專利名稱：工程化抗體恒定結(jié)構(gòu)域分子的制作方法
工程化抗體恒定結(jié)構(gòu)域分子相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求享有2008年1月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/063，245號(hào)的優(yōu)先 權(quán)，通過(guò)引用將其整體并入本文。領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗體，特別地涉及在特定位置突變的抗體恒定結(jié)構(gòu)域和/或從特異性 結(jié)合目的抗原的異源抗體移入一個(gè)或多個(gè)可變鏈環(huán)的抗體恒定結(jié)構(gòu)域。背景常規(guī)抗體是包含至少四條多肽鏈的大型多亞基蛋白復(fù)合物，所述四條多肽鏈包括 兩條輕鏈和兩條重鏈?？贵w的重鏈和輕鏈含有結(jié)合抗原的可變(V)區(qū)和提供結(jié)構(gòu)支撐和效 應(yīng)物功能的恒定(C)區(qū)?？乖Y(jié)合區(qū)包含兩個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域，重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域(\)。互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)為抗體可變結(jié)構(gòu)域中的短氨基酸序列，它提供抗原特 異性?？贵w分子的重鏈和輕鏈各提供三個(gè)⑶R(⑶R1、⑶R2和⑶R3)，因此能夠與抗原接觸 的每個(gè)抗體具有六個(gè)CDR，產(chǎn)生抗原特異性。典型的抗體如IgG分子具有大約150kD的分子量。治療應(yīng)用可能受限，因?yàn)榭贵w 相對(duì)較大的尺寸能夠限制組織滲透或表位進(jìn)入。已在鑒定了蛋白酶消化后天然存在的抗體的許多較小的抗原結(jié)合片段(例如， Fab、Fab'和F(ab，)2)。這些抗體片段具有范圍在大約50kD至IOOkD的分子量。已使用 重組的方法來(lái)產(chǎn)生替代的抗原結(jié)合片段，稱為單鏈可變片段(scFv)，它是由通過(guò)合成的肽 接頭相接合的\和Vh構(gòu)成。scFv分子具有大約25-30kD的分子量。盡管在人類和大多數(shù)其他的哺乳動(dòng)物中的天然存在的抗體的抗原結(jié)合單元一 般已知是由一對(duì)可變區(qū)組成，但是駱駝科(camelid)物種表達(dá)大比例的缺乏輕鏈序列的 全功能、高特異性抗體。駱駝科重鏈抗體作為通過(guò)其恒定區(qū)二聚的單一重鏈的同源二 聚體而存在(美國(guó)專利第5，840，526號(hào)和第6，838，254號(hào)；以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) 2003-0088074)。這些駱駝科重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域稱為VhH結(jié)構(gòu)域，它們?cè)诒环蛛x為 Vh鏈的片段時(shí)保留了高特異性結(jié)合抗原的能力(Hamer s-Casterman等人.Nature 363 446-448，1993 ；Gahroudi 等人.FEBS Lett. 414 :521_526，1997)。結(jié)合抗原的單Vh結(jié)構(gòu)域稱作結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)，也已將其從由免疫小鼠的基因組 DNA擴(kuò)增的小鼠Vh基因文庫(kù)中鑒定出來(lái)(Ward等，Nature 341 :544_546，1989)。還已描述 了能夠高親和力結(jié)合抗原的人類單免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域多肽(參見(jiàn)例如，PCT公開(kāi)號(hào)WO 2005/035572 和 WO 2003/002609)。然而，對(duì)能夠特異性結(jié)合抗原的非常小的抗體的需求仍存在。此類小分子可能提 供提高的表位進(jìn)入、更好的組織滲透，并且可能被用于利用抗體或其片段的任何診斷性或 治療性的應(yīng)用。概述本公開(kāi)涉及工程化抗體恒定結(jié)構(gòu)域分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體恒定結(jié)構(gòu)域是 來(lái)自IgG、IgA或IgD的CH2結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體恒定結(jié)構(gòu)域是來(lái)自IgE或
6IgM的CH3結(jié)構(gòu)域。如本文所述，CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子是小的、穩(wěn)定的、可溶的，具有最小 毒性乃至沒(méi)有毒性并且有效地結(jié)合抗原。因此，本文提供了包含免疫球蛋白CH2或CH3結(jié) 構(gòu)域的多肽，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)的至少一個(gè)被突變，或者所述CH2或CH3結(jié)構(gòu) 域的環(huán)區(qū)域的至少一部分被來(lái)自異源免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其功 能片段(如含有特異性決定殘基(SDR)的功能片段)取代，或者二者兼有。本文所述的CH2 和CH3結(jié)構(gòu)域分子具有小于約15kD的分子量。本文還提供了包含CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子 的組合物、文庫(kù)和試劑盒以及使用方法。還提供了表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性的重組恒定結(jié)構(gòu)域， 其可被用作構(gòu)建抗原結(jié)合的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的支架。還提供了鑒定特異性結(jié)合抗原的重 組CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的方法和產(chǎn)生包含重組CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)的方法。上述的和其他的特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下關(guān)于附圖進(jìn)行的若干實(shí)施方案的詳細(xì)描述 中變得更明顯。附圖簡(jiǎn)述圖IA是免疫球蛋白分子的示意圖。常規(guī)抗體是包含至少四條多肽鏈的大型多亞 基蛋白復(fù)合物，所述四條多肽鏈包括兩條輕(L)鏈和兩條重(H)鏈。抗體的重鏈和輕鏈含有 結(jié)合抗原的可變(V)區(qū)和提供結(jié)構(gòu)支撐和效應(yīng)物功能的恒定(C)區(qū)(如CH1、CH2和CH3結(jié) 構(gòu)域)?？乖Y(jié)合區(qū)包含兩個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域，重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(\)。圖IB顯示人類重鏈可變結(jié)構(gòu)域的共有氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。指出了⑶Rl、 ⑶R2、⑶R3(表示為H1、H2和H3)的位置。還顯示了三種不同的抗原特異性人類抗體的重鏈 的氨基酸序列(SEQID NO 2-4)。顯示的數(shù)字是基于Kabat編號(hào)系統(tǒng)(Wu和Kabat，J. Exp. Med. 132(2) :211_250，1970)。圖2顯示人類Y 1 CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQ ID NO 5)。指出了在β -折疊 (...)和α-螺旋(***)區(qū)域中的殘基。還顯示了環(huán)B-C (這里表示為環(huán)1)、環(huán)D-E (這里 表示為環(huán)2)、環(huán)F-G (這里表示為環(huán)3)、環(huán)Α-Β、環(huán)C-D和環(huán)E-F的位置。每個(gè)環(huán)中的殘基以 粗體顯示。圖3A-3C是圖解了在CH2結(jié)構(gòu)域上移植⑶R(或高變環(huán))的可能策略的示意圖。圖4顯示了展現(xiàn)工程化CH2結(jié)構(gòu)域的蛋白表達(dá)的凝膠圖像，所述工程化CH2結(jié)構(gòu) 域由箭頭指出。圖5A顯示人類CH2(NCB登錄號(hào)J00228 ;SEQ ID NO :5)與小鼠CH2 (NCB登錄號(hào) J00453 ；SEQ ID NO 92)的氨基酸序列比對(duì)。相同和相似的殘基分別是67%和92%。圖5B 是顯示人類CH2的尺寸排阻色譜的圖。插圖顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5C是顯示CH2結(jié)構(gòu)域分子 (以每泳道1-10 μ g或2-5 μ g的濃度)、單鏈可變片段(scFv)、抗體片段(Fab)和完整的抗 體分子(IgG)的分子量的SDS-PAGE凝膠的圖像。圖6A-6B是顯示通過(guò)圓二色性(⑶)和差示掃描熱量法(DSC)測(cè)量的人類CH2的 穩(wěn)定性的圖。(A)通過(guò)⑶測(cè)量，在25°C的折疊曲線(_)，在90°C的解折疊(□□□)和在 25°C的重折疊(一)。將蛋白的折疊級(jí)分(ff)計(jì)算為ff = ([Θ]-[ΘΜ])/([ΘΤ]-[ΘΜ])。 [θ τ]和[θ J其中在25°C的折疊態(tài)和90°C的解折疊態(tài)的平均殘基橢圓率是216。從對(duì)溫 度(T)的一階導(dǎo)數(shù)[d(折疊級(jí)分)/dT]確定了來(lái)自CD的精確Tm值(54. 1 士 1. 2°C )。(B) 來(lái)自DSC的熱誘導(dǎo)的解折疊曲線。Tm = 55. 4°C，其與來(lái)自⑶的Tm相似。圖7是顯示基于CH2結(jié)構(gòu)的m01和m02的設(shè)計(jì)的示意圖。在兩個(gè)天然Cys中的兩個(gè)Cas之間的距離是6.53 A。這兩個(gè)Cys殘基形成了天然二硫鍵(由黑色箭頭指出)。在 被半胱氨酸取代的VlO與K104(m01)之間或L12與K104(m02)之間引入工程化二硫鍵。圖8是顯示m01和m02高水平表達(dá)的SDS-PAGE凝膠的圖像。將m01和m02可溶 性表達(dá)與CH2的可溶性表達(dá)對(duì)比。表達(dá)是由箭頭指出。圖9A-9E是顯示通過(guò)⑶(A_C)、DSC (D)和熒光分光光度法(E)測(cè)量的兩種突變體 的提高的穩(wěn)定性的圖。顯示了 mOl(A)和m02(B)的在25°C的折疊曲線(_)，在90°C的解折 疊(□ □ □)和在25°C的重折疊(一)。(C)通過(guò)與CH2相同的方法計(jì)算m01和m02的折 疊級(jí)分。mOl 的 Tm = 77. 4士 1. 7°C，m02 的 Tm = 68. 6士0. 6°C。(D)mOl 和 m02 的熱誘導(dǎo)的解 折疊曲線也由DSC記錄。與CH2相比，mOl的Tm和m02的Tm分別提高約20°C和10°C。(E) 通過(guò)熒光分光光度法對(duì)比在CH2、m01和m02之間的尿素誘導(dǎo)的解折疊。CH2、m01和m02的 解折疊的中點(diǎn)分別是4. 2Μ、6· 8Μ和5. 8Μ。圖IOA顯示mOl和m02的尺寸排阻色譜。如CH2，m01只形成單體，而m02主要形成 單體并且在較小程度上形成二聚體。圖IOB是顯示N端平截的CH2(CH2)和平截的mOl(mOl) 的高穩(wěn)定性的圖。前七個(gè)N端殘基被缺失(SEQ ID NO :5的殘基1-7)。通過(guò)⑶測(cè)量的50% 解折疊溫度(Tm)(分別為62°C和79°C )顯著高(分別高8°C和5°C )于相應(yīng)的CH2和mOl 的解折疊溫度(分別為54°C和74°C )。

圖11是顯示CH2文庫(kù)的設(shè)計(jì)的示意圖。顯示了 CH2片段的圖示，其中實(shí)心矩形代 表環(huán)(L1-L3)。陰影矩形代表面向從環(huán)1到環(huán)3的相反方向環(huán)(L)和螺旋(HI、H2)。以字 母A-G標(biāo)記的空矩形代表形成β夾層結(jié)構(gòu)的七條β鏈。數(shù)字231和341代表在IgGl的情 況下CH2片段的起始?xì)埢湍┒藲埢?。CH2環(huán)1(SEQ ID NO 93)和環(huán)3 (SEQID NO 95)的 序列在下面示出，并加注下劃線。引入的突變顯示在括號(hào)中(SEQ ID N0:94和SEQ ID NO: 96)。圖12A-12B 顯示 CH2 結(jié)合物(binder)的表征。(A)四個(gè) Balgpl20_CD4 特異性 CH2 克隆如以下實(shí)施例所述地被表達(dá)并純化。純化的產(chǎn)物通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析。樣品1-4代表 來(lái)自可溶級(jí)分的克隆mlal到mla3’，而5_8從包涵體中復(fù)性。(B) CH2克隆與Bal gpl20_CD4 的結(jié)合的ELISA分析。圖13A-13B是顯示CH2特異性結(jié)合的決定簇的電泳凝膠的圖和圖像。㈧環(huán)1決 定了結(jié)合能力。兩個(gè)優(yōu)勢(shì)克隆mlal和mla2以及含有來(lái)自mlal和mla3的環(huán)1序列而非原 始的CH2環(huán)3序列的兩個(gè)雜合子從包涵體中被表達(dá)并純化，并且被重折疊(左圖)。然后將 這些蛋白用在ELISA分析中(右圖)。(B) CH2為環(huán)1提供關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)支持。攜帶額外的二 硫鍵的優(yōu)勢(shì)克隆mlal及其突變體被表達(dá)、純化以及重折疊(左圖)。然后將它們用在ELISA 分析中(右圖)。圖14是顯示由CH2結(jié)合物對(duì)HIV Env假型病毒感染進(jìn)行的廣泛中和的圖。兩個(gè) CH2克隆mlal和mla2以100 μ g/ml的固定濃度用來(lái)測(cè)試其抗一組九種HIV假病毒的中和 能力。濃度為4 μ g/ml或6 μ g/ml的C34肽用作陽(yáng)性對(duì)照。圖15顯示基于mlal的第二 CH2文庫(kù)的設(shè)計(jì)。來(lái)自CH2克隆mlal的環(huán)2 (SEQ ID NO 97)和環(huán)3 (SEQ ID NO 99)序列(以下劃線標(biāo)出)被括號(hào)中所示的序列(SEQ ID NO 98 和 SEQ ID NO 100)取代。圖16A-16D顯示了選自于第二 CH2文庫(kù)的CH2克隆的表征。(A)選自于第二文庫(kù)的CH2克隆的表達(dá)和純化。(B)mlb3的凝膠過(guò)濾分析。(C)CH2克隆的ELISA分析。(D)克 隆mlb3的環(huán)2和環(huán)3序列，其與原始CH2序列(SEQ ID NO :97_100)相比主要具有單體的形式。圖17是顯示由來(lái)自第二 CH2文庫(kù)的克隆的假病毒中和的圖。分析分離自第二文 庫(kù)的三個(gè)克隆在100μ g/ml的濃度針對(duì)相同組的HIV假病毒的中和能力。20μ g/ml的濃度 的平行純化的ScFv X5用作對(duì)照。圖18是顯示識(shí)別保守表位的CH2結(jié)合物的圖。主要為單體的CH2克隆mlb3是生 物素標(biāo)記并且將其在競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定中使用。將ELISA抗原Bal gpl20_⑶4包被在ELISA 板的底部。將固定量的1. 7 μ M的生物素?；膍lb3與指示量的未標(biāo)記的mlb3、scFv X5 或m36-Fc混合并添加到每個(gè)孔。用鏈親和素-HRP檢測(cè)結(jié)合的mlb3。序列表在附隨的序列表中列出的核酸序列和氨基酸序列是使用如在37C. F. R. 1. 822中 所定義的核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的三個(gè)字母密碼示出。只顯示每個(gè)核酸序列 的一條鏈，但是將互補(bǔ)鏈理解為通過(guò)任何提及的顯示的鏈而被包括在內(nèi)。在隨附的序列表 中SEQIDNO1是人類Vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
SEQIDNO2-4是三種人類抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
SEQIDNO5是人類Y 1CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
SEQID NO 6-10是用于產(chǎn)生突變CH2結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)的PCR引物的核苷·陵序列。
SEQIDNO11-30是具有隨機(jī)的環(huán)1的突變CH2結(jié)構(gòu)域的片段的氨基酸丨序列。
SEQIDNO31-50是具有隨機(jī)的環(huán)3的突變CH2結(jié)構(gòu)域的片段的氨基酸丨序列。
SEQIDNO51-68是用于將來(lái)自人抗體的⑶R3移入到CH2支架中的PCR引物的核苷酩〖序列。
SEQIDNO69-87是具有移植的H3的工程化CH2結(jié)構(gòu)域的片段的氨基·陵序列。
SEQIDNO88和89是CH2結(jié)構(gòu)域突變體m01的片段的氨基酸序列。
SEQIDNO90和91是CH2結(jié)構(gòu)域突變體m02的片段的氨基酸序列。
SEQIDNO:92是鼠CH2的氨基酸序列。
SEQIDNO:93是CH2環(huán)1的氨基酸序列。
SEQIDNO94是突變體CH2環(huán)1的共有氨基酸序列。
SEQIDNO:95是CH2環(huán)3的氨基酸序列。
SEQIDNO96是突變體CH2環(huán)3的共有氨基酸序列。
SEQIDNO97是來(lái)自克隆mlal的CH2環(huán)2的氨基酸序列。
SEQIDNO98是來(lái)自克隆mlal的突變體CH2環(huán)2的共有氨基酸序列。
SEQIDNO99是來(lái)自克隆mlal的CH2環(huán)3的氨基酸序列。
SEQIDNO100是來(lái)自克隆mlal的突變體CH2環(huán)3的共有氨基酸序列。
SEQIDNO=101-105是用于擴(kuò)增第一 CH2文庫(kù)的PCR引物的核苷酸序列L
SEQIDNO106是mlal合成肽的氨基酸序列。
SEQIDNO107是mlal環(huán)1的氨基酸序列。
SEQIDNO:108是mla2環(huán)1的氨基酸序列。
詳述I.縮寫ADCC 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性⑶C 補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性⑶R 互補(bǔ)決定區(qū)DNA 脫氧核糖核酸ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定HIV 人免疫缺陷病毒Ig:免疫球蛋白NK 天然殺傷細(xì)胞RNA 核糖核酸SDR:特異性決定殘基II.術(shù)語(yǔ)除非另外指明，否則技術(shù)術(shù)語(yǔ)是根據(jù)常規(guī)用法使用。在分子生物學(xué)中常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)的 定義可見(jiàn)于由牛津大學(xué)出版社1994年出版的BenjaminLewin的Genes V(基因V) (ISBN 0-19-854287-9)；由 Blackwell ScienceLtd 在 1994 年出版的 Kendrew 等人(編)The Encyclopedia of MolecularBiology (分子生物學(xué)百科全書)(ISBN 0-632-02182-9)；以及 S VCHPublishers, Inc. $ 1995 $出片反的 Robert A. Meyers (IS ), MolecularBiology and Biotechnology :a Comprehensive Desk Reference (分子生物學(xué)和生物技術(shù)綜合案頭參 考)(ISBN 1-56081-569-8)。為了促進(jìn)本發(fā)明的各實(shí)施方案的敘述，提供以下對(duì)具體術(shù)語(yǔ)的解釋施用通過(guò)選定的途徑將組合物引入到受試者中。例如，如果選定的途徑是靜脈 內(nèi)，那么通過(guò)將組合物引入到受試者的靜脈中來(lái)施用組合物。動(dòng)物有生命的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體，包括例如哺乳動(dòng)物和禽類的分類。術(shù)語(yǔ)哺 乳動(dòng)物包括人和非人動(dòng)物。類似地，術(shù)語(yǔ)“受試者”包括人和獸醫(yī)受試者?？贵w包括基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼的一種或多種 多肽的蛋白(或蛋白復(fù)合物)。識(shí)別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒 定區(qū)基因以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為κ或λ。重鏈被分類為Y、 μ、α、δ或ε，它們進(jìn)而分別定義了免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE0基本的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元一般為四聚體。每個(gè)四聚體包含兩對(duì)相同的 多肽鏈，每對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的N端 定義了主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100至110個(gè)或者以上個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“可變的輕 鏈(\)”和“可變的重鏈(Vh) ”分別是指這些輕鏈和重鏈。每條輕鏈含有單個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域 (CL)，而每條重鏈含有三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3 (或者對(duì)于IgE和IgM而言四個(gè)恒定 結(jié)構(gòu)域)。參見(jiàn)圖IA的常規(guī)免疫球蛋白分子的示意圖。如在此所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的免疫球蛋白以及一些具有約25至IOOkD分 子量的良好表征的片段。例如，與靶蛋白(或者與蛋白或融合蛋白內(nèi)的表位)結(jié)合的Fab、 Fv和單鏈Fv(SCFV)還將是該蛋白(或表位)的特異性結(jié)合劑。這些抗體片段被定義如 下(l)Fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，它是通過(guò)用木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體得到完整的輕鏈和一條重鏈的一部分而產(chǎn)生；(2)Fab’，通過(guò)用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體， 隨后還原得到完整的輕鏈和重鏈的一部分而獲得的抗體分子的片段；每個(gè)抗體分子獲得兩 個(gè)Fab’片段；(3) (Fab’)2，通過(guò)用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體且沒(méi)有隨后的還原所獲得的抗體 的片段；(4)F(ab’)2，通過(guò)兩個(gè)二硫鍵連在一起的兩個(gè)Fab’片段的二聚體；(5)Fv，含有輕 鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)的表達(dá)為兩條鏈的基因工程化片段；以及(6)scFv，單鏈抗體， 含有輕鏈的可變區(qū)、重鏈的可變區(qū)的基因工程化分子，所述輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū) 通過(guò)作為基因融合單鏈分子的適合多肽接頭相連接。制備這些片段的方法是常規(guī)的(參見(jiàn) 例如，Harlow 禾口 Lane, Using Antibodies :A LaboratoryManual (使用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)), CSHL, New York,1999)。抗體可以是單克隆或多克隆的。僅通過(guò)舉例，單克隆抗體可以根據(jù)Kohler和 Milstein的經(jīng)典方法(Nature 256 =495-97,1975)或其衍生方法從鼠雜交瘤中制備。例如， 用于單克隆抗體生產(chǎn)的詳細(xì)步驟由Harlow和Lane描述(Using Antibodies :A Laboratory Manual (使用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，CSHL, New York, 1999)。“人源化”免疫球蛋白例如人源化抗體是包括人框架區(qū)和來(lái)自非人類(例如小鼠、 大鼠或合成的)免疫球蛋白的一種或多種CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人類免疫球蛋 白命名為“供體”，而提供框架的人免疫球蛋白命名為“受體”。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有的 CDR是來(lái)自人源化免疫球蛋白中的供體免疫球蛋白。“人源化抗體”是包含人源化輕鏈和人 源化重鏈免疫球蛋白的抗體，例如人源化單克隆抗體。人源化抗體結(jié)合至與提供CDR的供 體抗體相同或相似的抗原上。人源化免疫球蛋白的受體框架可具有限制數(shù)目的取自供體框 架的氨基酸取代。人源化分子可以具有額外的保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代對(duì)抗 原結(jié)合或其他免疫球蛋白功能實(shí)質(zhì)上沒(méi)有影響。這些分子可以通過(guò)基因工程化手段構(gòu)建 (例如參見(jiàn)美國(guó)專利5，585，089)?？乖軌虼碳?dòng)物中抗體或T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被 注射或吸收到動(dòng)物中的組合物?？乖c特異性體液免疫或特異性細(xì)胞免疫的產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)。自身免疫疾病其中因組織損傷而起的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)為正常宿主的一部分的 抗原(也就是自身抗原)的免疫應(yīng)答(例如，B細(xì)胞應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答)的疾病。自身抗 原可以獲自宿主細(xì)胞，或者可以獲自正常定殖粘膜表面的共棲生物，例如微生物(稱為共 棲生物)。影響哺乳動(dòng)物的示例性自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型少關(guān)節(jié)型關(guān)節(jié) 炎(juvenile oligoarthritis)、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、多發(fā) 性硬化癥、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、炎性腸病(例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、自身免 疫性胃萎縮、尋常天皰瘡、牛皮癬、白癜風(fēng)、1型糖尿病、非肥胖型糖尿病、重癥肌無(wú)力、Grave 病、橋本氏甲狀腺炎、硬化性膽管炎、硬化性涎腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性血小板減 少性紫癜、肺出血_腎炎綜合征(Goodpasture’ s syndrome)、Addison病、全身性硬化癥、 多發(fā)性肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血以及類似疾病。結(jié)合親和力在結(jié)合位點(diǎn)與配體之間(例如，抗體、CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域與抗 原或表位之間)的結(jié)合的力。結(jié)合位點(diǎn)X對(duì)配體Y的親和力由解離常數(shù)(Kd)表示，解離常 數(shù)是占據(jù)溶液中存在的半數(shù)X的結(jié)合位點(diǎn)所需的Y的濃度。較低的(Kd)表明在X與Y之
11間較強(qiáng)或較高的親和力相互作用，并且需要較低濃度的配體占據(jù)這些位點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，結(jié)合 親和力可以受由互補(bǔ)位(識(shí)別表位的分子的部分)所識(shí)別的表位中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的改 變、修飾和/或取代影響。結(jié)合親和力可以是抗體結(jié)合抗原的親和力。在一個(gè)實(shí)例中，結(jié)合親和力是通過(guò)Ag-ELISA測(cè)定中的終點(diǎn)滴定所測(cè)量。如果修 飾的/置換的表位的特異性抗體的終點(diǎn)滴度與未改變的表位相比相差至少4倍，如至少10 倍，至少100倍或更大，那么結(jié)合親和力大體上是通過(guò)由抗體互補(bǔ)位所識(shí)別的表位中的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾和/或取代來(lái)降低(或可測(cè)量地減少)。CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子獲自免疫球蛋白CH2或CH2結(jié)構(gòu)域的多肽(或編碼多肽的 核酸)。免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。在本文所述的一個(gè)實(shí)施方案中，CH2 或CH3結(jié)構(gòu)域分子包含至少一個(gè)⑶R或其功能片段。CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子還可以包含額 外的氨基酸序列，例如完整的高變環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子至少具 有以⑶R或其功能片段置換的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)域的至少一部分。在本文所述的一些實(shí)施方 案中，CH2或CH3結(jié)構(gòu)域在該分子的環(huán)區(qū)域中包含一個(gè)或多個(gè)突變。CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的 “環(huán)區(qū)域”是指位于β-折疊的區(qū)域之間的蛋白部分(例如，每個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域包含七個(gè)β-折 疊A至G，方向從N端到C端)。如在圖3A-3C中所示，CH2結(jié)構(gòu)域包含六個(gè)環(huán)區(qū)域環(huán)1、環(huán) 2、環(huán)3、環(huán)Α-Β、環(huán)C-D和環(huán)E-F。環(huán)Α-Β、環(huán)C-D和環(huán)E-F分別位于β -折疊A與B之間、C 與D之間、以及E與F之間。環(huán)1、2和3分別位于β-折疊B與C之間、D與E之間、以及F 與G之間。對(duì)于CH2結(jié)構(gòu)域中的環(huán)的氨基酸范圍參見(jiàn)表1。本文所公開(kāi)的CH2和CH3結(jié)構(gòu) 域分子還可以包含N端缺失，例如約1個(gè)至約7個(gè)氨基酸的缺失。在具體的實(shí)例中，N端缺 失是1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。本文所公開(kāi)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子還可以包含C 端缺失，例如約1個(gè)至約4個(gè)氨基酸的缺失。在具體的實(shí)例中，C端缺失是1、2、3或4個(gè)氨 基酸長(zhǎng)度。CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子的尺寸較小，通常小于15kD。CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子的尺 寸可以改變，這取決于在環(huán)區(qū)域中插入的CDR/高變氨基酸序列的長(zhǎng)度、插入CDR的數(shù)量以 及另一分子(如效應(yīng)物分子或標(biāo)記)是否與CH2或CH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在一些實(shí)施方案中， CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子不包含額外的恒定結(jié)構(gòu)域(即CHl結(jié)構(gòu)域或另一 CH2結(jié)構(gòu)域或CH3 結(jié)構(gòu)域)或可變結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，CH2結(jié)構(gòu)域是來(lái)自IgG、IgA或IgD。在另一實(shí) 施方案中，恒定結(jié)構(gòu)域是與IgG、IgA或IgD的CH2結(jié)構(gòu)域同源的來(lái)自IgE或IgM的CH3結(jié) 構(gòu)域。本文提供的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子可以是糖基化或非糖基化的。例如，可以將重 組CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域表達(dá)在適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞中以允許該分子的糖基化?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)在抗原受體(如免疫球蛋白和T細(xì)胞受體)蛋白的可變結(jié)構(gòu) 域中發(fā)現(xiàn)的短氨基酸序列，其為該受體提供對(duì)抗原的接觸位點(diǎn)及其對(duì)特定抗原的特異性。 抗原受體的每個(gè)多肽鏈含有三個(gè)CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。抗原受體通常是由兩個(gè)多肽鏈 (重鏈和輕鏈)組成，因此每個(gè)抗原受體具有六個(gè)能夠與抗原接觸的CDR。因?yàn)榕c抗原受體 相關(guān)的大多數(shù)序列變異在CDR中被發(fā)現(xiàn)，所以這些區(qū)域有時(shí)被稱為高變結(jié)構(gòu)域。⑶R在抗原受體的環(huán)區(qū)域內(nèi)(通常在β-折疊結(jié)構(gòu)的區(qū)域之間；參見(jiàn)圖3A-3C)被 發(fā)現(xiàn)。這些環(huán)區(qū)域通常稱為高變環(huán)。每個(gè)抗原受體包含六個(gè)高變環(huán)111、!12、!13、1^1、1^2和 L3。例如，Hl環(huán)包含重鏈的⑶Rl，并且L3環(huán)包含輕鏈的⑶R3。本文所述的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子包含來(lái)自抗體可變結(jié)構(gòu)域的移入的氨基酸。移入的氨基酸包含CDR的至少一部分。 移入的氨基酸還可以包括額外的氨基酸序列，如完整的高變環(huán)。如本文所用，⑶R的“功能 片段”是保留了結(jié)合特異性抗原的能力的CDR的至少一部分。CDR 位置的編號(hào)規(guī)貝丨」由 Kabat 等人.，(1991) Sequences of Proteinsof Immunological Interest (免疫學(xué)目的蛋白的序列)，第5版，美國(guó)衛(wèi)生與公共服務(wù)部，公共 衛(wèi)生服務(wù)，國(guó)立衛(wèi)生研究院，Bethesda, MD (NIH公開(kāi)號(hào)91-3242)描述。接觸以直接物理關(guān)聯(lián)來(lái)放置，其包括以固體形式和以液體形式二者。簡(jiǎn)并變體如本文所述，CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子的“簡(jiǎn)并變體”是編碼CH2或CH3結(jié) 構(gòu)域分子的多核苷酸，該多核苷酸包括由于遺傳密碼簡(jiǎn)并的序列。存在20種天然氨基酸， 它們大多數(shù)被多于一個(gè)密碼子指定。因此，所有的簡(jiǎn)并核苷酸序列被包括在內(nèi)，只要由該核 苷酸序列所編碼的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子的氨基酸序列是不變的。結(jié)構(gòu)域一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)保留了獨(dú)立于蛋白質(zhì)的其余部分的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在 一些情況下，結(jié)構(gòu)域具有分離的功能特性并且可被添加、移除或轉(zhuǎn)移至另一蛋白而沒(méi)有功 能損失。效應(yīng)物分子預(yù)期對(duì)分子或嵌合分子所靶向的細(xì)胞具有期望的作用的分子或嵌合 分子的部分。效應(yīng)物分子也稱為效應(yīng)部分(EM)、治療劑或診斷劑或類似術(shù)語(yǔ)。治療劑包括這類化合物，如核酸、蛋白、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位 素、脂質(zhì)、碳水化合物或重組病毒。核酸治療部分和診斷部分包括反義核酸、與單鏈或雙鏈 DNA共價(jià)交聯(lián)的衍生的寡核苷酸和形成三股螺旋的寡核苷酸。可選地，與靶向部分相連的 分子如CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子可以是含有治療組合物的囊封系統(tǒng)，如脂質(zhì)體或膠束，所述治 療組合物例如藥物、核酸(如反義核酸)或能夠被屏蔽免于直接暴露于循環(huán)系統(tǒng)的另外的 治療部分。制備連接于抗體的脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見(jiàn)例如，美國(guó)專 利第 4，957，735 號(hào)；以及 Connor 等人·，Pharm. Ther. 28 :341_365，1985。診斷劑或診斷部 分包括放射性同位素或其他可檢測(cè)的標(biāo)記。用于此類目的的可檢測(cè)的標(biāo)記也是本領(lǐng)域公知 的，并且包括放射性同位素(如32p、125I和131I)、熒光團(tuán)、化學(xué)放光劑和酶。表位抗原決定簇。是在有抗原性的分子(即該分子引發(fā)特異性免疫應(yīng)答)上的 特定化學(xué)基團(tuán)，或者連續(xù)或不連續(xù)的肽序列?？贵w結(jié)合特定的抗原表位是基于該抗體的三 維結(jié)構(gòu)和匹配(或同源)的表位。表達(dá)核酸翻譯為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以被表達(dá)并留在細(xì)胞內(nèi)，成為細(xì)胞表面膜的組 分，或者被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)或介質(zhì)中。表達(dá)控制序列調(diào)控異源核酸序列的表達(dá)的核酸序列，所述異源核酸序列與之可 操作地連接。當(dāng)表達(dá)控制序列控制并調(diào)控核酸序列的轉(zhuǎn)錄和(適當(dāng)時(shí))翻譯時(shí)，該表達(dá)控 制序列與該核酸序列可操作地連接。因此表達(dá)控制序列可包括適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄 終止子、在編碼蛋白的基因前面的起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子的剪接信號(hào)、允許mRNA的適 當(dāng)翻譯的該基因的正確可讀框的維持序列以及終止密碼子。術(shù)語(yǔ)“控制序列”旨在最少包 括其存在能夠影響表達(dá)的組分，并且還包括其存在有利的額外組分，例如前導(dǎo)序列和融合 配偶體序列。表達(dá)控制序列可包括啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的一系列核酸控制序列。啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的 必要核酸序列，如在聚合酶II型啟動(dòng)子情況下的TATA元件。啟動(dòng)子還任選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻抑物元件，它們可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多達(dá)數(shù)千堿基對(duì)處。包括組成型啟動(dòng)子 和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子二者(參見(jiàn)例如，Bitter等人，Methods in Enzymology (酶學(xué)方法)153 516-544，1987)。還包括足以賦予啟動(dòng)子依賴性基因表達(dá)的那些啟動(dòng)子元件，所述啟動(dòng)子依賴性基 因表達(dá)是細(xì)胞類型特異性、組織特異性可控的，或者通過(guò)外部信號(hào)或試劑可誘導(dǎo)的；此類元 件可位于基因的5'或3'區(qū)域中。包括組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子二者(參見(jiàn)例如， Bitter 等人，Methodsin Enzymology (酶學(xué)方法)153 =516-544,1987) 例如，當(dāng)在細(xì)菌系 統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如細(xì)菌噬菌體λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜 合啟動(dòng)子)以及類似啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可使用 獲自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng) 子(如逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列；腺病毒后期啟動(dòng)子；痘苗病毒7. 5K啟動(dòng)子)。通過(guò)重 組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動(dòng)子也可以用來(lái)提供核酸序列的轉(zhuǎn)錄?？蓪⒍嗪塑账岵迦氲胶袉?dòng)子序列的表達(dá)載體中，所述啟動(dòng)子序列促進(jìn)宿主的 插入基因序列的有效轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子以及允許對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表 型選擇的特異性核酸序列?？蚣軈^(qū)在CDR(或高變區(qū))之間插入的氨基酸序列?？蚣軈^(qū)包括可變的輕鏈框架 區(qū)和可變的重鏈框架區(qū)。每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)框架區(qū)，通常稱為Rl、FR2、FR3和FR4。 框架區(qū)用來(lái)將CDR保持在適當(dāng)?shù)姆较蛞杂糜诳乖Y(jié)合。框架區(qū)通常形成折疊結(jié)構(gòu)。真菌相關(guān)抗原(FAA)能夠刺激真菌特異性T細(xì)胞限定的免疫應(yīng)答的真菌抗原。 示例性FAA包括但不限于來(lái)自以下的抗原白色念珠菌(Candida albicans)、隱球菌屬 (Cryptococcus)(如來(lái)自新型隱球菌(C. neoformans)的d25或MP98或MP88，或者其免疫 片段)、芽生菌屬(Blastomyces)(如皮炎芽生菌(B. dermatitidis)，例如WI-1或其免疫片 段)和組織胞漿菌屬(Histoplasma)(如莢膜組織胞漿菌(H. capsulatum)) 0異源的異源的多肽或多核苷酸是指獲自不同來(lái)源或物種的多肽或多核苷酸。高變區(qū)在抗體可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的序列變異性特別高的區(qū)域。高變區(qū)形成框架區(qū)的 β-折疊之間的環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，高變區(qū)也稱為“高變環(huán)”。每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)高變區(qū)， 在重鏈中通常稱為Η1、Η2和Η3，而在輕鏈中通常稱為L(zhǎng)1、L2和L3。高變環(huán)的環(huán)結(jié)構(gòu)描繪在 圖3A-5C中。免疫應(yīng)答免疫系統(tǒng)的細(xì)胞如B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞 (polymorphonucleocyte)對(duì)諸如抗原的刺激物的反應(yīng)。免疫應(yīng)答可包括參與宿主防御反應(yīng) 的身體的任何細(xì)胞，例如分泌干擾素或細(xì)胞因子的上皮細(xì)胞。免疫應(yīng)答包括但不限于先天 免疫應(yīng)答或炎癥。免疫結(jié)合物效應(yīng)物分子與抗體或者與CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子的共價(jià)連接。效應(yīng) 物分子可以是可檢測(cè)的標(biāo)記或免疫毒素。毒素的具體、非限制性實(shí)例包括但不限于相思豆 毒蛋白，蓖麻毒蛋白，假單胞菌外毒素(PE，如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)，肉 毒桿菌毒素或其改性的毒素，或者直接或間接地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死細(xì)胞的其他毒劑。例 如，PE和DT是通常通過(guò)肝毒性導(dǎo)致死亡的高毒性化合物。然而，可通過(guò)如下方式將PE和 DT改性成為用作免疫毒素的形式移除毒素的天然靶向組分(如PE的結(jié)構(gòu)域Ia和DT的 B鏈)并且用不同的靶向部分(如CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子)取代該天然靶向組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，將CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子與效應(yīng)物分子(EM)相接合。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 與效應(yīng)物分子相接合的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子還與脂質(zhì)或蛋白或肽的其他分子相連接以提 高CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子在體內(nèi)的半衰期。該連接可以通過(guò)化學(xué)手段或重組手段?！盎瘜W(xué) 手段”是指在CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子與效應(yīng)物分子之間的反應(yīng)，以使得在這兩個(gè)分子之間形 成共價(jià)鍵從而形成一個(gè)分子。在CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子與效應(yīng)物分子之間可以任選地包括 肽接頭(短肽序列)。因?yàn)槊庖呓Y(jié)合物最初是由具有不同官能性的兩個(gè)分子，如抗體和效應(yīng) 物分子制備，所以它們有時(shí)被稱為“嵌合分子”。本文所用的術(shù)語(yǔ)“嵌合分子”因此是指結(jié)合 (偶聯(lián))至效應(yīng)物分子的靶向部分，如配體、抗體或者CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”、“接合”、“鍵合”或“連接”是指使兩個(gè)多肽成為一個(gè)連續(xù)多肽分子， 或者是指將放射性核苷酸或其他分子與多肽，如CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子共價(jià)連接。在具體 的上下文中，所述術(shù)語(yǔ)包括指配體，如抗體部分與效應(yīng)物分子(“EM”)相接合。免疫原能夠在適當(dāng)條件下刺激動(dòng)物的免疫應(yīng)答，如抗體或T細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn) 生的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被注射或吸收到動(dòng)物中的組合物。分離的“分離的”生物組分(如核酸分子或蛋白)已從該組分天然存在的其他生 物組分(例如，細(xì)胞的其他生物組分)中基本上分離或純化出來(lái)，所述其他生物組分例如其 他的染色體的和染色體外的DNA和RNA以及蛋白，包括其他抗體。已被“分離的”核酸和蛋 白包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的純化方法純化的核酸和蛋白?！胺蛛x的抗體”是其已從其他蛋白或生物組 分基本上分離或純化出來(lái)以使得保持其抗原特異性的抗體。該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)宿主細(xì)胞中 的重組表達(dá)制備的核酸和蛋白(包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子)以及化學(xué)合成的核酸或蛋白 或者其片段。標(biāo)記直接或間接地與另外的分子如抗體或者CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子結(jié)合以促進(jìn) 該分子的檢測(cè)的可檢測(cè)的化合物或組合物。標(biāo)記的具體、非限制性實(shí)例包括熒光標(biāo)簽、酶連 接和放射性同位素。配體接觸殘基或特異性決定殘基(SDR)在CDR內(nèi)的參與接觸配體或抗原的殘基。 配體接觸殘基也被稱為特異性決定殘基(SDR)。非配體接觸殘基是CDR中不接觸配體的殘 基。非配體接觸殘基也可以是框架殘基。納米抗體(nAb)被工程化以使得分子特異性結(jié)合抗原的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子。 被工程化以結(jié)合抗原的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域分子是基于抗原特異性結(jié)合抗體結(jié)構(gòu)域的已知的 最小分子。瘤形成和腫瘤瘤形成的產(chǎn)物是瘤(腫瘤)，它是由細(xì)胞過(guò)度分裂產(chǎn)生的組織異常 生長(zhǎng)。瘤也被稱為“癌癥”。不轉(zhuǎn)移的腫瘤也被稱為“良性的”。入侵周圍組織和/或能夠 轉(zhuǎn)移的腫瘤也被稱為“惡性的”。實(shí)體腫瘤，如肉瘤和癌的實(shí)例包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨 性肉瘤、以及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴 樣惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、 腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管 癌、絨毛膜癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(如神經(jīng)膠 質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果體瘤、血管 母細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視
15網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。血液腫瘤的實(shí)例包括白血病，白血病包括急性白血病(如急性淋巴細(xì)胞性白血 病、急性粒細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓細(xì)胞性白血病、前髓細(xì)胞性白血病、骨 髓單核細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性及紅白血病)；慢性白血病(如慢性髓細(xì)胞性(粒細(xì)胞 性)白血病、慢性骨髓性白血病以及慢性淋巴細(xì)胞性白血病)；真性紅細(xì)胞增多癥；淋巴瘤； 霍奇金?。环腔羝娼鹆馨土?無(wú)痛形式和高級(jí)形式)；多發(fā)性骨髓瘤；沃爾丹斯特倫氏巨球 蛋白血癥；重鏈??；骨髓增生異常綜合癥；多毛細(xì)胞白血??；以及骨髓發(fā)育不良。核酸由通過(guò)磷酸二酯鍵連接的核苷酸單元(核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、相關(guān) 的天然存在的結(jié)構(gòu)變體及其合成的非天然存在的類似物)、相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體及 其合成的非天然存在的類似物構(gòu)成的聚合物。因此，該術(shù)語(yǔ)包括如下核苷酸聚合物其中核 苷酸與它們之間的連接包括非天然存在的合成類似物，諸如例如且不限制于硫代磷酸酯、 氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-0_甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)以及類 似物。此類多核苷酸可以例如使用自動(dòng)化DNA合成儀來(lái)合成。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”通常是指 不超過(guò)約50個(gè)核苷酸的短的多核苷酸。應(yīng)理解當(dāng)核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表 示時(shí)，這還包括RNA序列(即A、U、G、C)，在RNA序列中“U”代替“T”。本文使用常規(guī)符號(hào)來(lái)描述核苷酸序列單鏈核苷酸序列的左手末端是5'端；雙 鏈核苷酸序列的左手方向稱為5'方向。將核苷酸以5'到3'添加到新生RNA轉(zhuǎn)錄物的方 向也稱為轉(zhuǎn)錄方向。具有與mRNA相同的序列的DNA鏈稱為“編碼鏈”;在具有與從該DNA轉(zhuǎn) 錄的mRNA相同的序列的DNA鏈上并且被定位在RNA轉(zhuǎn)錄物的5'到5'端的序列稱為“上 游序列”；在具有與mRNA相同的序列的DNA鏈上并且是編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的3'到3'端的序 列稱為“下游序列”?！癱DNA”是指與mRNA互補(bǔ)或相同的單鏈或雙鏈形式的DNA?！熬幋a”是指在多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特定序列充當(dāng)合成生 物過(guò)程中的其他聚合物或大分子的模板的固有特性以及從中產(chǎn)生的生物特性，所述其他聚 合物或大分子具有確定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或確定的氨基酸序列。因 此，如果由基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生了蛋白，那么該基 因編碼該蛋白。用作基因或cDNA的轉(zhuǎn)錄模板的編碼鏈(其核苷酸序列與mRNA序列相同并 且通常被提供在序列表中)和非編碼鏈二者可稱為編碼該基因或cDNA的蛋白或其他產(chǎn)物。 除非另外指定，否則“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括為彼此的兼并形式并且編碼相同 的氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。“重組核酸”是指具有如下核苷酸序列的核酸所述核苷酸序列并非天然接合在一 起并且可通過(guò)人工組合兩個(gè)原本分離的序列區(qū)段而制備。人工組合通常是通過(guò)化學(xué)合成， 或更為常見(jiàn)地通過(guò)人工操作分離的核酸片段(例如通過(guò)基因工程技術(shù))來(lái)實(shí)現(xiàn)。重組核酸 包括核酸載體，所述核酸載體包含可用來(lái)轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞的擴(kuò)增的或裝配的核酸。包 含重組核酸的宿主細(xì)胞稱為“重組宿主細(xì)胞”。然后將該基因表達(dá)在重組宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生 “重組多肽”。重組核酸也可起非編碼功能的作用(例如，啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位 點(diǎn)以及類似物)?？刹僮鞯剡B接當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄幸怨δ荜P(guān)系與第二核酸序列一起放置時(shí)，該第一 核酸序列與該第二核酸序列可操作連接。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，那么該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接。一般來(lái)說(shuō)，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的，并 且如果有必要接合兩個(gè)蛋白編碼區(qū)，則可操作地連接的DNA序列是在相同的閱讀框內(nèi)。病原體引起宿主的疾病或疾患的生物原。病原體包括例如細(xì)菌、病毒、真菌、原生 動(dòng)物和寄生蟲。病原體也稱為傳染原。致病病毒的實(shí)例包括以下病毒科中的病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如 人免疫缺陷病毒(HIV)；人T細(xì)胞性白血病病毒(HTLV)；小RNA病毒科(Picornaviridae) (例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、 艾可病毒、口蹄疫病病毒)；杯狀病毒科(Calciviridae)(例如引起胃腸炎的毒株)；披 膜病毒科(Togaviridae)(例如馬腦炎、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(Flaviridae)(例如登革 病毒、黃病毒、西尼羅病毒、圣路易斯腦炎病毒、乙型腦炎病毒以及其他腦炎病毒)；冠狀 病毒科(Coronaviridae)(例如冠狀病毒、嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)病毒；彈狀病 毒科(Rhabdoviridae)(例如皰疹性口炎病毒、狂犬病毒)；纖絲病毒科(Filoviridae) (例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻 疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV))；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布 尼亞病毒科(Bunyaviridae)(例如漢坦病毒、辛諾瓦病毒、立夫特山谷熱病毒、布尼亞病 毒、靜脈病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血熱病毒、馬秋波病毒、鳩 寧病毒)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA 病毒科(Birnaviridae)嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)(型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科 (Parvoviridae)(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多瘤病毒、BK 病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大部分腺病毒)；皰疹病毒科(Herpesviridae)(單純皰 疹病毒(HSV)-I和HSV-2 ；巨細(xì)胞病毒(CMV) ；EB病毒(EBV)；水痘帶狀皰疹病毒(VZV)；以 及其他皰疹病毒，包括HSV-6)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和 虹彩病毒科(Iridoviridae)(如非洲豬瘟病毒)；纖絲病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉 病毒、馬爾堡病毒)；杯狀病毒科(Caliciviridae)(例如諾瓦克病毒)和未分類病毒(例 如海綿狀腦病的病原、S肝炎的病原(被認(rèn)為是乙型肝炎缺陷型衛(wèi)星病毒)；以及星狀病
) ο真菌病原體的實(shí)例包括但不限于新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、莢膜 組織胞楽菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽 生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙目艮衣原體(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌 (Candida albicans)0細(xì)菌病原體的實(shí)例包括但不限于幽門螺桿菌(Helicobacterpyloris)、伯氏 疏螺旋體(Borelia burgdorferi)、嗜月市軍團(tuán)菌(LegionelIapneumophi 1 ia)、分枝桿 菌(Mycobacteria sps)(如結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、禽分枝桿菌(M. avium)、 胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. krnsaii)、戈登分枝桿菌 (M. gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、單核細(xì)胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、化月農(nóng)鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (Α 群鏈球菌)、 無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae) (B 群鏈球菌)、鏈球菌(Streptococcus) (草綠色種群)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、牛鏈球菌(Streptococcus
17bovis)、鏈球菌(厭氧種)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性彎曲 桿菌(pathogenic Campylobacter sp.)、腸道球菌(Enterococcus sp.)、流感嗜血 菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、白喉棒桿菌 (corynebacterium diphtheriae)、棒狀桿菌(corynebacterium sp·)、豬紅斑丹毒絲 菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、產(chǎn)氣英月莫梭菌(Clostridium perfringers)、 破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、月市炎克 雷伯氏桿菌(Enterobacter aerogenes)、多殺性巴氏桿菌(Pasturella multocida)、 擬桿菌(Bacteroides sp·)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌 (Streptobacillus moniliformis)、蒼白密螺旋體(Tr印onemapallidium)、極細(xì)密螺旋 W (Treponema pertenue)、^(㈱(Leptospira)以i^fe歹[J方文(Actinomyces israelii)。其他的病原體(如原生生物)包括惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)和剛地 弓形體(Toxoplasma gondii)。藥學(xué)上可接受的介質(zhì)在本公開(kāi)內(nèi)容中有用的藥學(xué)上可接受的載體(介質(zhì))是常 夫 1 白勺。Remington’ s Pharmaceutical Sciences (), Ε. W. Martin, Mack dj 版公司，Easton，PA，第15版(1975)描述了適合于一種或多種治療性化合物或分子(如一 種或多種抗體)和其他藥劑的藥物遞送的組合物和制劑。一般來(lái)說(shuō)，載體的種類將取決于采用的具體施用方式。例如，腸胃外制劑通常包含 可注射液體，所述可注射液體包括作為介質(zhì)的藥學(xué)上和生理學(xué)上可接受的流體，如水、生理 鹽水、平衡鹽溶液、右旋糖水溶液、甘油等。對(duì)于固體組合物(例如，粉末、丸劑、片劑或膠囊 形式)來(lái)說(shuō)，常規(guī)的無(wú)毒固體載體可包括例如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除 了生物學(xué)上中性的載體以外，待施用的藥物組合物可以含有少量的無(wú)毒輔助性物質(zhì)，如濕 潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑和PH緩沖劑等，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。多肽一種聚合物，其中單體為通過(guò)酰胺鍵接合在一起的氨基酸殘基。當(dāng)氨基酸是 α氨基酸時(shí)，可使用L型光學(xué)異構(gòu)體或D型光學(xué)異構(gòu)體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋 白質(zhì)”旨在涵蓋任何氨基酸序列并且包括修飾的序列，如糖蛋白。術(shù)語(yǔ)“多肽”具體旨在覆 蓋天然存在的蛋白質(zhì)以及重組或合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“殘基”或“氨基酸殘基”包括所指的被摻入到蛋白、多肽或肽中的氨基酸?！氨Ｊ氐摹卑被崛〈腔旧喜挥绊懟蛘呓档投嚯牡幕钚曰蚩乖缘哪切┤〈?例如，多肽可以包括至多約1個(gè)、至多約2個(gè)、至多約5個(gè)、至多約10個(gè)或至多約15個(gè)保守 取代，并且其特異性結(jié)合與原多肽結(jié)合的抗體。術(shù)語(yǔ)保守的變異還包括使用取代的氨基酸 置換未取代的母體氨基酸，條件是針對(duì)取代的多肽所產(chǎn)生的抗體產(chǎn)生的抗體(antibodies raised antibodies raised)也與未取代的多肽免疫反應(yīng)。保守性取代的實(shí)例在下面顯示。
權(quán)利要求
一種包含IgG、IgA或IgD的免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，或者IgE或IgM的CH3結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域包含約1個(gè)至約7個(gè)氨基酸的N端平截，并且其中(i)所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)的至少一個(gè)被突變；(ii)所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)域的至少一部分被來(lái)自異源免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其功能片段置換；或者(iii)二者兼有，其中所述多肽具有小于約15kD的分子量，并且其中所述多肽特異性結(jié)合抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含來(lái)自IgG的CH2結(jié)構(gòu)域。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)1 被突變。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)2被突變。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)3被突變。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)A-B被突變。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)C-D被突變。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)E-F被突變。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的多肽，其中環(huán)A-B被⑶R置換。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的多肽，其中環(huán)E-F被⑶R置換。
11.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的多肽，其中所述⑶R是⑶R3。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的多肽，所述多肽具有約12kD至約14kD的分子量。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域包含約 7個(gè)氨基酸的N端平截。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域還包含 約1個(gè)至約4個(gè)氨基酸的C端平截。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域是非糖 基化的。
16.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域是糖基 化的。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域能夠結(jié) 合Fc受體。
18.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域能夠結(jié) 合補(bǔ)體蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的多肽，其中所述補(bǔ)體蛋白是Clq。
20.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域能夠結(jié) 合新生兒Fc受體。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述抗原來(lái)自病原體。
22.如權(quán)利要求21所述的多肽，其中所述病原體是病毒或細(xì)菌。
23.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
24.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述抗原是癌癥特異性抗原或癌癥相關(guān)蛋白。
25.如權(quán)利要求24所述的多肽，其中所述癌癥是白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、惡性 黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌或腎細(xì)胞癌。
26.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述抗原與自身免疫疾患或炎性疾患有關(guān)。
27.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的多肽。
28.—種載體，所述載體包含權(quán)利要求27所述的核酸分子。
29.一種分離的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求28所述的載體。
30.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的多肽和藥學(xué)上可接受 的載體。
31.一種組合物，所述組合物包含與效應(yīng)物分子或可檢測(cè)的標(biāo)記結(jié)合的權(quán)利要求1-26 中任一項(xiàng)所述的多肽。
32.—種治療受試者的HIV的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán) 利要求23所述的多肽。
33.一種治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán) 利要求24或權(quán)利要求25所述的多肽。
34.一種治療受試者的自身免疫疾患或炎性疾患的方法，所述方法包括向所述受試者 施用治療有效量的權(quán)利要求26所述的多肽。
35.如權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)所述的多肽在制備用于治療HIV感染，用于治療癌癥或 者治療自身免疫疾患或炎性疾患的藥物中的應(yīng)用。
36.一種包含IgG、IgA或IgD的免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，或者IgE或IgM的CH3結(jié)構(gòu) 域的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域包含第一氨基酸取代和第二氨基酸取代，其中 所述第一氨基酸和第二氨基酸取代各自用半胱氨酸殘基置換原始的殘基，其中所述半胱氨 酸殘基形成二硫鍵，并且其中所述多肽具有小于約15kD的分子量。
37.如權(quán)利要求36所述的多肽，其中所述第一氨基酸取代是在N端A鏈并且所述第二 氨基酸取代是在C端G鏈。
38.如權(quán)利要求36或權(quán)利要求37所述的多肽，所述多肽包含IgG的CH2結(jié)構(gòu)域。
39.如權(quán)利要求38所述的多肽，其中所述第一氨基酸取代是L12至C12，并且所述第二 氨基酸取代是K104至C104 (參考SEQ ID NO :5編號(hào))。
40.如權(quán)利要求38所述的多肽，其中所述第一氨基酸取代是VlO至C10，并且所述第二 氨基酸取代是K104至C104 (參考SEQ ID NO :5編號(hào))。
41.如權(quán)利要求36-40中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域包含約1個(gè)至 約7個(gè)氨基酸的N端平截。
42.如權(quán)利要求36-41中任一項(xiàng)所述的多肽，其中(i)CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)的至少一 個(gè)被突變；(ii)所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)域的至少一部分被來(lái)自異源免疫球蛋 白可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其功能片段置換；或者(iii) 二者兼有，并且其中所述 多肽特異性結(jié)合抗原。
43.一種包含IgG、IgA或IgD的免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，或者IgE或IgM的CH3結(jié)構(gòu) 域的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域包含約1個(gè)至約7個(gè)氨基酸的N端平截，并且其中所述多肽具有小于約15KD的分子量。
44.如權(quán)利要求43所述的多肽，所述多肽包含約7個(gè)氨基酸的N端平截。
45.如權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域還包 含第一氨基酸取代和第二氨基酸取代，其中所述第一和第二氨基酸取代各自用半胱氨酸殘 基置換原始的殘基，其中所述半胱氨酸殘基形成二硫鍵。
46.如權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)所述的多肽，其中(i)CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)的至少一 個(gè)被突變；( )所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)域的至少一部分被來(lái)自異源免疫球蛋 白可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其功能片段置換；或者(iii) 二者兼有，并且其中所述 多肽特異性結(jié)合抗原。
47.如權(quán)利要求36-46中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域是非糖 基化的。
48.如權(quán)利要求36-46中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域是糖基 化的。
49.一種鑒定特異性結(jié)合靶抗原的重組CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括(a)提供在它們的表面上展示重組CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的粒子的文庫(kù)，其中所述CH2或 CH3結(jié)構(gòu)域包含約1個(gè)至約8個(gè)氨基酸的N端缺失，并且其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域具有小 于約15KD的分子量，其中所述文庫(kù)是通過(guò)以下產(chǎn)生(i)提供編碼CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的遺傳多樣性群體的核酸分子的文庫(kù)，其中所述遺傳多 樣性群體是通過(guò)將突變引入CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)域中來(lái)提供；并且( )在重組的宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸分子的文庫(kù)，從而將CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域表 達(dá)在所述粒子的表面上，并且所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的核酸分子被所述粒子的遺傳材料編 碼；(b)將所述粒子的文庫(kù)與所述靶抗原接觸以選擇特異性結(jié)合所述靶抗原的粒子；以及(c)從表達(dá)特異性結(jié)合所述靶抗原的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的粒子中克隆CH2或CH3結(jié)構(gòu) 域核酸分子，由此鑒定特異性結(jié)合所述靶抗原的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域在環(huán)1中包含至少一個(gè)突變。
51.如權(quán)利要求49或權(quán)利要求50所述的方法，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域在環(huán) 2中包含至少一個(gè)突變。
52.如權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域在環(huán)3 中包含至少一個(gè)突變。
53.如權(quán)利要求49-52中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域在環(huán) A-B中包含至少一個(gè)突變。
54.如權(quán)利要求49-53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域在環(huán) C-D中包含至少一個(gè)突變。
55.如權(quán)利要求49-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域在環(huán) E-F中包含至少一個(gè)突變。
56.如權(quán)利要求49-55中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述文庫(kù)包含重組CH2結(jié)構(gòu)域。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域是IgGCH2結(jié)構(gòu)域。
58.一種鑒定特異性結(jié)合靶抗原的重組CH2結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括(a)提供在它們的表面上展示重組IgGCH2結(jié)構(gòu)域的粒子的文庫(kù)，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域 包含約1個(gè)至約8個(gè)氨基酸的N端缺失，并且其中所述CH2結(jié)構(gòu)域具有小于約15KD的分子 量，其中所述文庫(kù)是通過(guò)以下產(chǎn)生(i)提供編碼CH2結(jié)構(gòu)域的遺傳多樣性群體的核酸分子的文庫(kù)，其中所述遺傳多樣性 群體是通過(guò)將突變引入CH2結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)域中來(lái)提供，其中所述環(huán)區(qū)域選自環(huán) 1、環(huán)2和環(huán)3 ；并且( )在重組的宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸分子的文庫(kù)，從而CH2結(jié)構(gòu)域被表達(dá)在所述粒子的 表面上，并且所述CH2結(jié)構(gòu)域的核酸分子被所述粒子的遺傳材料編碼；(b)將粒子的文庫(kù)與所述靶抗原接觸以選擇特異性結(jié)合靶抗原的粒子；以及(c)從表達(dá)特異性結(jié)合所述靶抗原的CH2結(jié)構(gòu)域的粒子中克隆所述CH2結(jié)構(gòu)域的核酸 分子，由此鑒定特異性結(jié)合所述靶抗原的CH2結(jié)構(gòu)域。
59.如權(quán)利要求49-58中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述粒子是噬菌體粒子。
60.一種制備重組CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的文庫(kù)的方法，所述方法包括⑴將突變引入CH2 結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域支架的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)域中，或者(ii)用來(lái)自異源免疫球蛋白可變結(jié) 構(gòu)域的CDR或其功能片段置換所述CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域支架的環(huán)區(qū)域的一部分，或者 (iii) 二者兼有，其中所述支架包含IgG、IgA或IgD的分離的免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域或者 IgE或IgM的CH3結(jié)構(gòu)域。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域支架還包含約1個(gè)至約7 個(gè)氨基酸的N端平截。
62.如權(quán)利要求60或權(quán)利要求61所述的方法，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域支架還包含 約1個(gè)至約4個(gè)氨基酸的C端平截。
63.如權(quán)利要求60-62中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述CH2或CH3結(jié)構(gòu)域支架還包含第 一氨基酸取代和第二氨基酸取代，其中所述第一和第二氨基酸取代各自用半胱氨酸殘基置 換原始的殘基，其中所述半胱氨酸殘基形成二硫鍵。
64.一種鑒定特異性結(jié)合靶抗原的重組CH2結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括 使通過(guò)權(quán)利要求60-63中任一項(xiàng)所述方法產(chǎn)生的文庫(kù)與所述靶抗原接觸以選擇特異性結(jié) 合所述靶抗原的重組CH2或CH3結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本申請(qǐng)描述的是工程化抗體恒定結(jié)構(gòu)域分子，例如CH2或CH3結(jié)構(gòu)域分子，所述工程化抗體恒定結(jié)構(gòu)域分子包含至少一個(gè)突變，或者包含在所述CH2結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)域中移入的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其功能片段。本申請(qǐng)所述的CH2結(jié)構(gòu)域分子是小的、穩(wěn)定的、可溶的，表現(xiàn)出很少毒性乃至沒(méi)有毒性并且能夠結(jié)合抗原。
文檔編號(hào)C07K16/10GK101977932SQ200980110221
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2009年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日
發(fā)明者迪米特爾·S·迪米特羅夫 申請(qǐng)人:美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部