一種人體β淀粉樣蛋白檢測試劑盒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人體β淀粉樣蛋白檢測試劑盒及其用途，首先使用抗原β淀粉樣前體蛋白免疫小鼠，確定免疫成功后，分離出小鼠脾臟和小鼠體內(nèi)明顯的淋巴結(jié)，提取總的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴增出抗體的輕、重鏈基因；然后組裝與擴增scFvDNA，構(gòu)建pCANTAB5E-scFv重組質(zhì)粒；再轉(zhuǎn)化質(zhì)粒得到單鏈抗體噬菌體庫，通過篩選得到目標抗體；最后組裝成人體β淀粉樣前體蛋白檢測試劑盒。本發(fā)明篩選得到的抗體檢測范圍較廣，為0~1000pg/ml，線形相關(guān)系數(shù)高，檢測靈敏度可達3.5pg/ml，且非常穩(wěn)定，檢測時可采用兩步法、室溫振蕩的反應(yīng)模式，對實驗室條件及設(shè)備要求不高。
【專利說明】一種人體β淀粉樣蛋白檢測試劑盒及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種人體β淀粉樣蛋白檢測試 劑盒及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 人口老齡化是當今世界各國面臨的重大社會問題，已經(jīng)引起國際社會的廣泛關(guān) 注。據(jù)有關(guān)方面統(tǒng)計，我國北京、上海等大城市已邁入了老齡城市，下個世紀前半期我國就 將進入老齡社會，老年人的心理及身體健康問題日益成為全社會關(guān)注的焦點。老年癡呆癥 是老年人腦部功能失調(diào)的一種表現(xiàn)，是以智力衰退、行為及人格變化為特征。典型臨床癥狀 包括有記憶力、抽象思考、定向力障礙，同時伴有社會活動能力減退。主要表現(xiàn)為健忘、目光 呆滯、口齒遲鈍，繼而影響知覺神經(jīng)，失去自理能力。它已成為老年人健康的一大克星。
[0003] 阿爾茲海默病（Alzheimer' s disease, AD)是老年癡呆癥一種常見形式。目前全 世界大約有2500萬AD患者。患者多為老年人,AD目前尚無有效療法。該病患不僅患者自 身痛苦，而且對于其家庭乃至整個社會都會造成極為消極的影響。迄今為止，AD發(fā)病的確切 機理尚未完全清楚。但大量研究支持，淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP) 產(chǎn)生的淀粉樣蛋白（amyloid 1-Peptide，A1)在AD的病理學(xué)上起了重要作用?；颊叽竽X 中β淀粉樣蛋白出現(xiàn)異常蓄積，常在患者腦細胞內(nèi)形成腦纖維組織糾結(jié)（neurofibrillary tangle, NFT)、腦細胞外形成老年斑（senile plague, SP)。因此，NFT和SP也被認為AD的 病理診斷依據(jù)。β淀粉樣蛋白（β-Amyloid)是由前體物質(zhì)β淀粉樣前體蛋白（Αβ)經(jīng)酶 解作用形成40到43個氨基酸的多肽。在機體內(nèi)，ΑΡΡ普遍存在于人體的心臟、腦、腎、肺、 腸等器官。在腦中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元、星形細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞 均能表達ΑΡΡ。正常情況下，Αβ僅有極少量表達，低濃度的Αβ對未分化、不成熟的神經(jīng)元 有營養(yǎng)作用，而高濃度的Α β對已分化的成熟神經(jīng)元則有毒性作用。Α β的沉淀與ΑΡΡ的過 度表達和異常加工有關(guān)，ΑΡΡ經(jīng)β、γ分泌酶降解產(chǎn)生Α β生成可溶性和不可溶性兩種狀 態(tài)，不溶的以β折疊為主，上述構(gòu)象有利于Α β的聚集。Α β在形成高密度、纖維狀的聚合 體后可引起神經(jīng)毒性，從而妨礙神經(jīng)細胞的正常生長與傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞的死亡，弓丨 發(fā)AD。
[0004] 目前，臨床對于老年癡呆癥的治療，首先考慮的是對癥治療，如，神經(jīng)節(jié)苷脂能有 效修復(fù)受損或瀕死的腦神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)的修復(fù)再生及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重塑；補充膽堿類藥 物能改善其記憶和思維能力。研究β淀粉樣蛋白在腦神經(jīng)細胞內(nèi)部的早期蓄積發(fā)現(xiàn)，在腦 神經(jīng)細胞外還未出現(xiàn)β淀粉樣蛋白蓄積時，阿爾茨海默氏癥就已經(jīng)出現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)或有助 于提早診斷、治療阿爾茨海默氏癥，從而盡可能延緩病情惡化。研發(fā)人體β淀粉樣蛋白檢 測試劑或試劑盒，尤其是操作方便、檢測范圍廣、靈敏度高的檢測抗體是十分重要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種分離的結(jié)合分子。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的結(jié)合分子的用途。
[0007] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種核酸分子。
[0008] 本發(fā)明的第四個目的是，提供所述的核酸分子的用途。
[0009] 本發(fā)明的第五個目的是，提供一種表達載體。
[0010] 本發(fā)明的第六個目的是，提供一種宿主細胞。
[0011] 本發(fā)明的第七個目的是，提供一種組合物。
[0012] 本發(fā)明的第八個目的是，提供一種檢測阿爾茨海默氏癥的試劑盒。
[0013] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種分離的結(jié)合分子，其能識別并結(jié)合人體β淀粉樣蛋白或人體β淀粉樣前體蛋白， 所述的結(jié)合分子包含SEQ ID Ν0. 2所示的氨基酸序列。
[0014] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 所述的結(jié)合分子在制備檢測、治療和/或預(yù)防阿爾茨海默氏癥的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 編碼所述的結(jié)合分子的核酸分子。
[0016] 所述的核酸分子序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 所述的核酸分子在制備檢測、治療和/或預(yù)防阿爾茨海默氏癥的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種表達載體，所述的表達載體中含有編碼如上所述的結(jié)合分子的DNA。
[0019] 為實現(xiàn)上述第六個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種宿主細胞，所述的宿主細胞中含有如上所述的表達載體。
[0020] 為實現(xiàn)上述第七個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種組合物，所述的組合物含有有效量的如上所述的結(jié)合分子，以及藥學(xué)上可接受的 載體。
[0021] 為實現(xiàn)上述第八個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種檢測阿爾茨海默氏癥的試劑盒，其包括如上所述的結(jié)合分子。
[0022] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 1、 本發(fā)明篩選的抗體非常穩(wěn)定，檢測時采用兩步法、室溫振蕩的反應(yīng)模式，此方法具有 操作簡便、反應(yīng)快捷的優(yōu)點，對實驗室條件及設(shè)備要求不高，易于掌握和推廣； 2、 本發(fā)明的試劑盒檢測范圍較廣，其檢測范圍為(TlOOOpg/ml，與市場主流產(chǎn)品相比， 該試劑盒線形相關(guān)系數(shù)更高； 3、 本發(fā)明的試劑盒靈敏度較高，其檢測靈敏度最高可達3. 5pg/ml，可用于老年癡呆癥 早期檢測。
[0023] 總體來說，本發(fā)明的試劑盒其質(zhì)量及使用效果都達到了國內(nèi)外領(lǐng)先的水平。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 附圖1是pCANTAB-5E載體圖譜。
[0025] 附圖2是血清抗體效價檢測結(jié)果。
[0026] 附圖3是重鏈、輕鏈基因擴增產(chǎn)物的電泳圖譜。
[0027] 附圖4是VH和八連接后的ScFv基因的電泳圖譜。
[0028] 附圖5是篩選的單鏈抗體的電泳圖譜。
[0029] 附圖6是BioSource公司試劑盒的線性擬合曲線。
[0030] 附圖7是本發(fā)明試劑盒的線性擬合曲線。

【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0032] 本發(fā)明的技術(shù)路線是： 首先，使用抗原β淀粉樣前體蛋白免疫小鼠，確定免疫成功后，分離出小鼠脾臟和小 鼠體內(nèi)明顯的淋巴結(jié)，提取總的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴增出抗體的輕、重鏈基因。 然后組裝與擴增scFv DNA，構(gòu)建pCANTAB5E-scFv重組質(zhì)粒。再轉(zhuǎn)化質(zhì)粒得到單鏈抗體噬菌 體庫，通過篩選得到目標抗體。最后組裝成人體β淀粉樣前體蛋白檢測試劑盒。
[0033] 實施例1通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建和篩選單鏈抗體 1實驗材料 1. 1細胞及細胞株 萬.TG1，用于pCANTAB-5E的轉(zhuǎn)化ΗΒ2151，用于scFv的表達。
[0034] 1. 2質(zhì)粒載體 PCANTAB-5E :購自Pharmacia公司（被GE收購)，載體圖譜見圖1。
[0035] 1. 3 試劑 Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購自Invitrogen公司。Tag DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及內(nèi)切酶均購自NEB公司。DNA膠回收試劑盒購自天根公司。 M13K07輔助噬菌體購自Pharmacia公司（被GE收購)。
[0036] 1. 4基因擴增的引物序列（見表1) 表1基因擴增的引物序列表

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的結(jié)合分子，其能識別并結(jié)合人體β淀粉樣蛋白或人體β淀粉樣前體蛋 白，其特征在于，所述的結(jié)合分子包含SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子在制備檢測、治療和/或預(yù)防阿爾茨海默氏癥的藥物中 的應(yīng)用。
3. 編碼權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子的核酸分子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子序列如SEQ ID NO. 1 所示。
5. 權(quán)利要求3或4所述的核酸分子在制備檢測、治療和/或預(yù)防阿爾茨海默氏癥的藥 物中的應(yīng)用。
6. -種表達載體，其特征在于，所述的表達載體中含有編碼權(quán)利要求1所述的結(jié)合分 子的DNA。
7. -種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞中含有權(quán)利要求6所述的表達載體。
8. -種組合物，其特征在于，所述的組合物含有有效量的權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子， 以及藥學(xué)上可接受的載體。
9. 一種檢測阿爾茨海默氏癥的試劑盒，其特征在于，其包括權(quán)利要求1所述的結(jié)合分 子。
【文檔編號】G01N33/68GK104122400SQ201410310072
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】郭亞楠, 秦儉, 陳剛 申請人:上海依科賽生物制品有限公司