一種檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法，步驟如下：(1)取人凝血酶原復合物，稀釋至凝血因子IX為0.8-1.3IU/ml，加入等體積濃度為4-6IU/ml的人凝血酶溶液，混勻，室溫放置1-2min；(2)再加入與人凝血酶溶液等體積的凝血酶發(fā)色底物溶液，混勻，22-28℃條件下孵育4-6min，所述發(fā)色底物溶液的濃度為0.5-0.7mg/ml；(3)在405nm波長條件測定吸光值，每30s-50s測定1次，共測定5-8次；(4)以測定的吸光值為縱坐標(y)，以時間(s)為橫坐標(x)，繪制吸光值隨時間變化的趨勢，并建立線性方程y＝kx+a，其中k為斜率，計算1/k的值，即可。本發(fā)明檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法操作簡便，重復性好，可定量檢測PCCs制品的綜合抗凝能力，評價PCCs制品的安全性。
【專利說明】一種檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法。

【背景技術】
[0002] 人凝血酶原復合物（prothrombincomplexconcentrates，PCCs)是從健康人血 衆(zhòng)中分離制備的一種血衆(zhòng)蛋白制品，主要包含四種凝血因子（coagulationfactor，F(xiàn))，分 別為FII、FVII、FIX、FX，此四種凝血因子具有相似的理化性質，同時均需依賴維生素K合 成；此外，還含有蛋白C(proteinC,PC)、蛋白S(proteinS，PS)、蛋白Z(proteinZ，PZ)同 樣依賴維生素K合成的三種抗凝蛋白。自上世紀60年代該制品用于乙型血友病的臨床防 治以來，由于其成分較為復雜，其臨床適應癥不斷擴大，還可用于先天性或后天獲得的FII、 FVII、FX、PC、PS缺乏，肝臟疾病所引起的凝血功能紊亂癥，長期輸注FW機體產生抗FW 抗體的甲型血友病及外傷引起的嚴重失血的治療，近年來又擴大至服用雙香豆素抗凝藥物 過量而引起的出血癥的治療。我國人口基數大，肝病患者人群比例高，再加上高純的FII、 FVII、FX、PC、PS制劑缺乏，因此PCCs臨床應用更廣泛。
[0003] 自PCCs制品用于臨床以來，有不少關于導致血栓形成并發(fā)癥的報道，為了減少其 血栓性風險，上世紀90年代，不少學者認為在PCCs中加入肝素及抗凝血酶（antithrombin， AT)抗凝血制劑可降低PCCs的致血栓性，但對PCCs中肝素及AT的具體加入量并沒有一個 硬性的統(tǒng)一標準，并且，國內外廠家大多采用DEAE-sephadexA50凝膠進行PCCs分離，但具 體工藝條件并不相同，導致其含有的PC、PS、PZ也不一致，加之肝素及AT加入量沒有一個統(tǒng) 一標準，導致PCCs中抗凝成分（PC、PS、PZ、肝素及AT)含量有很大差異，從而致使PCCs的 抗凝能力也有很大不同。
[0004] 目前，生物制品的抗凝能力通常通過檢測抗凝物質的活性含量來衡量。然而，由于 不同工藝及統(tǒng)一標準的缺乏使不同PCCs中抗凝成分（PC、PS、PZ、肝素及AT)含量不一致， 且其與促凝成分FII、FVII、FIX、FX混雜在一起。因此，PCCs制品的抗凝能力檢測非常復 雜，且綜合抗凝能力很難評價，進而無法確定PCCs制品的血栓發(fā)生風險。
[0005] 急需尋找一種能夠測定PCCs綜合抗凝能力的方法。


【發(fā)明內容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法， 可以測定PCCs綜合抗凝能力。
[0007] 本發(fā)明檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法，它包括如下步驟：
[0008] (1)取人凝血酶原復合物，稀釋至FIX為0.8-1. 3IU/ml，加入等體積濃度為4-6IU/ ml的人凝血酶溶液，混勻，室溫放置l_2min;
[0009] (2)再加入與人凝血酶等體積的凝血酶發(fā)色底物溶液，混勻，22-28°C水浴條件下 孵育4-6min，所述發(fā)色底物溶液的濃度為0. 5-0. 7mg/ml;
[0010] (3)在405nm波長條件測定吸光值，每30-50S測定1次，共測定5-8次；
[0011] (4)以上述測定的吸光值為縱坐標（y)，以時間（s)為橫坐標（x)，繪制吸光值隨時 間變化的趨勢，并建立線性方程y=kx+a，其中k為斜率，計算1/k的值，即可。
[0012] 室溫：25°C±5°C。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（1)中，稀釋至凝血因子1-1.2IU/ml。
[0014] 優(yōu)選地，步驟⑴中，人凝血酶溶液的濃度為5IU/ml。
[0015] 優(yōu)選地，步驟（1)中，室溫放置的時間為2min。
[0016]優(yōu)選地，步驟⑵中，所述凝血酶發(fā)色底物為CS-01 (38)，其分子式為 H-D-Phe-Pip-Arg-pNa? 2HC1。
[0017] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述孵育的溫度是26°C。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述孵育的時間是6min。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述發(fā)色底物溶液的濃度為0. 6mg/ml。
[0020] 優(yōu)選地，步驟⑶中，每40-50s測定1次。
[0021] 優(yōu)選地，步驟（3)中，共測定5-6次。
[0022] 為了能準確衡量人凝血酶原復合物的抗凝能力，研宄人員目前致力于其抗凝成分 (如PC、PS、PZ、肝素、AT)的單一活性含量測定，然而其整體抗凝能力卻無法評價。
[0023] 然而，本發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法可以直接檢測人凝血酶原復合物的 整體抗凝能力，而無需檢測每個抗凝物質的活性含量，取得了意料不到的技術效果。
[0024] 發(fā)明人在研宄過程中發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法，將人凝血酶原復合物與凝血酶及其 底物在本發(fā)明特定條件下反應，在特定的時間段內，吸光值（OD值）的變化快慢與人凝血酶 原復合物的抗凝能力呈線性負相關，而吸光值與時間的線性方程中的斜率就是反應吸光值 的變化快慢的參數，因而通過計算該斜率的倒數，就可以確定人凝血酶原復合物的抗凝能 力。
[0025] 本發(fā)明檢測人凝血酶原復合物的方法操作簡便，重復性好，可定量測定PCCs制品 的綜合抗凝能力，從而可對不同PCCs制品的安全性進行評價及比較。
[0026] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內 容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1不同肝素及AT含量的PCCs制品測定的OD值隨時間（s)變化曲線及線性方 程
[0028] 圖2國內外四種PCCs制品測定的OD值隨時間（s)變化曲線及線性方程

【具體實施方式】
[0029] 凝血酶原復合物（PCCs)，購自國內外制品公司；
[0030] 人凝血酶，購自sigma公司，批號：SLBK7230V;
[0031] 凝血酶發(fā)色底物CS-01(38)，購自HYPEN-biomed公司，批號：30401-1。實施例1本 發(fā)明檢測方法
[0032] 1.人凝血酶原復合物（PCCs)制品的稀釋
[0033] 將PCCs制品用純水稀釋至0. 8IUFIX/ml，取40y1加入微孔板中。
[0034] 2.PCCs與人凝血酶混合
[0035] 取40y1濃度為4IU/ml的的人凝血酶，加入上述微孔板中，輕微震蕩，混合均勻， 室溫放置lmin。
[0036] 3.顯色反應
[0037] 上述微孔板中加入40y1濃度為0.5mg/ml的發(fā)色底物CS-01 (38)(分子式： H-D-Phe-Pip-Arg-pNa? 2HC1)溶液，混合均勻，22°C水浴條件下孵育4min。
[0038] 4?吸光度測定
[0039] 405nm波長條件測定吸光值（OD值），每30s測定1次，測定5次，共150s。
[0040] 5.線性方程建立
[0041] 以上述測定的OD值為縱坐標（y)，以時間（s)為橫坐標（x)，繪制OD值隨時間變 化的趨勢，并建立線性方程y=kx+a，其中k為斜率。
[0042] 6?綜合抗凝能力的定量計算
[0043] 計算1/k值，SP為PCCs綜合抗凝能力。
[0044] 實施例2本發(fā)明檢測方法
[0045] 1?人凝血酶原復合物（PCCs)制品的稀釋
[0046] 將PCCs制品用純水稀釋至0? 8-1.OIUFIX/ml，取60y1加入微孔板中。
[0047]2.PCCs與人凝血酶混合
[0048] 取60y1濃度為5IU/ml的的人凝血酶，加入上述微孔板中，輕微震蕩，混合均勻， 室溫放置1. 5min。
[0049] 3?顯色反應
[0050] 上述微孔板中加入60y1濃度為0. 6mg/ml的發(fā)色底物CS-01(38)(分子式： H-D-Phe-Pip-Arg-pNa? 2HC1)溶液，混合均勻，25°C水浴條件下孵育5min。
[0051]4.吸光度測定
[0052] 405nm波長條件測定吸光值（OD值），每40s測定1次，測定7次，共280s。
[0053]5.線性方程建立
[0054] 以上述測定的OD值為縱坐標（y)，以時間（s)為橫坐標（x)，繪制OD值隨時間變 化的趨勢，并建立線性方程y=kx+a，其中k為斜率。
[0055]6?綜合抗凝能力的定量計算
[0056] 計算1/k值，即為PCCs綜合抗凝能力。
[0057] 實施例3本發(fā)明檢測方法
[0058] 1.人凝血酶原復合物（PCCs)制品的稀釋
[0059] 將PCCs制品用純水稀釋至1. 3IUFIX/ml，取80y1加入微孔板中。
[0060]2.PCCs與人凝血酶混合
[0061] 取80y1濃度為6IU/ml的的人凝血酶，加入上述微孔板中，輕微震蕩，混合均勻， 室溫放置2min。
[0062] 3.顯色反應
[0063] 上述微孔板中加入80y1濃度為0?7mg/ml的發(fā)色底物CS-01 (38)(分子式： H-D-Phe-Pip-Arg-pNa? 2HC1)溶液，混合均勻，28°C水浴條件下孵育6min。
[0064] 4?吸光度測定
[0065] 405nm波長條件測定吸光值（OD值），每50s測定1次，測定8次，共400s。
[0066] 5.線性方程建立
[0067] 以上述測定的OD值為縱坐標（y)，以時間（s)為橫坐標（x)，繪制OD值隨時間變 化的趨勢，并建立線性方程y=kx+a，其中k為斜率。
[0068] 6?綜合抗凝能力的定量計算
[0069] 計算1/k值，即為PCCs綜合抗凝能力。
[0070] 以下用實驗例的方式說明本發(fā)明的有益效果：
[0071] 實驗例1不同肝素及AT含量的PCCs綜合抗凝能力的測定及比較
[0072] 1 ?實驗方法
[0073] (1)取市售PCCs濃縮物，測定FIX活性含量，超純水稀釋至FIX活性含量為1. 2IU/ ml，分裝200y1 -支。分別往等量PCCs濃縮物稀釋液中添加適量的AT(抗凝血酶）（50IU/ ml)和肝素（1000IU/ml)溶液，制備不同肝素及AT活性含量的PCCs制品，因添加不同AT及 肝素體積所導致的體積差，加入適量超純水彌補，最終體積均為250y1。制備不同肝素及 AT活性含量的PCCs制品分別標識為A、B、C、D，如表1所示。分別取所制備的不同AT及肝 素活性含量的PCCs制品50y1，加入96孔板中。以上操作均在2-4°C條件下進行。
[0074] 表1不同AT及肝素活性含量的PCCs制品
[0075]

【權利要求】
1. 一種檢測人凝血酶原復合物抗凝能力的方法，其特征在于：它包括如下步驟： (1) 取人凝血酶原復合物，稀釋至凝血因子IX為0. 8-1. 3IU/ml，加入等體積濃度為 4-6IU/ml的人凝血酶溶液，混勻，室溫放置l-2min ; (2) 再加入與人凝血酶溶液等體積的凝血酶發(fā)色底物溶液，混勻，22-28°C條件下孵育 4-6min，所述發(fā)色底物溶液的濃度為0. 5-0. 7mg/ml ; (3) 在405nm波長條件下測定吸光值，每30s-50s測定1次，共測定5-8次； (4) 以測定的吸光值為縱坐標（y)，以時間（s)為橫坐標（x)，繪制吸光值隨時間變化的 趨勢，并建立線性方程y = kx+a，其中k為斜率，計算1/k的值，S卩可。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，稀釋至凝血因子1-1. 2IU/ ml 〇
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，人凝血酶溶液的濃度為5IU/ ml 〇
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，室溫放置的時間為2min。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述凝血酶發(fā)色底物為 CS-01 (38)，其分子式為 H-D-Phe-Pip-Arg-pNa ? 2HC1。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述孵育的溫度是26°C。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述孵育的時間是6min。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述發(fā)色底物溶液的濃度為 0? 6mg/ml 〇
9. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)中，每40-50s測定1次。
10. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟⑶中，共測定5-6次。
【文檔編號】G01N33/86GK104459165SQ201410757119
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權日:2014年12月10日
【發(fā)明者】曹海軍, 田倩, 辛葉, 葉生亮, 李長清 申請人:中國醫(yī)學科學院輸血研究所