根優(yōu)選的啟動(dòng)子以及使用方法【專利摘要】本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)異源核苷酸序列在植物中表達(dá)的組合物和方法。組合物包含用于編碼高粱(Sorghum?bicolor)RCc3的基因的啟動(dòng)子的新型核苷酸序列。提供了使用本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子序列在植物中表達(dá)異源核苷酸序列的方法。所述方法包括用可操作地連接到本發(fā)明所述啟動(dòng)子中之一的核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞?！緦＠f(shuō)明】根優(yōu)選的啟動(dòng)子以及使用方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體而言涉及植物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]異源DNA序列在植物宿主中的表達(dá)有賴于存在有效連接的在該植物宿主中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序列的選擇將決定在生物體中何時(shí)和何處表達(dá)異源DNA序列。需要在特定組織或者器官中表達(dá)的情況下，可以使用組織優(yōu)選啟動(dòng)子。需要應(yīng)答于刺激而表達(dá)基因的情況下，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是首選的調(diào)節(jié)元件。相比之下，在需要在植物的細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的情況下，采用組成型啟動(dòng)子?？梢栽谵D(zhuǎn)化載體的表達(dá)構(gòu)建體中包括位于核心啟動(dòng)子序列上游和/或下游的另外調(diào)節(jié)序列，以便引起異源核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物中不同水平的表達(dá)。[0003]常常需要在植物的特定組織或器官中表達(dá)DNA序列。例如，可以通過(guò)遺傳操縱植物的基因組以包含可操作地連接到異源病原體抗性基因的組織優(yōu)選啟動(dòng)子，從而在所需植物組織中產(chǎn)生病原體抗性蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)植物對(duì)土源和空氣源病原體感染的抗性增加。[0004]或者，可能需要抑制植物組織內(nèi)天然DNA序列的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)所需的表型。在這個(gè)情況中，可以如下實(shí)現(xiàn)這種抑制:將植物轉(zhuǎn)化以使其包含可操作地連接到反義核苷酸序列的組織優(yōu)選啟動(dòng)子，從而該反義序列的表達(dá)產(chǎn)生了干擾天然DNA序列的mRNA翻譯的RNA轉(zhuǎn)錄物。[0005]到目前為止，盡管根對(duì)植物發(fā)育重要，但尚未充分研究植物根中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在某種程度上這歸因于缺少易得的根特異性生物化學(xué)功能，可對(duì)其基因進(jìn)行克隆、研究和操縱。通過(guò)使用基因工程技術(shù)遺傳地改變植物并且因此產(chǎn)生具有有用性狀的植物，這要求多種啟動(dòng)子可獲得。啟動(dòng)子的積累將允許研究人員設(shè)計(jì)出能夠按所需水平和細(xì)胞場(chǎng)所表達(dá)的重組DNA分子。因此，組織優(yōu)選啟動(dòng)子的集合將允許新性狀在所需組織中表達(dá)。[0006]因此，需要分離和表征組織優(yōu)選的(特別是根優(yōu)選的)啟動(dòng)子以進(jìn)行植物的遺傳操縱，所述啟動(dòng)子可以充當(dāng)以組織優(yōu)選方式表達(dá)目的異源核苷酸序列的調(diào)節(jié)區(qū)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]提供了用于調(diào)節(jié)目的異源核苷酸序列在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)的組合物和方法。組合物包含引發(fā)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的新型核苷酸序列。本發(fā)明的實(shí)施例包括在SEQIDNO:1中示出的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，所述核苷酸序列包含以專利保藏號(hào)NRRLB-50462所保藏的質(zhì)粒的植物啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序列，包含SEQIDNO:1的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物細(xì)胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄，和包含下述序列的核苷酸序列，所述序列與SEQIDN0:1中示出的序列具有至少85%序列同一性，其中所述序列在植物細(xì)胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄。[0008]提供了一種用于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)異源核苷酸序列的方法。該方法包括向植物或植物細(xì)胞內(nèi)引入表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含可操作地連接到本發(fā)明的啟動(dòng)子之一的目的異源核苷酸序列。以此方式，啟動(dòng)子序列可用于控制可操作連接的異源核苷酸序列的表達(dá)。在具體方法中，目的異源核苷酸序列以根優(yōu)選方式表達(dá)。[0009]還提供了一種在植物中以根優(yōu)選方式表達(dá)目的核苷酸序列的方法。該方法包括向植物細(xì)胞內(nèi)引入表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含可操作地連接到目的異源核苷酸序列的本發(fā)明啟動(dòng)子。[0010]目的核苷酸序列的表達(dá)可以提供對(duì)植物表型的修飾。這種修飾包括就數(shù)量、相對(duì)分布等而言調(diào)節(jié)內(nèi)源產(chǎn)物的產(chǎn)生，或外源表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)生以便在植物中提供新功能或產(chǎn)物。在具體方法和組合物中，目的異源核苷酸序列包括賦予除草劑抗性、病原體抗性、昆蟲(chóng)抗性和/或改變的鹽、寒冷或干旱耐受性的基因產(chǎn)物。[0011]提供了表達(dá)盒，其包含可操作地連接到目的異源核苷酸序列的本發(fā)明啟動(dòng)子序列。還另外提供了轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、種子和植物。【具體實(shí)施方式】[0012]本發(fā)明涉及針對(duì)植物啟動(dòng)子的組合物和方法以及它們的應(yīng)用方法。所述組合物包含與稻中RCc3具有強(qiáng)烈相似性的高粱(Sorghumbicolor)基因的啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，所述啟動(dòng)子區(qū)據(jù)報(bào)道以根特異性方式表達(dá)(XuY,etal.(1995)PlantMol.Biol.27:237-248(XuY等人，1995年，《植物分子生物學(xué)》，第27卷，第237-248頁(yè))。所述組合物還包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含與目的異源核苷酸序列可操作連接的高粱RCc3基因的啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。因此，給予SEQIDNO:1中示出的啟動(dòng)子標(biāo)識(shí)名稱“Sb-RCc3啟動(dòng)子”。具體地講，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:1中示出的核苷酸序列的分離核酸分子，和2011年I月25日以專利保藏號(hào)NRRLB-50462保藏于細(xì)菌宿主中的植物啟動(dòng)子序列，以及其片段、變體和互補(bǔ)序列。[0013]包含本發(fā)明的植物啟動(dòng)子核苷酸序列的質(zhì)粒于2011年I月25日作為美國(guó)伊利諾伊州皮奧里亞市北大學(xué)路1815號(hào)(郵編61604)(1815N.UniversityStreet,Peoria,IL,61604)的美國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心的專利保藏物保藏，并且被賦予專利保藏號(hào)NRRLB-50462。這份保藏物將按照國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的條款維持。這份保藏物僅僅為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便而制作，并且并非承認(rèn)按照美國(guó)法典第35篇第112條(35U.S.C.§112)要求保藏。一旦專利授權(quán)，該保藏物將不可撤回地和無(wú)限制或者無(wú)條件地可供公眾獲取。但是，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的可獲取性不構(gòu)成許可在損害政府法令所授予的專利權(quán)的情況下實(shí)施本發(fā)明。[0014]本發(fā)明的Sb_RCc3啟動(dòng)子序列包括允許在植物中引發(fā)轉(zhuǎn)錄的核苷酸構(gòu)建體。在具體的實(shí)施例中，Sb-RCc3啟動(dòng)子序列允許以組織優(yōu)選、更具體地講以根優(yōu)選方式引發(fā)轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的這種構(gòu)建體包括與植物發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。因此，本發(fā)明的組合物包括DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與Sb-RCc3啟動(dòng)子序列可操作連接的目的核苷酸序列。在SEQIDNO:1中示出了Sb-RCc3啟動(dòng)子區(qū)的序列。[0015]本發(fā)明的組合物包括天然Sb_RCc3啟動(dòng)子的核苷酸序列及其片段和變體。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于以組織優(yōu)選、尤其根優(yōu)選方式表達(dá)目的序列。另外本發(fā)明的核苷酸序列可用于構(gòu)建用于目的植物中后續(xù)表達(dá)異源核苷酸序列的表達(dá)載體或用作分離其他Sb-RCc3樣啟動(dòng)子的探針。[0016]本發(fā)明涵蓋分離的或基本上純化的核酸組合物?！胺蛛x的”或者“純化的”核酸分子或者其生物活性部分，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)或者培養(yǎng)基，或者當(dāng)用化學(xué)法合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或者其他化學(xué)物質(zhì)。“分離”的核酸不含在衍生該核酸的生物體的基因組DNA中天然處于該核酸旁側(cè)的序列(即位于該核酸5’和3’端的序列)(最佳地是蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在各個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸分子可以含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的在衍生該核酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然處于該核酸分子的旁側(cè)的核苷酸序列。本發(fā)明的Sb-RCc3啟動(dòng)子序列可以從它們各自的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)旁側(cè)的5’非翻譯區(qū)分離。[0017]所公開(kāi)的啟動(dòng)子核苷酸序列的片段和變體也為本發(fā)明所涵蓋。具體地講，SEQIDNO:1的Sb-RCc3啟動(dòng)子序列的片段和變體可用于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”是指核酸序列的一部分。Sb-RCc3啟動(dòng)子序列的片段可以保留引發(fā)轉(zhuǎn)錄的生物活性，更具體而言，以根優(yōu)選的方式驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄?；蛘?，可用作雜交探針的核苷酸序列片段可以不必保留生物活性。Sb-RCc3基因的啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列的片段可以范圍從至少約20個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸，并且對(duì)于該基因的啟動(dòng)子區(qū)最多至本發(fā)明的全長(zhǎng)核苷酸序列。[0018]Sb-RCc3啟動(dòng)子的生物活性部分可以通過(guò)分離本發(fā)明的Sb_RCc3啟動(dòng)子序列的一部分并評(píng)估該部分的啟動(dòng)子活性來(lái)制備。作為Sb-RCc3啟動(dòng)子核苷酸序列的片段，核酸分子包含至少約16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1550、1600、1650或1700個(gè)核苷酸或者最多至本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)Sb-RCc3啟動(dòng)子序列中存在的核苷酸數(shù)目(例如，對(duì)于SEQIDNO:1為1710個(gè)核苷酸)。[0019]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“變體”表示基本上類(lèi)似的序列。對(duì)于核苷酸序列,可以使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定天然存在的變體，例如用本文所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)來(lái)鑒定。[0020]對(duì)于核苷酸序列，變體包含在天然多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。如本文所用，“天然”核苷酸序列包括天然存在的核苷酸序列。對(duì)于核苷酸序列，天然存在的變體可以使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，例如用下文所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)進(jìn)行鑒定。變體核苷酸序列還包括合成方式衍生的核苷酸序列，如那些例如采用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的核苷酸序列。一般來(lái)講，本發(fā)明的特定核苷酸序列的變體將與這種特定核苷酸序列具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，這通過(guò)本文別處描述的序列比對(duì)程序和參數(shù)確定。本發(fā)明的核苷酸序列的生物活性變體與該序列可以相差少至I至15個(gè)核酸殘基，少至I至10個(gè)(例如6至10個(gè))、少至5個(gè)、少至4、3、2或甚至I個(gè)核酸殘基。[0021]變體核苷酸序列還涵蓋從誘變和誘重組方法(如DNA改組)衍生的序列。利用這樣的方法，可以操縱Sb-RCc3核苷酸序列以產(chǎn)生新的Sb-RCc3啟動(dòng)子。以此方式，從一組相關(guān)的多核苷酸序列產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫(kù)，所述相關(guān)的多核苷酸序列包含具有實(shí)質(zhì)的序列同一性且可以在體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)。這種DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751(Stemmer,1994年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第91卷，第10747至10751頁(yè))；Stemmer(1994)Nature370:389-391(Stemmer,1994年，《自然》，第370卷，第389至391頁(yè))；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15:436-438(Crameri等人，1997年,《自然生物技術(shù)》,第15卷,第436至438頁(yè)；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347(Moore等人，1997年，《分子生物學(xué)雜志》，第272卷，第336至347頁(yè)；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509(Zhang等人，1997年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》,第94卷，第4504至4509頁(yè))；Cramerietal.(1998)Nature391:288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288至291頁(yè))；以及美國(guó)專利N0.5，605，793和N0.5，837，458。[0022]本發(fā)明的核苷酸序列可以用來(lái)分離來(lái)自其他生物、尤其其他植物、更具體而言其他單子葉植物的相應(yīng)序列。以此方式,諸如PCR、雜交等之類(lèi)的方法可以用來(lái)基于這類(lèi)序列與本文所述序列的序列同源性鑒別這類(lèi)序列。本發(fā)明涵蓋基于其與本文示出的完整Sb-RCc3序列或者與其片段的序列同一性而分離的序列。[0023]在PCR方法中，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)，以便從提取自任何目的植物的基因組DNA中擴(kuò)增出相應(yīng)DNA序列。設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域公知的，并且公開(kāi)于以下文獻(xiàn)中:Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約普萊恩維尤)，下文稱“Sambrook”。另參見(jiàn)Innisetal.,eds.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NewYork)(Innis等人編輯，1990年，《PCR方案:方法和應(yīng)用指導(dǎo)》，學(xué)術(shù)出版社，紐約);InnisandGelfand,eds.(1995)PCRStrategies(AcademicPress,NewYork)(Innis和Gelfand編輯，1995年，《PCR策略》，學(xué)術(shù)出版社，紐約)；以及InnisandGelfand,eds.(1999)PCRMethodsManual(AcademicPress,NewYork)(Innis和Gelfand編輯，1999年，《PCR方法手冊(cè)》，學(xué)術(shù)出版社，紐約)。已知的PCR方法包括但不限于利用成對(duì)引物、巢式引物、單一特異引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等的方法。[0024]在雜交技術(shù)中，將已知核苷酸序列的全部或一部分用作探針，所述探針與來(lái)自所選生物體的一組克隆的基因組DNA片段中存在的其他相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交。雜交探針可以用可檢測(cè)基團(tuán)(例如32P)或任何其他可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，可以通過(guò)標(biāo)記基于本發(fā)明Sb-RCc3啟動(dòng)子序列的合成性寡核苷酸來(lái)制備雜交用探針。制備雜交用探針和構(gòu)建基因組文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在Sambrook中有公開(kāi)。[0025]例如，本文公開(kāi)的完整Sb_RCc3啟動(dòng)子序列，或其一個(gè)或多個(gè)部分，可以用作能夠與相應(yīng)Sb-RCc3啟動(dòng)子序列和信使RNA特異性雜交的探針。為了在多種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交，此類(lèi)探針包括在Sb-RCc3啟動(dòng)子序列中獨(dú)特的并且長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為至少約20個(gè)核苷酸的序列。這類(lèi)探針可以用來(lái)從選定的植物通過(guò)PCR擴(kuò)增相應(yīng)的Sb-RCc3啟動(dòng)子序列。這項(xiàng)技術(shù)可以用于來(lái)從所需生物體分離另外的編碼序列，或者用作診斷測(cè)定法以確定編碼序列在生物體中的存在。雜交技術(shù)包括雜交篩選鋪板的DNA文庫(kù)(噬斑或菌落；參見(jiàn)例如，Sambrook)ο[0026]這類(lèi)序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指探針與其靶標(biāo)序列雜交的程度比其與其他序列雜交的程度可檢測(cè)地更高(例如比背景高至少2倍)的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且將在不同環(huán)境下不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶標(biāo)序列(同源探測(cè))?；蛘撸梢哉{(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，最佳地長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。[0027]通常，嚴(yán)格條件將為其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或者其他鹽)，pH為7.0至8.3，對(duì)短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少30°C，對(duì)長(zhǎng)探針(例如超過(guò)50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴(yán)格條件還可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格性條件包括在37°C用30%至35%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，并在50°C至55°C于IX至2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括在370C于40%至45%甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中雜交和在55°C至60°C于0.5X至IXSSC中洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS中在37°C雜交，并在0.1XSSC中在60至65°C持續(xù)至少30分鐘時(shí)間的最終洗滌。雜交的持續(xù)時(shí)間通常少于約24小時(shí)，一般約4至約12小時(shí)。洗滌的持續(xù)時(shí)間將為至少足以達(dá)到平衡的時(shí)間長(zhǎng)度。[0028]特異性通常決定于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交體，Tm(熱熔點(diǎn))可以根據(jù)MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化學(xué)》，第138卷，第267-284頁(yè))的以下方程逼近:Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M為單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，%GC為DNA中鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體的長(zhǎng)度(單位為堿基對(duì))。TmS50%的互補(bǔ)靶標(biāo)序列與完美匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。Tm因每1%錯(cuò)配下降約rc;因此，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交、和/或洗滌條件以與具有所需同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有≥90%同一性的序列，則可以將Tm降低10°C。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的Tm低約5°C。然而，極嚴(yán)格條件可以利用比T1Jg1、2、3或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用比Tm低6、7、8、9或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用比T1Jg11、12、13、14、15或20°C的雜交和/或洗滌。利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯(cuò)配程度導(dǎo)致^低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度，從而可以使用更高的溫度。有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)見(jiàn)Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2(Elsevier,NewYork)(Tijssen,1993,《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)一核酸探針雜交》，第I部分，第2章，愛(ài)思唯爾出版社，紐約)；以及Ausubeletal.,eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandffiley-1nterscience,NewYork)(Ausubel等人編輯，1995年，《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，第2章，GreenePublishingandffiley-1nterscience出版社，紐約)。另參見(jiàn)“Sambrook”。[0029]因此，本發(fā)明涵蓋具有根優(yōu)選啟動(dòng)子活性并且在嚴(yán)格條件下與本文所公開(kāi)的Sb-RCc3啟動(dòng)子序列或與其片段雜交的分離序列。[0030]如下術(shù)語(yǔ)用來(lái)描述兩條或更多條核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系:(a)“參考序列”、(b)“比較窗口”、(C)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分?jǐn)?shù)”和(e)“實(shí)質(zhì)上相同”。[0031](a)本文所用的“參考序列”是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，為全長(zhǎng)cDNA或者基因序列的區(qū)段或者完整的cDNA或者基因序列。[0032](b)本文所用的“比較窗口”是指多核苷酸序列的連續(xù)和指定區(qū)段，其中該比較窗口中的該多核苷酸序列相比于參考序列(不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比對(duì)兩條序列。通常，比較窗口長(zhǎng)度為至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，任選可為30、40、50、100個(gè)或者更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，為避免由于在多核苷酸序列中納入空位所致的與參考序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。[0033]將序列比對(duì)以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。因此，可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成任何兩個(gè)序列之間序列同一性百分?jǐn)?shù)的確定，。此類(lèi)數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是MyersandMiller(1988)CAB10S4:ll-17(Myers和Miller,1988年，《生物信息學(xué)》，第4卷，第11-17頁(yè))的算法；Smithetal.(1981)Adv.Appl.Math.2:482(Smith等人，1981年，《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》,第2卷，第482頁(yè))的局部比對(duì)算法；NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453(Needleman和Wunsch,1970年，《分子生物學(xué)雜志》,第48卷,第443-453頁(yè))的全局比對(duì)算法；PearsonandLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444-2448(Pearson和Lipman,1988年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》第85卷，第2444-2448頁(yè))的搜索局部比對(duì)方法；KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264(Karlin和Altschul,1990年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第872264頁(yè))的算法，其在KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877(Karlin和Altschul,1993年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第90卷，第5873-5877頁(yè))中作了修正。[0034]這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行可以用來(lái)比較序列以確定序列同一性。此類(lèi)程序包括但不限于:PC/Gene程序(可獲自Intelligenetics公司，加利福尼亞州山景城(MountainView,California))中的CLUSTAL;GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage版本10(可獲自美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥的9685斯克蘭頓路(9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA)的AccelrysInc.)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的序列比對(duì)可以使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。以下文獻(xiàn)對(duì)CLUSTAL程序進(jìn)行了詳細(xì)描述:Higginsetal.(1988)，(Gene)，73:237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244頁(yè))；Higginsetal.(1989)，CAB10S5:151-153(Higgins等人，1989年，《生物信息學(xué)》，第5卷，第151-153頁(yè))；Corpetetal.(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》,第16卷，第10881-10890頁(yè));Huangetal.(1992)CAB10S8:155-65(Huang等人，1992年，《生物信息學(xué)》，第8卷，第155-165頁(yè))；以及Pearsonetal.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物學(xué)方法》，第24卷，第307-331頁(yè))。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出處同上)的算法。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，ALIGN程序可以使用PAMl20加權(quán)殘基表(weightresiduetable)、空位長(zhǎng)度罰分12和空位罰分LAltschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403(Altschul等人，1990年，《分子生物學(xué)雜志》，第215:卷，第403頁(yè))的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出處同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分(score)=100、字長(zhǎng)(wordlength)=12來(lái)進(jìn)行，以獲得與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用BLASTX程序、得分=50、字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為了出于比較目的獲得帶空位的比對(duì)結(jié)果，可以如Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389頁(yè))中所描述采用GappedBLAST(在BLAST2.0中)?；蛘?，PS1-BLAST(在BLAST2.0中)可以用來(lái)執(zhí)行檢測(cè)分子之間遠(yuǎn)源關(guān)系的迭代搜索。參見(jiàn)Altschul等人，(1997)，出處同上。當(dāng)采用BLAST、GappedBLAST、PS1-BLAST時(shí)，可以使用各個(gè)程序的默認(rèn)參數(shù)(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))。參見(jiàn)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站。還可以以手動(dòng)方式通過(guò)檢查來(lái)進(jìn)行比對(duì)。[0035]除非另外指明，否則本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下參數(shù)的GAP版本10或其任何等同程序獲得的值:核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；氨基酸序列的％同一'丨生和％相似性采用GAP權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2以及BL0SUM62評(píng)分矩陣。所謂“等同程序”意指任何序列比較程序，所述程序?qū)τ谒紤]的任何兩個(gè)序列，與GAP版本10所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)結(jié)果相比時(shí)，產(chǎn)生具有相同核苷酸殘基或氨基酸殘基匹配和相同序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對(duì)結(jié)果。[0036]GAP使用NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453(Needleman和Wunsch,1970年，《分子生物學(xué)雜志》，第48卷，第443-453頁(yè))的算法，以找到兩個(gè)完全序列的比對(duì)，該比對(duì)能使匹配數(shù)最大和使空位數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對(duì)和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對(duì)。它允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對(duì)于其插入的每個(gè)空位，必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對(duì)于每個(gè)插入的空位必須另外利用空位長(zhǎng)度乘以空位延伸罰分。對(duì)于蛋白質(zhì)序列，GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中的默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。對(duì)于核苷酸序列，默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分為50，而默認(rèn)空位延伸罰分為3?？瘴划a(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可以表述為選自0-200的整數(shù)。因此，例如，空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可以為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。[0037]GAP給出具有最佳比對(duì)的家族中的一個(gè)成員?？赡艽嬖谶@個(gè)家族的許多成員，但其他成員沒(méi)有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對(duì)的四個(gè)優(yōu)值因子:品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是為了比對(duì)序列而最大化的指標(biāo)(metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一性百分?jǐn)?shù)是實(shí)際匹配的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)是相似的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。將相應(yīng)于空位的符號(hào)忽略。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的評(píng)分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，評(píng)定為相似性。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的評(píng)分矩陣為BL0SUM62(參見(jiàn)HenikoffandHenikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第89卷，第10915頁(yè)))。[0038](C)在兩條核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比較窗口范圍為獲得最大對(duì)應(yīng)而比對(duì)時(shí)這兩條序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分?jǐn)?shù)針對(duì)蛋白質(zhì)使用時(shí)，認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基置換，因此不會(huì)改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差別在于保守置換，則可以上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的保守性質(zhì)。差異在于這類(lèi)保守置換的序列稱為具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個(gè)調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，這涉及將保守置換評(píng)定為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，從而增加序列同一性百分?jǐn)?shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予I分，非保守置換給予O分，則保守置換給予O至I之間的分?jǐn)?shù)。保守置換的評(píng)分是例如在程序PC/GENE(加利福尼亞州山景城(MountainView,California)的Intelligenetics公司)中所執(zhí)行那樣進(jìn)行計(jì)算。[0039](d)本文所用的“序列同一性百分?jǐn)?shù)”意指通過(guò)在比較窗口范圍內(nèi)比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列所確定的數(shù)值，其中與參比序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比較窗口中的部分包含添加或缺失(即空位)，以便最佳比對(duì)兩個(gè)序列。通過(guò)以下方式計(jì)算這種百分?jǐn)?shù):確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。[0040](e)術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列的“實(shí)質(zhì)同一性”意指某多核苷酸與參考序列相比包含具有至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%序列同一'丨生的序列,所述百分比是用所述比對(duì)程序之一采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)得到。[0041]核苷酸序列基本上相同的另一種指示是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下是否彼此雜交。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的Tm低約5°C。但是，嚴(yán)格條件涵蓋在比Tm低約1°C至約20°C的范圍內(nèi)的溫度，取決于本文另外限定的所需嚴(yán)格性程度。[0042]如本文所用，術(shù)語(yǔ)植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、從中可再生出植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、在植物或植物部分中完好的植物塊和植物細(xì)胞如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、仁、穗、穗軸、殼、莖、根、根尖、花粉囊等。谷粒意在表示由商業(yè)種植者出于栽培或繁殖物種之外的目的所生產(chǎn)的成熟種子。再生的植物的子代、變體和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，條件是這些部分包含所引入的多核苷酸。[0043]本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。植物物種的例子包括玉米(Zeamays);蕓苔屬物種(Brassicasp.)(例如，歐洲菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)),特別是可用作種子油來(lái)源的那些蕓苔屬物種;苜猜(Medicagosativa)、水稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor,Sorghumvulgare)、粟(如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黃米(PanicummiIiaceum)、谷子(Setariaitalica)、龍爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、茶(CamelliasinensiS)、香蕉(Musaspp.)、鱷梨(Perseaamericana)、無(wú)花果(Ficuscasica)、番石植(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、撤攬(Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲堅(jiān)果(Macadamiaintegrifolia)、杏樹(shù)(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘鹿(Saccharumspp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹(shù)。[0044]蔬菜包括番爺(Lycopersiconesculentum)、萵苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利馬豆(PhaseolusIimensis)、豌豆(Lathyrusspp.)和黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜胃$(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱樓(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙(Narcissusspp.)、矮牽牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)>一品紅(Euphorbiapulcherrima)和菊花。[0045]可用于實(shí)施本發(fā)明的針葉樹(shù)包括(例如)松樹(shù)如火炬松(Pinustaeda)、濕地松(Pinuselliotii)、西黃松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)和福射松(Pinusradiata);花方萁松(Pseudotsugamenziesii);西鐵杉(Tsugacanadensis);北美云杉(Piceaglauca);紅杉(Sequoiasempervirens);揪樹(shù)(truefirs)如銀揪(Abiesamabilis)和膠揪(Abiesbalsamea);以及雪松如西方紅雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黃雪松(Chamaecyparisnootkatensis)。在具體的實(shí)施例中，本發(fā)明的植物是作物植物(例如玉米、苜猜、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、稷、煙草等等)。在其他實(shí)施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他實(shí)施例中，玉米植物是最佳的。[0046]其他的目的植物包括提供目的種子的谷物植物、油料種子植物和豆科植物。目的種子包括谷物種子，例如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、裸麥等。油料種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔、玉蜀黍、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括豆類(lèi)和豌豆。豆類(lèi)包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。[0047]由本發(fā)明的Sb_RCc3啟動(dòng)子表達(dá)的異源編碼序列可以用于改變植物的表型。表型的各種變化是值得關(guān)注的，包括調(diào)芐基因在植物根中的表達(dá)、改變植物對(duì)病原體或昆蟲(chóng)的防御機(jī)制、提高植物在植物中對(duì)除草劑的耐受性、改變根發(fā)育以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫、調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽、溫度(熱和寒冷)、干旱的響應(yīng)等。這些結(jié)果可以通過(guò)表達(dá)包含適當(dāng)基因產(chǎn)物的目的異源核苷酸序列來(lái)獲得。在具體的實(shí)施例中，目的異源核苷酸序列是在該植物或植物部分中增加其表達(dá)水平的內(nèi)源植物序列。或者，這些結(jié)果可以通過(guò)引起植物中一種或者多種內(nèi)源基因產(chǎn)物、尤其酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者輔因子的表達(dá)降低或者通過(guò)影響植物中營(yíng)養(yǎng)物攝取來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表型變化。[0048]本發(fā)明的目的核苷酸序列的大體類(lèi)別包括(例如)涉及信息的那些基因(如鋅指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及持家的那些基因(如熱休克蛋白)。更具體的轉(zhuǎn)基因類(lèi)另Ij(例如)包括編碼農(nóng)藝學(xué)、昆蟲(chóng)抗性、抗病、除草劑抗性、環(huán)境脅迫抗性(對(duì)寒冷、鹽、干旱等的耐受性改變)的重要性狀的基因。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，目的任何基因可以與本發(fā)明的啟動(dòng)子可操作地連接并在植物中表達(dá)。[0049]昆蟲(chóng)抗性基因可以編碼針對(duì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量的害蟲(chóng)的抗性，所述害蟲(chóng)例如是根蟲(chóng)、切根蟲(chóng)、歐洲玉蜀黍螟等。這類(lèi)基因包括(例如)蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因(美國(guó)專利N0.5，366,892;5，747,450;5，736,514;5，723，756;5，593,881;和Geiseretal.(1986)Gene48:109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109頁(yè)));等。[0050]編碼抗病性性狀的基因包括解毒基因，例如對(duì)伏馬菌素解毒的那些基因(美國(guó)專利N0.5，792，931);無(wú)毒力(avr)和抗病性(R)基因(Jonesetal.(1994)Science266:789(Jones等人，1994年，《科學(xué)》，第266卷，第789頁(yè));Martinetal.(1993)Science262:1432(Martin等人，1993年，《科學(xué)》，第262卷，第1432頁(yè))；以及Mindrinosetal.(1994)Cell78:1089(Mindrinos等人，1994年，《細(xì)胞》，第78卷,第1089頁(yè))；等。[0051]除草劑抗性性狀可以包括編碼針對(duì)起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)之作用的除草劑的抗性的基因，特別是磺酰脲型除草劑(例如含有導(dǎo)致這種抗性的突變特別是S4和/或Hra突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因);編碼對(duì)能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑的抗性的基因，例如草胺膦或basta(例如bar基因);草甘磷(如，EPSPS基因和GAT基因；參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利公開(kāi)N0.20040082770和W003/092360)或本領(lǐng)域已知的其他此類(lèi)基因。bar基因編碼對(duì)除草劑basta的抗性，nptll基因編碼針對(duì)抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS基因突變體編碼針對(duì)除草劑氯磺隆的抗性。[0052]草甘磷抗性由突變的5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP)基因和aroA基因賦予。參見(jiàn)(例如)Shah等人的美國(guó)專利N0.4，940，835，其公開(kāi)了EPSPS形式的能賦予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美國(guó)專利N0.5，627，061也描述了編碼EPSPS酶的基因。還可參見(jiàn)美國(guó)專利N0.6，248，876B1;6，040，497;5，804，425;5，633，435;5，145，783；4，971，908;5，312，910;5，188，642;4，940，835;5，866，775;6，225，114B1;6，130，366；5，310,667;4，535，060;4，769，061;5，633，448;5，510,471；Re.36，449；RE37,287E；和5，491，288;以及國(guó)際公開(kāi)W097/04103;TO97/04114;TO00/66746;TO01/66704;W000/66747和W000/66748，將這些專利為此目的以引用的方式并入本文。也向植物賦予草甘磷抗性，所述植物表達(dá)編碼草甘磷氧化還原酶的基因，如美國(guó)專利N0.5，776，760和N0.5，463，175中更充分地描述，將這兩個(gè)專利為此目的以引用的方式并入本文。另外，可以通過(guò)過(guò)量表達(dá)編碼草甘磷N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因向植物賦予草甘磷抗性。參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利7，714，188和7，462，481。[0053]外源產(chǎn)物包括植物酶和植物產(chǎn)物以及來(lái)自包括原核生物和其他真核生物在內(nèi)的其他來(lái)源的那些酶和產(chǎn)物。這類(lèi)產(chǎn)物包括酶、輔因子、激素等等。[0054]其他適用基因及其相關(guān)表型的例子包括編碼病毒外殼蛋白和/或RNA的基因或者賦予病毒抗性的其他病毒基因或者植物基因；賦予真菌抗性的基因；促進(jìn)產(chǎn)量改善的基因；以及提供針對(duì)脅迫的抗性的基因，所述脅迫例如為寒冷、因干旱、熱和鹽度引起的脫水、有毒金屬或者痕量元素等。[0055]如上所述，與本文所公開(kāi)的Sb_RCc3啟動(dòng)子可操作地連接的異源核苷酸序列可以是針對(duì)靶向基因的反義序列。因此，本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子序列可以可操作地連接到反義DNA序列，以降低或抑制植物根中天然蛋白的表達(dá)。[0056]“RNAi”指用于降低基因的表達(dá)的一系列相關(guān)技術(shù)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利N0.6，506，559)。由其他名稱所指的較老技術(shù)現(xiàn)在據(jù)認(rèn)為基于相同的機(jī)制，不過(guò)在文獻(xiàn)中被賦予不同的名稱。這些包括“反義抑制”，即產(chǎn)生能夠抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物，以及“共抑制”或者“正義抑制”，指產(chǎn)生能夠抑制相同的或者實(shí)質(zhì)上相似的外來(lái)基因或者內(nèi)源基因的表達(dá)的正義RNA轉(zhuǎn)錄物(美國(guó)專利N0.5，231，020，以引用方式并入本文)。這種技術(shù)依賴于使用能導(dǎo)致積累這樣的雙鏈RNA的構(gòu)建體，該雙鏈RNA中的一條鏈與要沉默的靶標(biāo)基因互補(bǔ)。所述實(shí)施例的Sb-RCc3啟動(dòng)子可以用來(lái)驅(qū)動(dòng)將會(huì)產(chǎn)生RNA干擾的構(gòu)建體(包括microRNA和siRNA)的表達(dá)。[0057]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“轉(zhuǎn)錄起始區(qū)”意指DNA調(diào)節(jié)區(qū)，其通常包含能夠引導(dǎo)RNA聚合酶II以在特定編碼序列的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處引發(fā)RNA合成的TATA框。啟動(dòng)子可以另外包含通常位于TATA框的上游(5’)的其他識(shí)別序列，稱為上游啟動(dòng)子元件，它們影響轉(zhuǎn)錄引發(fā)速率。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在鑒定到本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列的情況下，分離和鑒定在本文所鑒定的特定啟動(dòng)子區(qū)上游的5’非翻譯區(qū)中的更多調(diào)節(jié)元件屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。另外，可以提供嵌合啟動(dòng)子。這種嵌合體包括該啟動(dòng)子序列的部分與異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的片段和/或變體融合。因此，本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)可包含上游調(diào)節(jié)元件，如那些負(fù)責(zé)編碼序列的組織表達(dá)和時(shí)序表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，增強(qiáng)子等等。以相同的方式，可以鑒定、分離使得在所需組織(如根)中表達(dá)成為可能的啟動(dòng)子元件，并將其與其他核心啟動(dòng)子一起使用以賦予根優(yōu)選的表達(dá)。在本發(fā)明的這個(gè)方面，“核心啟動(dòng)子”意指無(wú)啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子。[0058]在本發(fā)明的情形中，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”也指通常但不總是位于結(jié)構(gòu)基因的編碼序列的上游(5’)的DNA序列，其包括通過(guò)提供為使轉(zhuǎn)錄在特定位點(diǎn)引發(fā)而需要的RNA聚合酶和/或其他因子的識(shí)別來(lái)控制編碼區(qū)的表達(dá)的序列。提供RNA聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別以確保在特定位點(diǎn)處引發(fā)的調(diào)節(jié)元件的例子，是啟動(dòng)子元件。啟動(dòng)子元件包含負(fù)責(zé)引發(fā)轉(zhuǎn)錄的核心啟動(dòng)子元件以及修飾基因表達(dá)的其他調(diào)節(jié)元件(如在本專利申請(qǐng)其他地方所討論)。應(yīng)理解，位于編碼區(qū)序列的內(nèi)含子內(nèi)或者編碼區(qū)序列3’的核苷酸序列也可有助于目的編碼區(qū)的表達(dá)的調(diào)節(jié)。合適的內(nèi)含子的例子包括但不限于玉蜀黍IVS6內(nèi)含子，或者玉蜀黍肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子。調(diào)節(jié)元件還可包括那些位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游(3’)的元件，或者位于被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域內(nèi)的元件，或者同時(shí)以上兩種情況。在本發(fā)明的背景下，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件可以包括在轉(zhuǎn)錄引發(fā)之后有活性的元件，例如翻譯和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯和轉(zhuǎn)錄阻遏物和mRNA穩(wěn)定性決定因子。[0059]可以將本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件或其變體或片段與異源調(diào)節(jié)元件或啟動(dòng)子可操作地連接，以調(diào)控異源調(diào)節(jié)元件的活性。這種調(diào)控包括增強(qiáng)或抑制異源調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄活性、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后事件、或者增強(qiáng)或抑制異源調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄活性并調(diào)控轉(zhuǎn)錄后事件。例如，可以將本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)元件或其片段與組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子或其片段可操作地連接，以調(diào)控這種啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中的所需組織內(nèi)的活性。[0060]與目的異源核苷酸序列可操作地連接到時(shí)，本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列或其變體或片段可以驅(qū)動(dòng)所述異源核苷酸序列在表達(dá)這個(gè)構(gòu)建體的植物的根(或根部分)中的根優(yōu)選性表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“根優(yōu)選的”表示異源核苷酸序列的表達(dá)在根或根部分最為豐富，所述根部分包括(例如)根冠、頂端分生組織、原表皮、基本分生組織、原形成層、內(nèi)皮、皮質(zhì)、脈管皮質(zhì)、表皮等等。雖然異源核苷酸序列的某種表達(dá)水平可以在其他植物組織類(lèi)型中發(fā)生，但表達(dá)在根或根部分(包括初生根、側(cè)根和不定根)中最豐富地發(fā)生。[0061]“異源核苷酸序列”是不與本發(fā)明的啟動(dòng)子序列一起天然存在的序列。雖然這個(gè)核苷酸序列對(duì)于啟動(dòng)子序列是異源的，但它對(duì)于植物宿主可以是同源的、或天然的、或異源的、或外來(lái)的。[0062]可以修飾本發(fā)明的分離啟動(dòng)子序列以提供所述異源核苷酸序列的一系列表達(dá)水平。因此，可以利用小于完整的啟動(dòng)子區(qū)，并且驅(qū)動(dòng)目的核苷酸序列表達(dá)的能力得到保持。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以按不同方式缺失啟動(dòng)子序列的部分，改變mRNA的表達(dá)水平。如果(例如)在截短過(guò)程中移除(阻遏蛋白的)負(fù)調(diào)節(jié)元件，則因啟動(dòng)子的缺失，可以降低mRNA表達(dá)水平，或者可以增加表達(dá)。通常，分離的啟動(dòng)子序列的至少約20個(gè)核苷酸將用于驅(qū)動(dòng)核苷酸序列的表達(dá)。[0063]應(yīng)認(rèn)識(shí)到，為提高轉(zhuǎn)錄水平，可將增強(qiáng)子與本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)組合使用。增強(qiáng)子是起到增加啟動(dòng)子區(qū)的表達(dá)的作用的核苷酸序列。增強(qiáng)子是本領(lǐng)域已知的，包括SV40增強(qiáng)子區(qū)、35S增強(qiáng)子元件等。一些增強(qiáng)子還已知用來(lái)改變正常的啟動(dòng)子表達(dá)模式，例如通過(guò)造成啟動(dòng)子被組成型表達(dá)而改變正常的啟動(dòng)子表達(dá)模式，若沒(méi)有該增強(qiáng)子，則該啟動(dòng)子僅在一個(gè)特定組織或一些特定組織中被表達(dá)。[0064]本發(fā)明的分離啟動(dòng)子序列的修飾可以提供該異源核苷酸序列的一系列的表達(dá)。因此，可以將它們修飾成弱啟動(dòng)子或者強(qiáng)啟動(dòng)子。通常，“弱啟動(dòng)子”是指以低水平驅(qū)動(dòng)編碼序列的表達(dá)的啟動(dòng)子。“低水平”表達(dá)意在指以約1/10，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/100，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/500，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平表達(dá)。相反，強(qiáng)啟動(dòng)子以高水平或者說(shuō)以約1/10個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/100個(gè)轉(zhuǎn)錄物至約1/1，000個(gè)轉(zhuǎn)錄物的水平驅(qū)動(dòng)編碼序列的表達(dá)。[0065]已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以與它們的天然Sb-RCc3編碼序列一起使用以增加或減少表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表型的變化。這種表型變化可能進(jìn)一步影響已轉(zhuǎn)化植物的組織中金屬離子水平的增加或減少。[0066]本發(fā)明中公開(kāi)的核苷酸序列及其變體和片段可以用于任何植物的遺傳操縱。與待控制其表達(dá)以實(shí)現(xiàn)所需表型反應(yīng)的異源核苷酸序列可操作地連接時(shí)，Sb-RCc3啟動(dòng)子序列可用于這個(gè)方面。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指該異源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯處于該啟動(dòng)子序列的影響下。以此方式，可以將本發(fā)明的啟動(dòng)子的核苷酸序列與目的異源核苷酸序列一起在表達(dá)盒中提供，以便在目的植物中、更具體地在植物的根中表達(dá)。[0067]這種表達(dá)盒將包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)包含與該異源核苷酸序列可操作連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列之一或其變體或片段。這種表達(dá)盒可以配有多個(gè)限制位點(diǎn)用于插入該核苷酸序列以便處于調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。表達(dá)盒可以另外含有選擇標(biāo)記基因以及3’終止區(qū)。[0068]表達(dá)盒可以按5’-3’轉(zhuǎn)錄方向包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即本發(fā)明的啟動(dòng)子或其變體或片段)、翻譯起始區(qū)、目的異源核苷酸序列、翻譯終止區(qū)并任選包括在宿主生物體中有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。各實(shí)施例的調(diào)節(jié)區(qū)(即啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞而言或者彼此之間可以是天然的/同功的。或者，各實(shí)施例的調(diào)節(jié)區(qū)和/或多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞或者彼此之間可以是異源的。如本文所用，針對(duì)序列所謂的“異源”為起源于外來(lái)物種的序列，或者，如果起源于相同物種的話，則通過(guò)有意的人為干預(yù)對(duì)其天然形式在組成和/或基因座方面進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修飾的序列。例如，可操作地連接到異源多核苷酸的啟動(dòng)子來(lái)自與衍生這種多核苷酸的物種不同的物種，或者如果來(lái)自于相同/相似的物種，則一者或者兩者基本上從它們的原始形式和/或基因座修飾而獲得，或者該啟動(dòng)子不是用于可操作連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。[0069]雖然可能優(yōu)選的是使用本發(fā)明的啟動(dòng)子表達(dá)異源核苷酸序列，但也可以表達(dá)天然序列。這種構(gòu)建體將改變Sb-RCc3蛋白在植物或植物細(xì)胞中的表達(dá)水平。因此，改變植物或植物細(xì)胞的表型。[0070]終止區(qū)可以是對(duì)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言是天然的，可以對(duì)可操作連接的目的DNA序列而言是天然的，可以對(duì)植物宿主而言是天然的，或者可以衍自另一來(lái)源(即對(duì)于該啟動(dòng)子、被表達(dá)的DNA序列、植物宿主或者它們的任何組合而言是外來(lái)的或異源的)。便利的終止區(qū)可獲自根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒,如章魚(yú)氨酸合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)。另參見(jiàn)Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》，第262卷，第141-144頁(yè))；Proudfoot(1991)Cel164:671-674(Proudfoot,1991年，《細(xì)胞》，第64卷，第671-674頁(yè))；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5:141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和發(fā)育》，第5卷，第141-149頁(yè));Mogenetal.(1990)PlantCell2:1261_1272(Mogen等人，1990年，《植物細(xì)胞》，第2卷，第1261-1272頁(yè))；Munroeetal.(1990)Gene91:151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158頁(yè))；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903(Balias等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903頁(yè))；以及Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639頁(yè))。[0071]包含本發(fā)明的序列的表達(dá)盒還可以含有待共轉(zhuǎn)化入該生物體中的基因的至少一條另外核苷酸序列?；蛘?，所述另外序列可以在另一表達(dá)盒上提供。[0072]在適當(dāng)情況下，可以優(yōu)化其表達(dá)待處于本發(fā)明的根優(yōu)選啟動(dòng)子序列控制下的核苷酸序列和任何另外的核苷酸序列，以便在轉(zhuǎn)化的植物中增加表達(dá)。也即，可使用植物優(yōu)選的密碼子來(lái)合成這些核苷酸序列以改進(jìn)表達(dá)。有關(guān)宿主優(yōu)選密碼子用法的討論，參見(jiàn)例如CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.92:1-11(Campbell和Gowri,1990年，《植物生理學(xué)》，第92卷，第1-11頁(yè))。本領(lǐng)域可獲得用于合成植物優(yōu)選性基因的方法。參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利N0.5，380，831、5，436，391，以及Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477至498頁(yè))，上述文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。[0073]已知另外的序列修飾增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包括消除以下序列:編碼假多腺苷酸化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)的序列、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列以及其他此類(lèi)充分表征的可能有害于基因表達(dá)的序列。可以將異源核苷酸序列的G-C含量調(diào)整至給定細(xì)胞宿主的平均水平，所述平均水平通過(guò)參考該宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因來(lái)計(jì)算。當(dāng)可能時(shí)，修飾序列以避免預(yù)測(cè)的發(fā)夾二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。[0074]表達(dá)盒可以另外含有5’前導(dǎo)序列。此類(lèi)前導(dǎo)序列可以起到增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的并且包括:微RNA病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))(Elroy-Steinetal.(1989)Proc.Nat.Acad.Sc1.USA86:6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第86卷，第6126至6130頁(yè)))；馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)(Allisonetal.(1986)Virologyl54:9-20(Allison等人，1986年，《病毒學(xué)》，第154卷，第9-20頁(yè)));MDMV前導(dǎo)序列(玉蜀黍矮花葉病毒)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejaketal.(1991)Nature353:90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94頁(yè)))；來(lái)自苜蓿花葉病毒的外殼蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導(dǎo)序列(Joblingetal.(1987)Nature325:622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622至625頁(yè)));煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV)(Gallieetal.(1989)MolecularBiologyofRNA,pages237_256(Gallie等人，1989年，《RNA的分子生物學(xué)》，第237-256頁(yè)))；以及玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(Lommeletal.(1991)Virology81:382-385(Lommel等人，1991年，《病毒學(xué)》，第81卷，第382至385頁(yè)))。還可參見(jiàn)Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiology84:965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理學(xué)》，第84卷，第965-968頁(yè))。也可以采用已知增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的方法，例如內(nèi)含子，如玉蜀黍遍在蛋白內(nèi)含子(ChristensenandQuail(1996)TransgenicRes.5:213-218(Christensen和Quail,1996年，《轉(zhuǎn)基因研究》，第5卷，第213至218頁(yè));Christensenetal.(1992)PlantMolecularBiologyl8:675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物學(xué)》，第18卷，第675-689頁(yè)))或者玉蜀黍AdhI內(nèi)含子(Kyozukaetal.(1991)Mol.Gen.Genet.228:40-48(Kyozuka等人，1991年,《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》,第228卷,第40-48頁(yè));Kyozukaetal.(1990)Maydica35:353-357(Kyozuka等人，1990年，((Maydica)),第35卷，第353-357頁(yè)))等。[0075]在制備表達(dá)盒時(shí)，可對(duì)各種DNA片段進(jìn)行操縱，以提供處于正確取向的DNA序列，且適當(dāng)時(shí)提供處于正確的閱讀框的DNA序列。為此目的，可應(yīng)用銜接子或接頭將DNA片段連接在一起，或者可涉及其他的操縱以提供便利的限制位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制位點(diǎn)等。為此目的，可能涉及到體外誘變、引物修復(fù)、限制、復(fù)性、再置換，例如轉(zhuǎn)換和顛換。[0076]可以在表達(dá)盒中包含報(bào)告基因或者選擇性標(biāo)記基因。本領(lǐng)域已知的合適報(bào)告基因的例子可以見(jiàn)于(例如)以下文獻(xiàn):Jeffersonetal.(1991)inPlantMolecularBiologyManual,ed.Gelvinetal.(KluwerAcademicPublishers),pp.1-33(Jefferson等人，1991年，引自《植物分子生物學(xué)手冊(cè)》，Gelvin等人編輯，克呂維爾學(xué)術(shù)出版社，第1-33頁(yè));DeWetetal.(1987)Mol.Cell.Biol.7:725-737(Deffet等人，1987年，《分子細(xì)胞生物學(xué)》，第7卷，第725-737頁(yè));Goffetal.(1990)EMBOJ.9:2517_2522(Goff等人，1990年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第9卷，第2517至2522頁(yè));Kainetal.(1995)BioTechniquesl9:650-655(Kain等人，1995年，《生物技術(shù)》，第19卷,第650-655頁(yè))；和Chiuetal.(1996)CurrentBiology6:325-330(Chiu等人，1996年，《當(dāng)代生物學(xué)》，第6卷，第325-330頁(yè))。[0077]用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞或者組織的選擇性標(biāo)記基因可以包括賦予抗生素抗性或者除草劑抗性的基因。合適的選擇性標(biāo)記基因的例子包括但不限于:編碼針對(duì)以下物質(zhì)的抗性的基因:氯霉素(HerreraEstrellaetal.(1983)EMBOJ.2:987-992(HerreraEstrella等人，1983年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第2卷，第987-992頁(yè)))；甲氨喋呤(HerreraEstrellaetal.(1983)Nature303:209-213(HerreraEstrella等人，1983年，《自然》，第303卷，第209-213頁(yè)))；Meijeretal.(1991)PlantMol.Biol.16:807-820(Meijer等人，1991年，《植物分子生物學(xué)》，第16卷，第807-820頁(yè)));潮霉素(Waldronetal.(1985)PlantMol.Biol.5:103_108(Waldron等人，1985年，《植物分子生物學(xué)》，第5卷，第103-108頁(yè))；和Zhijianetal.(1995)PlantSciencel08:219-227(Zhijian等人，1995年，《植物科學(xué)》，第108卷，第219-227頁(yè)));鏈霉素(Jonesetal.(1987)Mol.Gen.Genet.210:86-91(Jones等人，1987年，《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》，第210卷，第86-91頁(yè)))；壯觀霉素(Bretagne-Sagnardetal.(1996)TransgenicRes.5:131-137(Bretagne-Sagnard等人，1996年，《轉(zhuǎn)基因研究》，第5卷，第131-137頁(yè)))；博來(lái)霉素(Hilleetal.(1990)PlantMol.Biol.7:171-176(Hille等人，1990年，《植物分子生物學(xué)》，第7卷，第171-176頁(yè)))；橫酸胺(Guerineauetal.(1990)PlantMol.Biol.15:127-136(Guerineau等人，1990年，《植物分子生物學(xué)》，第15卷，第127-136頁(yè)))；溴苯腈(Stalkeretal.(1988)Science242:419-423(Stalker等人，1988年，《科學(xué)》，第242卷，第419-423頁(yè)))；草甘膦(Shawetal.(1986)Science233:478-481(Shaw等人，1986年，《科學(xué)》，第233卷，第478-481頁(yè));以及美國(guó)專利申請(qǐng)N0.10/004，357和10/427,692);膦絲菌素(DeBlocketal.(1987)EMBOJ.6:2513-2518(DeBlock等人，1987年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第6卷，第2513-2518頁(yè)))。[0078]可以在回收轉(zhuǎn)基因事件中發(fā)揮作用但在最終產(chǎn)物中可能不需要的其他基因?qū)ǖ幌抻谥T如以下例子:GUS(β-葡糖醒酸酶；Jefferson(1987)PlantMol.Biol.Rep.5:387(Jefferson,1987年，《植物分子生物學(xué)報(bào)道》，第5卷，第387頁(yè)))、GFP(綠色熒光蛋白；Chalfieetal.(1994)Science263:802(Chalfie等人，1994年，《科學(xué)》，第263卷，第802頁(yè)))、螢光素酶(Riggsetal.(1987)NucleicAcidsRes.15(19):8115(Riggs等人，1987年，《核酸研究》,第15卷,第19期,第8115頁(yè))以及Luehrsenetal.(1992)MethodsEnzymol.216:397-414(Luehrsen等人，1992年，《酶學(xué)方法》，第216卷，第397-414頁(yè)))，以及編碼花青素生產(chǎn)的玉蜀黍基因(Ludwigetal.(1990)Science247:449(Ludwig等人，1990年，《科學(xué)》，第247卷，第449頁(yè)))。[0079]包含與目的核苷酸序列可操作連接的本發(fā)明Sb_RCc3啟動(dòng)子的表達(dá)盒可以用來(lái)轉(zhuǎn)化任何植物。以此方式，可以獲得基因修飾的植物、植物細(xì)胞、植物組織、種子、根等。[0080]本發(fā)明的方法涉及將多肽或多核苷酸引入植物中。“引入”意在指以多核苷酸或者多肽序列進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部的方式將多核苷酸或者多肽呈送到植物。本發(fā)明的方法不取決于將序列引入植物中的具體方法，只要多核苷酸或多肽進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。將多核苷酸或多肽引入植物的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。[0081]“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”意指引入植物中的核苷酸構(gòu)建體整合到植物的基因組中，并能夠由其后代繼承?！八矔r(shí)轉(zhuǎn)化”意指將多核苷酸引入植物中但它沒(méi)有整合到植物的基因組中，或者將多肽引入植物中。[0082]轉(zhuǎn)化方案以及將核苷酸序列引入植物中的方案，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化所指向的植物或者植物細(xì)胞的類(lèi)型(即單子葉植物或者雙子葉植物)變動(dòng)。將核苷酸序列引入植物細(xì)胞中并隨后插入植物基因組中的合適方法包括:微量注射法(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4:320-334(Crossway等人，1986年，《生物技術(shù)》，第4卷，第320-334頁(yè)))、電穿孔法(Riggsetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606(Riggs等人，1986年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》,第83卷,第5602至5606頁(yè)))、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(Townsendetal.,U.S.PatentNos.5,563,055(Townsend等人，美國(guó)專利N0.5，563，055)和Zhaoetal.，5，981，840(Zhao等人，美國(guó)專利N0.5，981，840))、直接基因轉(zhuǎn)移法(Paszkowskietal.(1984)EMBOJ.3:2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》，第3卷，第2717-2722頁(yè)))和彈道粒子加速(參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利N0.4，945，050;5，879，918;5，886，244;5，932，782；Tomesetal.(1995)inPlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin)(Tomes等人，1995年，《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng):基本方法》，Gamborg和Phillips編輯,斯普林格出版社,柏林)；McCabeetal.(1988)Biotechnology6:923-926(McCabe等人，1988年，《生物技術(shù)》，第6卷，第923-926頁(yè)))和Lecl轉(zhuǎn)化(W000/28058)。還可參見(jiàn)Weissingeretal.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477(Weissinger等人，1988年，《遺傳學(xué)年評(píng)》，第22卷，第421-477頁(yè));Sanfordetal.(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科學(xué)和技術(shù)》，第5卷，第27-37頁(yè))(洋蔥)；Christouetal.(1988)PlantPhysiol.87:671-674(Christou等人，1988年，《植物生理學(xué)》，第87卷，第671-674頁(yè))(大豆)；McCabeetal.(1988)Bio/Technology6:923-926(McCabe等人，1988年，《生物/技術(shù)》，第6卷，第923-926頁(yè))(大豆)；FinerandMcMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P:175-182(Finer和McMullen，1991年，《體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)》，第27P卷，第175-182頁(yè))(大豆)；Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(Singh等人，1998年，《理論和應(yīng)用遺傳學(xué)》，第96卷，第319-324頁(yè))(大豆)；Dattaetal.(1990)Biotechnology8:736-740(Datta等人，1990年，《生物技術(shù)》，第8卷，第736-740頁(yè))(水稻)；Kleinetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309(Klein等人，1988年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第85卷，第4305-4309頁(yè))(玉蜀黍)；Kleinetal.(1988)Biotechnology6:559-563(Klein等人，1988年，《生物技術(shù)》，第6卷，第559-563頁(yè))(玉蜀黍)；美國(guó)專利N0.5，240，855、N0.5，322，783和N0.5，324，646;Kleinetal.(1988)PlantPhysiol.91:440-444(Klein等人，1988年，《植物生理學(xué)》，第91卷，第440-444頁(yè))(玉蜀黍)；Frommetal.(1990)Biotechnology8:833-839(Fromm等人，1990年，《生物技術(shù)》，第8卷，第833-839頁(yè))(玉蜀黍)；Hooykaas_VanSlogterenetal.(1984)Nature(London)311:763-764(Hooykaas-VanSlogteren等人，1984年，《自然(倫敦)》，第311卷，第763-764頁(yè));美國(guó)專利N0.5，736，369(谷類(lèi))；Bytebieretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第84卷，第5345-5349頁(yè))(百合科)；DeWetetal.(1985)inTheExperimentalManipulationofOvuleTissues,ed.Chapmanetal.(Longman，NewYork)，pp.197-209(DeWet等人，1985年，《胚珠組織的實(shí)驗(yàn)操縱》，Chapman等人編輯，朗文出版社，紐約，第197-209頁(yè))(花粉);Kaeppleretal.(1990)PlantCellReports9:415_418(Kaeppler等人，1990年，《植物細(xì)胞報(bào)道》，第9卷，第415-418頁(yè))和Kaeppleretal.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(Kaeppler等人，1992年，《理論和應(yīng)用遺傳學(xué)》，第84卷，第560-566頁(yè))(觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D’Halluinetal.(1992)PlantCell4:1495-1505(D，Halluin等人，1992年，《植物細(xì)胞》，第4卷，第1495-1505頁(yè))(電穿孔);Lietal.(1993)PlantCellReportsl2:250-255(Li等人，1993年，《植物細(xì)胞報(bào)道》，第12卷，第250-255頁(yè))和ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75:407-413(Christou和Ford，1995年，《植物學(xué)年鑒》，第75卷，第407-413頁(yè))(水稻)；0sjodaetal.(1996)NatureBiotechnologyl4:745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技術(shù)》，第14卷，第745-750頁(yè))(通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)轉(zhuǎn)化玉蜀黍);所有這些文獻(xiàn)和專利均以引用方式并入本文。[0083]在具體的實(shí)施例中，可以使用多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，向植物提供包含本發(fā)明啟動(dòng)子序列的DNA構(gòu)建體。這類(lèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于病毒載體系統(tǒng)以及以阻止DNA后續(xù)釋放的方式沉淀多核苷酸。因此，可能從粒子結(jié)合的DNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但將它釋放出來(lái)以整合到基因組中的頻率大大降低。此類(lèi)方法包括使用聚乙基亞胺(PEI;Sigma#P3143)涂覆的粒子。[0084]在其他實(shí)施例中，可以通過(guò)使植物與病毒或病毒核酸接觸而將本發(fā)明的多核苷酸引入到植物中。通常，這類(lèi)方法涉及將本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體摻入病毒DNA或RNA分子內(nèi)部。涉及病毒DNA或RNA分子的用于將多核苷酸引入植物中并表達(dá)其中所編碼的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利N0.5，889，191,5,889,190,5,866,785,5，589，367、5，316，931和Portaetal.(1996)MolecularBiotechnology5:209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技術(shù)》，第5卷，第209-221頁(yè));將這些專利以引用方式并入本文。[0085]用于在植物基因組中特定位置處定向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施例中，使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)在所需的基因組位置處插入多核苷酸。參見(jiàn)(例如)W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，將這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文。簡(jiǎn)單而言，可以在轉(zhuǎn)移盒中包含本發(fā)明的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)移盒旁側(cè)分布有兩個(gè)不相同的重組位點(diǎn)。將轉(zhuǎn)移盒引入其基因組中穩(wěn)定摻入靶位點(diǎn)的植物中，其中所述靶位點(diǎn)旁側(cè)分布有兩個(gè)與該轉(zhuǎn)移盒的所述位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的不相同重組位點(diǎn)。提供適當(dāng)?shù)闹亟M酶并且將所述轉(zhuǎn)移盒整合在靶位點(diǎn)處。目的多核苷酸因此整合在植物基因組中的特定染色體位置。[0086]轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以根據(jù)常規(guī)方式培育成植株。參見(jiàn)例如McCormicketal.(1986)PlantCellReports5:81-84(McCormick等人，1986年，《植物細(xì)胞報(bào)道》,第5卷，第81-84頁(yè))。然后可以培育這些植株，用相同的轉(zhuǎn)化株系或者不同的株系授粉，并鑒定出具有所需表型特征的組成型表達(dá)的所得雜交體。可以培育兩代或更多代以確保穩(wěn)定保持和遺傳所需表型特性的表達(dá)，然后收獲種子以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。以此方式，本發(fā)明提供使得本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體(例如本發(fā)明的表達(dá)盒)穩(wěn)定摻入其基因組中的轉(zhuǎn)化種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)。[0087]本文所用的詞語(yǔ)“一個(gè)”和“一種”指一個(gè)(種)或不止一個(gè)(種)(即，指至少一個(gè)(種))該詞語(yǔ)的語(yǔ)法對(duì)象。舉例說(shuō)，“一個(gè)要素”是指一個(gè)或多個(gè)要素。[0088]在本說(shuō)明書(shū)通篇范圍內(nèi)，詞語(yǔ)“包含”及其語(yǔ)法變體將理解為表示包括所稱的要素、整數(shù)或步驟或者要素組、整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其他要素、整數(shù)或步驟或者要素組、整數(shù)組或步驟組。[0089]以下實(shí)例以說(shuō)明性方式而不是以限制性方式提供。[0090]實(shí)駘[0091]實(shí)例1:Sb_RCc3某閔的鑒定[0092]通過(guò)搜索從優(yōu)良自交系BTX623獲得的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，鑒定到Sb_RCc3基因。在6葉營(yíng)養(yǎng)階段和開(kāi)花末期(正好在花粉散播之前)對(duì)溫室培育的植物組織從每一個(gè)主要器官取樣。還收集來(lái)自繁殖器官的組織。對(duì)每個(gè)樣品取三個(gè)平行樣，其中每個(gè)平行樣由9個(gè)植株組成。從平行樣的每一個(gè)中分離RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并且使用SolexaDNA測(cè)序技術(shù)(億明達(dá)(Illumina))進(jìn)行測(cè)序。將序列“標(biāo)簽”與公開(kāi)可用的基因序列比對(duì)以鑒定基因。比較每一份樣品中的表達(dá)鑒定出具有根優(yōu)選表達(dá)的基因。[0093]實(shí)例2:Sb~RCc3啟動(dòng)子的PCR分離[0094]一旦鑒定出基因，則通過(guò)針對(duì)編碼區(qū)5’序列搜索公開(kāi)可用的基因組數(shù)據(jù)，獲得5’旁側(cè)序列。對(duì)于Sb-RCc3而言，鑒定大約1710bp的上游序列。將NotI限制核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)添加至序列的5’端，并且將BamHl識(shí)別位點(diǎn)添加至序列的3’端，以方便將DNA在化學(xué)合成表達(dá)載體時(shí)連接到該表達(dá)載體內(nèi)。分析序列的基序顯示距序列3’端大約108bp的推定TATA框以及距3’端大約83bp的推定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。[0095]實(shí)例3:轉(zhuǎn)基因玉蜀黍植物中的表達(dá)分析[0096]使用農(nóng)桿菌方案產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株(在實(shí)例4中詳述)以允許表征啟動(dòng)子活性，包括由啟動(dòng)子指導(dǎo)的表達(dá)模式和表達(dá)水平。將Sb-RCc3啟動(dòng)子(SEQIDN0:1)可操作地連接到B-葡糖苷酸酶(CTS)基因(縮寫(xiě)為Sb-RCc3:⑶S)或殺昆蟲(chóng)基因(縮寫(xiě)為Sb-RCc3:1Gl)。另外將所述啟動(dòng)子可操作地連接到Adhl內(nèi)含子(內(nèi)含子I)和IGl基因(縮寫(xiě)為Sb-RCc3(Adhl內(nèi)含子I):1G1)，目的是潛在地增加表達(dá)，因?yàn)橐炎C實(shí)在谷類(lèi)植物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)因一些5’近端內(nèi)含子的存在而增強(qiáng)(參見(jiàn)Callisetal.(1987)GenesandDevelopmentl:1183-1200(Callis等人，1987年，《基因與發(fā)育》，第I卷，第1183-1200頁(yè))；Kyozukaetal.(1990)Maydica35:353-357(Kyozuka等人，1990年，《Maydica》,第35卷，第353-357頁(yè)))。⑶S基因的使用允許通過(guò)針對(duì)⑶S酶活性的組織化學(xué)染色組織觀察由啟動(dòng)子指導(dǎo)的表達(dá)模式。[0097]再生出二十六個(gè)⑶S事件并且在溫室條件下培育，直至它們達(dá)到范圍從V4至V6的生長(zhǎng)期。由植株上的圍繞葉(collaredleaves)數(shù)目確定營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期。因此,V6期的植株具有6片完全圍繞的葉子。從處于這個(gè)時(shí)期的每個(gè)植株采集葉和根組織樣品。然后允許各植株生長(zhǎng)至Rl早期，這是正好在花粉散播之前的時(shí)間，此時(shí)收集花絲、莖桿以及穗組織。最終，當(dāng)植株開(kāi)始散播花粉時(shí)收集花粉。[0098]來(lái)自Sb_RCc3:⑶S的結(jié)果顯示Sb_RCc3啟動(dòng)子在玉蜀黍根中驅(qū)動(dòng)表達(dá)。在根的成熟區(qū)中(主要在皮質(zhì)中)檢測(cè)到表達(dá)。在根尖中，在伸長(zhǎng)區(qū)中檢測(cè)到表達(dá)，但在分生組織中或在根冠中檢測(cè)不到表達(dá)。在葉、穗或花絲組織中檢測(cè)不到表達(dá)。在花粉中也檢測(cè)不到表達(dá)。莖桿未顯示表達(dá)；然而，在大約半數(shù)事件中，在外皮的脈管中檢測(cè)到表達(dá)。相對(duì)于根中的表達(dá)水平，該表達(dá)不夠強(qiáng)。[0099]表1:Sb-RCc3:⑶S的玉蜀黍表汰結(jié)果1[0101]I組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)按O至3標(biāo)度表示，以充分表征的玉蜀黍Ub1-1啟動(dòng)子作為參考點(diǎn)。Ub1-1啟動(dòng)子是幾乎所有玉蜀黍組織中的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。[0102]在溫室中評(píng)估表達(dá)Sb_RCc3:1Gl的二十四種轉(zhuǎn)基因玉蜀黍植物和表達(dá)Sb-RCc3:ADH內(nèi)含子:IG1的15種植物。對(duì)根(包括根尖和成熟組織一起)和葉材料的定量ELISA顯示表達(dá)僅在具有兩種載體的根中發(fā)生。這支持使用GUS作出的觀察結(jié)果。為了增加表達(dá)，包含ADH內(nèi)含子。然而，使用Sb-RCc3的表達(dá)比沒(méi)有ADH內(nèi)含子的情況下好約2.7倍。Sb-RCc3:1Gl相對(duì)于公知的玉蜀黍遍在蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)要低約2倍。[0103]表2:Sb~RCc3和IGl的玉蜀黍表汰結(jié)果1[0105]I組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)按O至3標(biāo)度表示，以充分表征的玉蜀黍Ub1-1啟動(dòng)子作為參考點(diǎn)。Ub1-1啟動(dòng)子是幾乎所有玉蜀黍組織中的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。[0106]實(shí)例4:使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化和再生[0107]對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的用各實(shí)施例的Sb_RCc3啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)化玉蜀黍，利用Zhao的方法(美國(guó)專利N0.5，981，840(下文中為‘840專利)和PCT專利公布W098/32326;將所述專利的內(nèi)容以引用方式并入本文)。[0108]將農(nóng)桿菌在800培養(yǎng)基主平板上培育并且于28°C在黑暗下培養(yǎng)3天，并且此后在4°C保存最多一個(gè)月。將農(nóng)桿菌的工作平板在810培養(yǎng)基平板上培育并且于28°C在黑暗中孵育一至兩天。[0109]簡(jiǎn)而言之，從新鮮的無(wú)菌玉米穗中剖取胚并且將其保持在561Q培養(yǎng)基中直至收集到全部所需胚。隨后使胚與從工作平板制備的農(nóng)桿菌懸液接觸，其中所述農(nóng)桿菌包含具有各實(shí)施例的啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒。將胚與農(nóng)桿菌在562P平板上共同培養(yǎng)，如按‘840專利方案，胚在平板板上按軸朝下放置。[0110]在562P培養(yǎng)基上一個(gè)星期之后，將胚轉(zhuǎn)移至5630培養(yǎng)基。按2個(gè)星期的間隔在新鮮的5630培養(yǎng)基上對(duì)胚進(jìn)行繼代培養(yǎng)并且在相同條件下繼續(xù)孵育。在選擇6至8星期之后，愈傷組織事件開(kāi)始出現(xiàn)。[0111]在愈傷組織達(dá)到合適尺寸之后，將愈傷組織在再生(288W)培養(yǎng)基上培養(yǎng)并且保持在黑暗下2至3個(gè)星期以引發(fā)植物再生。在體細(xì)胞胚成熟后，將發(fā)育良好的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基用于萌發(fā)(272V)并轉(zhuǎn)移到有光照的培養(yǎng)室。大約7-10天后，將正在發(fā)育的小植株轉(zhuǎn)移到管中的無(wú)激素272V培養(yǎng)基7-10天，直到小植株完全長(zhǎng)好。然后將植株轉(zhuǎn)移到含有盆栽土的盤(pán)插入孔(相當(dāng)于2.5〃英寸盆)，并且在生長(zhǎng)室培育I星期，隨后在溫室培育另外I至2個(gè)星期，然后轉(zhuǎn)移到典型的600個(gè)盆(1.6加侖)并培育至成熟。[0112]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因S蜀黍植物的轉(zhuǎn)化和再生所使用的培養(yǎng)基:[0113]561Q培養(yǎng)基包含4.0g/LN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0mL/LEriksson維生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)、0.5mg/L鹽酸硫胺素、68.5g/L鹿糖、36.0g/葡萄糖、1.5mg/L2，4-D和0.69g/LL-脯氨酸(用KOH調(diào)節(jié)至pH5.2后以去離子水定容);2.0g/LGelrite?(用去離子水定容后加入)；及8.5mg/L硝酸銀(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。[0114]800培養(yǎng)基包含50.0mL/L母液A和850mL去離子水，并且用去離子水減去100mL/L后定容，此后加入9.0g植物瓊脂。在滅菌和冷卻之后，加入50.0mL/LBA母液B，連同5.0g葡萄糖和2.0mL的50mg/mL壯觀霉素的母液。母液A包含60.0gK2HPO4和20.0g磷酸二氫鈉，其溶解于950mL水中，用KOH調(diào)節(jié)至pH7.0，并且用去離子水定容為1.0L。母液B包含20.0gNH4Cl'6.0gMgSO4.7H20、3.0g氯化鉀、0.2gCaCl2和0.05gFeS04.7H20，全部均用去離子水定容、滅菌并且冷卻。[0115]810培養(yǎng)基包含5.0g酵母提取物(Difco)、10.0g蛋白胨(Difco)、5.0g氯化鈉，其溶解于去離子水中，并且在調(diào)節(jié)pH至6.8之后定容。隨后加入15.0g細(xì)菌瓊脂，將溶液滅菌并冷卻，并且加入1.0mL的50mg/mL壯觀霉素母液。[0116]562P培養(yǎng)基包含4.0g/LN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、LOmL/LEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/L鹽酸硫胺素、30.0g/L蔗糖和2.0mg/L2,4-D(用KOH調(diào)至pH5.8后以去離子水定容)；3.0g/LGelrite?(用去離子水定容后加入)；以及0.85mg/L硝酸銀和1.0mL的IOOmM乙酰丁香酮母液(均在培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。[0117]5630培養(yǎng)基包含4.0g/LN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0mL/LEriksson維生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)、0.5mg/L鹽酸硫胺素、30.0g/L蔗糖、1.5mg/L2,4_D、0.69gL-脯氨酸和0.5gMES緩沖液(用KOH調(diào)至pH5.8后以去離子水定容)。然后，加入6.0g/LUltrapure?瓊脂-瓊脂(EM科學(xué)公司(EMScience))并且將培養(yǎng)基滅菌并冷卻。隨后，加入0.85mg/L硝酸銀、3.0mL的lmg/mL雙丙氨磷母液和2.0mL的50mg/mL羧節(jié)青霉素母液。[0118]288W包含4.3g/LMS鹽(GIBC011117-074)、5.0mL/LMS維生素母液(0.1OOg煙酸、0.02g/L鹽酸硫胺素、0.10g/L鹽酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精煉去離子水定容)(MurashigeandSkoog(1962)Physiol.Plant.15:473(Murashige和Skoog,1962年，《植物生理學(xué)》，第15卷,第473頁(yè)))、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素和60g/L鹿糖,其在調(diào)至ρΗ5.6之后用精煉去離子水定容。之后，加入6.0g/L的Ultrapure?瓊脂-瓊脂(EM科學(xué)公司(EMScience))并且將培養(yǎng)基滅菌和冷卻。隨后，加入1.0mL/L的0.1mM脫落酸、1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L雙丙氨膦,連同2.0mL的50mg/mL羧節(jié)青霉素母液。[0119]無(wú)激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3g/LMS鹽(GIBC011117-074),5.0mL/LMS維生素母液(0.100g/L煙酸、0.02g/L鹽酸硫胺素、0.10g/L鹽酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去離子水定容)、0.lg/L肌醇和40.0g/L鹿糖(調(diào)節(jié)pH至5.6后用精制去離子水定容)；以及6g/L細(xì)菌瓊脂(在用精煉去離子水定容后加入)，滅菌并冷卻到60°C。[0120]實(shí)例5=RCc3啟動(dòng)子的缺失分析[0121]使用天然在啟動(dòng)子中以下位置處存在(3’至5’方向讀取)的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，可以將1710bpRCc3啟動(dòng)子分成5個(gè)300至400bp的區(qū)域=BAMHI(0),BglII(232),BspMI(545)、StuI(941)、NheI(1354)和NotI(1710)。這提供了生成四個(gè)5’啟動(dòng)子截短物的機(jī)會(huì)。植物中測(cè)試這些截短物可以提供對(duì)該啟動(dòng)子的表達(dá)和根優(yōu)選性中起重要作用的啟動(dòng)子區(qū)域認(rèn)識(shí)。[0122]用Not1-NheI限制性核酸內(nèi)切酶消化RCc3啟動(dòng)子導(dǎo)致產(chǎn)生1354bp啟動(dòng)子片段，稱為T(mén)R1。用NotI和StuI消化得到了941bp啟動(dòng)子片段，而用NotI和BspMI消化得到了545bp片段，分別稱為T(mén)R2和TR3。用NotI和BglII切割啟動(dòng)子得到了232bp的啟動(dòng)子片段，稱為T(mén)R4。將這些片段中的每一個(gè)純化并且連接到表達(dá)盒內(nèi)，這導(dǎo)致每個(gè)啟動(dòng)子片段可操作地連接到B-葡糖苷酸酶(CTS)基因。[0123]對(duì)于每個(gè)截短物，再生出二十五個(gè)轉(zhuǎn)基因玉蜀黍事件并且在溫室條件下培育。對(duì)葉和根材料取樣以進(jìn)行組織化學(xué)⑶S染色分析時(shí)，植物發(fā)育至V6/7期。隨后將這些植物培育至R1-R2期并且對(duì)莖桿、穗和花粉取樣。結(jié)果顯示各截短物均不影響葉、莖桿和花粉中的表達(dá)。在這些組織的任何一者中檢測(cè)不到GUS表達(dá)(表3)。另外也對(duì)圍繞莖桿的外皮組織檢查表達(dá)，并且檢測(cè)不到任何表達(dá)(數(shù)據(jù)未示出)。除用232bp啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)化的I個(gè)植株之外,在穗中也檢測(cè)不到表達(dá)。[0124]根中的表達(dá)并未不利地受截短物影響(表3)?？傮w保留整體表達(dá)模式，但包括分生組織區(qū)和部分伸長(zhǎng)區(qū)的根尖中的表達(dá)水平隨著啟動(dòng)子截短而降低。包含推定TATA框的232bp啟動(dòng)子片段未呈現(xiàn)任何根表達(dá)。[0125]可以在RCc3啟動(dòng)子中鑒定到多個(gè)基序，例如R00TM0TIFTAP0X1(ATATT)(數(shù)據(jù)未示出)。然而，啟動(dòng)子的截短表明RCc3啟動(dòng)子具有提供功能性冗余的序列，或者用于表達(dá)和根優(yōu)選的關(guān)鍵序列位于BspM1-BamHl片段上。根優(yōu)選表達(dá)維持至BspMI裂解位點(diǎn)，但在將啟動(dòng)子截短至BglII裂解位點(diǎn)時(shí)，使得啟動(dòng)子無(wú)功能。[0126]表3:缺失分析結(jié)果【權(quán)利要求】1.一種分離的核酸分子，其包含選自下列的核苷酸序列:a)包含SEQIDNO:1中示出的序列或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列；b)包含以專利保藏號(hào)NRRLB-50462保藏的質(zhì)粒的植物啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列；以及c)包含SEQIDNO:1中示出的序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物細(xì)胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄。2.表達(dá)盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地連接到目的異源核苷酸序列。3.一種載體,包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。4.植物細(xì)胞,其包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物細(xì)胞，其中所述表達(dá)盒穩(wěn)定整合到所述植物細(xì)胞的基因組中。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自單子葉植物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物是玉蜀黍。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自雙子葉植物。9.一種植物,其包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的植物，其中所述單子葉植物是玉蜀黍。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物。13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物，其中所述表達(dá)盒穩(wěn)定摻入到所述植物的基因組中。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的植物的轉(zhuǎn)基因種子，其中所述種子包含所述表達(dá)盒。15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物，其中所述目的異源核苷酸序列包含賦予對(duì)除草劑、鹽、寒冷、干旱、病原體或者昆蟲(chóng)的抗性的基因產(chǎn)物。16.—種在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列的方法，所述方法包括將包含可操作地連接到目的異源核苷酸序列的表達(dá)盒引入所述植物或植物細(xì)胞中，其中所述啟動(dòng)子包含選自以下的核苷酸序列:a)包含SEQIDNO:1中示出的序列的核苷酸序列；b)包含命名為專利保藏號(hào)NRRLB-50462的質(zhì)粒的植物啟動(dòng)子序列的核苷酸序列；以及c)包含SEQIDΝΟ:1中示出的序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物中引發(fā)轉(zhuǎn)錄。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述目的異源核苷酸序列包含賦予對(duì)除草劑、鹽、寒冷、干旱、病原體或昆蟲(chóng)的抗性的基因產(chǎn)物。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述目的異源核苷酸序列以根優(yōu)選方式表達(dá)。19.一種在植物中以根優(yōu)選方式表達(dá)核苷酸序列的方法,所述方法包括將表達(dá)盒引入到植物細(xì)胞中并從所述植物細(xì)胞再生出植物，所述植物使所述表達(dá)盒穩(wěn)定摻入其基因組中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接到目的異源核苷酸序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子包含選自以下的核苷酸序列:a)包含SEQIDNO:1中示出的序列的核苷酸序列；b)包含以專利保藏號(hào)NRRLB-50462保藏的質(zhì)粒的所述植物啟動(dòng)子序列的核苷酸序列；以及c)包含SEQIDNO:1中示出的序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物根細(xì)胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述目的異源核苷酸序列的表達(dá)改變所述植物的表型?！疚臋n編號(hào)】C07K14/415GK103476934SQ201280008988【公開(kāi)日】2013年12月25日申請(qǐng)日期:2012年2月13日優(yōu)先權(quán)日:2011年2月15日【發(fā)明者】S.迪恩,B.彼得森-伯奇申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司