專利名稱：篩選抗骨質(zhì)疏松癥藥物的材料和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于鑒別治療骨質(zhì)疏松癥的治療藥物的方法。本發(fā)明涉及分離、克隆并應用核苷酸，所述核酸含有命名為“雷洛昔芬(raloxifene)反應性元件”的新調(diào)節(jié)元件的哺乳動物轉(zhuǎn)化生長因子β基因的啟動子區(qū)域。本發(fā)明也包括用遺傳工程方法加工的含重組表達構(gòu)建體的真核細胞，其中，將雷洛昔芬反應性元件與報道基因可操作地相連。在所述細胞中，雷洛昔芬反應性元件能夠應答用特定化合物進行的治療而調(diào)節(jié)報道基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明也涉及鑒別抗骨質(zhì)疏松癥藥物的方法，所述藥物經(jīng)雷洛昔芬反應性元件誘導特定基因的轉(zhuǎn)錄，但不會特異性誘導與雌激素替代療法相關的有害或令人討厭的副作用，如增加患子宮和乳腺癌的危險。本發(fā)明的核酸、細胞和方法提供篩選推測的抗骨質(zhì)疏松藥物的來源并將其加以鑒定的有效方法。所述藥物的優(yōu)點在于沒有與目前抗-骨質(zhì)疏松藥物相關的令人討厭的副作用。本發(fā)明也誘導骨形成的方法，治療骨質(zhì)疏松的方法，治療骨折的方法，包括施用與雌激素受體結(jié)合的、有效誘導雷洛昔芬反應性元件轉(zhuǎn)錄的化合物。
在1991年，美國的藥物公司花費了約7.9億美元用于研制鑒定新的治療藥物(藥物制造商協(xié)會)。該數(shù)量之巨大部分是由于必須對成百(如果不是上千)種化合物進行試驗，以便鑒定一種不會產(chǎn)生不可接受水平的不令人滿意或有害的副作用的有效治療藥物。迫切要求經(jīng)濟地試驗大量化合物的方法，以便快速鑒別在治療疾病中可能有效的那些化合物。目前，還沒有這種經(jīng)濟的系統(tǒng)存在。
明顯缺乏一種迅速的方法來篩選大量潛在治療藥物的一種疾病是骨損失。骨損失發(fā)生于各種各樣的患者中，包括經(jīng)受子宮切除術患者、正在或已經(jīng)長期施用皮質(zhì)類固醇者、Cushing氏綜合癥或性腺發(fā)育不全的患者以及絕經(jīng)后的婦女。
骨損失的機制還不是很清楚，但從實際結(jié)果看，這種疾病起因于新的健康骨的形成與舊骨吸收之間的不平衡，造成骨組織的凈損失。這種骨損失包括骨礦物質(zhì)與蛋白質(zhì)基質(zhì)成分的減少，并導致明顯增加股骨和前臂及脊椎骨的骨折率。這些骨折又導致普遍增加的發(fā)病率，身高和活動性的明顯喪失，且在許多情況下，增加了并發(fā)癥引起的死亡率。
未曾遏止的骨損失可以導致骨質(zhì)疏松癥這種消耗性疾病，其主要特征是骨質(zhì)量減少而骨體積沒有減小(減小了密度而擴大了骨空間)，產(chǎn)生多孔性和易折性。在絕經(jīng)后的婦女中，骨質(zhì)疏松是一種最普遍的骨疾病，僅在美國就影響約20到25百萬婦女。
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要特征是由于卵巢停止生產(chǎn)雌激素，而造成骨質(zhì)量的大量迅速地損失。的確，資料清楚地表明，雌激素具有限制骨質(zhì)、疏松骨損失發(fā)展的能力，并且，在美國和許多其它國家，雌激素替代是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松公認的治療方法。
以低水平施用雌激素時，對骨有好的影響，但長期的雌激素替代療法已引起各種疾病，包括增加子宮和乳腺癌的危險。這些嚴重的副作用使得許多婦女拒絕這種治療方法。其它可減少癌癥危險的治療方法，如孕激素與雌激素的結(jié)合施用，使得某些患者有規(guī)律地撤退性失血，對于大多數(shù)老年婦女是不能接受的。擔心這些與雌激素替代療法有關的明顯令人不滿的副作用。以及雌激素逆轉(zhuǎn)存在的骨損失的能力有限，提供了一種強動力，促使研制其它可有效治療骨損失但不引起令人討厭的副作用的治療方法。
在骨質(zhì)疏松治療中，另一種方法是使用抗雌激素。通常，抗雌激素抑制(拮抗)體內(nèi)的雌激素活性?？勾萍に嘏c雌激素受體結(jié)合，盡管認為抗雌激素與雌激素受體之間的相互作用涉及雌激素結(jié)合的受體的不同區(qū)域。一些抗雌激素一方面表面為激動劑與拮抗劑特性的藥物學特性。另一方面，這些化合物產(chǎn)生某些類似雌激素的效果，同時在表達受體的細胞中，拮抗通常與施用雌激素相同的其它作用。由于某些抗雌激素的這種混合作用，它們發(fā)生與雌激素替代療法相關的相等反作用。
已知表現(xiàn)出上述混合的激動劑/拮抗劑作用的一種抗雌激素是三苯氧胺，一種用于乳腺癌治療的藥物。在降低乳腺腫瘤生長的能力方面，三苯氧胺作為一種雌激素拮抗劑而起作用，在降低健康和患乳腺癌婦女血清膽固醇含量的能力方面，它又作為一種激動劑而起作用(Love等人，Annals Int. Med.，115，860-864(1991))。三苯氧胺也可以增加乳腺癌患者的骨密度(Love等人，N.Eng.J.Med.，326，852-856(1991))。至少有一項研究表明，用三苯氧胺引起的可能的骨密度增加限于腰椎，而在用三苯氧胺治療的某些乳腺癌患者范圍內(nèi)，報道的是骨損失。此外，已經(jīng)表明三苯氧胺治療會增加絕經(jīng)后婦女的體重(Love等人，Ann.Int.Med.，同上)。
明顯地需要改進的抗骨質(zhì)疏松劑，它可以增加骨密度而不會引起副作用。不幸地是，目前還沒有迅速且有效地篩選大量化合物的方法，以鑒定表現(xiàn)所需的抗骨質(zhì)疏松作用的化合物。由于這種篩選方法在鑒定改進的抗骨質(zhì)疏松化合物中要消耗大量的時間和錢財，所以非常需要研制一種快速試驗大量化合物的方法，以鑒定可能具有抗骨質(zhì)疏松作用的化合物。
已經(jīng)肯定，雌激素通過與雌激素受體結(jié)合而發(fā)揮作用，然后，雌激素/雌激素受體復合物與DNA結(jié)合。該激素/受體復合物經(jīng)這種DNA結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(Kumar，Cell 55，145-156(1988))?？勾萍に匾才c雌激素受體結(jié)合。盡管這些抗雌激素/受體復合物也與DNA結(jié)合，但通常它們不能調(diào)節(jié)基因表達。雌二醇/雌激素受體復合物和羥三苯氧胺/雌激素受體復合物均在體內(nèi)與稱作雌激素反應性元件的DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合(Kumar，Cell出處同上)。
配體/受體復合物的構(gòu)型是某些爭論的問題。然而，最近的研究表明，在與雌二醇結(jié)合的雌激素和與4-羥三苯氧胺或ICI 164，384結(jié)合的相同雌激素受體間存在構(gòu)型差異(Klinge等人，J.Ster.Biochem.Mol.Biol.43，249-262(1992))。
在努力合理地找出發(fā)展改進的抗骨質(zhì)疏松藥物的問題過程中，研究人員已研究了在骨維持中起作用的已知蛋白質(zhì)。已知影響骨重建和骨代謝的一種蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)。盡管普遍認為是一個單個化合物，但實際上，現(xiàn)在已經(jīng)知道TGFβ是一個分子家族，包括至少三種異構(gòu)體TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3。(參見Arrick等人，Canc.Res.50，299-303(1990))。本發(fā)明人注意到，卵巢切除會引起大鼠骨中TGFβ-3的顯著減少(本發(fā)明人收集的資料未公開);其他人也注意到關于TGFβ(不特別說明異構(gòu)體)水平的相同的關系。(參見Finkelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，12190-12193(1992))。另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)給卵巢切除的大鼠施用雷洛昔芬(一種抗雌激素)，這種大鼠會貯存TGFβ-3濃度，達到等于或高于對照動物中所發(fā)現(xiàn)的水平。TGFβ-3水平與雌激素或抗雌激素循環(huán)水平之間的直接關系，以及TGFβ(不特別說明異構(gòu)體)在骨重建和代謝中起顯著作用的發(fā)現(xiàn)，說明骨質(zhì)疏松可能是由于體內(nèi)TGFβ-3的表達降低而引起的。(參見Noda等人，Endocrin.12，2991-2994(1989))。
TGFβ從大量來源中分離出來表現(xiàn)出各種不同作用的發(fā)現(xiàn)削弱了TGFβ-3水平的降低會引起骨損失的假設。例如，它抑制間質(zhì)細胞和上皮細胞的生長，它誘導蛋白多糖、纖維蛋白連接素、纖溶酶原激活劑的生物合成，并且對于成纖維細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞具化學趨向性。(參見Flaumenhaft等人，J.Cell.Bio.120(4)，995-1002(1993))。
此外，抗雌激素如三苯氧胺，或托瑞米芬(toremifene)誘導人胎兒成纖維細胞在沒有雌激素受體的情況下分泌TGFβ(沒有涉及異構(gòu)體)。(Colletta等人，Br.J.Cancer.62，405-409(1990))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGFβ刺激成骨細胞的骨形成并抑制破骨細胞的形成和破骨細胞的活性。(Mundy，“Clinical Application of TGFβ”，Ciba Fourdation Symposium No.157，137-151，Wiley，Chichester)。TGFβ抑制一種人子宮內(nèi)膜癌細胞系(Ishikawa)的分裂，但對于另一種上述細胞系(HEC-50)則是促分裂的。Murphy等人，J.Ster.Biochem，Molec.Bio.，41，309-314(1992))。
在乳腺癌活組織檢查中，用三苯氧胺進行的3個月的抗雌激素治療與細胞外TGFβ-1的誘導有關。(Butta等人，Cancer Res.，52，4261-4264(1992))。當將一種人子宮內(nèi)膜癌細胞系(HEC-50)暴露于雌二醇或某種抗雌激素時，在含1% ctFBS(木炭兩次解吸過的FBS)的培養(yǎng)基中生長的所述細胞中發(fā)現(xiàn)TGFβ-1mRNA的濃度有所降低。(Gong等人，Canc.Res.52，1704-1709(1992))。
用T-47D和MDA-MB-231細胞系表達TGFβ-2。用雌二醇處理這些細胞系降低了TGFβ-2mRNA的表達，但三苯氧胺沒有表現(xiàn)出相同的作用。TGFβ-3在富集骨細胞培養(yǎng)物的成骨細胞中以比TGFβ-1高3到5倍的速率誘導有絲分裂、膠原合成、堿性磷酸酶活性(Arrick等人，Canc.Res.50，299-303(1990))。
在Sporn等人的J.Cell Bio.，105，1039-1045(1987);Massague，Cell，49，437-438(1987)，和Moses，Cell，63，245-247(1990)中綜述了TGFβ的一般特性。這些文獻一般性地描述了TGFβ在體外和體內(nèi)系統(tǒng)中表現(xiàn)的特性。
上述的表達復合模型表明各種TGFβ異構(gòu)體的表達調(diào)節(jié)是一個獨特復雜的機制。已經(jīng)克隆并描述了基因TGFβ-1，TGFβ-2和TGFβ-3各自的啟動子區(qū)(Kin等人，J.Biol.Chem.，264，402-408(1989);Noma等人，Growth Factor，4，247-255(1991);Lafyatis等人，J.Biol.Chem.265，19128-12136(1990))。
已經(jīng)描述了TGFβ-2和TGFβ-3啟動子的特征，并報道它們含cAMP反應性元件、AP-1位點、AP-2位點和SP-1位點。Noma等人指明TGFβ-2啟動子活性取決于所研究的啟動子區(qū)域和誘導測定所選的細胞系。
在國際專利申請No.PCT/US92/00419中描述了至少一種用于篩選大量化合物的生物學活性的方法，該申請在權利要求中要求了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)生長因子表達的方法。該專利公開了鑒定化合物的檢測方法，所述化合物能夠通過人生長激素基因的啟動子區(qū)、c-ErbB2基因、K-ras序列的啟動子和巨細胞病毒的早期啟動子和增強子誘導轉(zhuǎn)錄。該申請主要是針對確定各種癌基因的調(diào)控的問題。
到目前為止，鑒定可能表現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松作用的化合物實際上要求在流行病學研究的基礎上隨機研究各個化合物，在達到所需效果和其它時間消耗及無效方法方面，利用有關的化合物。由目前篩選方法和所述無效試驗的經(jīng)濟花費引起的推延迫切需要經(jīng)濟有效的方法，來鑒別值得進一步研究的潛在的抗骨質(zhì)疏松藥物。


圖1描述了TGFβ-1基因的啟動子區(qū)。
圖2描述了TGFβ-2基因的啟動子區(qū)。
圖3描述了TGFβ-3基因的啟動子區(qū)。
圖4描述在存在對照化合物、雌激素、雷洛昔芬、三苯氧胺的情況下，在表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞中報道基因的相對表達水平，所述構(gòu)建體含有與CAT基因可操作連接的TGFβ-1啟動子，與CAT基因可操作連接的TGFβ-2啟動子，或與CAT基因可操作連接的TGFβ-3啟動子。通常，含TGFβ-3構(gòu)建體的細胞表達最高水平的報道基因，接著是含TGFβ-2構(gòu)建體和TGFβ-1構(gòu)建體的細胞。
圖5描述存在雌激素，雷洛昔芬和雌激素與雷洛昔芬結(jié)合物的情況下，在雌激素反應性元件或部分TGFβ-3啟動子的控制下報道基因的誘導。該圖說明兩種調(diào)節(jié)序列所表現(xiàn)出的明顯不同的調(diào)節(jié)方式。
圖6是一個柱形圖，說明存在及缺乏雌激素受體的情況下，在用含部分TGFβ-3啟動子序列的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并暴露于對照化合物、雌激素、雷洛昔芬、和雌激素與雷洛昔芬結(jié)合物的細胞中，報道基因表達的相對水平。雌激素受體對于由雌激素和抗雌激素誘導報道基因的表達是必需的。
圖7描述由實施例Ⅺ中列出的缺失構(gòu)建體表達的雌激素受體(ER)的各個區(qū)域。另外，表示出在用各種ER突變體和含TGFβ-3啟動子和熒光素酶基因的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞中，可達到的相對倍數(shù)誘導作用。
圖8描述存在各種濃度雌二醇、雷洛昔芬、三苯氧胺和ICI 164，384的情況下，在用含有TGFβ-3啟動子和CAT基因轉(zhuǎn)染的細胞中，可達到的報道基因的表達水平。概括地說，雷洛昔芬在全部各種濃度下均是最強的誘導劑，接著是ICI 164，384、三苯氧胺，在該系統(tǒng)中，雌激素是最弱的誘導劑。
圖9描述存在各種濃度雌二醇和雷洛昔芬的情況下，在用含有部分TGFβ-3啟動子和熒光素酶基因的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的CHO細胞中，報道基因的有關表達。概括地說，雷洛昔芬除在低濃度外，都是較強的誘導劑。
圖10描述存在各種深度雌二醇和雷洛昔芬的情況下，在用含有TGFβ-3啟動子和熒光素酶基因的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞中，報道基因的有關表達。在所有濃度下，雷洛昔芬都是較強的誘導劑。
圖11代表實施例Ⅹ中估計的化合物的化學結(jié)構(gòu)。
圖12表示在用TGFβ-3啟動子/CAT表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并暴露于實施例Ⅹ所列的各種濃度化合物的MG63細胞中，報道基因表達的相對誘導水平?？傊衔?77366是最強的誘導劑，而98005沒有誘導作用。
圖13描述用于鑒定41個堿基對的雷洛昔芬反應性元件的部分TGFβ-3啟動子，并描述在用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞中，雷洛昔芬對報道基因表達的有關誘導，所述質(zhì)粒含有與報道基因可操作相連的TGFβ-3啟動子序列被指示部分。盡管用pB-301構(gòu)建體達到的誘導倍數(shù)最高，但雷洛昔芬反應性元件(堿基+35至+75)的存在，對于這些細胞中雷洛昔芬明顯誘導的轉(zhuǎn)錄顯然是必需的。
圖14描述對TGFβ-3啟動子的分析。按實施例Ⅺ中的說明，描述了主要的轉(zhuǎn)錄起始位點和CCCTC-基序。
圖15描述存在雌激素受體和各種濃度雌二醇及雷洛昔芬的情況下，在用含有LDLR啟動子和熒光素酶基因的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的Hep 2細胞中，報道基因的有關表達?？傊?，雷洛昔芬是較強的誘導劑。
圖16描述存在各種深度雌二醇和雷洛昔芬但沒有雌激素受體的情況下，在用含有LDLR啟動子和熒光素酶基因的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的Hep 2細胞中，報道基因的有關表達。在等于或低于10-6M的濃度時，任何一種化合物均不表現(xiàn)出誘導作用。高濃度雷洛昔芬誘導一些表達，這表明在所述濃度下的一種不同的、非-ER依賴性誘導機制。
圖17是一個流程圖，舉例說明可按本發(fā)明教導完成的步驟順序，以便評估化合物誘導與本文描述的調(diào)控元件可操作連接的報道基因轉(zhuǎn)錄的能力。期望在表現(xiàn)出實施例ⅩⅢ所述誘導模式的化合物與能夠作為活體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松藥物起作用的所述化合物之間存在一種相互關系。
根據(jù)本發(fā)明，提供了新穎且有效的篩選化合物的方法，以確定這些化合物是否能夠調(diào)節(jié)來自含有雷洛昔芬反應性元件的啟動子的甾類激素-反應性基因的表達。也提供了基本由含有從TGFβ基因啟動子區(qū)分離的雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列組成的核酸及用其轉(zhuǎn)染的真核細胞。也提供了一種重組表達構(gòu)建體，含有與報道基因可操作連接的雷洛昔芬反應性元件。也提供了一種治療骨折的方法，一種治療骨質(zhì)疏松癥的方法，一種治療骨折的方法，包括施用一種化合物，當它與雌激素受體結(jié)合時，能夠誘導從TGFβ基因啟動子區(qū)開始的雷洛昔芬反應性元件的轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明涉及新穎且有效的篩選化合物的方法，以確定那些化合物是否能調(diào)節(jié)由始自含有本文發(fā)現(xiàn)并描述的雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子甾類激素-反應性基因的表達。本發(fā)明包括基本由含上述雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子組成的核酸。在優(yōu)選的實施方案中，含有雷洛昔芬反應性元件的啟動子得自人TGFβ-3或TGFβ-2基因的啟動子區(qū)。
本發(fā)明還包括含有啟動子的真核表達構(gòu)建體，所述啟動子帶有與報道基因可操作相連的雷洛昔芬反應性元件。在優(yōu)選的實施方案中，報道基因是氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因或熒光素酶基因。特別優(yōu)選的是熒光素酶基因。本發(fā)明也提供用所述真核表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞，當所述細胞暴露于雷洛昔芬或其它抗雌激素化合物時，能表達報道基因。
本發(fā)明還包括誘導骨形成的方法，包括施用有效量的一種化合物，當它與雌激素受體結(jié)合時，能夠從TGFβ-3基因啟動子區(qū)的雷洛昔芬反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明也提供一種治療骨折的方法，包括施用有效量的一種化合物，當它與雌激素受體結(jié)合時，能夠從TGFβ-3基因啟動子區(qū)的雷洛昔芬反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄。
在第一方面，本發(fā)明提供基本由含有雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列組成的核酸，其中所述元件來自哺乳動物，優(yōu)選的是人的轉(zhuǎn)化生長因子β基因的啟動子區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)化生長因子β基因是從TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在本發(fā)明這一方面進一步優(yōu)選的實施方案中，所述核酸基本由如本文進一步描述的下列質(zhì)粒中的TGFβ-3基因的啟動子序列組成質(zhì)粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。
在第二方面，本發(fā)明提供含有核酸的重組表達構(gòu)建體，所述核酸基本由含有與報道基因可操作相連的雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列組成，其中，所述元件來自哺乳動物，優(yōu)選的是人的轉(zhuǎn)化生長因子β基因的啟動子區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)化生長因子β基因是人TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在優(yōu)選的實施方案中，報道基因是氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因或熒光素酶基因。特別優(yōu)選的是熒光素酶基因。在本發(fā)明這一方面進一步優(yōu)選的實施方案中，所述核酸含有基本由TGFβ-3基因啟動子序列組成的啟動子序列，所述TGFβ-3基因啟動子序列含有如在本文進一步描述并與報道基因可操作相連的質(zhì)粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。
另一方面，本發(fā)明的重組表達構(gòu)建體能夠在用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的真核細胞中表達由所述構(gòu)建體編碼的報道基因。在優(yōu)選的實施方案中，所述真核細胞還表達一個雌激素受體蛋白或其突變衍生物。在特別優(yōu)選的實施方案中，通過用雷洛昔芬或本文定義的其它抗-雌激素化合物處理所述細胞，能夠誘導由本發(fā)明重組表達構(gòu)建體所攜帶的報道基因的表達。
本發(fā)明第三方面提供將本發(fā)明重組表達構(gòu)建體導入其中的真核細胞。在優(yōu)選的實施方案中，所述真核細胞是用本發(fā)明重組表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的真核細胞表達雌激素受體或其突變衍生物。在特別優(yōu)選的實施方案中，通過用雷洛昔芬或本文所定義的其它抗-雌激素化合物處理所述細胞，能夠誘導報道基因在所述細胞中的表達。
本發(fā)明也提供篩選多種化合物的方法，以鑒別可作為抗骨質(zhì)疏松藥物的那些化合物。本發(fā)明該實施方案的一個方面是提供篩選多種化合物的方法，以鑒別可作為抗骨質(zhì)疏松藥物的那些化合物。由本發(fā)明這一方面提供的方法包括從多種化合物中鑒別能從哺乳動物啟動子雷洛昔芬-反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄的化合物，它是一種特異性的轉(zhuǎn)錄誘導劑，不能從哺乳動物啟動子雌激素反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄，并且是一種抗雌激素或非雌激素化合物。由該實施方案提供的方法還包括步驟(a)檢測化合物誘導從哺乳動物啟動子雷洛昔芬反應性元件轉(zhuǎn)錄的能力;(b)檢測化合物缺乏從沒有雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子誘導轉(zhuǎn)錄的能力;(c)檢測化合物不能從雌激素反應性啟動子誘導轉(zhuǎn)錄的能力;和(d)檢測化合物在存在雌激素的情況下，抑制雌激素誘導的從雌激素反應性啟動子轉(zhuǎn)錄的能力。
在優(yōu)選的實施方案中，(a)部分的檢測還包括確定所述化合物誘導與含有雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子可操作相連的報道基因表達的能力的步驟。在另一優(yōu)選的實施方案中，(b)部分的檢測還包括確定所述化合物不能誘導與哺乳動物啟動子可操作相連的報道基因表達的能力的步驟，其中，所述啟動子不含有雷洛昔芬反應性元件。本發(fā)明這一方面的另一優(yōu)選的實施方案提供(c)部分的檢測還包括確定所述化合物不能誘導與雌激素反應哺乳動物啟動子可操作相連的報道基因表達的能力的步驟。在最后優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的(d)部分的檢測還包括確定所述化合物在雌激素存在情況下，抑制與雌激素反應哺乳動物啟動子可操作相連的報道基因的雌激素依賴性誘導表達的能力的步驟。
在本發(fā)明這一方面特別優(yōu)選的實施方案中，雷洛昔芬反應性哺乳動物啟動子分離自哺乳動物優(yōu)選的是人的轉(zhuǎn)化生長因子β基因。最優(yōu)選的實施方案是，其中轉(zhuǎn)化生長因子β基因是人的TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在其它優(yōu)選的實施方案中，報道基因是氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因或熒光素酶基因。在本發(fā)明這一方面其它優(yōu)選的實施方案中，雷洛昔芬反應性啟動子序列基本上由TGFβ-3基因的啟動子序列組成，所述啟動子序列含有質(zhì)粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列);pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。它們?nèi)绫疚膶⑦M一步描述的，并可操作地與報道基因相連。
從對特定優(yōu)選的實施方案和權利要求的更詳細描述中，可使本發(fā)明具體優(yōu)選的實施方案變得清楚明白。
本說明書包括許多縮寫。本文所用的“TGFβ”指轉(zhuǎn)化生長因子β(不涉及異構(gòu)體)。TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3具有本領域確定的意思，即代表轉(zhuǎn)化生長因子β基因的三種已知的異構(gòu)體。本文所用的縮寫“CAT”表示氯霉素乙?；鵆OA轉(zhuǎn)移酶?！按贫肌笔且环N雌激素，本文有時縮寫為E2。本文所用的縮寫“ER”表示雌激素受體蛋白質(zhì)。
本文所用的術語“雷洛昔芬反應性元件”指含有哺乳動物TGFβ基因啟動子區(qū)核酸的核苷酸序列。所述啟動子區(qū)能夠誘導在暴露于雷洛昔芬和雌激素受體蛋白的宿主細胞中與雷洛昔芬反應性元件可操作相連的任何結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。雷洛昔芬反應性元件包括，但不限于含有如在本文中進一步描述的下列質(zhì)粒的TGFβ啟動子序列的核苷酸序列和與那些具有與之基本相同生物學活性的核酸，所述質(zhì)粒為質(zhì)粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3啟動子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3啟動子序列)。該定義包括在TGFβ基因啟動子區(qū)的天然等位基因變異體。可以從任何種哺乳動物TGFβ啟動子，但最好是人的，得到分離的本發(fā)明雷洛昔芬反應性元件。
本文所用的抗雌激素包括全部和部分雌激素拮抗劑。本文描述的實施例中所用的所有雌二醇是17β-雌二醇。
術語“有效量”指化合物的量，當給哺乳動物施用時，所述化合物與雌激素受體結(jié)合，能夠誘導雷洛昔芬反應性元件的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)具體的環(huán)境，包括施用的化合物、施用途徑、被治療的具體條件以及類似的考慮來確定所施用化合物的具體劑量。
術語“有效地”指當在本文描述的體外檢測中測試所述化合物時(參見實施例Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ和ⅩⅣ)，化合物以低于或等于10nM(1×10-8M)的最小有效濃度與雌激素受體結(jié)合，誘導從雷洛昔芬反應性元件的轉(zhuǎn)錄。
根據(jù)其距離、核苷酸數(shù)、從基因的主要轉(zhuǎn)錄起始位點(在圖1-3中將該起始位點作為+1)開始來鑒別所有部分的啟動子序列。數(shù)字前的負號(-)表示5′到起始位點的核苷酸序列，數(shù)字前的正號表示3′到起始位點的核苷酸。用SEQ ID NO 1-3中標明的數(shù)字鑒別這些序列，并且與圖1-3的數(shù)字對應。
從本公開的角度，可以用化學合成法、體外擴增[包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR)]或從天然產(chǎn)生的來源(如哺乳動物細胞培養(yǎng)物、來自所述細胞的基因組DNA或所述DNA的文庫)或?qū)⑦@些方法結(jié)合起來得到編碼本發(fā)明雷洛昔芬反應性元件的DNA。
可以將雷洛昔芬反應性元件有效地與報道基因可操作相連并通過使用適當?shù)妮d體、構(gòu)建體及本領域熟知的方法，如DNA介導的基因轉(zhuǎn)移方法(包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔和病毒介導的感染)瞬時或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?。本文所用的術語“重組表達構(gòu)建體”是指能夠直接表達與本發(fā)明雷洛昔芬反應性元件可操作相連的報道基因的DNA構(gòu)建體。
當DNA區(qū)彼此在功能上有關時，它們是可操作相連的。例如，如果一個啟動子能控制一個編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列是可操作相連的;如果可將一個核糖體結(jié)合位點定位以便進行翻譯，則它與編碼序列是可操作相連的。
可以用標準方法，如酶活性測定、比色法、化學發(fā)光法、樣品中存在的放射性、ELISA、抗體結(jié)合、放射免疫或本領域?qū)I(yè)人員已知的定量方法將編碼結(jié)構(gòu)蛋白的報道基因定量，可根據(jù)所選的宿主和所選的轉(zhuǎn)化方法改變所用的報道基因。有用的報道基因包括但不限于氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶或任何其它可確定數(shù)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，報道基因是熒光素酶。
轉(zhuǎn)染細胞是用經(jīng)重組DNA技術生產(chǎn)的雷洛昔芬反應性元件-報道基因重組表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞。已經(jīng)用重組雷洛昔芬反應性元件-報道基因表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞(作為所述細胞的特征或由于雌激素受體編碼表達構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染)將在適當?shù)沫h(huán)境下(即暴露于一種抗雌激素或其它誘導劑)表達報道基因的基因產(chǎn)物。例如，適用于本發(fā)明的一個優(yōu)選的細胞系MCF-7，能夠表達雌激素受體。對于所述細胞系，單獨用重組雷洛昔芬反應性元件-報道基因表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，可以產(chǎn)生適用于本發(fā)明的細胞。另外，MG63細胞以雷洛昔芬-依賴性方式表達報道基因，僅當雷洛昔芬反應性元件-報道基因表達載體和雌激素受體表達載體的共轉(zhuǎn)染時。
由多細胞生物得到的細胞培養(yǎng)物是適于表達雷洛昔芬反應性元件-報道基因表達構(gòu)建體的宿主。理論上講，可以使用任何天然表達雌激素受體或經(jīng)遺傳工程方法修飾的表達雌激素(或其部分受體)的高等真核細胞。如在實施例中所說明的，哺乳動物細胞是優(yōu)選的。在細胞培養(yǎng)物中繁殖所述細胞已成為一種常規(guī)方法。(參見Tissue Culture，Academic Press，Kruse & Patterson，編輯(1973))。有用的宿主細胞的實例是MCF-7、MG63、HeLa、RL95.2、Hep G2和CHO細胞(所有的均可從美國典型培養(yǎng)物收集中心，Rockville，Maryland得到)。根據(jù)本發(fā)明的目的。使用MCF-7細胞系是特別優(yōu)選的，由于該細胞系可以表達雌激素受體。
按下文實施例所述，可以用表達雌激素受體或部分受體并含有雷洛昔芬反應性元件-報道基因表達構(gòu)建體的宿主細胞評估化合物通過雷洛昔芬反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄的能力。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，如果存在化合物比沒有化合物的情況下，報道基因的表達可增加2倍，就認為該化合物經(jīng)調(diào)節(jié)元件(包括但不限于從TGFβ啟動子或其缺失構(gòu)建體得到的核酸)可誘導轉(zhuǎn)錄。在不太優(yōu)選的實施方案中，如果化合物誘導的轉(zhuǎn)錄比對照高50%，則認為化合物是轉(zhuǎn)錄誘導劑。然而，總之，上述可檢測的誘導足以表明由化學化合物生產(chǎn)的誘導。
在本發(fā)明具體篩選方法的實踐中(見實施例ⅩⅢ)，由于質(zhì)粒pB-301表現(xiàn)出對雷洛昔芬的高水平反應性，所以使用該質(zhì)粒是優(yōu)選的。其它實施方案使用含有包括位置-38到+75 TGFβ-3啟動子區(qū)的構(gòu)建體。在本發(fā)明所有操作實施方案中，將雷洛昔芬反應性元件以能夠轉(zhuǎn)錄的方式與報道基因可操作相連，由于該元件對于允許本文描述的雷洛昔芬反應誘導是必需的。
完成本發(fā)明篩選方法步驟的順序可以改變，在某些情況下，有些步驟可以取消。下列實施例是本發(fā)明說明性的具體的實施方案和其各種用途。它們僅僅用于解釋目的，而不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1構(gòu)建報道質(zhì)粒A.phTG12、pTGF-1和pB-499作為開發(fā)用于篩選用效抗骨質(zhì)疏松藥物的細胞系的第一步，首先是從A. Roberts，National Institutes of Health，Laboratory of Chemoprevention(NIH/NCI，Bethesda，MD)得到一系列編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)(Gorma等人，Molec.Cell.Biol.，2，1044-1051(1982))的報道質(zhì)粒，其中的CAT基因經(jīng)操作連接至TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3基因的啟動子序列上。這些質(zhì)粒分別被命名為phTG12(TGFβ-1)、pTGF-1(TGFβ-2)和pB-499(TGFβ-3)。編碼上述啟動子的每個序列可見于下列文獻，即Kim等人，J. Biol. Chem.，264，402-408(1989))(TGFβ-1);Noma等人，Growth Factor，4，247-255(1991)(TGFβ-2)和Lafyatis等人，J.Biol.Chem.，265，19128-19136(1990)(TGFβ-3)。TGFβ-1的啟動子序列已被遞交到GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫，入藏登記號為JO 4431。TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3啟動子序列分別示于圖1、圖2和圖3中，并分別以SEQ IC NO∶1、SEQ IC NO∶2和SEQ ID NO∶3表示。
另外，利用常規(guī)的克隆技術(參見Sambrook，F(xiàn)ritsch，and Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Horbor，New York，下文稱為Sambrook等人)將每一TGFβ啟動子亞克隆到一個商售的CAT構(gòu)建體(例如，以pCAT為基礎的CAT構(gòu)建體，Promega，Madison，WI)中即可生產(chǎn)經(jīng)操作與每一TGFβ啟動子序列相連的含CAT的報道質(zhì)粒。
為了鑒定應答抗雌激素雷洛昔芬的TGFβ-3基因啟動子區(qū)，分析了由含有部分TGFβ-3基因啟動子序列的構(gòu)建體指導下的CAT報道基因的表達。從A.Roberts獲得六個TGFβ-3啟動子缺失/CAT報道構(gòu)建體。這些質(zhì)粒的命名及每一質(zhì)粒中所含啟動子區(qū)的范圍如下pB-301 -301-+110(對應于圖3和SEQ ID NO∶3中的1896-2306)pB-221 -221-+110(對應于圖3和SEQ ID NO∶3中的1976-2306)pB-91 -91-+110(對應于圖3和SEQ ID NO∶3中的2106-2306)pB-60 -60-+110(對應于圖3和SEQ ID NO∶3中的2137-2306)
pB-47 -47-+110(對應于圖3和SEQ ID NO∶3中的2150-2306)pB-38 -38-+110(對應于圖3和SEQ ID NO∶3中的2159-2306)如下所述構(gòu)建另外兩個TGFβ-3啟動子缺失構(gòu)建體。其中的第一個構(gòu)建體含有對應于啟動子序列中-38-+75位的人TGFβ-3啟動子區(qū)序列，這段序列相當于圖3和SEQ ID NO∶3中的2159-2271(參見Lafyatis等人，出處同上)。第二個啟動子缺失構(gòu)建體包含對應于啟動子序列中-38-+35位的人TGFβ-3啟動子區(qū)序列，這段序列相當于圖3和SEQ ID NO∶3中的2159-2231。在本領域中完善建立的手段將用于鑒定自轉(zhuǎn)錄起始位點的距離開始需被鑒定的所有啟動子序列。
上述質(zhì)粒的制備過程如下，利用DNA/RNA合成儀(Model 394，Applied Biosytems Inc.，F(xiàn)oster City，CA)根據(jù)制造商的說明在β-氰乙基磷酰胺糖醇合成條件下合成對應于每一質(zhì)粒所需的TGFβ-3啟動子序列長度的寡核苷酸。利用常規(guī)方法(Sambrook et al.，出處同上)合成，純化和混合用于每個質(zhì)粒構(gòu)建體的寡核苷酸互補對，并使之退火形成對應于合適TGFβ-3啟動子序列的雙鏈DNA。合成HindⅢ和XbaⅠ限制性酶識別位點分別在序列的3′和5′端作為適宜的突出末端。然后將雙鏈啟動子序列連接到經(jīng)HindⅢ/XbaⅠ消化的CAT報道質(zhì)粒pB-301上，并在標準條件下于細菌中增殖。以此產(chǎn)生的含TGFβ-3啟動子-38-+75區(qū)的報道質(zhì)粒稱為pTGFβ+75CAT，而含有TGFβ-3啟動子的-38-+35區(qū)的質(zhì)粒被稱為pTGFβ+35CAT。這些質(zhì)粒如下面的實施例Ⅴ所述用于CAT檢測中。
B.含有TGFβ-3啟動子缺失構(gòu)建體的熒光素報道質(zhì)粒及不含啟動子區(qū)的對照質(zhì)粒pTGFβ-301LUC、pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC、pTGFβ+35LUC和pLUC構(gòu)建四種含有在TGFβ-3啟動子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下被表達的熒光素酶基因(REF)及其改變的缺失之衍生物的質(zhì)粒。質(zhì)粒pTGFβ-301LUC的制備是通過用HindⅢ消化pB-301，然后用細菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)進行處理使HindⅢ消化產(chǎn)生的突出末端平端化。用XbaⅠ消化，釋放出對應于-301-+110位的TGFβ-3啟動子部分。該片段被亞克隆入SamⅠ/XbaⅠ消化的pSP73(Promega)中，產(chǎn)生穿梭載體pSPTGFβ-301。
在細菌體內(nèi)進行擴增后，用NdeⅠ和HindⅢ消化被分離和純化的pSPTGFβ-301的制備物，在經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠(BRL-Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)電泳分開后分離含啟動子序列的片段。用NdeⅠ/HindⅢ消化含熒光素酶的構(gòu)建體pLDLRLUC10(如1993年3月3日申請、申請?zhí)枮?8/018，985的美國專利申請所描述，并被進一步描述于下文的C部分中)，并在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化。然后混合、連接這些分離的片段，并用于轉(zhuǎn)化細菌(Sambrook等人，出處同上)。
通過BamHⅠ/XbaⅠ雙酶切的消化作用分別從pB-38、pTGFβ+75CAT和pTGFβ+35CAT中首先切除TGFβ-3的啟動子序列構(gòu)建質(zhì)粒pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC和pTGFβ+35LUC。用NheⅠ/BamHⅠ消化制備以pGL2為基礎的含熒光素酶的質(zhì)粒(或“pGL2LUC”)(Promega)并通過將適宜的TGFβ-3啟動子序列連接入含熒光素酶的質(zhì)粒而制備每一種重組質(zhì)粒。這些質(zhì)粒將被用于下面的實施例Ⅵ中所述的熒光素酶檢測中。
含有熒光素酶基因但不攜帶TGFβ-3基因部分的對照質(zhì)粒是通過用限制性酶XbaⅠ和HindⅢ消化pTGFβ+75LUC質(zhì)粒DNA來構(gòu)建的。在標準條件下(Sambrook et al.，出處同上)通過加入所有四種dNTP的Klenow酶反應將凸出的末端填平。在生產(chǎn)商建議的條件下將上述的平末端與T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)連接。
C.含LDLR啟動子的報道質(zhì)粒pLDLRLUC101993年3月3日申請、申請?zhí)枮?8/018，985的美國專利申請(下文稱為985申請)描述了質(zhì)粒pLDLRLUC10。下面將詳細地描述該質(zhì)粒的構(gòu)建過程用聚合酶鏈反應擴增人LDL受體啟動子的1546 bp序列。反應混合物含有下列每一種合成的寡核苷酸20pmol5′-GCGCCATATGAGTCTTAACTGCCAAAAATTCTTATCATCAAT-3′(SEQ ID NO∶4)5′-AAGCAAGCTTTCGCAGCCTCTGCCAGGCAGTGTCCCGACCCGGA-3′(SEQ ID MO∶5)和1μg由腺癌細胞系P3UCLA純化的人基因組DNA、dATP、dGTP、dCTP和TTP各200μM、2.5U Taq DNA聚合酶、10mM Tris-HCl pH9.3、50mM KCl、15mM MgCl2和0.1%明膠，終體積100μl，上述混合物進行由96℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 1秒組成的循環(huán)共30次。反應物在1%瓊脂糖凝膠上電泳、分離1546 bp條帶，用HindⅢ和NdeⅠ消化。該片段與預先也用HindⅢ和NdeⅠ消化過的質(zhì)粒pSP72(Promega)連接。所得的載體pNLDLRP用NdeⅠ和HindⅢ消化，消化物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，從中再次分離1546 bp的LDL受體序列。
是用HindⅢ和BglⅡ消化質(zhì)粒pSV2-珠蛋白，然后連接一個NruⅠ-XhoⅠ接頭到載體中構(gòu)建質(zhì)粒載體pSV2。質(zhì)粒pSV2珠蛋白公開于US4，775，624中，該專利文獻并入本文作為參考。上述接頭含有下列順序5′-AGCTTCGCGACTCGAGA-3′(SEQ ID NO∶6)5′-GATCTCTCCAGTCGCGA-3′(SEQ ID NO∶7)所得的載體被命名為pSV2-H NXB，因為它含有一個BamHⅠ位點、一個NruⅠ位點、一個XhoⅠ位點和一個BglⅡ位點。將含有熒火蟲熒光素酶基因(REF)的質(zhì)粒pAlc4(NRRL B-18783)的HindⅢ-BglⅡ片段連接入質(zhì)粒pSV2-HNXB的HindⅢ-BglⅡ位點。
分離上述的1546 bp片段，并克隆入含有熒火蟲熒光素酶報道基因和已被NdeⅠ完全消化和由HindⅢ部分消化的載體pSV2中。所得載體pLDLRLUC10含有指導熒火蟲熒光素酶基因表達的人LDL受體啟動子、氨芐青霉素抗性標志基因和復制起點。
實施例Ⅱ人雌激素受體表達質(zhì)粒含雌激素受體的哺乳動物表達構(gòu)建體pCMVER和pRSV-ER得自B.S.Katzenellenbogen，Department of Physiology and Biophysics，University of Illinois(Urbana-Champaign，IL)，也可參見Reese and Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887(1990)。這些質(zhì)粒被用于如下文實施例Ⅶ所述的表達檢測中。
實施例Ⅲ構(gòu)建含雌激素反應性元件/熒光素酶基因的質(zhì)粒設計并合成對應于來自非洲蟾蜍卵黃蛋白原的雌激素反應性元件(ERE)的互補寡核苷酸(相當于-341位--310位)[Metzger et al.，Nature，334，31-36(1988)]，然后退火，形成基本如實施例Ⅰ所述雌激素反應性元件的雙鏈區(qū)。合成含有XhoⅠ限制性酶識別位點的序列以用于側(cè)接ERE序列，所說的元件具有下列核苷酸序列(分別如SEQ ID NO∶8和SEQ ID NO∶9所示)5′-TCG-AGA-AAA-GTC-AGG-TCA-CAG-TGA-CCT-GAT-CAA-AC-3′3′-CT-TTT-CAG-TCC-AGT-GTC-ACT-GGA-CTA-GTT-TGA-GCT-5′雙鏈ERE被亞克隆入經(jīng)XhoⅠ消化的pGL12基質(zhì)粒(Promega)中，藉此，熒光素酶基因被置于ERE的轉(zhuǎn)錄影響之下，該質(zhì)粒命名為pGL2ERELUC并被用于如下所述(實施例Ⅵ)的進一步實驗中。
實施例ⅣDNA轉(zhuǎn)染A.細胞培養(yǎng)在由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基(兩者以3∶1的比例混合，得自GIBCO，Grand Island，NY)組成的培養(yǎng)基(稱為3∶1培養(yǎng)基)中培養(yǎng)哺乳動物細胞，所說培養(yǎng)基不含酚紅，含10%胎牛血清(FBS;Hyclone，Logan，UT)。細胞以4天的間隔傳代。轉(zhuǎn)染的前一天，通過將細胞與1ml 0.05%胰蛋白酶/5.3mM乙二胺四乙酸四鈉(GIBCO)的溶液在室溫下一起保溫5分鐘來處理細胞，然后以1×106細胞/10cm培養(yǎng)皿的密度將細胞接種于含10%用活性炭解吸過的FBS(csFBS;Hyclone)的3∶1培養(yǎng)基中。
B.TGFβ構(gòu)建體和人ER構(gòu)建體瞬時的共同轉(zhuǎn)染利用ProFection哺乳動物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Promega)在MG63(人骨肉瘤)細胞中進行共同轉(zhuǎn)染實驗。將10μg含TGFβ啟動子的報道質(zhì)粒DNA與5μg含人雌激素受體(ERE)的表達質(zhì)粒(pRSV-ER或pCMV-ER，得自B.S.Katzenellenbogen Department of Physiology and Biophysics，University of Illinois，也可參見Reese and Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887，1990)或pRSV(對照)質(zhì)?；旌?，共同被沉淀，然后轉(zhuǎn)染入10cm培養(yǎng)皿中的2-4×106個細胞中。在細胞與DNA沉淀物于37℃一起保溫15小時后，通過用Dulbecco磷酸緩沖鹽液(D-PBS;GIBCO)洗滌細胞兩次以除去DNA沉淀物。用含10%csFBS的新鮮3∶1培養(yǎng)基再次培養(yǎng)細胞。在適當時候加入待測其調(diào)節(jié)報道基因表達的能力的化合物，并根據(jù)下文所述進行測定。
C.TGFβ構(gòu)建體和人ER構(gòu)建體穩(wěn)定的共同轉(zhuǎn)染用MCF-7細胞進行轉(zhuǎn)染實驗，使得被轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒序列穩(wěn)定地整和到受體細胞的基因組中。在這些實驗中，將含有TGFβ啟動子的質(zhì)粒DNA與編碼可選擇標志的DNA混合。例如，將60μg含TGFβ啟動子的質(zhì)粒DNA(pTGFβ-301LUC、pGL2LUC或pGL2ERELUC)與60μg pSV2HYG衍生的、含潮霉素抗性基因的質(zhì)粒pSV2HYGtB(進一步描述于1992年9月29日申請、申請?zhí)枮?7/953，633的美國專利申請中，該文獻并入本文作為參考混合，并利用上述ProFection系統(tǒng)(Promega)轉(zhuǎn)染2×106個MCF-7細胞。37℃培養(yǎng)過夜后，如上所述從細胞中洗去沉淀物。然后將細胞用含10% FBS的新鮮3∶1培養(yǎng)基在37℃重新培養(yǎng)48小時，此時的細胞一般達到了融合。如上所述用胰蛋白酶處理細胞，再將每個培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物裝入兩個10cm培養(yǎng)皿的含10%FBS 3∶1培養(yǎng)基中。通過在添加了200μg/ml潮霉素B(Calbiochem-Novabiochem，LaJolla，CA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來選擇潮霉素抗性。每兩天用添加了潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基更換上述選擇培養(yǎng)基，但不擾亂細胞的選擇實驗過程。于選擇培養(yǎng)基中生長約14天后可見克隆的菌落。分離這類克隆，并用無菌吸移管管尖移至24孔細胞培養(yǎng)板(Flow Laboratories，Mclean，VA)的各孔中。這種克隆在選擇培養(yǎng)基中生長并維持。
為了鑒定已用含熒光素酶基因的質(zhì)粒序列成功地進行了共轉(zhuǎn)染的潮霉素抗性克隆，用聚合酶鏈反應(PCR)檢測轉(zhuǎn)染體DNA中的熒光素酶cDNA衍生的DNA序列。合成相當于熒光素酶cDNA序列的355-373位(有意義引物)和929-911位(反義引物)的寡核苷酸PCR引物。在基本上如生產(chǎn)商所述的條件下利用Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600進行PCR共35次循環(huán)，每個PCR循環(huán)包括94℃ 45秒、55℃ 45秒和72℃ 2分鐘。
將含熒光素酶的潮霉素抗性克隆與如上所述的雌激素或raloxifene一起保溫，通過測定存在于細胞提取物中的酶活性量分析對報道基因表達的影響。為了測定熒光素酶，在含有0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.8)/1% Triton X-100(Boehringer Mannheim)/2mM EDTA和1mM二硫蘇糖醇(DTT，Boehringer Mannheim)的白細胞裂解劑中裂解細胞，并用由Analytical Luminescence Laboratory(San Diego，CA)改良的最佳未增強的熒光素酶測定方案進行檢測。然后將這類用TGFβ報道基因構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞的克隆用于如下所述(實施例ⅩⅢ)的新型抗骨質(zhì)疏松篩選測定法中。
實施例Ⅴ分析由雌激素和抗雌激素激活的TGFβ啟動子介導的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)有技術已知，用雌激素和三苯氧胺可以不同程度地誘導TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3基因的表達(參見背景技術及相關技術部分)。利用上述含有TGFβ啟動子的質(zhì)?？稍谙率鲆幌盗畜w外表達測定中描述所說可誘導性的程度和方式的特征。
利用ProFection系統(tǒng)(Promega)以pRSVER質(zhì)粒與phTG12或pTGF-1或pB2-499一起瞬時地共轉(zhuǎn)染MG63細胞的培養(yǎng)物，對于每個被轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物而言，滴加含DNA的磷酸鈣培養(yǎng)物至每一培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)基中充分混勻。培養(yǎng)基的pH值要精確地維持在pH7.2-7.4。被轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物在5% CO2中于37℃培養(yǎng)過夜。之后，通過從所有培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基隨后再用D-PBS洗各皿兩次而去除沉淀物。對于每個被共轉(zhuǎn)染的細胞系，用含有10% csFBS和下列成分之一的10ml新鮮培養(yǎng)基替換緩沖液a.10μl乙醇(激素載體)＝對照;
b.溶于乙醇濃度為10-4M的10μl 17β-雌二醇(Sigma)(“estradiol”);
c.溶于乙醇濃度為10-4M的10μl雷洛昔芬(Eli Lilly Laboritories);
d.溶于乙醇濃度為10-4M的10μl三苯氧胺(Sigma)。
在與上述激素制備物(或載體對照)一起孵育24小時后，用D-PBS洗細胞兩次。然后用rubber policeman和1ml D-PBS將細胞從培養(yǎng)皿中刮下。在臺式離心機(MicroMax Model，IEC，Newark，NY)中以8，000rpm離心兩分鐘收集細胞。去掉上清細胞團丸重懸于150μl 0.25M Tris-HCl溶液(pH7.8)。通過在干冰/乙醇浴中冷凍和在37℃水浴中融化的三次循環(huán)來裂解細胞，每個循環(huán)歷時3分鐘。被裂解的細胞制備物在4℃下以15，000rpm離心5分鐘，除去細胞碎片。將含有可溶性細胞裂解物的上清液移至新的一套試管中，以測定氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性。
在對這類細胞裂解物進行測定之前，用商售測定劑(BioRad Laboratories，Richmond，CA)首先確定每一裂解物中的蛋白質(zhì)含量。含100μg總蛋白的每一細胞裂解物與CAT測定緩沖液
-氯霉素)混合15小時。經(jīng)此保溫后，通過用900μl乙酸乙酯強烈地抽提反應混合物而中止反應。以14，000rpm短暫離心1分鐘分離出有機相和水相，將大約800μl有機相移至一套新的試管中。蒸發(fā)乙酸乙酯以濃縮CAT催化的反應產(chǎn)物。
用95∶5(V/V)氯仿/甲醇混合物作為上行緩沖液，借助薄層色譜分辨乙酰化和未乙?；穆让顾?。用Batascope 603印跡分析儀(Betagen，Intelligenetics Inc，Mountain View，CA)檢測被分辨的每種氯霉素的放射活性。計算乙?；牧肯鄬τ诳偭康陌俜直龋玫矫糠N被測轉(zhuǎn)染體的相對CAT活性(本文所表示的全部CAT活性均是以此為基礎計算的)。每一測定進行兩次。
用MG63轉(zhuǎn)染細胞系進行上述實驗所得的結(jié)果示于圖4中。有代表性實驗的結(jié)果列表顯示如下 Fold induction是在與對照進行比較的基礎上計算出來的。
這些實驗表明，CAT報道基因的轉(zhuǎn)錄是由雌激素和抗雌激素雷洛昔芬和三苯氧胺誘導的，雷洛昔芬表現(xiàn)出的效力強于雌激素，尤其反映在對TGFβ-3啟動子的誘導作用上。相反，用于該實驗的TGFβ-1啟動子區(qū)(-1032-+727位)沒有對雌二醇或雷洛昔芬產(chǎn)生應答。
實施例Ⅵ雌激素和雷洛昔芬對TGFβ-3啟動子和卵黃蛋白原啟動子的ERE的不同誘導作用前文實施例中所得結(jié)果表明，TGFβ-3啟動子對雌激素和“抗雌激素”化合物如雷洛昔芬和三苯氧胺都具有轉(zhuǎn)錄反應性，并且由雷洛昔芬誘導的轉(zhuǎn)錄其程度相對要大于應答雌激素所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄誘導作用。該實施例說明編碼非洲蟾蜍蛋白卵黃原的基因在體內(nèi)以完全相反的方式應答，也就是說，卵黃蛋白原基因的轉(zhuǎn)錄受到雌激素的強烈誘導，而僅僅受到雷洛昔芬的微弱誘導。此外，當同時給予雷洛昔芬和雌激素兩種化合物時，雷洛昔芬強烈地拮抗雌激素誘導的產(chǎn)生卵黃蛋白原的誘導作用。此結(jié)果表明在上述實施例Ⅵ中所測定的報道質(zhì)粒中指導報道基因轉(zhuǎn)錄的TGFβ啟動子序列包含一個新的雷洛昔芬反應性元件，其特征在于有一個獨特的雌激素及抗雌激素反應性方式。
利用前文實施例所述的報道基因測定系統(tǒng)進一步研究了上述雌激素和抗雌激素反應性方式。如實施例Ⅳ所述，用pB-301和pRSVER瞬時地共轉(zhuǎn)染MG63細胞培養(yǎng)物。用濃度在10-9M-10-5M之間10倍增長變化的雌二醇和雷洛昔芬處理上述瞬時轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物以檢測報道基因表達的轉(zhuǎn)錄激活。通過測定10-8M雷洛昔芬對報道基因應答相同于單用雌激素時的系列濃度的雌激素的誘導作用的影響，也檢測了雌激素和雷洛昔芬的聯(lián)合作用，這些測定基本上如實施例Ⅴ進行。
用經(jīng)pGL2ERELUC和pRSVER瞬時轉(zhuǎn)染的MG63細胞培養(yǎng)物完成了類似的測定。但在這些測定中，與雌激素聯(lián)用的雷洛昔芬的用量是變化的，以致于雷洛昔芬濃度是混合物中雌激素濃度的20倍(即10-9M雌激素/2×10-8雷洛昔芬;10-8雌激素/2×10-7M雷洛昔芬等)。
用各種激素含量和各種激素組合處理轉(zhuǎn)染的細胞，然后用D-PBS洗兩次。細胞在與200μl白細胞裂解劑(如實施例Ⅵ所述)一起于4℃保溫20分鐘后被裂解，用rubber policeman刮下移至微型離心機管中。細胞裂解物以14，000rpm離心1分鐘除去細胞碎片。然后檢測細胞提取物(上清液部分)的蛋白含量和熒光素酶活性。
熒光素酶的測定過程如下。加50μl每一細胞提取物至微量滴定板各孔的100μl試劑A緩沖液(含4.0mM A7P/15mM MgSO4/30mM麥黃酮(tricine)緩沖液(pH7.8)/10mM DTT)中。再向各孔加入100μl 1mM D(-)熒光素(溶于0.1M KPO4pH7.8，Boehringer Mannheim)，用ML3000微量滴定板發(fā)光計測量所產(chǎn)生的光量(條件為整合閃點模式、高增益、整合窗＝10秒，22℃)。熒光素酶活性被計算為總的光產(chǎn)量比上各細胞裂解物樣品中的蛋白質(zhì)含量。
這些檢測結(jié)果制表顯示如下
上述實驗結(jié)果如圖5所示。
這些結(jié)果清楚地說明在TGFβ基因啟動子中存在一個對抗雌激素具有反應性的獨特啟動子區(qū)。當雷洛昔芬作為由基因(如卵黃蛋白原基因)的含ERE啟動子啟始的轉(zhuǎn)錄的有效拮抗劑時，本文發(fā)現(xiàn)它在誘導由TGFβ-3啟動子開始的轉(zhuǎn)錄中充當超級激動劑。令人感興趣的是，在低濃度時，雷洛昔芬與雌激素協(xié)同誘導本發(fā)明報道質(zhì)粒中TGFβ-3啟動子的轉(zhuǎn)錄，這表明被雷洛昔芬誘導的基因轉(zhuǎn)錄可以由新的機制所介導。
實施例Ⅶ用雌激素和抗雌激素激活TGFβ-3的雌激素受體依賴性基因現(xiàn)有技術已經(jīng)知道雌激素與抗雌激素兩者影響TGFβ產(chǎn)生的能力依賴于雌激素受體(ER)的表達，但尚不清楚在哪一級水平(即轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后)上產(chǎn)生上述影響。因此，利用本發(fā)明含TGFβ啟動子的構(gòu)建體進行了一系列實驗，以研究所推定的報道基因表達的誘導作用對ER表達的依賴性，ER表達的缺乏實際上削弱了TGFβ-3的表達，無論是否存在雌二醇或雷洛昔芬。通過應用突變的ER蛋白已經(jīng)確定ER分子的不同結(jié)構(gòu)區(qū)負責雌激素和雷洛昔芬的誘導作用。
A.TGFβ-3的ER依賴性誘導作用如實施例Ⅳ所述制備用于共轉(zhuǎn)染的NG63細胞培養(yǎng)物，用pB2-499和pRSVER共轉(zhuǎn)染其中的一份培養(yǎng)物，另一份培養(yǎng)物用pB2-499和pRSV載體質(zhì)粒(對照)共轉(zhuǎn)染。然后，基本如實施例Ⅴ所述測定了下列化合物通過TGFβ-3基因的雷洛昔芬反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄的能力(a)乙醇;
(b)17β-雌二醇(10-7M);
(c)雷洛昔芬(2×10-6M);
(d)17β-雌二醇(10-7M)和雷洛昔芬(2×10-6M)一個上述實驗的結(jié)果列于下表中，而薄層色譜所產(chǎn)生的代表性實例如圖6所示。
上述結(jié)果清楚地表明，ER的表達對于應答雌激素、抗雌激素及其結(jié)合，TGFβ-3基因啟動子介導的報道基因表達的誘導作用是需要的。
B.分析誘導TGFβ-3啟動子所需的ER蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)現(xiàn)有技術已經(jīng)公開ER蛋白質(zhì)中稱為“E”的區(qū)域為結(jié)合雌激素所必需，而“C”區(qū)為結(jié)合DNA所需(參見kumar et al.，EMBO J.9，2231-2236，1986)。同樣也很清楚地知道，“C”區(qū)為含ERE基因的ER激活所需，而“E”區(qū)為雌激素依賴的誘導性所需。
為了確定ER中涉及誘導TGFβ-3啟動子轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，如實施例Ⅳ所述制備用于共轉(zhuǎn)染的MG63細胞培養(yǎng)物。用pTGFβ-301LUC和下列含有各種ER缺失突變體的表達質(zhì)粒之一的混合物轉(zhuǎn)染細胞a.pCMV-ER
b.pCMV-ER△A/Bc.pCMV-ER△B/C/Dd.pCMV-ER△E/Fe.pCMV-ER1-530f.pCMV-ERL540Q參見Reese & Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887，1990，圖7中進一步說明了這些質(zhì)粒中各缺失的范圍。
用載體(10μl乙醇)或10-7M雷洛昔芬處理其轉(zhuǎn)染的細胞，以檢測上述突變ER介導雷洛昔芬誘導的TGFβ-3激活的能力。雷洛昔芬誘導的熒光素酶活性在基礎活性值上的增加被計算為在如圖7所示的各種突變ER形式存在下由雷洛昔芬產(chǎn)生的倍數(shù)誘導作用。
一個上述實驗的結(jié)果示于下表中 上述結(jié)果表明，激素結(jié)合區(qū)(“即雌激素受體分子的“E”區(qū))是必需的，并足以介導雷洛昔芬刺激的、本發(fā)明報道質(zhì)粒中報道基因的TGFβ-3啟動子介導的轉(zhuǎn)錄。ER分子的“C”區(qū)似乎不為上述過程所需。這一結(jié)果進一步支持了ER的激活基因轉(zhuǎn)錄新機制可牽涉TGFβ啟動子轉(zhuǎn)錄的觀點。
實施例Ⅷ雌激素和抗雌激素對TGFβ-3啟動子的激活已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素和抗雌激素化合物對TGFβ啟動子介導的基因表達的轉(zhuǎn)錄激活作用是濃度依賴性。如實施例Ⅴ所述用pB-301和pRSVER瞬時地共轉(zhuǎn)染MG63細胞培養(yǎng)物。這類轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物被分成四組，每組十二份，四組培養(yǎng)物中的每一組都用于檢測一種雌激素或抗雌激素化合物分別誘導TGFβ-3啟動子轉(zhuǎn)錄的能力。對于每一組的十二份培養(yǎng)物而言，在有從10-9M-10-5M的六種濃度以10倍增加的特定雌激素或抗雌激素存在的復制培養(yǎng)物以及僅用載體處理的，套復制培養(yǎng)物(每個實驗性處理共十二份培養(yǎng)物)中進行檢測。如上所述，將激素溶解于乙醇中并用于培養(yǎng)物，所測試的四種雌激素和抗雌激素如下a.17β-雌二醇(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO);
b.雷洛昔芬(Eli Lilly，Indianapolis，IN);
c.三苯氧胺(Sigma)d.ICI 164，384(描述于1988年7月20日發(fā)行的歐洲專利EP138504中)。
在用激素處理(或?qū)φ?24小時后，如實施例Ⅴ所述洗滌、收集、裂解細胞，并檢測CAT活性。一個上述實驗的結(jié)果列表顯示如下，并示于圖8中。
盡管所有的雌激素和抗雌激素都影響TGFβ-3啟動子的活性，但每種化合物均顯示出其各自獨特的劑量-反應曲線。雷洛昔芬是迄今最有效的激活劑，對報道基因的轉(zhuǎn)錄有超過20倍的誘導作用，并且其ED50在納摩爾濃度水平。與此相反，雌二醇僅表現(xiàn)出對報道基因表達4倍的誘導作用，其ED50比雷洛昔芬的高出二個數(shù)量級。三苯氧胺只在高濃度(即大于微摩爾)時激活TGFβ-3啟動子。ICI 164，384的ED50為10-7M，但該化合物在高濃度(10-5M)時似乎只有很小的活性。這些結(jié)果表明在TGFβ-3基因的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了稱為雷洛昔芬反應性元件(RRE)的新元件。該元件在雌激素和抗雌激素兩者存在下誘導轉(zhuǎn)錄，并且上述化合物中的每一種都有一個轉(zhuǎn)錄激活的特征性劑量-反應圖。
實施例Ⅸ雷洛昔芬在CHO和MCF-7細胞中介導的TGFβ-3啟動子的轉(zhuǎn)錄激活已在各種細胞系中證明雷洛昔芬誘導TGFβ-3啟動子轉(zhuǎn)錄的能力不同于雌激素介導的誘導作用。
A.在CHO細胞中TGFβ-3的激活作用如實施例Ⅳ所述用pB-301和pRSVER瞬時地共轉(zhuǎn)染CHO細胞培養(yǎng)物，并用于測定雷洛昔芬和雌二醇通過雷洛昔芬反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄的能力。在同樣的實驗中用10-9M-10-5M10倍遞增的六種濃度的雌二醇或雷洛昔芬處理十二份瞬間轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物(以及只用載體作對照的十二分培養(yǎng)物)。如上所述，將激素溶于乙醇中，并用于培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。
與激素制備物(或?qū)φ瘴?一起保溫24小時后，如實施例Ⅴ所述洗滌、收集、裂解細胞，并檢測CAT活性。其結(jié)果列表顯示如下，并如圖9所示。
這些結(jié)果表明，當在CHO細胞中進行檢測時，先前觀察到的TGFβ-3啟動子對雌激素和雷洛昔芬的反應性依然存在。
B.TGFβ-3在MCF-7細胞中的激活如實施例Ⅳ所述用pTGFβ-301LUC瞬時地轉(zhuǎn)染MCF-7細胞的培養(yǎng)物。這些培養(yǎng)用于檢測雷洛昔芬和雌二醇在這一細胞類型中誘導轉(zhuǎn)錄的能力。用0M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M和10-5M六種濃度之一的雌二醇或雷洛昔芬處理培養(yǎng)物。如前所述將激素溶解于乙醇中，并用于培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。
用激素制備物(或載體對照)處理24小時后，按照實施例Ⅵ的方法洗滌、收集、裂解細胞，并測定LUC活性。該實驗的結(jié)果列表顯示如下，而這類系列實驗的結(jié)果總結(jié)于圖10中。
(熒光素酶活性以成千的單位表示)在人子宮內(nèi)膜癌細胞(RL59.2)、人宮頸癌細胞(Hela)和猴腎細胞(COS-1)(ATCC，Rockville，MD)中進行類似的實驗。發(fā)現(xiàn)在雌激素和雷洛昔芬所有測試的細胞類型中誘導由TGFβ-3啟動子開始的轉(zhuǎn)錄(在誘導作用的大小上不同)。這些結(jié)果表明雌激素和雷洛昔芬介導的對從TGFβ-3啟動子開始的報道基因轉(zhuǎn)錄的誘導作用并不限于特定的細胞類型中。然而，在不同細胞中表現(xiàn)出的不同誘導水平可能說明在這些細胞中涉及調(diào)節(jié)作用的其它因子的充分性。用熒光素酶和CAT作為報道基因所發(fā)現(xiàn)的TGFβ-3啟動子對雷洛昔芬和雌激素具有反應性的事實表明，該調(diào)節(jié)作用是從TGFβ-3啟動子開始的基因表達的共同特征。
實施例Ⅹ用雷洛昔芬及相關化合物比較性誘導由TGFβ-3啟動子開始的報道基因的表達現(xiàn)有技術已知抗雌激素化合物能夠以劑量依賴性方式誘導TGFβ基因的表達[Knabbe等人，Am.J.Clin.Onc.，14(Suppl.2)，S15-S20(1991)]。而且，如上述實施例Ⅷ所示，已發(fā)現(xiàn)雷洛昔芬和三苯氧胺能夠以劑量依賴性方式誘導TGFβ-3基因的表達。
為了使化合物通過TGFβ-3啟動子的雷洛昔芬反應性元件產(chǎn)生的誘導轉(zhuǎn)錄的能力與其已知的在切除卵巢的大鼠中所證實的親子宮能力相關聯(lián)，進行了本實施例中所述的多個實驗。測試了七種在結(jié)構(gòu)上與雷洛昔芬相關的化合物通過TGFβ-3啟動子的雷洛昔芬反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄的能力?？梢杂善鋸挠H子宮性(LY112676、LY81099和LY13314)至抗親子宮性(LY113526、LY139482和LY177366)的體內(nèi)活性譜來分辨所說的化合物，還包括一種已知在體內(nèi)呈惰性的化合物(LY98005)。
上述化合物的IUPAC名稱和權利要求中要求了上述化合物的美國專利如下

上述化合物描述在圖11中。
測定雷洛昔芬、LY81099、LY98005、LY112676、LY113526、LY13314、LY139482和LY177366(Eli Lilly and Company，Indianapolis，Indiana)，比較其在不同濃度時誘導始自TGFβ-3基因啟動子的轉(zhuǎn)錄的能力。用0M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M和10-5M的上述化合物如實施例Ⅵ所述處理經(jīng)pB-301和pRSVER瞬時共轉(zhuǎn)染的MG63細胞培養(yǎng)物。實驗結(jié)果以下列表格形式表明，并描述于圖12中。
顯示出體內(nèi)親子宮特性的化合物(即雌激素類化合物)的ED50值大約為10-7M，并且對始自TGFβ-3啟動子的報道基因表達具有相對較低的倍數(shù)誘導作用，這非常類似于雌激素在實施例Ⅷ中所反映出的情形。與之相反，類似于雷洛昔芬的體內(nèi)作用情況的化合物表明ED50值為10-9M和比雌激素性化合物相對大的倍數(shù)誘導作用。有關雷洛昔芬的體內(nèi)數(shù)據(jù)已在1992年7月28日申請的美國專利申請(申請?zhí)枮?7/920，933)中給出，該文獻并入本文作為參考?？傊?，產(chǎn)生雌激素樣體內(nèi)特性的化合物比產(chǎn)生抗雌激素樣體內(nèi)特性的化合物表現(xiàn)出明顯小的通過TGFβ-3啟動子的轉(zhuǎn)錄誘導作用。
這些實驗結(jié)果證明了本文所述的含報道基因表達質(zhì)粒作為鑒定潛在抗骨質(zhì)疏松藥物的篩選技術的應用，因為那些具有雷洛昔芬樣誘導作用情形和ED50的化合物比在該測定中具有較低誘導作用情形和較高ED50的雌激素樣化合物顯示出相對更低的親子宮作用。
實施例Ⅺ雷洛昔芬反應性元件定位于TGFβ-3啟動子中的+35至+75區(qū)至少人TGFβ-3基因啟動子中的一部分雷洛昔芬反應性元件大概定位地+35至+75位的特定41個核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)該序列對于介導雷洛昔芬誘導的上述TGFβ報道基因表達構(gòu)建體中報道基因表達的轉(zhuǎn)錄激活作用所必需的。
A.通過對體外制備的TGFβ-3啟動子缺失突變體進行功能性分析來鑒定雷洛昔芬反應性元件如實施例Ⅰ所述，制備用pCMVER和多種TGFβ-3啟動子缺失報道構(gòu)建體之一(包括pB-499、pB-301、pB-221、pB-91、pB-60、pB-47、pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC、pTGFβ+35LUC和pLUC)瞬時共轉(zhuǎn)染MG63細胞培養(yǎng)物。然后用乙醇(作為對照)或10-6M雷洛昔芬處理上述培養(yǎng)物，計算每一TGFβ-3啟動子缺失構(gòu)建體用雷洛昔芬處理后誘導報道基因表達的程度相對于單用載體處理所得到的誘導程度，列表顯示如下，并描繪于圖13中
這些結(jié)果將至少一部分雷洛昔芬反應性元件定位于TGFβ-3啟動子序列的+35至+75位。
B.雷洛昔芬反應性元件的核苷酸序列TGFβ-3啟動子從-38至+110位的核苷酸序列描繪在圖14中。以上發(fā)現(xiàn)的雷洛昔芬序列是圖中以略圖形式描繪的序列?？招募^表示主要的轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)。兩個黑箭頭表示兩個小的轉(zhuǎn)錄起始位點?！癟ATA”序列示以明框。推定的CCCTC基序用推定的雷洛昔芬反應性元件序列下一系列的水平箭頭表示。參見Lobanenkov et al，Omogene，5，1743-1753，1990。
由對TGFβ-3的分析可得出兩個結(jié)論。其一，在TGFβ-3啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)沒有與ERE同源的回文序列。這個發(fā)現(xiàn)與在實施例Ⅶ中所表明的不需要ER的DNA結(jié)合活性的結(jié)果相一致。其二，ER介導的TGFβ-3的雷洛昔芬激活很可能需要能夠結(jié)合至雷洛昔芬反應性元件上的其它因子。一個很好的這類蛋白質(zhì)的候選物是由Lobanenkov等人鑒定的，涉及c-myc基因調(diào)節(jié)的CTCF因子。這些結(jié)果使得可以鑒別作為在其啟動子中具有雷洛昔芬反應性元件的潛在雷洛昔芬可調(diào)基因的其它基因。而且，這類基因可用于鑒別具有用于實施例ⅩⅢ所述篩選程序中的雷洛昔芬反應性元件活性的遺傳元件。
本發(fā)明的雷洛昔芬反應性元件用于檢索GenBank序列庫。在該元件及下列基因的元件間發(fā)現(xiàn)了顯著的同源性GenBank/EMBL 數(shù)據(jù)庫入藏登記號 基因X56595 雞Ⅵ型膠原蛋白_-2X55373 人ETS-2啟動子區(qū)M30137 人ETS-2(5′側(cè)翼)D10231 小鼠葡萄糖運輸因子(增強子2)M12731 小鼠N-myc原癌基因M13945 小鼠pim-1原癌基因S63281 R.norvegicus N-myc基因X16995 小鼠N10基因M94152 大鼠腺苷受體M20131 大鼠細胞色素p450ⅡE1M34111 大鼠PTHrPJ05097 大鼠P物質(zhì)受體M64236 大鼠P物質(zhì)受體上述結(jié)果支持該元件作為一個能在各種組織和細胞類型中介導體內(nèi)多向性生理作用的分離的和重要的調(diào)節(jié)單位存在。
實施例Ⅻ雌激素和雷洛昔芬誘導LDL受體啟動子激活LDL受體表達在調(diào)節(jié)血清LDL-膽固醇攝入過程中起重要作用。已知雌激素在體內(nèi)誘導LDL受體的信使RNA(Ma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，792-796，1986)。如本實施例所示，ER介導雌激素對LDL受體啟動子序列的激活作用。雷洛昔芬也誘導LDL受體啟動子，但這種誘導作用是ER非依賴性的。
A.雌激素和抗雌激素在ER存在下誘導LDLR-LUC產(chǎn)生如實施例Ⅳ所述，用pLDLRLUC10和pRSVER共轉(zhuǎn)染ATCC HepG2細胞株。在實施例Ⅵ所述條件下將上述細胞與雌二醇和雷洛昔芬接觸。其結(jié)果制表顯示如下，系列實驗的結(jié)果描繪于圖15中。
B.沒有ER時雌激素和抗雌激素誘導的LDLR-LUC的產(chǎn)生如實施例Ⅳ所述，用pLDLRLUC10和pRSV載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ATCCH2pG2細胞株。在實施例Ⅵ所述條件下將上述細胞與雌二醇和雷洛昔芬接觸。其結(jié)果制表顯示如下，有代表性的系列實施結(jié)果示于圖16中。

上述結(jié)果表示雷洛昔芬和雌激素兩者都具有誘導LDL受體表達的能力。該結(jié)果提供了一種用雌激素和雷洛昔芬在動物模型中和人體中降低血脂的解釋。
實施例ⅩⅢ篩選潛在抗骨質(zhì)疏松藥物的方法在上述實施例的基礎上設計了用熒光素酶作為報道基因的測定法以篩選潛在的抗骨質(zhì)疏松的藥物。
利用實施例Ⅳ中所述方法用pTGFβ-301LUC、pGL2LUC或pGL2ERELUC穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染MCF-7細胞培養(yǎng)物。然后將細胞用于圖17所描述的有創(chuàng)造性的方法中。
步驟1.用于篩選測定中的第一步是確定化合物誘導自TGFβ-3啟動子開始轉(zhuǎn)錄的能力用經(jīng)pTGFβ-301LUC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞、基本按實施例Ⅸ所述方法進行測定。細胞培養(yǎng)和測定條件要適合96孔微量滴定板形式。以產(chǎn)生大約50%融合的密度接種細胞至96孔板中。測試化合物選自各種來源，包括藥物研究記錄、化學生產(chǎn)商的產(chǎn)品目錄以及天然存在的來源，如發(fā)酵提取物。在含有測試化合物的生長培養(yǎng)基(如實施例Ⅳ所述)中培養(yǎng)細胞約24小時。然后在板中原位裂解細胞，裂解物進行定量蛋白測定和熒光素酶活性測定。誘導熒光素酶活性增加2倍以上的化合物被認為能夠用于進一步的試驗中。
步驟2.用如步驟1所述鑒定的化合物對已用pGL2LUC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物進行測定，以確定這類化合物是普通的轉(zhuǎn)錄誘導劑。當這類普通的轉(zhuǎn)錄誘導劑缺乏作為雷洛昔芬反應性元件依賴性基因表達的調(diào)節(jié)子的潛在抗骨質(zhì)疏松藥物所需的轉(zhuǎn)錄誘導特異性時，這類普通的誘導劑被排除于進一步的試驗之外。
步驟3.具有作為潛在抗骨質(zhì)疏松所需轉(zhuǎn)錄誘導特異性(即能在pTGFβ-301LUC細胞中誘導轉(zhuǎn)錄誘導作用而不在用pGL2LUC轉(zhuǎn)染的細胞中誘導轉(zhuǎn)錄)的化合物是雷洛昔芬反應性元件依賴性基因表達的調(diào)節(jié)子，對其進行測定以明確這類化合物是否誘導始自雌激素反應性元件的轉(zhuǎn)錄。如實施例Ⅵ所述，在存在和缺乏雌二醇的情況下測定用pGL2ERELUC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。在缺乏雌激素的情況下能激活pGL2ERELUC的化合物不具備進一步測試的資格，因為這些化合物在缺乏雌激素的情況下能夠誘導始自雌激素反應性元件的轉(zhuǎn)錄表明了在體內(nèi)具有潛在的雌激素性活性。
步驟4.進一步測試完全符合步驟1-3標準的化合物，以確定這類化合物是抗雌激素類的，或是非雌激素類/非抗雌激素類的。為此，在雌二醇存在的情況下在用pGL2ERELUC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中測試化合物。在該測定中所產(chǎn)生的對雌激素誘導的熒光素酶活性的抑制作用表明這類化合物具有抗雌激素性活性?？勾萍に匦院头谴萍に匦曰衔飳⒂善鋭┝?反應方式和ED50值來描述特征。可以進行進一步的實驗以確定這類化合物的劑量-反應類型，并將其與已知的抗雌激素(如雷洛昔芬)進行比較。參見實施例Ⅹ。
根據(jù)上述篩選方案，可以應用常規(guī)測定法，尤其是涉及適宜動物模型系統(tǒng)的體內(nèi)測定法進一步描述如本文所述鑒定的化合物的抗雌激素性特征。由本測定法鑒定的化合物可有利地和迅速地實現(xiàn)對具有所需抗骨質(zhì)疏松特性的抗雌激素類化合物的開發(fā)。
實施例ⅩⅣ體外和體內(nèi)活性間的相互關系進行下面的實驗以確定體外測定和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松體內(nèi)模型間的相互關系。體外測定檢測測試化合物通過TGFβ-3啟動子的雷洛昔芬反應性元件誘導轉(zhuǎn)錄的能力。體內(nèi)模型檢測除去卵巢的大鼠中骨(股骨)質(zhì)密度的改變。下面的化合物將用于這些實驗中。
如US4，133，814(1979年1月9日出版)所述制備上述化合物，該文獻并入本文作為參考。
測定雷洛昔芬、088074、156678、171147和309503(Eli Lilly and Company)，以確定在小于10nM的濃度下[即最小有效濃度(MEC)＜10nM]對始自TGFβ-3基因啟動子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生2倍誘導作用的能力(如由熒光素酶活性所測)。轉(zhuǎn)染前一天，用0.05%胰蛋白酶/5.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)四鈉的溶液處理Hela細胞，產(chǎn)生單個細胞懸液。計數(shù)拆開的融合細胞，并稀釋至1×106細胞/ml的濃度。將3×106細胞和3∶1培養(yǎng)基加至t-150燒瓶中，培養(yǎng)過夜。第二天，從細胞中除去培養(yǎng)基，代之以新鮮培養(yǎng)基(25ml)。利用ProFection哺乳動物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Promega)用pTGFβ-301LUC(10μg)、pCMVER(1μg)和pRSVβgal(1μg)瞬時共轉(zhuǎn)染細胞。將pTGFβ-301LUC(940μg)、pCMVER(94μg)和pRSVβgal(94μg)Cacl2(5.704ml)和無核酸酶的水(47ml)與2XHEPES(47ml)混合，同時搖晃，制得轉(zhuǎn)染液。所得溶液于室溫保溫30分鐘。將該轉(zhuǎn)染液(3ml)加至各燒瓶中。
細胞與轉(zhuǎn)染液保溫過夜后，去除培養(yǎng)基，用無Ca/Mg的磷酸鹽緩沖液(10ml，GIBCO)洗每個燒瓶。洗過的細胞用胰蛋白酶處理以分散細胞。用新鮮培養(yǎng)基3ml處理分散的細胞。經(jīng)離心和除去培養(yǎng)基及胰蛋白酶制得細胞團丸。將細胞重懸于大約20ml培養(yǎng)基中計數(shù)。稀釋細胞至濃度為5×105細胞/ml。然后，5×104細胞(100μl)加至96孔板的各孔中，細胞培養(yǎng)過夜。
將測試化合物溶解于二甲亞砜，并初步稀釋到1∶1000。該稀釋過程的完成是通過將2μl藥物溶液加至深孔微量滴定板的1000μl培養(yǎng)基中(1∶500稀釋)，然后再將100μl稀釋的藥物溶液加入板中已有的100μl培養(yǎng)基中(1∶2稀釋)。對于每一種化合物篩選，如前所述將化合物稀釋1∶1000，再進一步稀釋1∶100。此外，用8個稀釋度的劑量-反應曲線測定最低有效濃度?；衔锱c細胞在96孔板中保溫過夜。
從細胞中除去培養(yǎng)基，用無Ca/Mg的磷酸鹽緩沖液(200μl)洗各孔。去掉鹽溶液，用60μl裂解液(100mM KPO4、0.2% Triton X-100，1mM DTT pH7.8)裂解細胞。所得溶液用于測定熒光素酶或β-半乳糖苷酶活性。熒光素酶活性測定基本如實施例Ⅵ所述，除了熒光素溶液含有100mg熒光素、9ml 1M N-甘氨酰甘氨酸、36ml 40mM EGTA、720ml 1M DTT、5.4ml 1M MgSO4和310ml水外。這些實驗的結(jié)果制成表Ⅻ顯示
a.“+”表示測試化合物對標準化的熒光素酶活性產(chǎn)生2倍的誘導作用，ED50＜10mMb.“+”表示骨質(zhì)密度經(jīng)統(tǒng)計學處理高于去除卵巢的動物還測試了上述化合物維持切除卵巢大鼠中骨質(zhì)密度的能力。75天齡雌性Sprague Dawley大鼠(重量范圍225-275g)得自Charles River Laboratories(Portage，MI)。將其分成3組飼養(yǎng)，并可隨意取食(鈣含量大約1%)和水。室溫維持在22.2℃±1.7℃，最小相對濕度為40%。室內(nèi)光周期為12小時明亮12小時黑暗。
得到大鼠一周后，在麻醉下[44mg/kg克他命和5mg/kg甲苯噻嗪(Butler，Indianapolis，IN)肌內(nèi)給藥]對大鼠進行雙側(cè)卵巢切除術。術后當天動物清醒之后開始用載體或測試化合物進行處理。溶于0.5ml 1%羧甲基纖維素(CMC)中的口服劑量經(jīng)管飼法施用。手術時及其后的每周稱重，以根據(jù)改變的體重調(diào)整劑量。平行于作為陰性和陽性對照的各實驗組評價施用載體或被處理且行卵巢切除術(ovex)大量及未行卵巢切除(完整的)大鼠。
每天對大鼠進行處理，歷時35天(6只大鼠/治療組)，第36天用斷頭術將其處死。35天的時間周期足以使得骨密度最大程度降低(如本文所測)。切除右側(cè)股骨，在距髕骨溝1mm的遠側(cè)干骺端用單光子吸光測定法進行掃描。光密度計檢測的結(jié)果表示了作為骨質(zhì)含量指標的骨密度和髖度的計算值。一般說來，行卵巢切除術的大鼠與完整的載體處理對照相比其股骨密度降低約25%這些實驗結(jié)果示于表Ⅻ。
這些實驗結(jié)果表明，能有效誘導始自TGFβ-3基因啟動子區(qū)的雷洛昔芬反應性元件轉(zhuǎn)錄的化合物(如雷洛昔芬、156678和171147)也表現(xiàn)出能在行卵巢切除術的大鼠中保持骨密度。
不能誘導雷洛昔芬反應性元件轉(zhuǎn)錄的化合物(如088074和309503)也不能對行卵巢切除術動物的骨質(zhì)密度的喪失表現(xiàn)出統(tǒng)計學意義上的顯著保護作用。
應該理解，前面公開的內(nèi)容著重于本發(fā)明的某些具體實施方案，對其作出的所有改良或等價改變都落入如所附權利要求所述的本發(fā)明精神或范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Yang，Na N(ⅱ)發(fā)明題目篩選抗骨質(zhì)疏松藥物的材料和方法(ⅲ)序列數(shù)目9(ⅳ)通訊地址(A)收信人Eli Lilly and Company(B)街道Lilly Corporate Center(C)城市Indianapolis(D)州IN(E)國家U.S.A(F)郵政編碼46285(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Diskette-3.50英寸，1.44 Mb儲存(B)計算機IBM兼容(C)操作系統(tǒng)MS-DOS
(D)軟件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)目前的申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日(C)分類號(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/081，610(B)申請日June 21，1993(C)分類號435(ⅷ)代理人/代理資料(A)姓名Leeds，James P.
(B)注冊號35，241(C)案卷號X-9088A(ⅸ)電訊資料(A)電話317-276-1667(B)電傳317-277-1917(2)SEQ ID NO∶1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2205堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征
(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置1..2(D)其它資料/注＝“序號1相當于TGFβ-1啟動子的-1362”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置1363..1365(D)其它資料/注＝“相當于TGFβ-1到+1密碼子”(xi)序列描述SEQ ID NO∶1
(2)SEQ ID NO∶2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度5578堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞TATA_信號(B)位置2248..2252(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位置2278..3980(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞內(nèi)含子(B)位置3981..5578(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置3635..3980(D)其它資料/注＝“CDS，起始密碼子＝1”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置1..2(D)其它資料/注＝“序號1相當于TGFβ-2，-2277”(xi)序列描述SEQ ID NO∶2



(2)SEQ ID NO∶3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度3303堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞mRNA
(B)位置2170..3303(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞mRNA(B)位置2214..3303(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞mRNA(B)位置2219..3303(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_RNA(B)位置3301..3303(D)其它資料/注＝“CDS開始，起始密碼子＝1，轉(zhuǎn)譯M”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞TATA_信號(B)位置2170..2176(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置1896..2306(D)其它資料/注＝“pB-301 -301～+110”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置1976..2306(D)其它資料/注＝“pB-221 -221～+110”(ⅸ)特征
(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置2106..2306(D)其它資料/注＝“pB-91 -91～+110”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置2137..2306(D)其它資料/注＝“pB-60 -60～+110”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置2150..2306(D)其它資料/注＝“pB-47 -47～+110”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置2159..2306(D)其它資料/注＝“pB-38 -38～+110”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置2159..2271(D)其它資料/注＝“TGFβ-3位置-38到+75”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞misc_特征(B)位置2159..2231(D)其它資料/注＝“TGFβ-3位置-38到+35”(xi)序列描述SEQ ID NO∶3


AGCCTCAGTC TTTGGGATCT GGGGAGGCCG CCTGGTTTTC CTCCCTCCTTCTGCACGTCT 3240GCTGGGGTCT CTTCCTCTCC AGGCCTTGCC GTCCCCCTGG CCTCTCTTCCCAGCTCACAC 3300ATG 3303(2)SEQ ID NO∶4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度42堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶4GCGCCATATG AGTCTTAACT GCCAAAATT CTTATCATCA AT 42(2)SEQ ID NO∶5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度44堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶5AAGCAAGCTT TCGCAGCCTC TGCCAGGCAG TGTCCCGACC CGGA 44(2)SEQ ID NO∶6的資料
(ⅰ)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶6AGCTTCGCGA CTCGAGA 17(2)SEQ ID NO∶7資料(ⅰ)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶7GATCTCTCCA GTCGCGA 17(2)SEQ ID NO∶8資料(ⅰ)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO∶8TCGAGAAAAG TCAGGTCACA GTGACCTGAT CAAAC 35(2)SEQ ID NO∶9資料(ⅰ)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶9TCGAGTTTGA TCAGGTCACT GTGACCTGAC TTTTC 3權利要求
1.一種含有從TGFβ基因啟動予區(qū)分離的雷洛昔芬反應性元件的核酸，其中的人TGFβ基因是TGFβ-2或TGFβ-3。
2.根據(jù)權利要求1的核酸，其中核酸的核苷酸序列含有選自下列序列的序列相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的1896到2306的序列，相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的1976到2306的序列，相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2106到2306的序列，相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2137到2306的序列，相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2150到2306的序列，相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2306的序列，相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2271的序列;和相當于圖3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2231的序列。
3.一種含有根據(jù)權利要求1或權利要求2的核酸和報道基因的重組表達構(gòu)建體。
4.一種用根據(jù)權利要求3的重組表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的真核細胞。
5.一種篩選多種化合物以鑒別具有作為抗骨質(zhì)疏松藥物能力的化合物的方法，該方法包括識別多種化合物中的某一化合物，它能夠誘導從哺乳動物啟動子的雷洛昔芬反應性元件開始的轉(zhuǎn)錄，它是一種非特異性轉(zhuǎn)錄誘導劑，但不能誘導哺乳動物啟動子的雌激素反應性元件的轉(zhuǎn)錄，并且它是一種抗雌激素或非雌激素化合物，該方法包括下列步驟(a)檢測該化合物誘導哺乳動物啟動子的雷洛昔芬反應性元件轉(zhuǎn)錄的能力;(b)檢測該化合物不能從誘導不含雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子轉(zhuǎn)錄的能力;(c)檢測該化合物不能誘導雌激素反應性啟動子轉(zhuǎn)錄的能力;和(d)在存在雌激素的情況下檢測該化合物抑制雌激素誘導的雌激素反應性啟動子轉(zhuǎn)錄的能力。
6.一種化合物(a)能夠誘導TGFβ-3基因啟動子區(qū)的雷洛昔芬反應性元件的轉(zhuǎn)錄;(b)不能誘導沒有雷洛昔芬反應性元件的哺乳動物啟動子轉(zhuǎn)錄;(c)不能誘導雌激素反應性啟動子轉(zhuǎn)錄;和(d)在存在雌激素的情況下，能抑制雌激素誘導的雌激素反應性啟動子的轉(zhuǎn)錄;條件是該化合物不是下式的化合物或其可藥用的鹽 其中n是0、1或2R和R1分別是氫、羥基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-酰氧基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-酰氧基、R3取代的芳氧基、R3取代的芳酰氧基、R4取代的羰氧基、氯或溴;R2是選自吡咯烷基、哌啶子基或六亞甲基亞氨基的雜環(huán);R3是C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、氫或鹵素;和R4是C1-C6-烷氧基或芳氧基。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒別治療骨質(zhì)疏松治療藥物和降低血脂藥物的方法。本發(fā)明也涉及分離、克隆并使用來自含有稱為“雷洛昔芬反應性元件”的新調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)化生長因子β基因啟動子區(qū)的核酸。本發(fā)明還包括含有與報道基因可操作相連的雷洛昔芬反應性元件，以便雷洛昔芬反應性元件調(diào)節(jié)報道基因轉(zhuǎn)錄的真核細胞。本發(fā)明還提供鑒別抗骨質(zhì)疏松藥物的方法，所述藥物誘導與所述雷洛昔芬反應性元件可操作相連的基因的轉(zhuǎn)錄，而不會引起與目前抗骨質(zhì)疏松治療方式相關的有害或令人討厭的副作用。
文檔編號C07K14/46GK1102437SQ9410671
公開日1995年5月10日 申請日期1994年6月20日 優(yōu)先權日1993年6月21日
發(fā)明者N·N·楊 申請人:伊萊利利公司