專利名稱：一種從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法。
背景技術(shù)：
迷迭香(Rosmarinus offoconalis L.)為唇形科迷迭香屬植物，富含多種高效、 安全的抗氧化成分。迷迭香提取物是一類新型優(yōu)良的天然抗氧化劑，能夠有效清除體內(nèi)自 由基，防止食品變質(zhì)，并且具有消炎、抗腫瘤、抗艾滋病毒等功效([1]楊燕.迷迭香抽提物 的性質(zhì)與應(yīng)用[J]·中國食品工業(yè)，1999，(3) :38-39. [2]OffordEA, MaceK, Avanti 0，et al. Cancer Letters [J], 1997,114(12) :275-281.)。鼠尾草酸(Carnosic Acid, CA)是迷迭 香脂溶性抗氧化劑中最主要的有效成分，不僅具有抗氧化活性，而且具有抗癌特性，在化妝 品、藥物和保健品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前國內(nèi)外對分離鼠尾草酸的研究中主要存在以下難點1、鼠尾草酸在眾多溶劑 中穩(wěn)定性很差，易被氧化，溶劑分離方法幾乎不可能獲得高含量產(chǎn)品；2、普通硅膠柱層析方 法分離鼠尾草酸的時間均較長，鼠尾草酸組分流出慢，效率低；3、大多數(shù)分離的后續(xù)步驟包 含重結(jié)晶過程中，鼠尾草酸不僅溶劑穩(wěn)定性差，而且熱穩(wěn)定性同樣不好；4、成本高，不具有 實際經(jīng)濟(jì)效益。因此，國際國內(nèi)市場上能夠提供的鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品的最高含量為92%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種從迷迭香葉提取物中分離 鼠尾草酸的方法，利用該方法鼠尾草酸組分流出快，時間短，且含量高。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案一種從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，包括以下步驟(1)將柱層析硅膠分散在由無水乙醇磷酸=200 2. 5 200 7. 5v/v制成的 磷酸-乙醇溶液中，所述磷酸硅膠為1 40 3 40v/w，抽真空，再超聲浸潤，然后回收 乙醇，烘干得到磷酸-硅膠固定相；(2)將迷迭香葉提取物溶于乙酸乙酯中，將迷迭香葉提取物磷酸-硅膠固定相 =1 4 1 6w/w，加入磷酸-硅膠固定相，充分?jǐn)嚢韬蠡厥找宜嵋阴?，得到吸附迷迭?葉提取物的固定相；(3)將步驟(1)的磷酸-硅膠固定相填充至已通入高純氮氣保護(hù)的層析柱管中，得 到磷酸-硅膠層析柱；(4)將步驟O)的吸附迷迭香葉提取物的固定相加入到步驟(3)的磷酸-硅膠層 析柱中進(jìn)行分離，采用乙酸乙酯正己烷=5 95 18 82v/v的混合溶液作為洗脫液， 收集洗脫組分；(5)將洗脫組分減壓蒸餾至溶液變渾濁，冷藏至晶體析出，傾出溶劑，晶體經(jīng)真空 干燥后，充高純氮氣保存，即得鼠尾草酸。優(yōu)選地，所述步驟(1)中磷酸硅膠為2 40。
優(yōu)選地，所述步驟O)中迷迭香葉提取物磷酸-硅膠固定相=1 5。如果磷 酸-硅膠固定相過少，迷迭香葉提取物超出硅膠的擔(dān)載量，分離的色帶易重疊，影響分離效 果；過多，會造成磷酸-硅膠固定相的浪費，因此，迷迭香葉提取物磷酸-硅膠固定相= 1 5最為適宜。用少量磷酸-硅膠固定相來吸附迷迭香葉提取物，提高了鼠尾草酸在樣品 處理過程中的利用率。優(yōu)選地，所述步驟(4)中乙酸乙酯正己烷=10 90v/v，乙酸乙酯含量過多，洗 脫液極性太大，會使洗脫速度過快，鼠尾草酸和其他較高極性的物質(zhì)不能得到很好的分離； 乙酸乙酯含量過少，洗脫速度過慢，分離時間長導(dǎo)致鼠尾草酸被氧化，因此，乙酸乙酯正 己烷=10 90v/v最為適宜。和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明使用磷酸-硅膠固定相來分離鼠尾草酸，通過酸性環(huán)境在一定程度上保持 了鼠尾草酸的穩(wěn)定性；只需一次過柱就將鼠尾草酸單獨分離出來，過柱時間短，鼠尾草酸在 第一個色帶前已出峰，即在分離時組分最先流出，可以節(jié)省洗脫液的用量，提高經(jīng)濟(jì)效益； 操作時間短，有效地提高了鼠尾草酸的純度，通氮氣保護(hù)結(jié)晶后含量可達(dá)92%，抗氧化活性 好，達(dá)到市售標(biāo)準(zhǔn)品含量指標(biāo)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實施例所用試劑與儀器如下柱層析硅膠Q00-300固，青島海洋化工廠)、正己烷、乙酸乙酯、磷酸(均為市售分 析純試劑)、石英雙蒸水(由申請人實驗室自制)、含60%鼠尾草酸的迷迭香葉提取物(市
佳)
口 乂 OLC-10AT vp plus高效液相色譜儀(日本島津公司)由兩臺LC-10AT vp plus 輸液泵、一臺SPD-10A vp plus紫外檢測器、一臺CBM-10A vp plus系統(tǒng)控制儀、一只 77251六通進(jìn)樣閥和Lcsolution lite色譜工作站組成；色譜柱DELTAPAKC18 (5 μ m, 150x 3. 9mmID, Waters)。操作條件為80%甲醇(B溶液)和20%含0. 5%磷酸的磷酸溶液(A溶 液)等度洗脫，流量為lml/min。檢測波長^4nm。進(jìn)樣量20 μ 1。 RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。實施例1從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，包括以下步驟(1)在500ml圓底燒瓶內(nèi)加入200ml無水乙醇和2. 5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶 液，稱取100克柱層析硅膠分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅膠顆粒間的 空氣，防止過柱過程中鼠尾草酸被氧化，再超聲浸潤20min，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙醇，于 120°C烘干8小時得磷酸-硅膠固定相，備用；(2)稱取2克含60%鼠尾草酸的迷迭香葉提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷 酸-硅膠固定相，充分?jǐn)嚢瑁谛D(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香葉提取物的固 定相；(3)空柱管通以高純氮氣將其中空氣排出，在通氮保護(hù)的條件下按下述步驟裝柱 稱取90克磷酸-硅膠固定相，加入500ml無水正己烷，超聲浸潤20min，再抽真空15min，得
4到磷酸-硅膠正己烷分散液，備用；將磷酸-硅膠正己烷分散液攪拌，使磷酸-硅膠固定相 均勻懸浮在正己烷中(裝柱過程均保持分散狀態(tài))，緩慢倒入層析柱管中，打開柱管旋塞， 使溶劑均勻流下。在磷酸-硅膠固定相完全沉積前加入后續(xù)磷酸-硅膠正己烷分散液，保 證柱床層致密均勻。磷酸-硅膠固定相形成理想床層后保證磷酸-硅膠固定相上部至少有 Icm以上的正己烷，不使柱頭變干，從而得到磷酸-硅膠層析柱；(4)將吸附迷迭香葉提取物的固定相用無水正己烷分散，按裝柱方法裝于柱床層 的上部，在樣品上部用少量脫脂棉固定；用含5%乙酸乙酯的正己烷溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液流量每分鐘3_5ml。 當(dāng)色層距濾板約3cm時開始收集，每IOOml收集一次。用含5%乙酸乙酯的正己烷洗脫色層 至無色后，增加乙酸乙酯的比例至15%，繼續(xù)洗脫，至鼠尾草酸的檢測為陰性。對每批接收 液，采用高效液相色譜法分析鼠尾草酸的最高含量為83%。(5)將洗脫組分減壓蒸餾至溶液變渾濁，添加少量脫氣溶劑，冷藏至晶體析出，傾 出溶劑，晶體經(jīng)40°C真空干燥后，轉(zhuǎn)入樣品瓶，充高純氮氣保存，即得鼠尾草酸，晶體重0. 5 克，HPLC測定鼠尾草酸含量為85 %。實施例2從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，包括以下步驟(1)在500ml圓底燒瓶內(nèi)加入200ml無水乙醇和5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶 液，稱取100克柱層析硅膠分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅膠顆粒間的 空氣，防止過柱過程中鼠尾草酸被氧化，再超聲浸潤20min，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙醇，于 120°C烘干8小時得磷酸-硅膠固定相，備用；(2)稱取2克含60%鼠尾草酸的迷迭香葉提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷 酸-硅膠固定相，充分?jǐn)嚢瑁谛D(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香葉提取物的固 定相；(3)空柱管通以高純氮氣將其中空氣排出，在通氮保護(hù)的條件下按下述步驟裝柱 稱取90克磷酸-硅膠固定相，加入500ml無水正己烷，超聲浸潤20min，再抽真空15min，得 到磷酸-硅膠正己烷分散液，備用；將磷酸-硅膠正己烷分散液攪拌，使磷酸-硅膠固定相 均勻懸浮在正己烷中(裝柱過程均保持分散狀態(tài))，緩慢倒入層析柱管中，打開柱管旋塞， 使溶劑均勻流下。在磷酸-硅膠固定相完全沉積前加入后續(xù)磷酸-硅膠正己烷分散液，保 證柱床層致密均勻。磷酸-硅膠固定相形成理想床層后保證磷酸-硅膠固定相上部至少有 Icm以上的正己烷，不使柱頭變干，從而得到磷酸-硅膠層析柱；(4)將吸附迷迭香葉提取物的固定相用無水正己烷分散，按裝柱方法裝于柱床層 的上部，在樣品上部用少量脫脂棉固定；用含10%乙酸乙酯的正己烷溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液流量每分鐘 3-5ml。當(dāng)色層距濾板約3cm時開始收集，每IOOml收集一次。用含10%乙酸乙酯的正己烷 洗脫色層至無色后，增加乙酸乙酯的比例至12%，繼續(xù)洗脫，至鼠尾草酸的檢測為陰性。對 每批接收液，采用高效液相色譜法分析鼠尾草酸的最高含量為89%。(5)將洗脫組分減壓蒸餾至溶液變渾濁，添加少量脫氣溶劑，冷藏至晶體析出，傾 出溶劑，晶體經(jīng)80°C真空干燥后，轉(zhuǎn)入樣品瓶，充高純氮氣保存，即得鼠尾草酸，晶體重0. 6 克，HPLC測定鼠尾草酸含量為92 %。
實施例3從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，包括以下步驟(1)在500ml圓底燒瓶內(nèi)加入200ml無水乙醇和7. 5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶 液，稱取100克柱層析硅膠分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅膠顆粒間的 空氣，防止過柱過程中鼠尾草酸被氧化，再超聲浸潤20min，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙醇，于 120°C烘干8小時得磷酸-硅膠固定相，備用；(2)稱取2克含60%鼠尾草酸的迷迭香葉提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷 酸-硅膠固定相，充分?jǐn)嚢?，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香葉提取物的固 定相；(3)空柱管通以高純氮氣將其中空氣排出，在通氮保護(hù)的條件下按下述步驟裝柱 稱取90克磷酸-硅膠固定相，加入500ml無水正己烷，超聲浸潤20min，再抽真空15min，得 到磷酸-硅膠正己烷分散液，備用；將磷酸-硅膠正己烷分散液攪拌，使磷酸-硅膠固定相 均勻懸浮在正己烷中(裝柱過程均保持分散狀態(tài))，緩慢倒入層析柱管中，打開柱管旋塞， 使溶劑均勻流下。在磷酸-硅膠固定相完全沉積前加入后續(xù)磷酸-硅膠正己烷分散液，保 證柱床層致密均勻。磷酸-硅膠固定相形成理想床層后保證磷酸-硅膠固定相上部至少有 Icm以上的正己烷，不使柱頭變干，從而得到磷酸-硅膠層析柱；(4)將吸附迷迭香葉提取物的固定相用無水正己烷分散，按裝柱方法裝于柱床層 的上部，在樣品上部用少量脫脂棉固定；用含12%乙酸乙酯的正己烷溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液流量每分鐘 3-5ml。當(dāng)色層距濾板約3cm時開始收集，每IOOml收集一次。用含12%乙酸乙酯的正己烷 洗脫色層至無色后，增加乙酸乙酯的比例至15%，繼續(xù)洗脫，至鼠尾草酸的檢測為陰性。對 每批接收液，采用高效液相色譜法分析鼠尾草酸的最高含量為86%。(5)將洗脫組分減壓蒸餾至溶液變渾濁，添加少量脫氣溶劑，冷藏至晶體析出，傾 出溶劑，晶體經(jīng)80°C真空干燥后，轉(zhuǎn)入樣品瓶，充高純氮氣保存，即得鼠尾草酸，晶體重0. 5 克，HPLC測定鼠尾草酸含量為87%。
權(quán)利要求
1.一種從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將柱層析硅膠分散在由無水乙醇磷酸=200 2. 5 200 7. 5v/v制成的磷 酸-乙醇溶液中，所述磷酸硅膠為1 40 3 40v/w，抽真空，超聲浸潤后回收乙醇，烘 干得到磷酸-硅膠固定相；(2)將迷迭香葉提取物溶于乙酸乙酯中，按迷迭香葉提取物磷酸-硅膠固定相為 1 4 1 6w/w的比例，加入步驟(1)的磷酸-硅膠固定相，充分?jǐn)嚢韬蠡厥找宜嵋阴ィ?得到吸附迷迭香葉提取物的固定相；(3)將步驟(1)的磷酸-硅膠固定相填充至已通入高純氮氣保護(hù)的層析柱管中，得到磷 酸-硅膠層析柱；(4)將步驟O)的吸附迷迭香葉提取物的固定相加入到步驟(3)的磷酸-硅膠層析柱 中進(jìn)行分離，采用乙酸乙酯正己烷=5 95 18 82v/v的混合溶液作為洗脫液，收集 洗脫組分；(5)將洗脫組分減壓蒸餾至溶液變渾濁，冷藏至晶體析出，傾出溶劑，晶體經(jīng)真空干燥 后，充高純氮氣保存，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，其特征在于，所 述步驟⑴中磷酸硅膠為2 40。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，其特征在于，所 述步驟O)中迷迭香葉提取物磷酸-硅膠固定相=1 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，其特征在于，所 述步驟中乙酸乙酯正己烷=10 90v/vo全文摘要
本發(fā)明公開一種從迷迭香葉提取物中分離鼠尾草酸的方法，包括將柱層析硅膠分散在磷酸-乙醇溶液中，抽真空，再超聲浸潤，然后回收乙醇，烘干得磷酸-硅膠固定相；磷酸-硅膠固定相裝填至已通入高純氮氣保護(hù)的層析柱管中，得到磷酸-硅膠層析柱；將迷迭香葉提取物溶于乙酸乙酯中，加入磷酸-硅膠固定相，充分?jǐn)嚢韬蠡厥找宜嵋阴ィ玫轿矫缘闳~提取物的固定相，將吸附迷迭香葉提取物的固定相加入到磷酸-硅膠層析柱中，洗脫，收集餾分并真空干燥后得到鼠尾草酸。本發(fā)明只需一次過柱就將鼠尾草酸單獨分離出來，過柱時間短，純度可達(dá)92％，有利于產(chǎn)品在市場中的應(yīng)用。
文檔編號C07C51/42GK102115442SQ20111000101
公開日2011年7月6日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者左雄軍, 曾健青, 粱鈺, 陳瞾 申請人:廣州和博生物科技有限公司