新型多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分離的多肽、編碼該多肽的核酸、載體和宿主細胞，以及基于其的治療性處理。其中，該多肽包括：(a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或(b)與SEQ ID NO:1具有至少95％的相似度的氨基酸序列。
【專利說明】
新型多肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一類新型多肽、編碼該多肽的核酸和包括該多肽的組合物，以及它們 在治療方法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 碳水化合物代謝紊亂以多種形式發(fā)生，最常見的紊亂是獲得性的。碳水化合物代 謝的獲得性或繼發(fā)性紊亂，例如糖尿病酮癥酸中毒、高滲性昏迷和低血糖癥，都影響中樞神 經(jīng)系統(tǒng)。在糖尿病中同樣可見外周神經(jīng)疾病的許多形式和變種。碳水化合物代謝的其余紊 亂是罕見的先天性代謝缺陷（即遺傳缺陷）。
[0003] 碳水化合物代謝的獲得性紊亂在美國和國際上均相當普遍。在酗酒者和經(jīng)胰島素 治療的糖尿病患者中，低血糖癥是神經(jīng)疾病，特別是急性精神衰退、失憶、定向障礙、遲鈍以 及昏迷的常見原因。高胰島素血癥很少由其它原因造成，但胰腺腫瘤可能是其原因。糖尿病 及其各種神經(jīng)并發(fā)癥是成年病患中最常見的紊亂之一。
[0004] 糖尿病是最常見的內(nèi)分泌疾病，其特征是葡萄糖代謝異常。與這種疾病相關(guān)的葡 萄糖代謝異常導致高血糖癥(高的血糖水平），并最終導致包括眼睛、腎臟、神經(jīng)和血管的多 器官系統(tǒng)的并發(fā)癥。持續(xù)高血糖或葡萄糖耐量異常的患者通常被診斷為患有這種疾病，雖 然最常見的患者起初存在過度排尿(多尿癥)和常因極度口渴(煩渴)而頻繁飲水的情形。這 些典型的起始癥狀是由高血糖的滲透作用所導致的。
[0005] 糖尿病的發(fā)病機理通常與胰腺機能障礙相關(guān)，特別是與朗格漢斯胰島細胞相關(guān)。 這種機能障礙可以導致產(chǎn)生胰島素(一種葡萄糖調(diào)節(jié)肽激素）的胰島辟田胞被破壞，胰島素 則是一種調(diào)節(jié)葡萄糖的肽激素。通常，將糖尿病分類為胰島素依賴型或I型、以及與之相對 的非胰島素依賴型或II型。
[0006] 糖尿病的三種主要形式是：
[0007] -I型：因身體不能產(chǎn)生胰島素所導致，其治療通常涉及施用胰島素。
[0008] -II型：因身體不能正確使用胰島素的健康狀況所導致，并伴有相關(guān)胰島素的缺 乏。許多最終發(fā)展為II型糖尿病的人會經(jīng)歷多年的糖尿病前期狀態(tài)，該前期狀態(tài)是人的血 糖水平高于正常水平、但并未高至足以診斷為II型糖尿病時的健康狀況。
[0009] -妊娠糖尿病:之前從未得過糖尿病但是孕期具有高血糖（葡萄糖)水平的孕婦被 認為具有妊娠糖尿病。妊娠糖尿病影響全部孕婦中的大約4%，其可繼續(xù)發(fā)展為II型（或罕 見地為I型)糖尿病。
[0010] -從上述形式分開歸類的許多其它形式的糖尿病。其實例包括因胰島素分泌的遺 傳缺陷所導致的先天性糖尿病、與囊性纖維化相關(guān)的糖尿病、由高劑量糖皮質(zhì)激素誘導的 類固醇糖尿病、以及幾種形式的單基因糖尿病。
[0011]然而，隨著人們對于該類疾病的更深入地理解，上述術(shù)語的定義也在變化。例如， 已發(fā)現(xiàn)在某些患有非胰島素依賴型糖尿病的患者中，疾病進展為胰島素依賴型，而在其它 患者中胰島素依賴并未發(fā)展。
[0012] 因此，經(jīng)常依據(jù)胰島破壞的病理學機制對患者進行分類，且I型的指定現(xiàn)在用于指 自身免疫性島發(fā)病機理，即指由胰島特異的自身免疫性攻擊所導致的糖尿病，并在本文中 如此使用。術(shù)語胰島素依賴型糖尿?。↖DDM)指已經(jīng)進展到這種階段的I型糖尿病，其中已發(fā) 生的胰辟田胞的自身免疫性破壞足以產(chǎn)生明顯癥狀。術(shù)語前IDDM指可通過活檢或者自身免 疫反應(yīng)分析所檢測到的自身免疫狀態(tài)，在該狀態(tài)下胰島細胞受到特異性自身免疫攻擊，該 攻擊具有致使其中一些細胞可能受到破壞的程度。然而，在前IDDM中，該破壞(如果存在的 話)還未進展到足以需要施用胰島素的程度。由于在I型糖尿病的早期可以有一個點，其中 雖然觀察到明顯癥狀，但是某些胰島功能依然保持(已知為"蜜月期"），因而不是所有I型糖 尿病都被分類為IDDM，也不是所有前IDDM都沒有明顯癥狀存在。
[0013] 與由胰島素不足所導致的代謝異常相關(guān)的代謝并發(fā)癥可以影響很多器官系統(tǒng)。最 常見的急性代謝并發(fā)癥是糖尿病酮癥酸中毒，其特征是嚴重的高血糖(并產(chǎn)生由滲透性利 尿所導致的血容量減少）以及由過度的游離脂肪酸釋放和酮體產(chǎn)生所引發(fā)的代謝性酸中 毒。
[0014] 除了酮癥酸中毒的急性代謝并發(fā)癥，糖尿病患者易患一系列導致相當高發(fā)病率和 過早死亡率的晚期并發(fā)癥。由于葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝的異常，動脈粥樣化病在糖尿病患 者中比一般群體更廣泛且更早地發(fā)生。這種血管病理尤其是可以導致冠狀動脈疾病、中風、 以及帶有壞疽的外周血管疾病。視網(wǎng)膜病是糖尿病的另一種血管并發(fā)癥。糖尿病視網(wǎng)膜病 是導致失明的主要原因，其通過增加視網(wǎng)膜毛細血管的滲透性而引發(fā)，這種滲透性增加可 進展為堵塞、出血、形成動脈瘤和已知作為增殖性視網(wǎng)膜病的新血管形成。
[0015] 如上所述，謹慎控制血糖與改善I型糖尿病的晚期并發(fā)癥相關(guān)，這表明保留或恢復 β細胞的功能可以減少或消除該疾病的大部分病理性并發(fā)癥。
[0016] 碳水化合物代謝的遺傳性紊亂相當罕見。已在很少的患者（2-6例）中報告丙酮酸 脫氫酶(PDH)復合物的嚴重缺陷以及稱為戊糖尿的良性化學異常。
[0017] 低血糖癥、糖尿病酮癥酸中毒和高滲性昏迷都是有可能致命，但又有可能治愈的 疾病。
[0018] 在W0 2011/016026中，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種新型的分泌蛋白，即PRT5、PRT6、 PRT7和PRT8。特別地，已經(jīng)顯示出PRT8能夠顯著地降低血液中的葡萄糖水平。
[0019] 然而，發(fā)明人現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，縮短的PRT8肽，即sbPRTS具有比完整長度的 PRT8肽改進的生物活性，并且能夠更加顯著地降低血糖水平，而其它的PRT8片段并沒有顯 示出任何實質(zhì)活性。
[0020] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供與PRT8相比具有改進的活性的多肽，以及編碼該 多肽的核酸、載體和細胞。
[0021] 本發(fā)明的另一目的是提供sbPRTS用于治療與血液中葡萄糖過量（即高血糖癥)相 關(guān)的疾病或紊亂的方法和用途。
[0022]本發(fā)明的這些和其它用途、以及其目的將隨著以下描述而變得清楚明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]本發(fā)明的目的是提供一種分離的多肽，其包括：（a)如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列;或(b)與SEQ ID NO: 1具有至少95%相似度的氨基酸序列；其中，所說的多肽能夠降低 血液中的葡萄糖水平。在一個【具體實施方式】中，分離的多肽由如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列組成。在另一【具體實施方式】中，多肽在其N-端通過乙?；鶊F修飾，在其C-端通過酰胺基 團修飾。
[0024] 本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，其包括如上所定義的分離的多肽以及至少 一種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種在治療上為有效量的上述多肽在降低受試者血糖水平方面 的用途。在某些【具體實施方式】中，所說的受試者患有與高血糖癥相關(guān)的疾病或紊亂，這種疾 病或紊亂可以選自但不限于：1型糖尿病、2型糖尿病、代謝綜合征、肥胖癥、腎病、視網(wǎng)膜病、 心血管疾病、腺功能障礙、胰臟疾病、膿毒癥、顱內(nèi)疾病和術(shù)后壓力。
[0026] 本發(fā)明還進一步提供了一種在治療上為有效量的上述多肽在降低受試者血漿甘 油三酯(TG)水平方面的用途。
[0027] 本發(fā)明進一步提供了一種在治療上為有效量的上述多肽在降低受試者血液中糖 化血紅蛋白（HbAlc)水平方面的用途。
[0028] 本發(fā)明進一步提供了編碼多肽的分尚的核酸分子、包括該核酸分子的表達載體、 以及包括該表達載體的宿主細胞；其中，該多肽包括：（a)如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列;或(b)與SEQ ID NO: 1具有至少95%相似度的氨基酸序列。
【附圖說明】
[0029] 圖lA-lB:sbPRT8對經(jīng)鏈脲佐菌素（streptozotocyn，STZ)處理的C57B1/6小鼠的效 果；
[0030] 圖1A:該圖示出注射了 STZ(按50mg/kg的劑量腹腔注射4天)的C57B1/6小鼠在采用 PRT8或sbPRT8治療5周、并按lmg/kg的劑量腹腔注射葡萄糖（IPGTT)后的葡萄糖水平；
[0031] 圖例：-.-PRT8 100yg/每只小鼠；-▲_sbPRT8 20yg/每只小鼠；-_-sbPRT8 100μ g/每只小鼠;Glucose =葡萄糖;Time =注射葡萄糖后的時間；
[0032]圖1B:該圖示出注射了 STZ (按50mg/kg的劑量腹腔注射4天）的C5 7B1 /6小鼠在采用 PRT8或sbPRT8治療4周、并按lmg/kg的劑量腹腔注射葡萄糖（IPGTT)后的葡萄糖水平；
[0033] 圖例：-A-PRT8 100yg/每只小鼠；-_-sbPRT8 100yg/每只小鼠；-?_SbPRT8 300 yg/每只小鼠。
【具體實施方式】
[0034] W0 2011/016026公開了命名為PRT5、PRT6、PRT7和PRT8的新型蛋白。尤其是在胰腺 和睪丸中發(fā)現(xiàn)了 PRT8,且同樣在肝臟中也發(fā)現(xiàn)了 PRT8。特別地，已顯示出PRT8能夠顯著降低 血液中的葡萄糖水平。
[0035]本發(fā)明中，發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)縮短的PRT8肽，即sbPRTS具有比完整長度的 PRT8肽改進的生物活性，并且能夠更加顯著地降低血糖水平。
[0036]因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種分離的多肽，其包括如SEQ ID NO: 1所示的氨 基酸序列，以及其同系物和衍生物;其中，所說的多肽能降低血液中的葡萄糖水平（即降低 血液中的葡萄糖濃度）。
[0037]本文中所使用的術(shù)語"多肽"指多肽或蛋白。多肽可以通過基因工程方法合成而 得，并在宿主細胞中表達，或通過其它合適手段合成而得。除非特別指出，多肽通常由天然 存在的L-氨基酸組成。
[0038] 在某些實施例中，本發(fā)明的多肽在其C-端和/或N-端被修飾。在一個具體的實施例 中，肽被修飾為如下：乙?；鵢(肽序列)_酰胺。在某些其它具體實施例中，本發(fā)明的多肽被 修飾為具有一個或多個選自生物素基團、熒光基團或半胱氨酸殘基的基團。
[0039] 關(guān)于被修飾的多肽、片段、以及其同系物和衍生物，結(jié)合本發(fā)明，應(yīng)理解其保持如 SEQ ID NO: 1所示的多肽的生物活性。為了確定多肽是否保持與未修飾分子在性質(zhì)上相似 的生物活性，可以執(zhí)行一種或多種測定，例如體外、體內(nèi)或臨床實驗，其中將被修飾的多肽 與相應(yīng)的未修飾多肽進行比對，該未修飾的多肽與被修飾的多肽平行測定或單獨地進行實 驗。
[0040] 被修飾的多肽或者變種多肽可以是包括至少兩個、三個或更多個sbPRTS拷貝的多 肽，這些拷貝可選地被氨基酸間隔區(qū)所分隔。被修飾的多肽還可以是與SEQ ID NO: 1具有至 少70%、優(yōu)選為至少80%、更為選為至少90%、特別是至少95%相同度的多肽。
[0041] 本發(fā)明還提供了衍生自sbPRTS的多肽，例如通過保守性置換而將其中一個或多個 氨基酸替換為其它氨基酸的被修飾多肽。如在本文中所使用的，"保守性置換 (conservative substitution)"是指一個類別中的氨基酸被同一類別的氨基酸所取代，其 中的類是通過共同的物理化學氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)以及在天然發(fā)現(xiàn)的同源蛋白中的高置換頻 率來定義的。已經(jīng)劃分了 6種一般種類的氨基酸側(cè)鏈，包括:類別I(Cys);類別II(Ser、Thr、 ?1'〇、厶1&、61}〇;類別111(厶811、厶8卩、6111、6111);類別1￥(]^8、厶坪、1^8);類別￥(116、1^11、\%1、 Met);和類別￥1(?1^、了7廣1'?。?。例如，將48?置換為類別111的另一種殘基，如4811、6111或6111 的置換是保守性置換。
[0042] 在一個實施例中，氨基酸序列中僅有一個置換;在另一實施例中，有兩個置換;在 再一實施例中，有三個置換。置換的最大數(shù)量應(yīng)當不超過如下的氨基酸數(shù)量:在未置換的序 列中保留至少70%、期望為至少80%、優(yōu)選為至少90%、最優(yōu)選為至少95%的氨基酸。在一 個具體實施例中，包括不超過3個、有時不超過6個被其它氨基酸取代的氨基酸殘基的置換 是保守性置換。在另一實施例中，一個或多個氨基酸可以被D-氨基酸、優(yōu)選為對應(yīng)的D-氨基 酸所替換。在一個具體實施例中，所有的氨基酸都是D-氨基酸。
[0043]優(yōu)選的置換是期望不改變多肽的二級結(jié)構(gòu)的變化，即保守性的變化。下表顯示了 可以與原始氨基酸(左側(cè))替換的氨基酸(右側(cè)）。
[0046] 還可以根據(jù)氨基酸的基本特征，如電荷、側(cè)鏈大小等等對氨基酸進行分組。下表顯 示了相似氨基酸的組。優(yōu)選的置換是出現(xiàn)在一個組中的氨基酸與同一組中的氨基酸進行替 換，如下：
[0047] 1、脂族、非極性小殘基:Ala、Ser、Thr、P;ro、Gly;
[0048] 2、極性、負電荷殘基及其酰胺:Asp、Asn、Glu、Gln;
[0049] 3、極性、正電荷殘基:Hi s、Arg、Ly s;
[0050] 4、脂族、非極性大殘基:Met、Leu、Ile、Val、Cys;
[0051] 5、芳香族大殘基:？116、15^、1'印。
[0052]如在下文中所詳細描述的，上文所詳述的優(yōu)選的保守性氨基酸置換期望為基本上 保持或增加本發(fā)明蛋白的功能或活性。當然，其中所得到的多肽保持了其原始功能的任何 氨基酸置換、添加或刪除均被認為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，保守性置換是其中本發(fā)明的 多肽仍然被識別野生型多肽的抗體所識別的置換。
[0053]本發(fā)明的多肽可以通過常規(guī)化學方法，例如固相合成(使用例如FM0C和B0C技術(shù)） 和液相合成而產(chǎn)生。這些蛋白或多肽還可以在細菌細胞、昆蟲細胞或其它體內(nèi)真核轉(zhuǎn)錄系 統(tǒng)中產(chǎn)生。產(chǎn)生之后，多肽從產(chǎn)生它們的細胞中純化出來。多肽的純化和分離方法是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的。有利地，多肽可以作為具有第二蛋白（如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或類似 物）、或序列標簽(如組氨酸標簽(His-標簽)序列）的融合物而產(chǎn)生。融合物或標簽蛋白的應(yīng) 用簡化了純化程序。
[0054] 本發(fā)明的多肽還可以在無細胞系統(tǒng)中合成，例如使用細胞提取物或核糖體。
[0055] 本發(fā)明的多肽可以被進一步修飾，以提高其功能、親和力或穩(wěn)定性。例如，可以使 用環(huán)化作用以賦予多肽更高的穩(wěn)定性和/或全面改進的性能。已經(jīng)開發(fā)了許多不同的環(huán)化 方法，包括側(cè)鏈環(huán)化和骨架環(huán)化，這些方法在現(xiàn)有技術(shù)中已有充分的記載。一種具體的環(huán)化 方法涉及通過使用苯環(huán)的對位取代氨基酸衍生物而實現(xiàn)的兼性分子的α-螺旋的穩(wěn)定作用。 另一種具體的環(huán)化方法是骨架環(huán)化。還可以使用另一種涉及骨架與側(cè)鏈連接的環(huán)化方法。
[0056] 但是，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多肽可以在其Ν-端和/或C-端用多種相同或不同的有 機基團擴展，該有機基團不是天然存在的或合成的氨基酸。作為這種擴展的一個實施例，多 肽可以用Ν-乙?；谄洇?端和/或C-端擴展。
[0057]為了改進多肽結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的多肽可通過其Ν-端與十二烷基-半胱氨酸(LC)殘基 連接和/或通過其C-端與半胱氨酸(C)殘基連接，或與適于將多肽和用于免疫的佐劑連接的 其它殘基連接。
[0058]另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸，其編碼如SEQ ID NO: 1所示的多肽及其 衍生物和類似物。
[0059] 如在本文中所使用的，術(shù)語"核酸分子"意圖包括DNA分子(例如cDNA)、RNA分子(例 如mRNA)、以及使用核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但 優(yōu)選為雙鏈DNA。
[0060]術(shù)語"分離的核酸分子"意圖包括分離自其它核酸分子的核酸分子，且當通過重組 技術(shù)產(chǎn)生時，其基本上沒有其它細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當化學合成時，其基本上沒有化學 前驅(qū)體或其它化學品。
[0061 ]本發(fā)明范圍內(nèi)的衍生物還包括多核苷酸衍生物。多核苷酸衍生物或核酸衍生物不 同于在核苷酸序列中記載的或已知的序列。例如，多核苷酸衍生物的特征可以是一個或多 個核苷酸的置換、插入或刪除。
[0062]本發(fā)明的核酸分子，即具有編碼sbPRTS的核苷酸序列的核酸分子，可以通過使用 標準分子生物學技術(shù)和本文所提供的序列信息而生成。
[0063] 再一方面，本發(fā)明提供了一種載體，其包括分離的核酸分子，該核酸分子能編碼如 SEQ ID NO: 1所示的多肽或其功能性衍生物或類似物的。在該載體的一個實施例中，所說的 核酸分子可操作地連接至啟動子。在另一實施例中，所說的載體是表達載體。
[0064] 如在本文中所使用的，術(shù)語"載體"意圖包括這樣的核酸分子，其能夠?qū)⒘硪缓怂?轉(zhuǎn)運至該核酸分子已經(jīng)連接的位置。載體的特征可以是一個或少量多個限制性核酸內(nèi)切酶 位點，在位點處的這些DNA序列可以以預定的方式切開而不使載體喪失主要的生物學功能， 且在位點處可以連接入DNA片段，以使其得以復制和克隆。載體可以進一步包含適合于用來 標識隨載體轉(zhuǎn)化的細胞的標記物。一種類型的載體是"質(zhì)粒"，其是指額外的DNA片段可以連 接至其中的圓形雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以連接 至病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主復制（如具有細菌復制起 點的細菌載體和游離型哺乳動物載體）。其它載體(如非游離型哺乳動物載體)通過引入到 宿主細胞中而結(jié)合至宿主細胞的基因組，從而隨著宿主基因組而復制。此外，某些載體能夠 引導與它們可操作地連接的基因的表達。在本文中將這樣的載體稱為"表達載體"。一般而 言，在重組DNA技術(shù)中所使用的表達載體通常是以質(zhì)粒的形式。在本說明書中，由于質(zhì)粒是 最通常使用的載體形式，因而"質(zhì)粒"和"載體"可以相互替換地使用。但是，本發(fā)明意圖包括 提供相等功能的其它形式的表達載體，例如病毒載體(如復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和 腺相關(guān)病毒）。
[0065]術(shù)語"可操作地連接"意思是指分子之間彼此功能性連結(jié)，因為一種分子的活性或 狀態(tài)的變化被另一種分子的活性或狀態(tài)所影響。當調(diào)節(jié)序列與編碼目標多肽或蛋白的DNA 序列功能性關(guān)聯(lián)時，核苷酸序列是"可操作地連接"的。例如，如果啟動子核苷酸序列控制編 碼目標蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)錄，則啟動子核苷酸序列與編碼目標多肽的DNA序列可操作地連 接。典型地，兩條可操作地連接的多肽通過肽鍵共價連接。
[0066]又一方面，本發(fā)明提供了一種包括上述載體的細胞，該載體包括能編碼如SEQ ID NO: 1所示的多肽及其衍生物或類似物的分離的核酸分子。在一個具體實施例中，該細胞是 選自由植物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞所組成的組中的宿主細 胞。
[0067]術(shù)語"宿主細胞"和"重組宿主細胞"在本文中可以相互替換地使用。"宿主細胞"包 括能夠通過引入外源DNA而修飾的任何可培養(yǎng)的細胞。優(yōu)選的，宿主細胞是其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋 白可以穩(wěn)定表達、轉(zhuǎn)錄后修飾、定位至合適的亞細胞室并參與合適的轉(zhuǎn)錄組織的細胞。檢測 信號的選擇同樣可以影響到合適宿主細胞的選擇。例如，如上所述，報告子構(gòu)建體能夠基于 應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄的激活或抑制而提供可選擇的或可篩選的特性;為了達到最 佳的選擇或篩選，將考慮宿主細胞的表現(xiàn)型。應(yīng)當理解，這樣的術(shù)語并不僅僅指具體的受試 者細胞，也包括這種細胞的后代或可能的后代。因為在隨后的后代中可能由于突變或環(huán)境 影響而發(fā)生一些變化，這樣的后代事實上可能與親本細胞并不相同，但是它們?nèi)匀话ㄔ?如本文所使用術(shù)語的范圍內(nèi)。
[0068] 本發(fā)明的宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏 陽性生物，例如大腸桿菌或桿菌(Bacilli)。適于用來轉(zhuǎn)化的原核宿主細胞例如包括:大腸 桿菌、枯草芽胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌，以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬內(nèi)的多個 其它種。真核細胞包括但不限于:酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、昆蟲細胞(如桿狀病毒）、 哺乳動物細胞、和寄生物(如錐體蟲)的細胞。
[0069] 如在本文中所使用的，術(shù)語"酵母"不僅包括嚴格分類學意義上的酵母，即單細胞 生物，也包括似酵母的多細胞真菌或絲狀真菌。示例性的種包括乳酸克魯維酵母、粟酒裂殖 酵母和Ustilaqo maydis，其中釀酒酵母是優(yōu)選的。在本發(fā)明實踐中可以使用的其它酵母是 粗糙脈胞菌(Neurospora erassa)、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、畢赤酵母、熱帶假絲酵母和多形漢遜 酉孝母（Hansenula polymorpha)。
[0070] 哺乳動物宿主細胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括已經(jīng)建立的細胞系，例如HeLa細胞、COS細胞、L細 胞、3T3細胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、胚胎干細胞，等等。
[0071] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種包括分離的多肽sbPRTS的組合物;其中，該多肽包 括如上所述的SEQ ID NO: 1所示的序列或其衍生物或類似物。
[0072] 在一個具體實施例中，本發(fā)明所提供的組合物可以進一步包括藥學上可接受的佐 劑、載體、賦形劑或稀釋劑。
[0073] 術(shù)語"藥學上可接受的載體"意思是任意一種不與活性組分反應(yīng)的惰性、無毒材 料。有時基于所期望的制劑形式選擇載體。有時載體還可以具有促進將活性組分遞送或滲 透至目標組織的效果，用于促進藥物的穩(wěn)定性、減緩清除速率、給予慢釋放性質(zhì)、減少不期 望的副作用等。載體也可以是穩(wěn)定制劑的物質(zhì)（如防腐劑），用于為制劑提供可食用的滋味 等。載體可以是通常使用的那些中的任意一種，并僅由化學-物理因素，例如溶解度和缺乏 與本發(fā)明抗體的反應(yīng)性，以及給藥途徑限定。載體可以包括添加劑、著色劑、稀釋劑、緩沖 液、崩解劑、潤濕劑、防腐劑、調(diào)味劑和藥理學上相容的載體。此外，載體可以是佐劑，該佐劑 定義為以可預測的方式影響活性組分作用的物質(zhì)。載體的典型例子包括：（a)液體溶液，其 中有效量的活性物質(zhì)溶解在例如水、鹽水、原汁、醇、糖漿等的稀釋劑中；（b)膠囊(例如包含 如表面活性劑、滑潤劑和惰性填充物的普通硬殼或軟殼凝膠類型）、片劑、糖錠(其中活性物 質(zhì)在調(diào)味料中，如鹿糖和阿拉伯樹膠(acacia)或黃苗膠(tragacanth)中；或者活性物質(zhì)在 惰性基質(zhì)中，如凝膠和甘油中）和錠劑，每一種都包含預定量的作為固體或顆粒的活性試 劑；（c)粉末；（d)在合適液體中的懸浮液;（e)合適的乳狀液;（f)脂質(zhì)體制劑；以及其它。
[0074] 在另一具體實施例中，本發(fā)明的組合物還可以可選擇地進一步包括附加的活性 劑，例如但不限于抗生素、細胞因子、淋巴因子、生長因子、荷爾蒙、抗氧化劑和維生素等等。 [0075]另一方面，本發(fā)明還提供了多肽sbPRTS在制備藥品中的用途，該藥品用于治療與 高血糖癥相關(guān)的疾病或紊亂，尤其是選自由1型糖尿病、2型糖尿病、代謝綜合征、肥胖癥、腎 病、視網(wǎng)膜病、心血管疾病、腺功能障礙、胰臟疾病、膿毒癥、顱內(nèi)疾病和術(shù)后壓力所組成的 組中的疾病或紊亂。
[0076]本文所指的術(shù)語"有效量"意思是實現(xiàn)所挑選的結(jié)果所必需的量，其目前涉及用于 治療紊亂所必需的sbPRTS、或其生物學上的活性衍生物的量。
[0077]所說的治療上的有效量或有效劑量依賴于需要治療的疾病狀態(tài)的嚴重程度和反 應(yīng)性，其療程持續(xù)一小時至幾個小時，一天至幾天，或直到痊愈或疾病狀態(tài)已經(jīng)緩解。普通 技術(shù)人員可以容易地確定最適宜的劑量、定量給藥方法和重復率。最適宜的劑量可以依據(jù) 本發(fā)明的每一種多肽或蛋白、或包含其的組合物的相對效力而變化，并通常基于EC 5Q估計， 這被發(fā)現(xiàn)在動物模型的體外以及體內(nèi)均有效。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地基于測定殘 留時間和濃度而估計給藥重復率，并調(diào)整所采用的多肽或蛋白。
[0078] 本文所使用的術(shù)語"治療"或"處理"的意思是改善患有疾病或紊亂的患者的疾病 活性的一種或多種臨床指示。"處理"指治療性處理。
[0079] "患者"或"需要的受試者"意指期望治療其紊亂或疾病以克服所說紊亂或疾病的 任何哺乳動物，特別是人類受試者。
[0080] 通常，"治療上的有效量"同樣通過疾病的嚴重程度并結(jié)合預防性或治療性目的、 給藥途徑和患者的綜合狀況(年齡、性別、體重和主治醫(yī)生所知道的其它考慮因素)而確定。
[0081] 可以使用多種給藥方法來將本發(fā)明所描述的sbPRTS遞送至需要的受試者。該多肽 或包括該多肽的組合物可以通過靜脈(i.v.)注射、肌內(nèi)（i.m.)注射、腹膜內(nèi)（i.p.)注射、局 部注射或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)的任何其它合適的途徑而遞送。為了有效治療，本發(fā)明 的多肽或蛋白應(yīng)當以使得它們在施用之后能夠在系統(tǒng)中穩(wěn)定的方式制備。
[0082]如在本文中所使用的，術(shù)語"紊亂"是指其中正常功能被擾亂的狀況。"疾病"是致 使受侵襲的人或與這個人接觸的其它人不適、功能不良或苦惱的身體或精神上的任何異常 狀況。有時，該術(shù)語被廣泛使用為包括傷害、先天性畸形、殘疾、綜合征、癥狀、不正常行為、 結(jié)構(gòu)和功能的非典型變化、以及由疾病所導致的慢性或永久性健康缺陷。
[0083]術(shù)語"疾病"、"紊亂"、"狀況"和"病"在本文中可以相互替換地使用。
[0084] 當本文中指稱受試者時，該受試者可以是人類或者非人類的哺乳動物。非人類的 哺乳動物包括但不限于牛、馬、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠等等。通常，受試者為人類，尤其是患 者或健康的人。
[0085] 如所公開和描述的，應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文所公開的具體實施例、方法步驟和 材料，因為這些方法步驟和材料可以有些變化。也應(yīng)理解，由于本發(fā)明的范圍將只通過所附 權(quán)利要求以及其等同物加以限制，因而本文所使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的 而無限制意圖。
[0086] 必須注意的是，除非上下文另外清楚指出，如在本說明書及其所附權(quán)利要求中所 使用的，單數(shù)形式的"一"和"該"包括復數(shù)的指稱對象。
[0087] 在本說明書以及其所附的權(quán)利要求中，除非上下文另有需要，術(shù)語"包括"及其變 化形式如"包含"、"含有"將理解為意指包括確定的整體或步驟、或整體或步驟的集合，但是 不排除任何其它整體或步驟、或整體或步驟的集合。
[0088] 如在本文中所使用的，"與高血糖癥相關(guān)的疾病或紊亂"是指其中過量的葡萄糖在 血漿內(nèi)循環(huán)的疾病或紊亂。這通常是葡萄糖水平高于ll.lmmol/l(200mg/dl)，但直到甚至 更高值，例如15-20mmol/l (~250-300mg/dl)，癥狀才開始變得可以察覺。根據(jù)美國糖尿病 協(xié)會指南，受試者的葡萄糖水平持續(xù)處于100至126的范圍內(nèi)時考慮為血糖過高，而高于 126mg/dl或7mmol/l則通常被認為患有糖尿病，水平長期超過7mmol/l(125mg/dl)可以產(chǎn)生 器官損害。與高血糖癥相關(guān)的疾病或紊亂包括:糖尿?。?型和2型）、腎病、視網(wǎng)膜病、心血管 疾?。ㄈ缰酗L、心肌梗死）、腺功能障礙(如甲狀腺、腎上腺或垂體）、胰臟疾病、膿毒癥、顱內(nèi) 疾病(如腦炎、腦瘤、腦出血、腦膜炎）。持續(xù)很久的大手術(shù)可以臨時性地增加葡萄糖水平。最 近的結(jié)果還表明，在非禁食狀態(tài)下，以不依賴于血漿胰島素或游離脂肪酸水平的方式，急性 高血糖癥通過刺激肝臟的TG分泌物而增加血漿甘油三酯(TG)。
[0089] 如在本文中所使用的，"糖化血紅蛋白"（又稱為血紅蛋白Alc、HbAlc、AlC、HblcS HbAlc)是這種形式的血紅蛋白，其主要被測定來確定血漿葡萄糖在長期時間內(nèi)的平均濃 度。它通過血紅蛋白暴露于血漿葡萄糖的非酶糖基化途徑形成。正常水平的葡萄糖產(chǎn)生正 常量的糖化血紅蛋白。隨著血漿葡萄糖平均量的增加（高血糖癥），糖化血紅蛋白部分以可 預測的方式增加。在糖尿病中，更高量的糖化血紅蛋白已經(jīng)與心血管疾病、腎病和視網(wǎng)膜病 相關(guān)聯(lián)。
[0090] 以下實施例代表發(fā)明人在實施本發(fā)明方面時所采用的代表性技術(shù)。應(yīng)當理解，雖 然這些技術(shù)是用于實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的示例，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開將 認識到可在不脫離本發(fā)明預期范圍的條件下進行許多修改。
[0091] 除非特別定義，本文所使用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。
[0092] 比較例1
[0093] 與PRT8施用相比，sbPRT8施用對經(jīng)鏈脲佐菌素(STZ)處理的C57B1/6小鼠葡萄糖水 平的效果
[0094]在以下實驗中，采用了在其N-端嵌段有乙酰基團且在其C-端嵌段有酰胺基團 (NH2)的sbPRT8肽。在經(jīng)鏈脲佐菌素(STZ)處理的小鼠中檢驗sbPRT8施用對葡萄糖水平的效 果，并將其與PRT8施用所起到的效果進行比對。本領(lǐng)域技術(shù)人員習知，STZ是一種對哺乳動 物中產(chǎn)生胰島素的胰腺細胞具有特別毒性的化合物，其在醫(yī)學上用于治療朗格漢斯島的 某些癌癥，并在醫(yī)學研究中用于產(chǎn)生1型糖尿病和2型糖尿病的動物模型。
[0095] 實施例1:
[0096] 從位于以色列耶路撒冷的Harlan Laboratories Ltd.購得C57B1/6雄性小鼠。經(jīng) 過7天的休息后，按50mg/kg的劑量對小鼠 IP注射STZ 4天。在STZ注射的5天之后，對小鼠進 行如下處理：
[0097] -A組（對照）-PRT8100yg/每只小鼠（對照）
[0098] -B組(處理)-sbPRTMOyg/每只小鼠（處理1)
[0099] -C組(對照）-sbPRT81 OOyg/每只小鼠（處理2)
[0100] 在經(jīng)過5周的處理后，僅使小鼠饑餓12個小時，然后按lmg/kg的劑量對其IP注射葡 萄糖溶液（IPGTT)。在葡萄糖注射之后的第0、15、30、60、90和120分鐘，采用4(^11(*6(^血糖 檢測儀(Roche)測量小鼠血液中的葡萄糖水平。
[0101] 實施例2:
[0102] 從位于以色列耶路撒冷的Harlan Laboratories Ltd.購得C57B1/6雄性小鼠。經(jīng) 過7天的休息后，按50mg/kg的劑量對小鼠 IP注射STZ 4天。在STZ注射的5天之后，對小鼠進 行如下處理：
[0103] -A組(對照)-PRT8100yg/每只小鼠（對照）
[0104] -B組（處理）-sbPRT8100yg/每只小鼠（處理1)
[0105] -C組(對照）-sbPRT8300yg/每只小鼠（處理2)
[0106] 在經(jīng)過4周的處理后，僅使小鼠饑餓12個小時，然后按lmg/kg的劑量對其IP注射葡 萄糖溶液（IPGTT)。在葡萄糖注射之后的第0、15、30、60、90和120分鐘，采用4(^11(*6(^血糖 檢測儀(Roche)測量小鼠血液中的葡萄糖水平。
[0107] 結(jié)果顯示于圖1A-1B。在所有處理中，葡萄糖水平在注射后的第30分鐘達到峰值。 雖然注射PRT8使得小鼠的血糖水平顯著降低，但是注射sbPRTS在降低血糖水平方面顯示了 令人驚訝且非常顯著的改進。這些結(jié)果清楚地證明SEQ ID N0:1肽（sbPRT8,其是PRT8的C-端片段），具有比完整長度的PRT8肽改進的葡萄糖降低活性。采用兩種其它的PRT8片段，即 SEQ ID N0:2(PRT8N-ter)和SEQ ID N0:3(PRT8C-ter)進行了類似的實驗，與采用sbPRT8所 獲得的結(jié)果相反，沒有觀察到顯著的血糖降低。
[0108] 從上述內(nèi)容可知，在葡萄糖代謝調(diào)節(jié)和血糖水平降低方面，與完整長度的PRT8肽 相比較，短肽sbPRT8表現(xiàn)出顯著的改進潛力。因此，sbPRT8在治療與高血糖癥相關(guān)的疾病或 紊亂方面可以具有重大意義。另外，sbPRT8可以用于降低糖化血紅蛋白的血液水平(HbAlc 水平)和降低血漿甘油三酯(TG)水平，因為這兩種水平都是與血糖濃度密切相關(guān)的。
[0109] 提供以上全部描述和實施例的目的在于說明而非以任何方式限制本發(fā)明。
【主權(quán)項】
1. 一種分離的多肽，其包括：（a)如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；或（b)與SEQ ID NO: 1具有至少95%的相似度的氨基酸序列;其中，所述的多肽能降低血液中的葡萄糖濃度。2. 如權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其由如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列組成。3. 如權(quán)利要求1或2所述的分離的多肽，其中，所述的多肽在其N-端通過乙?；鶊F修飾， 在其C-端通過酰胺基團修飾。4. 一種藥物組合物，其包括如權(quán)利要求1至3之一所述的分離的多肽、以及至少一種藥 學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。5. -種如權(quán)利要求1至3之一所述的分離的多肽或者如權(quán)利要求4所述的藥物組合物在 治療與高血糖癥相關(guān)的疾病或紊亂方面的用途;其中，所述疾病或紊亂選自于如下一組：1 型糖尿病、2型糖尿病、代謝綜合征、肥胖癥、腎病、視網(wǎng)膜病、心血管疾病、腺功能障礙、胰臟 疾病、膿毒癥、顏內(nèi)疾病和術(shù)后壓力。6. -種如權(quán)利要求1至3之一所述的分離的多肽或者如權(quán)利要求4所述的藥物組合物在 降低血糖水平方面的用途。7. -種如權(quán)利要求1至3之一所述的分離的多肽或者如權(quán)利要求4所述的藥物組合物在 降低血漿中甘油三酯(TG)水平方面的用途。8. -種如權(quán)利要求1至3之一所述的分離的多肽或者如權(quán)利要求4所述的藥物組合物在 降低血液中糖化血紅蛋白（HbAl c)水平方面的用途。9. 一種編碼如權(quán)利要求1至3之一所述多肽的分離的核酸分子。10. -種包括如權(quán)利要求9所述的核酸分子的表達載體。11. 一種包括如權(quán)利要求10所述的表達載體的宿主細胞。
【文檔編號】C07K7/08GK105916874SQ201480072200
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年12月30日
【發(fā)明人】塔馬蕾·桑德勒, 奧利·迪瓦里
【申請人】兩合生物科技有限公司