專利名稱：一種檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)β -內(nèi)酰胺酶的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，動(dòng)物源食品中的藥物殘留日益受到國(guó)際社會(huì)的重視。 內(nèi)酰胺類抗生素作為發(fā)現(xiàn)最早、用量最多的一類抗生素，在牛乳及動(dòng)物組織中殘留檢出
報(bào)道最多。內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青霉素類和頭孢菌素類，其作用特點(diǎn)是能夠抑制細(xì)菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性，從而阻止細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，呈現(xiàn)殺菌活性。在動(dòng)物生產(chǎn)中，內(nèi)酰胺類抗生素廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動(dòng)物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘留，給人類健康帶來(lái)嚴(yán)重危害，如產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、破壞胃腸道菌群平衡和增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性等。更為重要的是，抗生素被過(guò)量食入健康人腸道，會(huì)破壞健康人的正常菌群環(huán)境，導(dǎo)致人體免疫力的降低，從而危害消費(fèi)者的身體健康。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)了 “生鮮牛乳抗生素分解劑”，該分解劑的主要成分是β -內(nèi)酰胺酶，在我國(guó)內(nèi)酰胺酶是不允許使用的食品添加劑，嚴(yán)禁將內(nèi)酰胺酶加入到有抗生素的奶中用于分解抗生素。目前對(duì)內(nèi)酰胺酶常用的檢測(cè)方法主要有液相法及微生物法， 但是液相法雖然準(zhǔn)確度高，但是存在操作復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員要求高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，成本高等缺點(diǎn)，微生物檢測(cè)方法成本低，但是檢測(cè)靈敏度低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，耗時(shí)長(zhǎng)，不適合現(xiàn)場(chǎng)使用。因此，在實(shí)踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡(jiǎn)單、成本低、適合大規(guī)模推廣的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)β -內(nèi)酰胺酶的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒包括微孔試劑、酶測(cè)試劑和試紙，酶測(cè)試劑和微孔試劑均具有微孔塞，試紙包括底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜，其依次連接；所述微孔試劑中凍干有頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物，所述酶測(cè)試劑中凍干有青霉素藥物； 頭孢類藥物特異性抗體可為頭孢類藥物單克隆抗體或頭孢類藥物多克隆抗體；反應(yīng)膜上包被有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；當(dāng)頭孢類特異性抗體為頭孢類藥物單克隆抗體時(shí)，檢測(cè)區(qū)包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠抗抗體；當(dāng)頭孢類藥物特異性抗體為頭孢類藥物多克隆抗體時(shí)，檢測(cè)區(qū)包被頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗兔抗抗體。所述保護(hù)膜粘貼在試紙兩端，其中一端粘貼在樣品吸收墊上，為檢測(cè)端，上面有 MAX標(biāo)記線，另一端粘貼在吸水墊上為手柄端。所述檢測(cè)區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一側(cè)，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離所述有 MAX標(biāo)記線的保護(hù)膜的一側(cè)。所述頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物是由頭孢類藥物與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。所述頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的頭孢類藥物特異性抗體是以頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得。所述底板可由不吸水的韌性材料制成，如硬質(zhì)塑料、不吸水硬紙，具體可為PVC板材；樣品吸收墊可為吸濾紙或慮油紙；吸水墊為濾紙；反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或?yàn)榧兝w維素膜；所述保護(hù)膜可為PE材質(zhì)的保護(hù)膜。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種制備上述試劑盒的方法，其包括步驟1)制備凍干有頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；2)制備凍干有青霉素藥物的酶測(cè)試劑；3)制備具有包被頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)區(qū)和包被抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；4)將3)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙5)將1) ,2)和幻制備好的微孔試劑、酶測(cè)試劑和試紙組裝成試劑盒。具體的說(shuō)，步驟包括1)將頭孢類藥物與載體蛋白偶聯(lián)，形成頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物；2)用頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)融合、篩選，得到分泌頭孢類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株或用頭孢類藥物-載體蛋白免疫兔，得到頭孢類藥物多克隆抗體；3)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗體或羊抗兔抗抗體；4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；5)將制備的頭孢類藥物特異性抗體加入到制備的膠體金中，得到頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物；6)將頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑微孔中后，將微孔試劑加上微孔塞；7)將青霉素藥物凍干到酶測(cè)試劑微孔中；8)將樣品吸收墊用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0. 5% (體積百分含量))、PH為7. 2,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡池，在37°C下烘干池；9)在底板上按順序貼上樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜；10)將制備好的微孔試劑、酶測(cè)試劑和試紙裝入組裝成試劑盒，2_8°C條件下保存 6個(gè)月本發(fā)明的另一個(gè)目的提供了一種牛奶樣本中內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法。用本發(fā)明上述任一所述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理將待檢樣本液滴加于酶測(cè)試劑，混勻后，40°C 50°C 保溫25min，后室溫回溫10 15min，將回溫后的酶測(cè)試劑滴加于微孔試劑條中，混勻，孵育 5min，將標(biāo)有MAX線標(biāo)記端向下，插入孵育后的微孔試劑，待檢樣品液與微孔中的金標(biāo)抗體結(jié)合后一起向反應(yīng)膜擴(kuò)散；若待檢樣品液含有中β -內(nèi)酰胺酶，則β -內(nèi)酰胺酶分解酶測(cè)試劑中青霉素藥物，則金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)不能被封閉，進(jìn)而金標(biāo)抗體會(huì)與反應(yīng)膜上頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測(cè)區(qū)顯色，同時(shí)抗抗體也可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色；若待檢樣品液中不含有內(nèi)酰胺酶很低，則酶測(cè)試劑中的青霉素不會(huì)被分解，則擴(kuò)散過(guò)程中青霉素藥物可與金標(biāo)抗體結(jié)合，進(jìn)而完全封閉金標(biāo)抗體上內(nèi)酰胺類抗生素的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與反應(yīng)膜上偶聯(lián)頭孢類藥物載體蛋白，檢測(cè)區(qū)不顯色。如果質(zhì)控區(qū)不顯色，則試紙失效。如圖3所示。陰性當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，而檢測(cè)區(qū)⑴不顯色，判為陰性，用“_”表
7J\ ο陽(yáng)性當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，而檢測(cè)區(qū)⑴顯色，判為陽(yáng)性，用“ + ”表示。無(wú)效當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)不顯示紅色條帶，則無(wú)論檢測(cè)區(qū)⑴是否出現(xiàn)紅色條帶，試紙均失效。本發(fā)明的試劑盒具有敏感度高、特異性高、成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。其中，采用高特異性的頭孢類藥物單克隆抗體，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性；將金標(biāo)抗體凍干在微孔試劑中，在檢測(cè)過(guò)程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個(gè)體系的反應(yīng)靈敏度。用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)內(nèi)酰胺類抗生素的方法，簡(jiǎn)便、快速、直觀、準(zhǔn)確，適用范圍廣，成本低，易推廣使用。


圖1為試紙剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為試紙的俯視圖。圖3為試紙檢測(cè)結(jié)果判定圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、檢測(cè)β -內(nèi)酰胺酶的試劑盒的構(gòu)成一、微孔試劑 所述微孔試劑上具有微孔塞；所述微孔試劑上凍干有膠體金標(biāo)記的頭孢類藥物單克隆抗體，包被量 0. 15-0. 20μ g/ml。二、酶測(cè)試劑所述酶測(cè)試劑微孔板具有微孔塞；所述酶測(cè)試劑微孔板上凍干有青霉素藥物，包被量0. 15-0. 20 μ g/ml。二、試紙(稱作試紙條)(圖1)所述試紙是由底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜組成；所述樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜依次按順序黏貼在所述底板6上， 樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；所述試紙兩端黏貼有保護(hù)膜。保護(hù)膜7-1覆蓋在吸水墊上手柄端，保護(hù)膜7-2覆蓋在樣品吸收墊上的檢測(cè)端，在檢測(cè)端保護(hù)膜上應(yīng)有MAX字樣(圖2)。所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)區(qū)4和質(zhì)控區(qū)5，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均為與所述試紙條的長(zhǎng)相垂直的條帶狀，檢測(cè)區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記線的保護(hù)膜的一側(cè)，質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離所述有MAX 標(biāo)記的保護(hù)膜的一側(cè)。檢測(cè)區(qū)包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物(頭孢類藥物-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物)，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體。底板由PVC板材制成；樣品吸收墊由尼龍膜制成；吸水墊為慮紙；反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)的保護(hù)膜。將上述試紙與微孔試劑、酶測(cè)試劑組裝成試劑盒，在2 8°C的環(huán)境中儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。實(shí)施例2、實(shí)施例1中所述試劑盒的制備方法一、試劑盒的制備該試劑盒的制備方法主要包括如下步驟1)制備凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑板；2)制備凍干有青霉素藥物的酶測(cè)試劑；3)制備具有包被頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；4)將3)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；5)將1)、2)和3)制備好的微孔試劑、酶測(cè)試劑和試紙組裝成試劑盒。下面分步詳細(xì)敘述(一 )各部件的制備1、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定頭孢類藥物是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。2)免疫原的制備-頭孢類藥物與卵清蛋白偶聯(lián)物合成取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1. 5ml雙蒸水溶解，得到⑴液；取EDC40mg和NHS60mg 用0. 5ml水溶解得到(II)液；在攪拌狀態(tài)下將(II)加入(I)中，反應(yīng)lh，得到(III)液； 取卵清蛋白60mg用8ml水溶解，得到(IV)液；將(IV)加入(III)中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h分別得到免疫原，用0. 02M PBS透析3天，分裝、凍存。3)包被原的制備-頭孢類藥物與牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1. 5ml雙蒸水溶解，得到⑴液；取EDC40mg和NHS60mg 用0. 5ml水溶解得到(II)液；在攪拌狀態(tài)下將(II)加入(I)中，反應(yīng)lh，得到(III)液； 取牛血清白蛋白IOOmg用8ml水溶解，得到(IV)液；將(IV)加入(III)中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 24h分別得到免疫原，用0. 02M PBS透析3天，分裝、凍存。4)頭孢類藥物-載體偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7. 4的PBS配成 0. 5mg/ml的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200-800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明頭孢類藥物與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、頭孢類藥物單克隆抗體的制備(1)制備單抗a.動(dòng)物免疫
將步驟1得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)
生抗血清。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合， 篩選得到穩(wěn)定分泌頭孢類藥物單克隆抗體的頭孢類藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-20°C保存。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為0. 2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。3、羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(1)膠體金的制備用雙蒸去離子水將氯金酸(購(gòu)于sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)T09041)稀釋成 0.01% (質(zhì)量百分含量)，置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入 2. 5mll%檸檬酸三鈉(購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠，產(chǎn)品目錄號(hào)BG11-AR-01KG)，繼續(xù)攪拌加熱反應(yīng)至液體呈紅色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無(wú)沉淀和漂浮物。(2)頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下，用0. 2mol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至7. 0，按50-100 μ g抗體/ml 膠體金的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述頭孢類藥物單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入 10% BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為(體積百分含量)，靜置30min。12000rpm、 4°C離心30min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，得到的頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物溶液的濃度為50ug 單抗/ml溶液，置4°C備用。復(fù)溶緩沖液含酪蛋白、吐溫-80的0. 02mol/L、pH7. 2的磷酸鹽溶液，其中酪蛋白在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0. 05-0. 1% (體積百分含量)，吐溫-80在復(fù)溶緩沖液中的終濃度為0. 05-0. 15% (質(zhì)量百分含量)。5、將頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 μ 1頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度為-70°C條件下，預(yù)凍4h后，再凍干14h，即可取出，得到凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑。6、將青霉素藥物凍干到酶測(cè)試劑微孔板上向酶測(cè)試劑微孔板中加入100 μ 1青霉素藥物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度
7為-70°C條件下，預(yù)凍4h后，再凍干14h，即可取出，得到凍干有青霉素藥物的酶測(cè)試劑。7、樣品吸收墊的準(zhǔn)備將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0. 5% (體積百分含量))、pH為7. 2、0. lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C 烘池備用；8、反應(yīng)膜的制備包被過(guò)程用磷酸緩沖液將頭孢類藥物-牛血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL， 用Biodot點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)，包被量為1. Ομ g/cm2 ；用0. 01M、pH 7. 4PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200μ g/ml，用Biodot點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)，包被量為1.0 μ g/cm2。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥池，備用。( 二)各部件的組裝1、試紙的組裝將所述樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次按順序黏貼在所述底板上；樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；在組裝好試紙兩端黏貼保護(hù)膜。2、試劑盒組裝將上述步驟1得到試紙與微孔試劑、酶測(cè)試劑組裝成試劑盒，在2 8°C的環(huán)境中儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。二、試劑盒的靈敏度和特異性檢驗(yàn)(一)靈敏度試驗(yàn)將β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)61305)；稀釋成如下不同濃度 0、0. 5、1、2IU/L ；所用的稀釋液為PH為6. 6,0. 2mol/L的碳酸鹽緩沖液。用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每次向酶測(cè)試劑微孔中滴加250 μ 1待檢樣品，40°C 50°C 保溫25min，后室溫回溫10 15min ；將回溫后的酶測(cè)試劑滴加于微孔試劑板中，混勻，孵育5min，將標(biāo)有MAX標(biāo)記線端向下，插入孵育后的微孔試劑反應(yīng)，結(jié)果為滴試0、0. 5IU/L β -內(nèi)酰胺酶時(shí)，試紙上檢測(cè)區(qū)不顯色，質(zhì)控區(qū)顯色，呈陰性；滴試1、2IU/L β -內(nèi)酰胺酶時(shí)，試紙上檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均顯色，呈陽(yáng)性；表明，本試劑盒對(duì)內(nèi)酰胺酶檢測(cè)靈敏度為 1IU/L。實(shí)施例3、試紙的應(yīng)用一、用實(shí)施例1中所述試劑盒檢測(cè)牛奶中β -內(nèi)酰胺酶本發(fā)明的試劑盒可以檢測(cè)牛奶樣品。一般的檢測(cè)方法如下1)檢測(cè)方法向酶標(biāo)試劑板孔中滴加需檢測(cè)的樣品溶液，混勻后，45 V保溫25min，室溫回溫 lOmin，將回溫后的酶測(cè)試劑滴加200μ 1于微孔試劑板中，混勻后，將試紙有MAX線標(biāo)記端朝下插入微孔試劑板孔中，在5min內(nèi)觀看結(jié)果。2)結(jié)果判定β -內(nèi)酰胺酶在樣品中濃度高于或等于試劑盒最低檢測(cè)限時(shí)，β -內(nèi)酰胺酶分解酶測(cè)試劑中的青霉素藥物，膠體金抗體則不能與青霉素藥物結(jié)合，從而在檢測(cè)區(qū)內(nèi)金標(biāo)抗體與頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而出現(xiàn)紅色條帶，呈陽(yáng)性。陰性樣品在檢測(cè)過(guò)程中， 青霉素藥物不被分解，與金標(biāo)抗體結(jié)合后，金標(biāo)抗體的內(nèi)酰胺類抗生素的抗原結(jié)合位
8點(diǎn)被封閉，金標(biāo)抗體將不與檢測(cè)區(qū)頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測(cè)區(qū)不顯色，質(zhì)控區(qū)顯色。如圖3所示。陽(yáng)性當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，而檢測(cè)區(qū)⑴不顯色時(shí)，判為陰性，用“_”。 如圖3a所示陽(yáng)性當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，檢測(cè)區(qū)⑴顯示紅色條帶，判為陽(yáng)性，用 “ +，，。如圖北所示無(wú)效當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)不顯示出紅色條帶，則無(wú)論測(cè)試區(qū)(T)顯示出紅色條帶與否， 該試紙判為無(wú)效。如圖3c、3d所示下面具體舉例取已知β -內(nèi)酰胺酶含量大于1IU/L的牛奶陽(yáng)性樣品20份和濃度小于1IU/L的牛奶樣本陰性樣品20份，用3個(gè)批次生產(chǎn)的試劑盒分別進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其陰陽(yáng)性率。表1、檢測(cè)陽(yáng)性樣本結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)內(nèi)酰胺酶的試劑盒，其特征在于包括試紙、微孔試劑和酶測(cè)試劑，所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜、底板組成，所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)， 檢測(cè)區(qū)包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體，所述微孔試劑上凍干有頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物，所述酶測(cè)試劑板孔上凍干有青霉素藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次黏貼在底板上組成，所述微孔試劑和酶測(cè)試劑板孔上均具有微孔塞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述保護(hù)膜粘貼在試紙兩端，其中一端有MAX標(biāo)記線，另一端為手持端。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一側(cè)，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離所述有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一側(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物由頭孢類藥物與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、 甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的頭孢類藥物特異性抗體是以頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得，所述頭孢類藥物特異性抗體可為頭孢類藥物單克隆抗體或頭孢類藥物多克隆抗體。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶中的應(yīng)用。
8.一種制備權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒方法，其包括步驟1)制備凍干有頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；2)制備凍干有青霉素藥物的酶測(cè)試劑；3)制備具有包被頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)區(qū)和包被抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；4)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、保護(hù)膜、吸水墊、底板組裝成試紙；5)將1)、幻和4)制備好的凍干有頭孢類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試劑盒。
9.一種內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法，其包括步驟1)用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；2)分析檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的試劑盒及方法。試劑盒包括微孔試劑、酶測(cè)試劑和試紙，所述微孔試劑中凍干有頭孢類藥物特異性-膠體金標(biāo)記物，所述酶測(cè)試劑中凍干有青霉素藥物，所述頭孢類藥物特異性抗體為頭孢類藥物單克隆抗體或頭孢類藥物多克隆抗體；所述試紙由底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜，依次連接組成，所述反應(yīng)膜上包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)區(qū)包被有頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體。所述反應(yīng)膜上包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)區(qū)包被有頭孢類藥物和載體蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體。用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的方法，簡(jiǎn)便、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
文檔編號(hào)C07K16/44GK102455357SQ201010521870
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者萬(wàn)宇平, 何麗霞, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 馮靜, 崔海峰, 李勇, 汪善良, 王建霞, 羅曉琴, 趙正苗 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司