專利名稱:乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物在制備對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答預(yù)防制品中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域。涉及乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物的新用途,具體涉及乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物在制備對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答預(yù)防制品中的用途。
背景技術(shù):
目前國內(nèi)外已有的乙肝預(yù)防性疫苗在預(yù)防乙肝及肝癌的發(fā)生、發(fā)展方面做出了重要貢獻(xiàn)(Beasley RP et al,Lancet,21099,1983;Lo KJ et al,J Inf Dis152817,1985;沙慶洪等,病毒學(xué)報vol 7 suppl56,1991。現(xiàn)用于預(yù)防乙肝的疫苗均由乙肝表面抗原蛋白(HBsAg)制成,其來源為自血漿純化后滅活、用重組酵母基因工程菌表達(dá)或用哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)后純化的乙肝表面抗原蛋白(徐志一等,病毒學(xué)報vol 7 suppl48,1991;張權(quán)一等,病毒學(xué)報vol 7 suppl108;6 Sung JL,et al.Vaccine,8(suppl)95,1990)。正常成人、兒童或嬰兒接種上述乙肝疫苗后的保護(hù)性作用主要表現(xiàn)為血清可產(chǎn)生對乙肝表面抗原的抗體(抗-HBs)。然而在疫苗接種者中約有5-10%的健康接種者雖然全程接種了保證質(zhì)量的乙肝疫苗,但對乙肝疫苗不產(chǎn)生抗-HBs,或僅產(chǎn)生低滴度的抗-HBs(一般以10mIU/ml,國際單位為最低的有效保護(hù)指標(biāo)),被稱為對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者(Chiou SS et al Immunology,64545,1988;Magafuchi S et al.Lancet,21522,1987;Leroux-Roels,G et al.Acta Clin Belg 56209,2001)。曾有報道,這些無應(yīng)答或低應(yīng)答者如接觸乙肝病毒仍可被感染并可發(fā)病(HadlerSC.New Engl J Med 315209,1986)。黑龍江省報道,全人群免疫接種乙肝疫苗后抗-HBs陽轉(zhuǎn)率為81.97%(陳美征等,病毒學(xué)報vol 7 suppl73,1991),北京市的學(xué)者經(jīng)過多年對疫苗接種的嬰兒隨訪,發(fā)現(xiàn)低、無應(yīng)答的發(fā)生率為4.68-8.18%(龔曉紅等,疾病監(jiān)測13447,1998),中學(xué)生及成人中低、無應(yīng)答的發(fā)生率約占10-20%(龔曉紅等,中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志5(3),1991)。在江蘇啟東進(jìn)行的乙肝疫苗接種預(yù)防肝癌群體現(xiàn)場中,也發(fā)現(xiàn)有約5%的疫苗接種者為低、無應(yīng)答者。Das等也將對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者定為5-10%(DasK,etal Trop Gastroenterol 25113,2004)。
對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,目前仍在研究中。在排除疫苗質(zhì)量、接種技術(shù)或過程有問題的因素外,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為主要與個體的免疫應(yīng)答低下有關(guān)。其中既包括整體免疫應(yīng)答低下者(如腎透析病人);也包括對其他疫苗可產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答,僅對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者。有學(xué)者認(rèn)為與組織相容性抗原的特殊類型相關(guān)(De Silvestri et al.Genes Immun 2367,2001;Kremer J,et al.Immunol Lett.59;13,1997;Stachowski J,et al.NephrolDial Transplant 9144,1994)。國內(nèi)外已采取了用增加現(xiàn)有乙肝疫苗免疫用的劑量(由5-10微克加大至20-30微克),增加注射次數(shù)(由3次增加至5-6次)等方法,雖然在部分對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者中誘生出合格滴度的抗-HBs.但仍有一定比例的正常人不能產(chǎn)生合格滴度的抗-HBs。另有學(xué)者采用了加用佐劑的方法。Decombere用乙肝疫苗與佐劑AS04共免疫HLA DQ2型健康人(可能為對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者),但因HLA DQ2不是對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答的好指標(biāo)而未能獲得結(jié)果(Desobere I,et al.Vaccine 202597,2002)。Mcdermott等用帶有PreS1/PreS2蛋白的HBsAg免疫對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者,雖有部分人出現(xiàn)了抗-HBs,在這部分人群中抗-HBs的滴度迅速下降,而且仍有一部分為無應(yīng)答(McDermott AB,et al.J Viral Hepat Supp;2;9,1998)。Hervas-Stubbs則用了HBsAg加一段肽對無應(yīng)答小鼠SJL/J免疫結(jié)果小鼠產(chǎn)生了抗-HBs,認(rèn)為可能是一種有希望能改變對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者狀態(tài)的制品(Hervas-Stubbs S,et al.Vaccine 12867,1994)。Jungers等用HBsAg/Pre-S2/IL-2免疫對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者,但未能顯示其效果(Jungers P,et al.Lancet 344856,1994)。迄今,尚未見有關(guān)將乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物用于對于乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者使其產(chǎn)生合格滴度的抗-HBs的報道或?qū)@暾?。與本發(fā)明相關(guān)的文件還有Stachowski J,etal.Nephrol Dial Transplant 9144,1994;Desobere I,et al.Vaccine202597,2002;McDermott AB,et al.J Viral Hepat Supp;2;9,1998;Hervas-Stubbs S,et al.Vaccine 12867,1994;Jungers P,et al.Lancet344856,1994;Wen YM et al.Lancet 34567;Wen YM et al.Int Rev Immunol18351,1998;Wen YM et al US patent 6,221,664;Thoma et al US patent6,589,530;聞玉梅等中國發(fā)明專利ZL931124093。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物的預(yù)防新用途,具體涉及乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物在制備對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答預(yù)防制品中的用途。
本發(fā)明采用乙肝表面抗原-抗體組成的復(fù)合物應(yīng)用予對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者,使這一人群產(chǎn)生合格量的抗-HBs,從而保護(hù)這一人群不被乙肝病毒感染。
本發(fā)明在已有的組建乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物作為治療性疫苗技術(shù)的基礎(chǔ),提供乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物的預(yù)防新用途。所述乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物的制備技術(shù)是已有技術(shù)(ZL931124093),但本發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域完全不同,作用機(jī)理也不同。已有的乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物是治療已經(jīng)乙肝病毒感染,血清乙肝表面抗原陽性,并已發(fā)病的慢性乙肝病人。其機(jī)理是通過復(fù)合物中的抗體調(diào)控原來已對乙肝表面抗原處于免疫耐受的抗原呈遞細(xì)胞,攝取乙肝表面抗原,改變對乙肝表面抗原的加工和呈遞,通過這一修飾過程,重新使病人的T,B細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答,達(dá)到清除病毒的作用。因此是作為一種治療用的生物制品,實質(zhì)是一類藥物。類似的制品邊不僅限于肝炎,還可用于治療腫瘤等。國際上將這類藥物稱為治療性疫苗(Cohen J Science 264503,1994.)。
本發(fā)明的的貢獻(xiàn)在于將乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物用于對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答的人體。所述人體并未感染過乙肝病毒,因此體內(nèi)沒有乙肝病毒,也沒有乙肝表面抗原。這一群體的問題是經(jīng)過已有的乙肝疫苗注射后不能正常應(yīng)答,不能產(chǎn)生合格的抗-HBs。在這類人群中,乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物中的抗體是作為一種佐劑,通過抗體的輔佐作用,激活機(jī)體產(chǎn)生有效的抗-HBs。正如在注射一些已有的預(yù)防性疫苗時(如傷寒-副傷寒疫苗等)應(yīng)選擇體內(nèi)有抗體時加強(qiáng)注射,從而可以獲得更高的抗體效價。本發(fā)明采用乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物在這些對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答人體中可以誘生有效的抗-HBs,保護(hù)對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者預(yù)防乙肝病毒感染。可作為針對現(xiàn)有乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者特殊人群的一種新的增強(qiáng)免疫的預(yù)防制品。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用基因工程酵母菌表達(dá)的乙肝表面抗原(HBsAg),或哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)的重組HBsAg,或滅活血源HBsAg,經(jīng)純化、與含乙肝表面抗原的抗體(抗-HBs)的血清或免疫球蛋白組成復(fù)合物,用于對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者,以促使他們產(chǎn)生有效抗-HBs。其特點為HBsAg與抗-HBs在分別作不同稀釋度的方陣滴定測定法下,根據(jù)HBsAg的特性和抗體親和力的不同,確定HBsAg與抗-HBs用量的最適比例。選擇最適比例量的HBsAg與抗-HBs,混合后,在37℃孵育2-4小時后,12,000轉(zhuǎn)/分,離心30-40分鐘,檢測上清中殘留的HBsAg和抗-HBs量,均應(yīng)為很低,表示HBsAg和抗-HBs已充分結(jié)合。吸去上清液,在沉淀物中再加入原來所用量的HBsAg,以保證復(fù)合物含有過量抗原,并加入氫氧化鋁劑及防腐劑。
本發(fā)明所述的乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物由乙型肝炎病毒包膜抗原與抗乙型肝炎病毒包膜抗原的抗體組成。其中所述的乙型肝炎病毒包膜抗原為乙型肝炎表面抗原,可選自血源、基因工程表達(dá)的乙型肝炎病毒表面抗原或合成的乙型肝炎表面抗原;所述的抗體為乙型肝炎表面抗原的抗體,來自人、動物或重組表達(dá)的抗乙型肝炎病毒表面抗原的抗體;所述的對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答是指正常成人,兒童或嬰兒對常規(guī)乙肝疫苗注射3針后未能產(chǎn)生>10mIU/ml的乙型肝炎表面抗體;或是患有其他疾病或因治療其他疾病或因年齡、工作環(huán)境等因素造成的免疫低下對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答;或是因組織相容性抗原特殊型別而對常規(guī)乙肝疫苗注射3針后未能產(chǎn)生>10mIU/ml的乙型肝炎表面抗體對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答。
本發(fā)明的特點為(1)用這一制品可在對HBsAg無應(yīng)答的小鼠品系中,如B10.S,或SJL/j,誘生高效價的抗-HBs,證實在因組織相容性抗原型別(HLA)特殊而對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者中,HBsAg-抗-HBs復(fù)合物能誘生合格的抗-HBs。(2)在用環(huán)孢菌素A(cyclosporin A)造成免疫低下的小鼠中,用HBsAg-抗-HBs免疫,可以產(chǎn)生比用單純HBsAg免疫更高效價的抗-HBs。環(huán)孢菌素A的主要作用是使使機(jī)體的細(xì)胞因子如IL-2,IFN-gamma水平下降,T細(xì)胞增值降低,并繼發(fā)地影響B(tài)細(xì)胞功能。而本發(fā)明HBsAg-抗-HBs復(fù)合物可以比單純HBsAg誘生更高的抗-HBs,表明本制品可用于制備因免疫功能低下對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答的預(yù)防制品。
具體實施例方式
實施例1對兩種不同品系的小鼠B10,B10s(組織相容型均為H2f,(Jackson co.)前者對HBsAg為應(yīng)答品系,后者為不應(yīng)答品系)分別用HBsAg及HBsAg-抗-HBs免疫,結(jié)果單純HBsAg不能在B10s中誘生與B10品系相當(dāng)水平的抗-HBs,但HBsAg-抗-HBs可在B10s中誘生與B10品系相當(dāng)水平的抗-HBs。
根據(jù)已進(jìn)行過的方陣滴定與對殘留的HBsAg,抗-HBs測定結(jié)果,取血源純化的HBsAg 27.5μg(分2次加入),加入1∶30稀釋,效價ELISA為1∶3200鼠抗-HBs 47μl,制成HBsAg-抗-HBs,另取同批HBsAg 27.5μg,加入磷酸緩沖液47μl,為HBsAg注射液對照。分別各取10只B10,10只B10s小鼠,不加佐劑,每只鼠肌肉注射1μg HBsAg或含1μg HBsAg的HBsAg-抗-HBs復(fù)合物,共免疫2次,間隔4周。分別在第1、2次免疫后2周采血清,用ELISA測定血清抗-HBs效價。結(jié)果見表1。
表1 B10(正常應(yīng)答鼠)及B10s(低應(yīng)答鼠)對HBsAg-抗-HBs復(fù)合物及HBsAg免疫后產(chǎn)生抗-HBs的效價(不加氫氧化鋁)
由上述表可見經(jīng)一次單純HBsAg免疫后,無論B10或B10s鼠系血清均未能測及抗體,但用HBsAg-抗-HBs免疫后B10鼠系產(chǎn)生了112±4.24mIU/ml的抗-HBs,但B10s鼠系僅產(chǎn)生了10±4.32mIU/ml的低水平抗體。但經(jīng)再次免疫后,B10s鼠血清可達(dá)到類似B10鼠的抗-HBs效價,分別為52,468±423mIU/ml及52468±423mIU/ml的抗-HBs。單純用HBsAg免疫的B10s鼠系的抗-HBs效價(98±9.19mIU/ml)比B10鼠系的抗-HBs效價低約50倍(98±9.19mIU/ml)。結(jié)果說明HBsAg-抗-HBs可提高對乙肝疫苗(HBsAg)無應(yīng)答或低應(yīng)答鼠產(chǎn)生抗-HBs的能力,可用于因HLA類型特殊而對乙肝疫苗(HBsAg)無應(yīng)答或低應(yīng)答作為預(yù)防制品。
實施例2用對乙肝疫苗(HBsAg)有應(yīng)答的Balb/c鼠,先用環(huán)孢菌素A(cyclosporinAclin Exp Immunol 1989,78263-70;World J Gastroenterol 1999,5209-212;),然后分別用酵母基因工程表達(dá)的單純HBsAg或酵母基因工程表達(dá)的HBsAg-與鼠抗-HBs免疫,采取血清后用ELISA法測定抗-HBs效價。結(jié)果HBsAg-抗-HBs免疫鼠的抗-HBs效價明顯高于單純用HBsAg免疫鼠的抗-HBs效價,說明HBsAg-抗-HBs復(fù)合物可用于因免疫低下而對乙肝疫苗(HBsAg)無應(yīng)答或低應(yīng)答的機(jī)體作為預(yù)防制品。
取16-20克重的Balb/c鼠24只,20只每只腹腔注射環(huán)孢菌素A(cyclosporinA)0.5mg(用生理鹽水稀釋,以后每只隔日注射0.1-2環(huán)孢菌素。另外4只僅注射生理鹽水為對照。待用流式細(xì)胞儀及/或細(xì)胞因子檢測證實T細(xì)胞數(shù)或功能降低后,分別用2微克HBsAg,或含2微克HBsAg的HBsAg-抗-HBs做1-3次腹腔注射。分別采取血清測定抗-HBs效價。結(jié)果單用HBsAg免疫的小鼠抗-HBs效價僅為1∶40以下,而經(jīng)HBsAg-抗-HBs免疫鼠的效價可高達(dá)1∶160以上。結(jié)果說明HBsAg-抗-HBs復(fù)合物比HBsAg能更有效地在因免疫抑制而出現(xiàn)對乙肝疫苗(HBsAg)無應(yīng)答或低應(yīng)答的機(jī)體中誘生出高效價的抗-HBs。因此HBsAg-抗-HBs復(fù)合物可用于因免疫低下而對乙肝疫苗(HBsAg)無應(yīng)答或低應(yīng)答的機(jī)體作為預(yù)防制品。
權(quán)利要求
1.乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物在制備對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答預(yù)防制品中的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物由乙型肝炎病毒包膜抗原與抗乙型肝炎病毒包膜抗原的抗體組成。
3.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的乙型肝炎病毒包膜抗原為乙型肝炎表面抗原。
4.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的乙型肝炎病毒表面抗原為來自血源、基因工程表達(dá)的乙型肝炎病毒表面抗原或合成的乙型肝炎表面抗原。
5.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的抗體為乙型肝炎表面抗原的抗體。
6.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的抗體為來自人、動物或重組表達(dá)的抗乙型肝炎病毒表面抗原的抗體。
7.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答是指正常成人,兒童或嬰兒對常規(guī)乙肝疫苗注射3針后未能產(chǎn)生>10mIU/ml的乙型肝炎表面抗體。
8.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答是患有其他疾病或因治療其他疾病或因年齡、工作環(huán)境等因素造成的免疫低下。
9.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答是因組織相容性抗原特殊型別而對常規(guī)乙肝疫苗注射3針后未能產(chǎn)生>10mIU/ml的乙型肝炎表面抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物的新用途,具體涉及乙肝表面抗原-抗體復(fù)合物在制備對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答預(yù)防制品中的用途。本發(fā)明采用基因工程酵母菌表達(dá)的乙肝表面抗原,或哺乳類動物細(xì)胞表達(dá)的重組HBsAg,或滅活血源HBsAg,經(jīng)純化、與含乙肝表面抗原的抗體的血清或免疫球蛋白組成復(fù)合物,用于對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答者,動物實驗結(jié)果表明可提高對乙肝疫苗)無應(yīng)答或低應(yīng)答鼠產(chǎn)生抗-HBs的能力,能更有效地在因免疫抑制而出現(xiàn)對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答的機(jī)體中誘,生出高效價的抗-HBs。本發(fā)明可用于對乙肝疫苗無應(yīng)答或低應(yīng)答的機(jī)體作為預(yù)防制品。
文檔編號A61P1/16GK1919341SQ20061008228
公開日2007年2月28日 申請日期2006年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者聞玉梅, 袁正宏, 姚忻 申請人:復(fù)旦大學(xué), 上海復(fù)旦悅達(dá)生物技術(shù)有限公司