微擬球藻NgAUREO1基因在調(diào)控脂肪酸代謝中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明克隆了微擬球藻(Nannochloropsis gaditana)的一個(gè)2080bp的藍(lán)光誘導(dǎo)的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子(NgAUREO1)的全長(zhǎng)。該基因包括一個(gè)1398bp的ORF，192bp的5’端非編碼區(qū)和490bp的3’端非編碼區(qū)，編碼465個(gè)氨基酸。該基因含有一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合到特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控特定基因的表達(dá)；以及一個(gè)LOV結(jié)構(gòu)域可以感受470nm左右的藍(lán)光，進(jìn)而賦予該基因受藍(lán)光調(diào)控的特性。該基因與無隔藻中的aureochromel基因的氨基酸序列相似性為59％。我們構(gòu)建了該基因的酵母表達(dá)載體，并將此基因?qū)脶劸平湍钢校岣吡私湍傅挠椭?。通過對(duì)重組酵母進(jìn)行藍(lán)光刺激證明了該基因可以藍(lán)光作為開關(guān)調(diào)節(jié)其參與脂肪酸代謝的途徑。
【專利說明】微擬球藻NgAUREOI基因在調(diào)控脂肪酸代謝中的應(yīng)用 一、
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及從微擬球藻中克隆了一個(gè)新的編碼區(qū)為1398bp的受藍(lán)光調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄 因子相關(guān)基因（NgAUREOl)，并證明了該基因在調(diào)節(jié)脂肪酸代謝中的新功能。 二、
【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著當(dāng)今世界能源危機(jī)的日趨嚴(yán)重，人們已經(jīng)逐步把目光從傳統(tǒng)的石油化工燃 料，轉(zhuǎn)向生物質(zhì)能源上。然而生物體油脂含量的高低是影響生物質(zhì)能源發(fā)展的關(guān)鍵問題之 一。已經(jīng)有許多科學(xué)家在這一問題上做了大量的研究。有的通過篩選油脂含量相對(duì)較高的 生物體作為原料，但仍無法滿足生物質(zhì)能源的需求；有的將生物體置于缺氮、低溫等逆境中 以促進(jìn)生物體油脂含量的增高，但是這必然導(dǎo)致生物量的降低；還有人提出通過基因工程 對(duì)生物體進(jìn)行改造，使其可以大量積累油脂，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果多數(shù)不盡人意。究其原因主要是 所利用的基因多為調(diào)控單一通路的功能基因，其調(diào)控范圍窄，影響能力弱，從而無法達(dá)到理 想的效果。
[0003] 轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是指能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特 異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用可以激 活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。與基因技術(shù)定位于改造單個(gè)基因不同，轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)影響一系 列基因的多條代謝路徑，這些代謝路徑在同時(shí)作用下完成正向或者負(fù)向的調(diào)控。目前這一 技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)可以促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物在植物細(xì)胞中的積累。
[0004] Aureochromel于2007年從無隔藻中被發(fā)現(xiàn)，研究表明該基因編碼的蛋白具有轉(zhuǎn) 錄因子功能，可以特異性的結(jié)合TGACGT序列。這一序列是典型的S型或D型bZIP的結(jié)合位 點(diǎn)。該基因由一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（bZIP)和一個(gè)感受藍(lán)光的LOV結(jié)構(gòu)域組成。正 是由于這一特殊的結(jié)構(gòu)賦予了該轉(zhuǎn)錄因子受藍(lán)光誘導(dǎo)的特性。研究表明，該基因控制著無 隔藻的分支發(fā)育活動(dòng)。然而未有研究證明該基因具有其他功能。
[0005] 我們從微擬球藻（Nannochloropsis gaditana)中克隆了一個(gè)新的藍(lán)光誘導(dǎo)的 bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，并命名為NgAUREOl。該基因所編碼的蛋白具有一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)域用于結(jié) 合目的基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性序列，以及一個(gè)可以感受波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光的LOV結(jié)構(gòu)域。 該基因與無隔藻中aureochromel的氨基酸序列相似性為59%。我們構(gòu)建了該基因的酵母 表達(dá)載體并將此轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入釀酒酵母中，通過測(cè)定酵母脂肪酸的含量，證明了該轉(zhuǎn)錄因 子可以促進(jìn)酵母細(xì)胞內(nèi)油脂含量的增加。我們還通過對(duì)轉(zhuǎn)有該基因的釀酒酵母進(jìn)行藍(lán)光照 射，并測(cè)定脂肪酸含量，證明了藍(lán)光可以控制該轉(zhuǎn)錄因子參與脂肪酸的合成與分解。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0006] 1、克隆了微擬球藻中的藍(lán)光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NgAUREOl
[0007] 從本實(shí)驗(yàn)室所建立的微擬球藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到aureochromel基因的片段， 根據(jù)該片段設(shè)計(jì)了兩對(duì)基因特異性引物（5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP2)。利用TransZol Plant total RNA提取試劑盒提取微擬球藻RNA，用TransScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄形 成cDNA，通過PCR擴(kuò)增得到NgAUREOl基因的全長(zhǎng)，連接到pMD19-T載體上，導(dǎo)入感受態(tài)大腸 桿菌，挑選陽性克隆菌株進(jìn)行菌液PCR鑒定。最后將帶有目的基因片段的大腸桿菌送上海 生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明該基因的ORF為1398bp ;5'端非編碼區(qū)為192bp ;3'端非編碼區(qū) 為490bp，編碼465個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果與無隔藻中aureochromel基因的序列進(jìn)行相似 性比較，發(fā)現(xiàn)微擬球藻中的aureochromel基因編碼的氨基酸序列與無隔藻中相應(yīng)基因編 碼的氨基酸序列有59 %的同源性。將這個(gè)蛋白序列進(jìn)行BLAST分析，顯示該蛋白的241-300 位氨基酸為一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域；341-444位氨基酸為一個(gè)可以感受藍(lán)光的LOV結(jié)構(gòu) 域。以上分析說明該基因?yàn)槲M球藻中的一類新的可以感受藍(lán)光的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，命名 為 NgAUREOl。
[0008] 2、構(gòu)建了 NgA UREOl基因的酵母表達(dá)載體pYES2-NgAURE01
[0009] 設(shè)計(jì)一對(duì)帶有HindIII和SacI限制性酶切位點(diǎn)的引物（P1，P2)以微擬球藻cDNA 為模板擴(kuò)增NgAUREOl基因，并將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上，導(dǎo)入大腸桿菌中 進(jìn)行繁殖。提取質(zhì)粒利用HindlII和SacI限制性酶對(duì)pMD19-T和pYES2同時(shí)進(jìn)行雙酶切， 分別獲取小片段和大片段，利用T4連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行PCR和酶切鑒定 后得到重組質(zhì)粒pYES2-NgAURE01。
[0010] 3、證明了該基因可以促進(jìn)脂肪酸積累的新功能
[0011] 分別將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pYES2-NgAURE01和空質(zhì)粒PYES2,分別通過電擊的方法 轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)。利用2%的半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，測(cè)定兩者的油脂含量。實(shí)驗(yàn)表明， 轉(zhuǎn)pYES2-NgAURE01質(zhì)粒的酵母細(xì)胞的油脂含量比轉(zhuǎn)空質(zhì)粒pYES2的酵母細(xì)胞的油脂含量 要高。這表明了，NgAUREOl是一類可以促進(jìn)細(xì)胞積累油脂的轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明首次證明了 微擬球藻aureochromel基因具有積累油脂的功能，提示本發(fā)明的基因 NgAUREOl可以用于 微藻乃至其他各類生物質(zhì)能源材料的遺傳改造，從而獲得高油脂含量的生物原料。對(duì)于開 發(fā)生物質(zhì)能源具有重要的理論意義和實(shí)際意義。
[0012] 4、證明了 NgAUREOl基因可以藍(lán)光作為開關(guān)進(jìn)行脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)
[0013] 將兩組重組酵母先置于黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)兩天，然后給其中一組進(jìn)行48小時(shí) 的藍(lán)光刺激，另一組則保持在黑暗條件下。利用尼羅紅染色法測(cè)定這兩組酵母的油脂含量。 結(jié)果表明，在藍(lán)光刺激后酵母的油脂含量明顯降低，而再轉(zhuǎn)移到黑暗條件下時(shí)，酵母的油脂 含量又會(huì)有所上升。提示本發(fā)明的基因 NgAUREOl可以在藍(lán)光的控制下調(diào)節(jié)脂肪酸含量。
[0014] 四、附圖簡(jiǎn)要說明：
[0015] 圖1是表示酵母表達(dá)載體pYES2-NgAURE01構(gòu)建流程的圖。
[0016] 圖2是重組酵母的PCR鑒定。
[0017] 圖中擴(kuò)增條帶大小約為1400bp，電泳帶從左到右分別編號(hào)為1、2、3、M。1-3為陽 性克隆，M為分子標(biāo)記Marker。
[0018] 圖3是釀酒酵母在不同時(shí)間段的尼羅紅熒光值。
[0019] 橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為熒光值。轉(zhuǎn)PYES2的釀酒酵母表示為▲;轉(zhuǎn) pYES2-NgAURE01的釀酒酵母表示為·。
[0020] 圖4是轉(zhuǎn)PYES2與轉(zhuǎn)pYES2-NgAURE01的釀酒酵母的油脂含量。
[0021] 縱坐標(biāo)為油脂占酵母干重的質(zhì)量百分比。
[0022] 圖5是轉(zhuǎn)pYES2_NgAURE01的釀酒酵母在藍(lán)光與黑暗條件下的尼羅紅熒光值。
[0023] 橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為熒光值。▲表示在誘導(dǎo)第二天后進(jìn)行48小時(shí)的藍(lán)光刺 激，再轉(zhuǎn)入黑暗中；表示在黑暗條件下誘導(dǎo)7天的油脂含量。 五、【具體實(shí)施方式】：
[0024] 所有實(shí)施例中的微生物培養(yǎng)和DNA操作均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（黃培堂等 譯，科學(xué)出版社，北京（2002))和《精編分子生物學(xué)指南》（顏?zhàn)臃f等譯，科學(xué)出版社，北京 (1998))。分子操作中的工具酶如限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Takara公司。
[0025] 實(shí)施例INgAUREOl基因的克隆
[0026] 從本實(shí)驗(yàn)室所建立的微擬球藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到aureochromel基因的片段， 根據(jù)該片段設(shè)計(jì)了兩對(duì)基因特異性引物（5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP2)。利用TransZol Plant total RNA提取試劑盒提取微擬球藻RNA，用TransScriptRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄形 成cDNA，通過PCR擴(kuò)增得到NgAUREOl基因的全長(zhǎng)。引物序列如下：
[0027] 5GSP1 :5'-GCTTCCTTGTTCAGTTCCTTCG-3'
[0028] 5GSP2 :5'-CAACCACTACCTCCGCCTCA-3'
[0029] 3GSP1 :5'-TACATCTGGCACTACGGGGC-3，
[0030] 3GSP2 :5'-GCTAACACCGACGCTCAAACT-3，。
[0031] 將通過PCR擴(kuò)增出來的NgAUREOl產(chǎn)物，經(jīng)純化回收，連接到pMD19-T載體上，送上 海生工進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明該基因的ORF為1398bp ;5'端非編碼區(qū)為192bp ;3' 端非編碼區(qū)為490bp，編碼465個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果與無隔藻中aureochromel基因的序 列進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)微擬球藻中的aureochromel基因編碼的氨基酸序列與無隔藻中 相應(yīng)基因編碼的氨基酸序列有59%的同源性。將這個(gè)蛋白
[0032] 序列進(jìn)行BLAST分析，顯示該蛋白的241-300位氨基酸為一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu) 域；341-444位氨基酸為一個(gè)可以感受藍(lán)光的LOV結(jié)構(gòu)域。以上分析說明該基因?yàn)槲M球 藻中的一類新的可以感受藍(lán)光的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，命名為NgAUREOl。
[0033] 微擬球藻RNA的提取：
[0034] (1)向f/2液體培養(yǎng)基中接入微擬球藻，在25°C，光照強(qiáng)度80001x，光暗比為 12h/12h的條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)后期；
[0035] (2)取Iml藻液于I. 5ml離心管中，離心收集，在液氮中研磨；
[0036] (3)加入Iml TRIzon，反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置5分鐘，使蛋白 核酸復(fù)合物完全分離；
[0037] (4)向以上溶液中加入0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘；
[0038] (5)4°C 12000rpm離心15分鐘，此時(shí)樣品分為三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無 色水相，RNA主要在水相中，把水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的Rnase-Free離心管中；
[0039] (6)在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘；
[0040] (7) 4°C 12000rpm 離心 10 分鐘，棄上清；
[0041] (8)加入lml75%乙醇洗滌沉淀；
[0042] (9) 4°C 12000rpm離心3分鐘，小心吸棄上清；
[0043] (10)室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30 μ 1的無 Rnase的水，充分溶解RNA ;
[0044] 細(xì)菌質(zhì)粒 DNA 的制備（根據(jù) Ε. Ζ. Ν. A. ? Plasmid Miniprep Kit):
[0045] (1)挑取單菌落接種于含適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；
[0046] (2)取I. 5ml菌液于離心管中，IOOOOrpm離心60秒；
[0047] (3)菌體沉淀重懸于250 μ 1溶液I中，振蕩混勻并靜置數(shù)分鐘；
[0048] (4)加入250 μ 1溶液11顛倒混勻，靜置2分鐘；
[0049] (5)加入350 μ 1的溶液III顛倒混勻直到生成白色絮狀沉淀；
[0050] (6) 13000rpm 離心 10 分鐘；
[0051] (7)將上清轉(zhuǎn)移至干凈的 HiBind Miniprep Column (I)中；IOOOOrpm 離心 1 分鐘；
[0052] (8)去除液體，向 HiBind Miniprep Column (I)中加入 500 μ 1 的緩沖液 HB, IOOOOrpm離心1分鐘；
[0053] (9)去除液體，加入700 μ 1的DNA沖洗緩沖液，IOOOOrpm離心1分鐘；
[0054] (10)去除液體，將空管在13000rpm的條件下，離心2分鐘；
[0055] (11)將 HiBind Miniprep Column (I)置于新的 I. 5ml 的離心管上，加入 30 μ 1 的 無菌水，放置2分鐘，13000rpm離心1分鐘，獲得DNA ;
[0056] (12)以上說用試劑均購(gòu)置于OMEGA公司。
[0057] 質(zhì)粒酶切條件：
[0058] 3(^1反應(yīng)體系中，加入10父酶切緩沖液3 4 1，0嫩1-5以8，限制性內(nèi)切酶14 1， 加無菌雙蒸水補(bǔ)至30 μ 1，37°C反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。
[0059] DNA片段的回收（根據(jù)AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒）：
[0060] (1)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切 碎。計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積（如IOOmg=IOOy 1);
[0061] (2)加入3個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，混勻后于75°C加熱，間斷混合，直至凝膠塊 完全熔化；
[0062] (3)加入 0· 5 個(gè) BufferDE-A 體積的 BufferDE-B，混勻；
[0063] (4)吸取步驟3中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000rpm離心1分鐘。棄濾 液；
[0064] (5)將制備管置回2ml離心管，加500 μ I BufferWl，12000rpm離心30秒，棄濾液；
[0065] (6)將制備管置回21111離心管，加70(^181^€61^2，12000印111離心30秒，棄濾液 ；
[0066] (7)將制備管置回2ml離心管，12000rpm離心1分鐘；
[0067] (8)將制備管置于潔凈的I. 5ml離心管中，在制備膜中央加入25 μ 1的去離子水， 室溫靜置1分鐘。12000
[0068] rpm離心1分鐘洗脫DNA。
[0069]連接：
[0070] 10 μ 1反應(yīng)體系中加入5 :1比例量的插入片段和載體片段，1μ 1的T4DNA連接酶， 16 °C放置10個(gè)小時(shí)左右。
[0071] 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：
[0072] (1)取100μ 1感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)置于全式金公司）加5μ 1連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰 置30分鐘；
[0073] (2)于42°C水中熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2分鐘；
[0074] (3)加200 μ I LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)；
[0075] (4)均勻涂布于含有適當(dāng)抗生素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。
[0076] 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定：
[0077] a.酶切鑒定：挑取單菌落于含有適當(dāng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜提 取質(zhì)粒DNA，用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切以判斷是否為陽性克??；
[0078] b. PCR檢測(cè)：以質(zhì)粒DNA為模板，用特定引物在適當(dāng)條件下做PCR擴(kuò)增反應(yīng)，電泳 檢測(cè)是否有特異條帶。
[0079] 實(shí)施例2酵母表達(dá)載體pYES2-NgAURE01的構(gòu)建：
[0080] 將 NgAUREOl 基因連接到 pMD19-T 載體上，并命名為 ρΤ-NgAUREOl。將 pT-NgAUREOl 用HindlII和SacI進(jìn)行酶切，回收小片段，同時(shí)將pYES2用HindlII和SacI酶切，回收 大片段，連接小片段和大片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行PCR和酶切鑒定后得到 pYES2-NgAURE01。
[0081] 操作過程中有關(guān)質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的酶切鑒定和 PCR鑒定均按照實(shí)施例1所述步驟進(jìn)行。
[0082] 實(shí)施例3釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化：
[0083] 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備：
[0084] (1)將釀酒酵母接種到IOOml的YPD培養(yǎng)基中30°C過夜，250rpm，至密度達(dá)到 I X108cells / ml ；
[0085] (2)將細(xì)胞置于冰浴上15分鐘停止生長(zhǎng)；
[0086] (3)將細(xì)胞分裝于2個(gè)滅菌的250ml離心管中，4°C 3000rpm離心5分鐘；
[0087] (4)去除上清，將離心管置于冰上；
[0088] (5)加50ml的滅菌冰冷的水，渦旋重懸，每個(gè)離心管中定容到50ml，4°C 3000rpm 離心5分鐘；
[0089] (6)用25ml的滅菌冰冷的水按（5)重復(fù)操作；
[0090] (7)加4ml的滅菌冰冷的IM山梨醇重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)到冰的30ml離心管中， 4°C 3000rpm離心5分鐘，棄上清；
[0091] (8)加入0. 5ml滅菌的冷的IM山梨醇重懸細(xì)胞，細(xì)胞體積定量到I. 3ml，細(xì)胞濃度 達(dá)到 lXIOlOcells / ml。
[0092] 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化：
[0093] (1)加入10 μ I DNA樣品置于I. 5ml離心管中，置于冰上預(yù)冷；
[0094] (2)加入80 μ 1感受態(tài)細(xì)胞與DNA樣品輕輕混勻并于冰上5分鐘；
[0095] (3)將DNA與細(xì)胞混合物轉(zhuǎn)到規(guī)格為0. 2cm的電轉(zhuǎn)杯中，置于冰上冷凍，放入設(shè)備 中，進(jìn)行電擊；
[0096] (4)直接將Iml的冰冷的IM山梨醇加入電轉(zhuǎn)杯中，并輕輕的轉(zhuǎn)移到滅菌的管中；
[0097] (5)將電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有IM山梨醇的瓊脂平板上，于30°C培養(yǎng)48-72小時(shí)。
[0098] 實(shí)施例4重組酵母的鑒定與檢測(cè)
[0099] 用滅菌的牙簽沾取實(shí)施例3中平板上生長(zhǎng)出的單菌落，加入到PCR反應(yīng)液中，以合 成的NgAUREOl基因的特異性引物
[0100] Pl：TGCAAGCTTAAAATGTCTACCACCACCAT
[0101] P2 ：CGAGCTCTTATTCTTCTTCGTCAAAGTTG
[0102] (上述序列中劃線部分分別為HindIII和SacI酶切位點(diǎn)）
[0103] 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到約HOObp的條帶，說明NgAUREOl基因已轉(zhuǎn)入釀酒酵母 中。（見圖2:重組酵母的PCR鑒定）
[0104] 實(shí)施例5重組酵母脂肪酸的測(cè)定
[0105] 尼羅紅染色法測(cè)定中性脂含量：
[0106] (1)將重組酵母與轉(zhuǎn)有空質(zhì)粒的酵母接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，加2%的半乳糖進(jìn)行誘 導(dǎo)；
[0107] (2)取不同時(shí)間段的酵母1ml，加入50 μ 1的二甲基亞砜，混勻；
[0108] (3)加入10 μ 1的0. lg/Ι的尼羅紅溶液，避光靜置5分鐘；
[0109] (4)在激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為616nm的條件下測(cè)定菌液的突光值，此突光 值反映著中性脂的含量。
[0110] 結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)第3天時(shí)，熒光值達(dá)到最高，并且重組酵母的熒光值明顯高于轉(zhuǎn) 空質(zhì)粒的酵母。（見圖3 :釀酒酵母在不同時(shí)間段的尼羅紅熒光值）
[0111] 菌體油脂提取及含量測(cè)定：
[0112] (1)將誘導(dǎo)3天的培養(yǎng)液經(jīng)3000rpm離心15分鐘，收集菌體，冷凍干燥24小時(shí)，稱 重；
[0113] (2)每克菌體加入6ml4M的鹽酸，振蕩混勻，室溫下放置30分鐘；
[0114] ⑶轉(zhuǎn)入沸水浴3分鐘，_2〇°C速冷；
[0115] (4)加入IOml的氯仿：甲醇（1 :1)，充分振蕩后，3000rpm離心15分鐘；
[0116] (5)取氯仿層，加入等體積0· 1%的氯化鈉溶液，混勻，3000rpm離心15分鐘；
[0117] (6)用已知重量的試管收集氯仿層，揮發(fā)除去氯仿層，稱重，得到的油脂產(chǎn)量。
[0118] 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pYES2-NgAURE01的釀酒酵母的油脂含量比轉(zhuǎn)pYES2的釀酒酵母的油 脂含量要高27. 8%。（見圖4 :轉(zhuǎn)pYES2與轉(zhuǎn)pYES2-NgAURE01的釀酒酵母的油脂含量）
[0119] 實(shí)施例6重組酵母在藍(lán)光刺激下脂肪酸的測(cè)定
[0120] 將兩組重組酵母先置于黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)兩天，然后給其中一組進(jìn)行48小時(shí) 的藍(lán)光刺激，另一組則保持在黑暗條件下。利用尼羅紅染色法測(cè)定這兩組酵母的油脂含量。 結(jié)果表明，在藍(lán)光刺激后酵母的油脂含量明顯降低，而再轉(zhuǎn)移到黑暗條件下時(shí)，酵母的油脂 含量又會(huì)有所上升。這表明，藍(lán)光可以控制NgAUREOl在脂肪酸代謝中的作用。（見圖5:轉(zhuǎn) pYES2-NgAURE01的釀酒酵母在藍(lán)光與黑暗條件下的尼羅紅熒光值）
[0121] 操作過程中尼羅紅測(cè)定中性脂按照實(shí)施例5中所述步驟進(jìn)行。
【權(quán)利要求】
1. 從微擬球藻中克隆的編碼區(qū)為1398bp的受藍(lán)光誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子基因 NgAUREOl，該 基因的特征在于：該基因編碼一條由465個(gè)氨基酸組成的蛋白，該蛋白由一個(gè)N端的堿性亮 氨酸拉鏈（bZIP)和一個(gè)C端的L0V感光結(jié)構(gòu)域組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，該基因所編碼的氨基酸序列與無隔藻中的 aureochromel基因所編碼的氨基酸序列具有59%的同源性，無隔藻中該基因的GenBank登 陸號(hào) gi 1158853253 | dbj | BAF91488. 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，該基因可用于構(gòu)建成適合在釀酒酵母中表達(dá)NgAUREOl 基因的酵母表達(dá)載體pYES2-NgAURE01。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母表達(dá)載體pYES2-NgAURE01，該酵母表達(dá)載體的特征 在于：驅(qū)動(dòng)NgAUREOl基因的啟動(dòng)子為半乳糖啟動(dòng)子（GAL1)，終止子為CYC1，篩選標(biāo)記為 Ampicillin抗性基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的酵母表達(dá)載體pYES2-NgAURE01，該載體可通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo) 入酵母細(xì)胞，生長(zhǎng)出含有目的基因 NgAUREOl的轉(zhuǎn)基因酵母。
6. 權(quán)利要求1所述的NgAUREOl基因在調(diào)節(jié)脂肪酸代謝中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的NgAUREOl基因在光遺傳學(xué)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/405GK104419711SQ201310428941
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】鄭明剛, 黃一江, 王玲, 鄭立, 李妍, 仝顏麗, 趙燕燕, 王春, 周曉麗 申請(qǐng)人:鄭明剛, 黃一江, 王玲