaki 等人(2007)CellMetabolism5,415)0這提供了之前缺乏的PPAR α下游的關(guān)聯(lián)，肝臟藉此與身體的其余部分在調(diào)控能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)生物學中溝通(Galman等人(2008)Cell MetaboIism8, 169) (Lundasen等人(2007) Biochemical and Biophysical Research Communications360, 437)。
[0006]FGF21通過激活AMPK/SIRT1/PGC1 α通路抑制PPAR y表達和增加線粒體功能，來調(diào)控脂肪細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。(Chau等人(2010)PNAS107，12553)如培養(yǎng)的人肌管和分離的小鼠組織中測量的，F(xiàn)GF21還增加骨骼肌的葡萄糖攝入(Mashili等人(2011)Diabetes Metab ResRev27, 286-97)。嚙齒類胰島細胞的FGF21治療導致通過激活ERK1/2和Akt通路的改善的功能和存活(Wente等人(2006)Diabetes55，2470)。FGF21治療還導致嚙齒類肝臟中關(guān)于脂肪發(fā)生和脂肪酸氧化酶的基因表達改變，可能是通過HNF4CI和Foxa2信號傳遞。然而，目前的研究(Wei等人(2012)PNAS109，3143-48)提示，由于消退的PPAR Y激活(通過降低的SUMO化作用)，用FGF21治療膳食誘導的肥胖小鼠誘導骨丟失；在FGF21治療后，骨中存在增加的PPARy活性的條件下，可觀察到充質(zhì)干細胞從向成骨細胞分化轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛑炯毎只?br> [0007]與使用FGF-21直接作為生物治療劑相關(guān)的困難是其半壽期非常短(Kharitonenkov, A.等人(2005) Journal of Clinical Investigationll5:1627-1635)。在小鼠中，人FGF21的半壽期是0.5至I小時，而在食蟹猴中，半壽期是2至3小時。FGF21可以作為多用途的、無菌藥物制劑使用。然而，已確定防腐劑，即，間甲酚，在上述條件下對其穩(wěn)定性具有不利作用。
[0008]另一種已處于臨床的強力代謝調(diào)節(jié)物是胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1) (Knudsen等人(2004) Journal of Medicinal Chemistry47, 4128)。GLP-1 是由哺乳動物腸道的 L 細胞分泌的36個氨基酸的腸降血糖素，作用于α和β細胞，以依賴于葡萄糖的方式刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素釋放(Hare等人(2010)Diabetes59, 1765 ；Meier等人(2005)Diabetes-Metabolism Research and Reviews21, 91)。GLP-1 結(jié)合和激活 GLP-1 受體(GLP-1R)，后者是II類G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族的7次跨膜的螺旋蛋白質(zhì)(Mayo等人(2003) Pharmacological Reviews55:167)。作為 GLP-1 受體激動劑，GLP-1 通過刺激胰腺分泌胰島素，從而增加外周組織吸收葡萄糖和抑制胰高血糖素分泌，導致降低的肝葡萄糖釋放，在減少餐后血糖水平中扮演了重要的角色。
[0009]第二個臨床上重要的GLP-1受體激動劑是毒蜥外泌肽(Exendin)-4.毒蜥外泌肽-4是由毒蜥蜥蜴(Gila Monster)唾液腺生產(chǎn)的39個殘基的多肽(Goke等人(1993)Diabetes46:433-439 ；Fehmann 等人(1995)Endocrine Rev.16:390-410)。雖然它是獨特的非哺乳動物基因的產(chǎn) 物，并且似乎僅由唾液腺表達，但是毒蜥外泌肽-4與GLP-1享有52%氨基酸序列同源性，且在哺乳動物中與GLP-1受體相互作用(Goke等人Jhorens等人(1993) Diabetes42:1678-1682)。在體外，毒蜥外泌肽_4已表現(xiàn)出促進胰島素生產(chǎn)細胞分泌胰島素，在給予等摩爾量時，比GLP-1更強力地導致胰島素生產(chǎn)細胞釋放胰島素。此外，毒蜥外泌肽-4在嚙齒類和人類中都強力刺激胰島素釋放以降低血漿葡萄糖水平，且比GLP-1作用時間更長；然而，由于它不是哺乳動物中天然存在的，毒蜥外泌肽-4在哺乳動物中具有GLP-1所缺少的某些潛在抗原特性。
[0010]臨床上已經(jīng)建立了 GLP-1和毒蜥外泌肽-4類似物(例如，利拉魯肽(Liraglutide)和艾塞那肽(Byetta))改善人體內(nèi)的葡萄糖控制的能力(Idris (2010)Diabetes Obesity&Metabolisml2,89 ；Monami 等人(2009)European Journal ofEndocrinologyl60，909)。還報道了 GLP-1通過誘導增殖和抑制凋亡，來增加β細胞量(Egan, A 等人(2003)Diabetes-Metabolism Research and Reviewsl9, 115 ；Farilla, L.等人(2003)Endocrinologyl44, 5149 ；Xu, G.等人(1999) Diabetes48, 2270)。它還作為腸道激素發(fā)揮作用，抑制胃內(nèi)的胃酸分泌和胃排空，同時提供減少胃口的飽食信號(Vilsboll等人(2009)Best Practice&Research Clinical Endocrinology&Metabolism23, 453)。這些效果可能解釋了向2型糖尿病患者施用GLP-1類似物時觀察到的有益的體重減輕。GLP-1還在缺血后的哨齒類心臟中表現(xiàn)出護心作用(Ossum等人(2009)PharmacologicalResearch60, 411 ；Sonne, D.P.等人(2008) Regulatory Peptidesl46, 243 ；Nikolaidis, L.A.等人(2004) Circulationl09, 962)。
[0011]此外，GLP-1可以通過降低PPARy的表達，降低人充質(zhì)干細胞(hMSC)向脂肪細胞分化，并且GLP-1促進細胞增殖和hMSC的細胞保護作用(Sanz等人(2010) Am J PhysiolEndocrinol Metab298, E634-E643)。
[0012]在研發(fā)用作治療I型和2型糖尿病和其他代謝病況的治療劑的FGF21蛋白(包括其變體或類似物)時，半壽期和穩(wěn)定性的增加是理想的。具有增強的半壽期和穩(wěn)定性的FGF21蛋白將允許對要施用所述蛋白質(zhì)的患者頻率較低的給藥。明顯的，需要研發(fā)用于治療性蛋白質(zhì)FGF21的穩(wěn)定的水性蛋白質(zhì)制劑。
[0013]此外，在研發(fā)蛋白質(zhì)藥劑(如代謝調(diào)節(jié)物FGF21、GLP-1和毒蜥外泌肽-4)中的重大挑戰(zhàn)是解決其物理和化學的不穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的組成變化和特征定義了特殊的行為，如折疊、構(gòu)象穩(wěn)定性和解折疊/變性。當目標是利用水性的蛋白質(zhì)溶液使研發(fā)藥物制劑條件過程中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定時，應該解決這類特征(Wang, ff.，Int.J.0fPharmaceutics, 18，(1999))。穩(wěn)定目標治療蛋白(例如本發(fā)明的蛋白質(zhì))的理想效果是增加對蛋白水解和酶促降解的耐受性，從而改善蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和降低蛋白質(zhì)聚集。
[0014]發(fā)明概述
[0015]本發(fā)明涉及鑒別新型蛋白質(zhì)，例如，融合蛋白，所述融合蛋白包含成纖維細胞生長因子21 (FGF21)和其他代謝調(diào)節(jié)物(例如GLP-1和毒蜥外泌肽_4)，并且在藥劑制劑條件下，具有相比構(gòu)件活性劑改良的藥劑特性，例如更穩(wěn)定、具有改善施用對象的代謝參數(shù)的能力、對蛋白水解和酶促降解更不易受、更不可能聚集和形成復合物，和更不可能是免疫原性的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有FGF21受體激動劑和GLP-1受體激動劑活性；其包含F(xiàn)GF21的截短形式和變體，并且還包含例如，胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)、毒蜥外泌肽-4或其他代謝調(diào)節(jié)物或其變體中的一個或多個。
[0016] 還公開了這樣的方法，所述方法用于治療FGF21相關(guān)疾病和GLP-1相關(guān)疾病，以及其他代謝的、內(nèi)分泌的和心血管的病癥，如肥胖、I型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動脈粥樣硬化、外周動脈病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴重失活突變相關(guān)的病癥、包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng)不良在內(nèi)的脂肪營養(yǎng)不良和其他的代謝病癥，和降低垂?；颊叩乃劳雎屎桶l(fā)病率。
[0017]本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用作規(guī)律施用的(例如，每天、更優(yōu)選每周、每兩周或每月)可注射劑、單獨或與口服抗糖尿病劑組合，將改善I型和2型糖尿病患者的血糖控制、體重和脂類譜。蛋白質(zhì)還可用于治療肥胖或其他FGF21或GLP-1相關(guān)性病況。
[0018]本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如，本發(fā)明的GLP-1-FGF21變體和毒蜥外泌肽-4-FGF21變體融合蛋白，克服了與蛋白質(zhì)治療劑相關(guān)的，包括例如與施用野生型FGF21相關(guān)的生理學不穩(wěn)定性的顯著障礙，因為其在藥物制劑條件下，比野生型FGF21更穩(wěn)定、對蛋白水解和酶促降解更不易受、更不可能聚集和形成復合物，和更不可能是免疫原性的。
[0019]在第一個方面，本發(fā)明提供了成纖維細胞生長因子21 (FGF21)蛋白，例如包含表1列舉的和本文進一步描述的一條或多條序列的融合蛋白。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可包含GLP-1和/或毒蜥外泌肽-4蛋白，不論是野生型、截短的或突變的形式，或其變體。表1列舉的FGF21序列是野生型FGF21序列的變體，例如，具有NCBI參考號NP_061986.1的野生型FGF21序列，并可見于專利公開中，例如屬于Chiron Corporation的US6, 716, 626B1。表1列舉的GLP-1和毒蜥外泌肽-4序列是野生型GLP-1和毒蜥外泌肽_4序列的變體，例如，分別具有NCBI參考號NP_002045和AAB22006.1的那些序列，并可見于專利公開中，例如分別屬于 Eli Lilly and C0.和 General Hospital Corp.的 W098/19698 和 W087/06941A (GLP-1)和屬于Amylin的US5, 424，286 (毒蜥外泌肽_4)。
[0020]其他實施方案涉及編碼本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的多核苷酸，含有所述多核苷酸的載體和攜帶所述載體的宿主細胞。
[0021]本文提供了用于生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法涉及通過例如在野生型FGF21蛋白的目標位置上位點特異性地摻入氨基酸來修飾野生型FGF21蛋白，以及在分子的FGF21部分與其他代謝調(diào)節(jié)物(如胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)和毒蜥外泌肽_4)之間的融合，或者與用GLP-1和/或毒蜥外泌肽-4修飾的聚合物綴合。所述修飾和融合增強了本發(fā)明的蛋白質(zhì)相對于蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)(例如，F(xiàn)GF21、GLP-1和毒蜥外泌肽-4)的生物學特性，以及在一些情況下，作為例如標簽和蛋白質(zhì)半壽期延長活性劑的連接點，并用于將所述變體固定在固體支持物的表面的目的。本發(fā)明的相關(guān)實施方案是生產(chǎn)能夠生產(chǎn)本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)的細胞的方法，和生產(chǎn)能夠生產(chǎn)含有編碼所述變體和融合物的DNA的載體的細胞的方法。
[0022]在多個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包含F(xiàn)GF21、毒蜥外泌肽_4和/或GLP-1序列的一個或多個片段，包括長度小至8-12個氨基酸殘基的片段，其中多肽能夠降低哺乳動物中的血糖。在多個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包括FGF21、毒蜥外泌肽-4和/或GLP-1序列的一個或多個變體，例如，相對于其野生型序列具有一個或多個氨基酸缺失、插入、添加或取代。
[0023]在一些實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與一種或多種聚合物共價連接，例如聚乙二醇(PEG)或多聚唾液酸，不論是在相對于野生型FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽_4進行位點特異性氨基酸修飾的位置上，還是在與這些蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)通常共享的氨基酸位置上。PEG基團是以這樣的方式連接的，所述方式增強，和/或不干擾本發(fā)明的融合蛋白的構(gòu)件部分(例如，GLP-1蛋白變體或FGF21蛋白變體)的生物學功能。在其他實施方案中，本發(fā)明的多肽可以與異源氨基酸序列融合，任選通過接頭，如GS、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO: 8)或SGGGGSGGG(SEQ ID NO: 128)。異源氨基酸序列可以是IgG恒定結(jié)構(gòu)域或其片段(例如Fe區(qū))、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白結(jié)合多肽。本文公開的這類融合蛋白也可以形成多聚物。
[0024]在一些實施方案中，異源氨基酸序列(例如，HSA、Fc等)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基端融合。在其他實施方案中，融合異源氨基酸序列(例如，HSA、Fc等)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的羧基端融合。在其他仍然更優(yōu)選的實施方案中，異源氨基酸序列(例如，HSA、Fc等)位于本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的中間，即，在GLP-1或毒蜥外泌肽-4序列的C-末端殘基與FGF21序列的N-末端殘基之間。所述優(yōu)選的實施方案，例如，為了最大的GLP-1 (毒蜥外泌肽-4)活性留下游離的N-末端，和為了最大的FGF21活性留下游離的完整C-末端。
[0025]在一些實施方案中，GLP-1受體激動劑與抗體的重鏈和輕鏈的N-末端融合，同時FGF21與同一抗體的重鏈和輕鏈的C-末端融合(即，本文所述的fusobody)。所述優(yōu)選的實施方案為了最大的GLP-1 (毒蜥外泌肽-4)活性留下游離的N-末端，和為了最大的FGF21活性留下游離的完整C-末端。優(yōu)選的實施方案使用PCT公開W02011/076781中描述的抗體序列。
[0026]在一些實施方案中,GLP-1或毒蜥外泌肽_4肽與FGF21化學連接。在一些實施方案中，所述肽與FGF21的氨基酸殘基側(cè)鏈連接。在其他實施方案中，所述肽通過天然的化學鍵或本領(lǐng)域已知的其他方法，與FGF21的N-末端連接。優(yōu)選的實施方案為了最大的活性而留下GLP-1 (毒蜥外泌肽-4)的游離的N-末端，和為了最大活性而留下FGF21的完整的C-末端O
[0027]在一些實施方案中，GLP-1或毒蜥外泌肽-4肽共價連接于聚合物分子，所述聚合物分子轉(zhuǎn)而與FGF21蛋白變體連接。在優(yōu)選的實施方案中，GLP-1或毒蜥外泌肽_4肽連接于PEG聚合物，所述PEG聚合物同時連接于FGF21蛋白變體。所述優(yōu)選的實施方案為了最大的GLP-1 (毒蜥外泌肽-4)活性而留下了游離的N-末端，和為了最大的FGF21活性而留下了游離的完整C-末端。在本發(fā)明的一些實施方案中，GLP-1受體激動劑肽通過PEG接頭或其他聚合物接頭與FGF21變體連接的，所述其他聚合物接頭同時提供了半壽期延長和兩種受體激動劑的共價連接。
[0028]另一個實施方案涉及治療患者的方法,所述患者表現(xiàn)出一種或多種FGF21相關(guān)疾病或GLP-1-相關(guān)疾病，如肥胖、2型糖尿病、I型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動脈粥樣硬化、外周動脈病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴重失活突變相關(guān)的病癥、包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng) 不良在內(nèi)的脂肪營養(yǎng)不良和其他的代謝病癥，所述方法包括向所述需要這類治療的患者施用治療有效量的一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其藥物組合物。
[0029]本發(fā)明還提供了包含本文公開的本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)和可藥用的配制劑的藥物組合物。這類藥物組合物可用于治療代謝病癥的方法中，并且方法包括向所述有需要的人類患者施用本發(fā)明的藥物組合物。可以治療的代謝病癥的非限制性例子包括I型和2型糖尿病，以及肥胖。
[0030]在本發(fā)明的下列詳細說明中，闡明了在本發(fā)明的這些和其他方面。
附圖簡介
[0031]圖1A和IB顯示了具有不同N-末端突變的GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白，和毒蜥外泌肽-4-FGF21-PEG融合蛋白的活性。圖1A顯示了添加的用于減慢DPP-4蛋白酶加工的突變(GLP-1Jft (圓圈)或含有野生型(V231 ;空心方塊)、G0(V251 ;空心圓圈)、A8G(V258 ;空心三角)、A8S(V232 ;三角)或E9P(V271 ;方塊)GLP-1的雙功能蛋白質(zhì))。圖1B顯示了毒蜥外泌肽-4融合物(GLP-1肽(方塊)或具有毒蜥外泌肽-41-39 (V234 ;三角)、1-30 (V267 ；圓圈)或l-30/E16G/E17Q(V268 ;空心三角)的雙功能蛋白質(zhì))。
[0032]圖 2 顯示了 GLP-1-FGF21-PEG 融合蛋白(FGF21-PEG (V294 ;空心方塊)、GLP-1 (A8S) -PEG(V253 ;空心圓圈)或具有野生型GLP-1 (V237 ;圓圈)或GLP_1(A8S) (V235 ；三角)GLP-1的雙功能蛋白質(zhì))的藥代動力學特性(PK)。顯示了注射0.25mg/kg的野生型非PEG化的FGF21的PK用于比較(方塊)。
[0033]圖3A-3C顯示了使用口服糖耐受測試(OGTT)測量半壽期延長的GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白的效力的結(jié)果。腹膜內(nèi)(1.P.)注射lrng/kg化合物或載體(實心白色柱；三角)，對8周齡C57BL/6J小鼠(η = 5)給藥。在給藥I和24小時后測量血糖，評估GLP-1的急性效果，I小時的效果與野生型GLP-1 (V239 ;散列柱；方塊)和GLP-1 (A8S)形態(tài)(V232 ;黑色柱；圓圈)相似，而24小時仍然保持比GLP-1 (A8S)形態(tài)略佳。在第三晚，在給藥后72小時用1.5g/kg 口服葡萄糖刺激前，使小鼠空腹。用A8S形態(tài)給藥的小鼠表現(xiàn)出比用野生型GLP-1形態(tài)給藥的小鼠顯著改善的血糖控制，提示A8S突變增加活性GLP-1的長期水平。
[0034]圖4顯示了 GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白在ob/ob小鼠中的功效。用所示化合物對10周齡雄性ob/ob小鼠(n = 8) 1.P.給藥，每周2次，共計2周。等量給藥的FGF21-PEG(V238 ;對角線散列柱；方塊)和 GLP-1-FGF21 (R154C)-PEG(V239 ;水平線散列柱；空心方塊)顯示出與載體治療組(圓圈)非常相似的對血糖水平、體重和肝臟健康狀態(tài)(由血清ALT水平和肝重測量)的改善作用。DPP-4-抗性融合物、0.2mg/kgGLP-l (A8S) -FGF21(R154C)-PEG(V235 ;垂直線散列柱；空心三角)顯示出與其他化合物相似的效力，但以lmg/kgGLP-1 (A8S)-FGF21 (R154C)-PEG(V235 ;黑色柱；三角)的相等給藥產(chǎn)生額外降低血糖、體重、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和肝重。
[0035]圖5A-5G 顯示了在 ob/ob 小鼠中 GLP-1 (A8S) -FGF21 (R154C) -PEG (V235 ;黑色柱； 空心三角)融合蛋白與共同施用FGF21(R154C)-PEG+GLP-1(A8S)-PEG(垂直線散列柱；空心圓圈)、單一施用FGF21 (R154C)-PEG(V238 ；0.2mg/kg(淺色對角線散列柱);lmg/kg(深色對角線散列柱；方塊))，和單一施用GLP-1 (A8S)-PEG(V253 ；0.2mg/kg(淺色水平線散列柱)；lmg/kg(深色水平線散列柱；空心方塊))的比較。用所示化合物或載體(實心白色柱；圓圈)對9周齡雄性ob/ob小鼠(n = 8) 1.p.給藥，每周2次，共計4周。融合物顯示出比共同施用 FGF21 (R154C) -PEG+GLP-1 (A8S) -PEG 顯著改善的效力。雖然僅在 FGF21 (R154C) -PEG和GLP-1 (A8S)-FGF21 (R154C)-PEG中觀察到中等程度的體重丟失，但其他組卻增加了大量體重，僅部分是由于食物攝取的差異。
[0036]圖6A-6F顯示了 GLP-1 (A8S) -FGF21-PEG融合蛋白在ob/ob小鼠中的效力，比較 FGF21 (R154C) -PEG (V235 ;深色柱)與 FGF21 (V76) -PEG (V272 ;淺色柱)。用所示化合物或載體(實心白色柱)對9周齡雄性ob/ob小鼠(n = 8) 1.p.給藥，每周2次，共計2周。從0.05至0.2mg/kg (0.05對角線散列柱；0.1水平線散列柱；0.2垂直線散列柱)，GLP-1 (A8S)-FGF21 (R154C)-PEG 和 GLP-1 (A8S)-FGF21 (V76)-PEG 融合物都表現(xiàn)出對葡萄糖控制和體重的劑量應答。在0.2mg/kg，GLP-1 (A8S) -FGF21 (V76) -PEG比GLP-1 (A8S)-FGF21FGF21 (R154C)-PEG更有效，特別是對于降低葡萄糖水平、體重、血清甘油三酯和膽固醇。圖6A-6C分別顯示了基礎(chǔ)葡萄糖(AUC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和血清總膽固醇的水平。圖6D-6F分別顯示了 D12體重、肝脂類和血清甘油三酯的水平。
[0037]圖7A-7B顯示了相對于單獨的活性劑的組合，GLP-1 (A8S) -FGF21 (V76) -PEG融合蛋白改善胰腺功能和增加胰島的胰島素含量的能力。用單獨的GLP-1 (A8S)-PEG+FGF21 (V76)-PEG的組合(V76+V253 ;垂直線散列柱)，以及用本發(fā)明的GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG雙功能融合蛋白(V272 ;對角線散列柱；淺色為0.5mg/kg，深色為lmg/kg)或載體(白色柱)對Db/db小鼠每周給藥2次,共計4周。[0038]圖8A-8B顯示了相對于單獨的活性劑的組合，GLP_1_FGF21_PEG融合蛋白改善葡萄糖降低和體重的能力。使用載體(白色柱；空心圓圈)、單獨的GLP-1 (A8S)-PEG(V253 ；3mg/kg(淺色水平線散列柱；空心菱形)和5mg/kg(深色水平線柱；菱形))和FGF21 (V76) -PEG (3mg/kg (V76 ;淺色對角線散列柱；空心方塊)和5mg/kg (深色對角線散列柱；方塊))的組合，以及用本發(fā)明的GLP-1 (A8S) -FGF21 (V76) -PEG雙功能融合蛋白(V272 ；0.2mg/kg(小格子柱；空心三角)；lmg/kg(大格子柱；三角))，對Db/db小鼠每周給藥 2 次，共計 2 周。如圖可見，0.2mg/kg 的 GLP-1 (7-35 ；A8S) -FGF21 (V76) -PEG 雙功能融合蛋白(V272)與5mg/kg的FGF21(V76)-PEG同樣有效。圖中還可見，對于血糖和體重終點而言，1.0mg/kg 的 GLP-1 (7-35 ;A8S)-FGF21 (V76)-PEG 雙功能融合蛋白(V272)比FGF21 (V76)-PEG+GLP-1 (7-35 ；A8S)-PEG(1+lmg/kg(淺色水平線散列柱；X 形)和 3+3mg/kg(深色水平線柱；星形)的最大有效組合劑量更有效。 [0039]圖9顯示了 FGF21活性測定的結(jié)果。在用所示化合物處理HEK293-β -klotho細胞后，測量ERK的磷酸化。在存在或缺少等摩爾艾塞那肽(艾塞那肽)的條件下，與相同的FGF21變體FGF21(V76)-PEG對比，GLP-1 (A8S)-V76-PEG(V272)的信號高度的活性顯著更聞。
[0040]圖10展示了與匹配的單個激動劑蛋白質(zhì)或肽相比，用于測量融合蛋白活性的受體藥理學測定法的結(jié)果。在化合物處理I小時后，測定用GLP-1R和FGFRlc/β -klotho (IOa和10b)，或僅用GLP-lR(10c和IOd)轉(zhuǎn)染的HEK293細胞的GLP-1R對β-抑制蛋白的招募。測定法中檢測的分子是:毒蜥外泌肽_4(方塊)、GLP-1 (A8S)-FGF21 (V76)-PEG(V272 ；圓圈)、GLP-1 (A8S) -PEG (V253 ;三角)、V253+FGF21 (V76) -PEG (空心菱形)、毒蜥外泌肽-4(l-39)-Fc-FGF21(V103) (V211 ;空心圓圈)、毒蜥外泌肽 _4 (1-39)-Fe (V201 ;空心三角)和 V201+FGF21 (V101)(菱形)。
[0041]發(fā)明詳述
[0042]本發(fā)明的蛋白質(zhì)代表了如本領(lǐng)域已知的全長野生型FGF21多肽的修飾的形態(tài)。以FGF21野生型序列作為參考序列(SEQ ID NO:1)，例如當需要比較FGF21野生型序列和蛋白質(zhì)變體時。FGF21野生型序列具有NCBI參考序列號NP_061986.1，并且可見于這類公開的專利中，例如屬于 Chiron Corporation 的 US6, 716，626B1 (SEQ ID NO:1)。
[0043]
【權(quán)利要求】
1.雙功能融合蛋白，其包含GLP-1受體激動劑區(qū)域和FGF21受體激動劑區(qū)域。
2.權(quán)利要求1的雙功能融合蛋白，其包含與FGF21變體融合的GLP-1受體激動劑肽、接頭、和以這樣的方式連接的PEG基團，所述方式增強了所述GLP-1受體激動劑或FGF21變體的生物學功能。
3.權(quán)利要求2的雙功能融合蛋白，其中FGF21變體是變體76。
4.權(quán)利要求3的雙功能融合蛋白，其中接頭是Fe。
5.權(quán)利要求3的雙功能融合蛋白，其中接頭是Fe變體。
6.權(quán)利要求1的雙功能融合蛋白，其中所述雙功能融合蛋白還包含變體208、變體209、變體211、變體214、變體272、變體277，或變體311。
7.治療代謝疾病的方法，所述方法通過向有需要的對象施用包含GLP-1受體激動劑和FGF21受體激動劑的雙功能融合蛋白。
8.權(quán)利要求7的方 法，其中所述雙功能融合蛋白相比組合施用單獨的GLP-1受體激動劑和FGF21受體激動劑改善了對象中的代謝參數(shù)，
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述雙功能融合蛋白還包含變體208、變體209、變體211、變體214、變體272、變體277，或變體311。
【文檔編號】C07K14/50GK104024273SQ201280057819
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月26日
【發(fā)明者】B·R·貝徹, S·L·卡普蘭, S·E·塞利蒂, D·S·丹尼爾斯, 濱松紀夫, B·H·蓋爾斯坦格爾, S·利基, A·洛, S·C·韋爾登 申請人:諾華股份有限公司, Irm責任有限公司