通過(guò)組裝多個(gè)肽片段來(lái)制備肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于制備n個(gè)片段和n4個(gè)具有硫醇官能團(tuán)之氨基酸的肽組裝物的方法，所述肽組裝物由式(I)表示:A1-C1-A2-A3-...-Ci-1-Ai-...-Cn-1-An，其中A1、A2、A3...Ai...An是肽片段，C1、C2、C3...Ci-1Cn-1是具有硫醇官能團(tuán)的氨基酸殘基，n為3至50，i為2至n，所述方法包括通過(guò)硫醇R-SH在環(huán)二硫化物還原劑的存在下由雙(2-硫乙基)氨基肽A1-SEAoff，其中SEAoff是環(huán)雙(2-硫乙基)氨基基團(tuán)來(lái)制備式A1SR(II)的肽硫酯，其中A1是肽片段，SR是烷基化的硫酯的殘基，R是任選取代的烷基，隨后在芳香族硫醇ArSH的存在下與具有結(jié)構(gòu)H-C1(SR')-A2-SEAoff(III)的肽片段縮合，其中(SR')是氨基酸C1的硫醇上的二硫化物殘基，然后通過(guò)硫醇R-SH在環(huán)二硫化物還原劑存在下使所得具有結(jié)構(gòu)A1-C1-A2-SEAoff(IV)的新的肽轉(zhuǎn)化為式A1-C1-A2-SR(II')的肽-硫酯，在芳香族硫醇ArSH的存在下其與結(jié)構(gòu)為H-C2(SR’)-A3-SEAoff(III’)的肽片段縮合，這產(chǎn)生了具有結(jié)構(gòu)A1-C1-A2-C2-A3-SEAoff(IV)的肽片段，重復(fù)所述兩個(gè)步驟多至n-2次從而獲得具有結(jié)構(gòu)A1-C1-A2-C2-A3-...-Ci-1-Ai-...-Cn-2-An-1-SEAoff(IVm)的肽片段，然后在環(huán)二硫化物還原劑的存在下通過(guò)還原使用所得肽片段(IVm)與式H-Cn-1-An(Vn)的肽的天然連接反應(yīng)，產(chǎn)生通式(I)的多個(gè)肽的組裝物。
【專利說(shuō)明】通過(guò)組裝多個(gè)肽片段來(lái)制備肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過(guò)使用多肽的天然連接來(lái)組裝多個(gè)肽片段從而制備肽或多肽的方法。本發(fā)明還涉及該方法中使用的中間體的制備和通過(guò)所述方法制備的所述中間體。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)合成的多肽較大時(shí)，通過(guò)常規(guī)的固相法(氨基酸接著氨基酸)合成多肽受到低產(chǎn)率的限制。為了克服該限制，已知通過(guò)化學(xué)連接組裝兩個(gè)多肽從而產(chǎn)生更長(zhǎng)的多肽。
[0003]多肽的全合成對(duì)于制備具有良好定義之結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)越來(lái)越有用。化學(xué)連接方法為該需求提供了響應(yīng)，但是它們被證明在其使用及其工業(yè)應(yīng)用方面是受限的。
[0004]一般來(lái)說(shuō)，在這些方法中，期望通過(guò)連接而組裝的多肽之間的鍵是天然的，即，與多肽的天然結(jié)構(gòu)一致。
[0005]目前存在的主要的天然連接方法是例如在Kent和Dawson，國(guó)際申請(qǐng)W096/34878和W098/28434中描述的方法。該方法基于(C-端)的硫酯肽和半胱氨?；闹g的化學(xué)選擇性反應(yīng)。然而，該方法的主要缺點(diǎn)是需要復(fù)雜的化學(xué)方法生產(chǎn)硫酯肽。特別是，根據(jù)由
S.Kent描述的組裝方法(動(dòng)力學(xué)可控連接(Kinetically Controled Ligation, KCL)),合成A-SAr、H-Cys-B-SAlk和H-Cys-C片段是必需的。但是，難以產(chǎn)生A-SAr類型片段且被證明其易于水解。此外，該方法不能使超過(guò)3個(gè)片段的組裝成為可能。
[0006]一種替代方法是所謂的Staudinger連接，其描述于國(guó)際申請(qǐng)WOO1/68565和W001/87920中。這包括膦基硫酯(phos`phinothioester)與疊氮化物反應(yīng)并水解組合的試劑以形成酰胺鍵。但是，該方法難以應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模。
[0007]在國(guó)際申請(qǐng)W02007/037812中描述的另一種方法基于α-酮酸與烷氧基胺的脫羧縮合反應(yīng)。但是，酮酸是難以產(chǎn)生且難以并入肽中的分子。第三個(gè)方法也難以適用于無(wú)法進(jìn)行復(fù)雜有機(jī)合成的肽合成實(shí)驗(yàn)室。
[0008]D.Bang, B.L.Pentelute 和 S.B.H.Kent 的出版物 Angew.Chem.1nt.Ed.2006,45,3985-3988提出涉及肽_(硫代苯基酯)與Cys-肽-硫酯的合成路徑，ff.Hou等的出版物OrgLett.，(2010)，2010年12月22日，提出用于合成蛋白質(zhì)的肽-硫酯的形成。但是這些方法無(wú)法阻止不同的硫酯反應(yīng)之間的競(jìng)爭(zhēng)，不可避免地導(dǎo)致可能難于分離的混合物，因此影響所得終產(chǎn)物的純度，并且不可避免地?fù)p失產(chǎn)率。
[0009]最后，0.Melnyk等的出版物 Org.Lett.，！^(22)，5238-41 (2010)描述了通過(guò)肽-雙(硫乙基)氨基片段的肽的天然連接。但是該方法迄今為止仍沒(méi)有用于合成含有多個(gè)片段的多肽。
[0010]使得通過(guò)全合成實(shí)現(xiàn)肽合成成為可能的方法向工業(yè)規(guī)模的轉(zhuǎn)化是一種需求，其需要待發(fā)現(xiàn)的方法簡(jiǎn)單、廉價(jià)、產(chǎn)生滿足工業(yè)健康需求的高純度的質(zhì)量產(chǎn)品。
[0011]出于以上提到的原因，需要找到一種全合成方法,其具有匯集,性(convergente)且可用于工業(yè)規(guī)模，從而使合成所需長(zhǎng)度和性質(zhì)的肽鏈形成成為可能。特別是涉及從N末端向C末端的組裝方法，其提供了生產(chǎn)的簡(jiǎn)便性和所獲得的肽或多肽的高純度。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)構(gòu)成本發(fā)明之目的的用一釜法組裝多個(gè)肽的片段的組裝，所述一釜法涉及簡(jiǎn)單的方法(例如形成肽-硫酯和天然連接)，可以產(chǎn)生匯集性的可用于工業(yè)規(guī)模并符合所需純度標(biāo)準(zhǔn)的全合成。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，組裝方法涉及肽-硫酯的合成、其與肽(或多肽)的縮合反應(yīng)以及在還原介質(zhì)中在所得多肽的C末端的天然化學(xué)連接，
[0014]所述肽(或多肽)具有處于環(huán)二硫化物狀態(tài)的雙(硫乙基)氨基官能團(tuán)，其符合通式:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.制備η個(gè)片段和η-l個(gè)具有硫醇官能團(tuán)之氨基酸的肽組裝物的方法，所述肽組裝物由下式表示:
C1-A2-C2-A3-...-CiH-Ai'...—C^j-An (I)
其中 A1' A2> A3...A1...An 是肽片段， C1^ C2> C3...C^1...Clri是具有硫醇官能團(tuán)的氣基酸殘基， η為3至50，優(yōu)選3至20，或者3至10，且i是為2至η的任意整數(shù)，其特征在于 通過(guò)硫醇R-SH的作用，在環(huán)二硫化物還原劑的存在下，由雙(2-硫乙基)氨基肽=A1-SEAoff,其中SEAoff是環(huán)雙(2-硫乙基)氨基基團(tuán)I實(shí)施制備下式的肽-硫酯:
A1-SR (II) 其中A i是肽片段且SR是烷基硫酯殘基，R可以是任選取代的烷基，隨后在芳香族硫醇ArSH的存在下與具有以下結(jié)構(gòu)的肽片段縮合:
H-C1 (SR，)-A2-SEAoff (III), 其中Cp A2和SEAoff如上定義，(SR’)表示氨基酸C1的硫醇上的二硫化物殘基，然后通過(guò)硫醇R-SH的作用在環(huán)二硫化物還原劑的存在下使所得具有以下結(jié)構(gòu)的新的肽片段:`
A1-C1-A2-SEAoff (IV) 其中Ap Cp A2和SEAoff如上定義，轉(zhuǎn)化為下式的肽-硫酯: AfCfA2-SR (II，)， 其中A1JpA2和R如上定義， 其在芳香族硫醇ArSH的存在下與具有以下結(jié)構(gòu)的肽片段縮合:
H-C2 (SR，)-A3-SEAoff (III，)， 其中SEAoff和R’以及C2和A3如上定義，從而產(chǎn)生具有以下結(jié)構(gòu)的肽片段: A1-C1-A2-C2-A3-SEAoff (IV，) 其中A1'CpAyC2'A3和SEAoff如上定義， 重復(fù)這兩個(gè)操作多至n-2次，從而獲得具有以下結(jié)構(gòu)的肽片段:
AfCfA2-C2-A3-...-C1-J-A1-...._Cn_2_An_「S E Aoff (IVm) 其中 A2、A3.…A1.…Ai^ C1^C2, C3...Ch...、Cn_2 和 SEAoff 如上定義，隨后在環(huán)二硫化物還原劑的存在下通過(guò)還原實(shí)施所得肽片段(IVm)與具有下式的肽的天然連接反應(yīng):H_Cn_「An (Vn), 其中Clri和An如上定義，從而產(chǎn)生通式(I)的多個(gè)肽的組裝物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于制備3或4個(gè)片段的肽組裝物，其具有結(jié)構(gòu)A1-C1-A2-C2-A3 或 A1-C1-A2-C2-A3-C3-A40
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在“一釜”反應(yīng)中制備3個(gè)片段的肽組裝物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3之一所述的方法，其特征在于CpC2, C3...Cp1...Clri表示Cys殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其特征在于肽片段A2...A1...Alri中的一個(gè)或更多個(gè)可以具有一個(gè)或更多個(gè)經(jīng)修飾的氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一所述的方法，其特征在于在4-巰基苯基乙酸的存在下進(jìn)行所述肽-硫酯與結(jié)構(gòu)(III)的肽片段的所述縮合。
7.藥物組合物的制備方法，其特征在于所述方法包括: -根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的用于制備式(I)多肽的方法來(lái)制備多肽或肽，以及-制備包含由此制備的多肽或肽的藥物組合物，所述多肽或肽處于純的狀態(tài)或與一個(gè)或更多個(gè)相容的且藥學(xué)上可接受的佐劑組合。
8.制備診斷設(shè)備的方法，其特征在于其包括: -根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的用于制備式(I)多肽的方法來(lái)制備多肽或肽，以及 -配制或形成適用于診斷設(shè)備之形式的`該多肽。
【文檔編號(hào)】C07K1/02GK103517914SQ201280009075
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月16日
【發(fā)明者】奧列格·梅爾尼克, 納塔莉·奧利維耶, 雷達(dá)·姆希迪亞, 朱利恩·德?tīng)? 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心, 里爾第一大學(xué)-科學(xué)技術(shù)