抗上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)抗體及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種經(jīng)分離單株抗體或其抗原結(jié)合片段。該抗體或抗原結(jié)合片段具有以下的特征：(a)對(duì)包括胺基酸序列SEQ?ID?NO:1的上皮細(xì)胞黏著分子(Epithelial?cell?adhesion?molecule；EpCAM)具有特異性結(jié)合親和力；(b)對(duì)可以表現(xiàn)EpCAM的癌細(xì)胞具有特異性結(jié)合親和力，該癌細(xì)胞是選自由口腔癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞(nasopharyngeal?cancer?cell；NPC)、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞所組成的群；(c)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human?umbilical?vein?endothelial?cell；HUVEC)及正常鼻黏膜上皮細(xì)胞(normal?nasal?mucosal?epithelia；NNM)不具結(jié)合親和力。本發(fā)明亦公開了一種經(jīng)分離單株抗體或其抗原結(jié)合片段，其對(duì)于位處上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)的EGF樣區(qū)域II內(nèi)的KPEGALQNNDGLYDPDCDE(SEQ?ID?NO:63)序列內(nèi)的抗原決定部位具有特異性結(jié)合親和力。本發(fā)明亦公開使用該等的方法。
【專利說(shuō)明】抗上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)抗體及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明大體上是涉及抗癌劑，更特定而言是涉及用在癌癥治療、診斷及照影成像的抗體。

【背景技術(shù)】
[0002]頭及頸部鱗狀細(xì)胞癌(headand neck squamous cell carcinoma ；HNSCC)是全球已發(fā)展國(guó)家中第六位最常見的惡性腫瘤?？谇击[狀細(xì)胞癌(oral squamous cellcarcinoma ；0SCC)則是頭及頸部位最常見的腫瘤。雖然頭及頸部癌癥在診斷、局部處理及化療法上有明顯的改進(jìn)，但在過(guò)去30年間，長(zhǎng)期存活率并沒(méi)有明顯的增加。即使具有現(xiàn)代的醫(yī)療服務(wù)，針對(duì)口腔內(nèi)癌癥方面的整體死亡率仍維持在約50%的高水平。因此，高風(fēng)險(xiǎn)性癌前病灶的預(yù)防及早期診斷與治療在降低HNSCC相關(guān)死亡上是有相當(dāng)幫助的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]在一方面，本發(fā)明是涉及一種經(jīng)純化或經(jīng)分離的單株抗體或其抗原結(jié)合片段，其對(duì)于位處上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)的EGF樣區(qū)域II (SEQ ID NO:1)內(nèi)的KPEGALQNNDGLYDH)⑶E(SEQ ID NO:63)序列內(nèi)的抗原決定部位具有特異性結(jié)合親和力。
[0004]在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段會(huì)展現(xiàn)出下列的特征:當(dāng)EpCAM的EGF樣區(qū)域II內(nèi)的胺基酸95位置處的酪胺酸(Y)或胺基酸96位置處的天門冬胺酸(D)或該Y及D發(fā)生突變(或具有取代性突變作用)，則前述的結(jié)合親和力會(huì)消失。
[0005]在本發(fā)明另一具體實(shí)施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段包括:
[0006](a) 一重鏈可變域，其包括⑴包含SEQ ID NO:4的互補(bǔ)決定域I (⑶Rl) ; (ii)包含SEQ ID N0:5的互補(bǔ)決定域2(CDR2);及(iii)包含SEQ ID NO: 6的互補(bǔ)決定域3 (CDR3)；及
[0007](b) 一輕鏈可變域，其包括⑴包含SEQ ID NO: 7的CDRl ；(ii)包含SEQ ID NO:8的 CDR2 ;及(iii)包含 SEQ ID NO:9 的 CDR3。
[0008]在本發(fā)明另一具體實(shí)施例中，該結(jié)合片段包括該抗體的Fv片段。另一選擇地，該結(jié)合片段包括該抗體的Fab片段。
[0009]在本發(fā)明另一具體實(shí)施例中，該抗體是經(jīng)擬人化單株抗體。
[0010]在本發(fā)明另一具體實(shí)施例中，該重鏈可變域包括SEQ ID N0:24的胺基酸序列，而該輕鏈可變域包括SEQ ID NO:25的胺基酸序列。
[0011]在另一方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)純化或經(jīng)分離的單鏈可變片段，其包括:
[0012](a)包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO:3的胺基酸序列的輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的輕鏈可變域；及
[0013](b)鏈接該重鏈可變域及該輕鏈可變域的鏈接肽。
[0014]除此之外，在另一方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)分離的單株抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有下列的特征:
[0015](a)對(duì)于包括SEQ ID NO:1胺基酸序列的上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)具有特異性結(jié)合未和力；
[0016](b)對(duì)于可表現(xiàn)EpCAM的癌細(xì)胞具有特異性結(jié)合親和力，該癌細(xì)胞是選自由口腔癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞所組成的群；及
[0017](C)對(duì)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及正常鼻黏膜上皮細(xì)胞則不具結(jié)合親和力。
[0018]在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段在活體內(nèi)可展現(xiàn)出誘導(dǎo)該癌細(xì)胞凋亡及/或抑制該癌細(xì)胞生長(zhǎng)的特征。
[0019]在本發(fā)明另一具體實(shí)施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段對(duì)于位處EpCAM的EGF樣區(qū)域II內(nèi)的KPEGALQNNDGLYDroCDE(SEQ ID NO:63)序列內(nèi)的抗原決定部位具有特異性結(jié)合親和力。
[0020]在本發(fā)明另一具體實(shí)施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段是經(jīng)一可偵測(cè)化合物或酵素加以標(biāo)記，或是經(jīng)囊封在脂質(zhì)體內(nèi)。
[0021]在本發(fā)明另一具體實(shí)施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段包括:
[0022](a)包含SEQ ID NO:2胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO:3胺基酸序列的輕鏈可變域；或
[0023](b)包含SEQ ID NO: 24胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO: 25胺基酸序列的輕鏈可變域。
[0024]除此之外，在另一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包括:(a)如前所提的經(jīng)分離的抗體或抗原結(jié)合片段；(b) —抗癌藥劑 '及(C) 一醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0025]除此之外，在另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制癌細(xì)胞及/或腫瘤啟始細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括向一有其需要的個(gè)體投予一組合物，該組合物包括:(a)如前所提的經(jīng)分離的抗體或抗原結(jié)合片段 '及(b) —醫(yī)藥上可接受的載劑，其中該癌細(xì)胞及/或腫瘤啟始細(xì)胞具表現(xiàn)EpCAM。
[0026]在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，是將擬人化抗體或抗原結(jié)合片段投予至該個(gè)體。該癌細(xì)胞是選自由口腔癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞所組成的群。
[0027]又另一方面，本發(fā)明涉及偵測(cè)及/或診斷具表現(xiàn)EpCAM的癌細(xì)胞的方法，該方法包括:
[0028](a)自一病患取得細(xì)胞或組織樣本；
[0029](b)將該細(xì)胞或組織樣本與如前所提的抗體或結(jié)合片段接觸；
[0030](c)分析該抗體或結(jié)合片段結(jié)合至該細(xì)胞或組織樣本的情況；及
[0031](d)與正常對(duì)照組比較結(jié)合情況，以判定個(gè)體中具表現(xiàn)EpCAM的癌細(xì)胞存在。
[0032]并與下文圖式及下列較佳實(shí)施例的說(shuō)明，本發(fā)明該等或其他態(tài)樣會(huì)是顯而易見的，雖然其中可以進(jìn)行變化及修飾，但不會(huì)脫離本發(fā)明新穎概念上的精神及范疇。
[0033]該等所附圖式可說(shuō)明清楚本發(fā)明一或多個(gè)實(shí)施例，且并與書面說(shuō)明可用以解釋本發(fā)明原理。只要有可能的情況下，通篇圖式是使用與實(shí)施例同一或類似組件的相同參考編號(hào)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1顯示0CAb9_l與各種不同癌細(xì)胞株的結(jié)合活性。(A)0CAb9_l在各種不同癌細(xì)胞株的結(jié)合活性的ELISA分析。NM-1gG是作為對(duì)照組。(B)0CAb9_l單株抗體對(duì)抗口腔癌細(xì)胞(SAS)、鼻咽癌細(xì)胞(NPC)、肺癌細(xì)胞(H441及H520)、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞(HCT116、SW620及COLO 205)及卵巢癌細(xì)胞(SK0V-3)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)及正常鼻黏膜上皮細(xì)胞(NNM)的西方轉(zhuǎn)潰分析。(C)抗EpCAM單株抗體(0CAb9_l)在人類組織微數(shù)組中的免疫組織染色。將經(jīng)包埋石蠟部分與0CAb9-l培養(yǎng)反應(yīng)，以偵測(cè)不同人類癌組織(包括口腔、乳房、結(jié)腸、卵巢及子宮及該等對(duì)應(yīng)的正常組織)中的EpCAM表現(xiàn)。EpCAM(染成棕色)、蘇木精(染成藍(lán)色)為背景染色之用。細(xì)胞照影成像是放大200倍取得。
[0035]圖2顯示0CAb9_l標(biāo)靶蛋白的鑒定。(A)通過(guò)免疫親和力層析純化的0CAb9_l標(biāo)靶蛋白。第I行:分子量標(biāo)志；第2行:自經(jīng)共軛0CAb9-l親和力管柱所純化的蛋白質(zhì)，及第3行:自經(jīng)共軛0CAb9-l親和力管柱所純化蛋白質(zhì)的西方轉(zhuǎn)潰分析。將39 kDa蛋白質(zhì)(箭頭指示處)經(jīng)純化，并進(jìn)行LC/MS/MS分析。(B)以Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)0CAb9_l的標(biāo)靶蛋白。全長(zhǎng)的人類TACSTD1 (EpCAM)為含有314個(gè)胺基酸的多肽。高度亮點(diǎn)序列是被LC/MS/MS點(diǎn)擊的肽。(C) SAS細(xì)胞溶解物與0CAb9_l抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，之后與兔子抗EpCAM單株抗體(1144-1)及EpAb3_5、EpAb4_l抗體進(jìn)行轉(zhuǎn)潰分析。(D)兩種EpCAM shRNA質(zhì)體(shEpCAMl及shEpCAM2)分別轉(zhuǎn)染至SAS細(xì)胞株之后，萃取出每一細(xì)胞株的總RNA，并以qRT-PCR分析檢測(cè)。shEpCAMl及shEpCAM2兩者質(zhì)體在經(jīng)轉(zhuǎn)染SAS細(xì)胞株中對(duì)于EpCAMmRNA具有明顯的抑制效應(yīng)。測(cè)量經(jīng)混合選殖體的樣本，每一處代表平均值土SEM(η = 3)。***表示P〈0.001。(E)進(jìn)行西方轉(zhuǎn)潰分析及(F)流式細(xì)胞分析，以評(píng)估抗0CAb9-l單株抗體與對(duì)照組細(xì)胞及剔除EpCAM基因SAS細(xì)胞的結(jié)合。
[0036]圖3顯示該等抗EpCAM單株抗體的特征。0CAb9_l及EpAb單株抗體可辨識(shí)人類癌細(xì)胞株。將SAS、HCT116及NNM細(xì)胞與0CAb9-l及EpAb單株抗體培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞分析技術(shù)、免疫熒光染色(A)及西方轉(zhuǎn)潰(B)測(cè)量該等抗EpCAM單株抗體的結(jié)合活性。以EpAb2-6 (0-20 μ g/ml)處理(C) SAS細(xì)胞及(D) HCTl 16細(xì)胞6小時(shí)，利用膜聯(lián)蛋白V-FITC及PI雙重染色通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)量細(xì)胞死亡情況。膜聯(lián)蛋白V-FITC可用以測(cè)量細(xì)胞族群內(nèi)在早期(6小時(shí))活躍性地進(jìn)行細(xì)胞凋亡作用的細(xì)胞百分比。碘化丙啶(PI)是用以從不具生命力細(xì)胞中區(qū)分出具生命力的細(xì)胞。
[0037]圖4顯示EpCAM shRNA及EpAb2_6在活體外及活體內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。通過(guò)EpCAM shRNA(shEpCAM)剔除EpCAM基因在SAS細(xì)胞中的表現(xiàn)。單獨(dú)使用LKO shRNA載體(對(duì)照組shRNA)是作為對(duì)照組。(A)EpCAM的降調(diào)節(jié)會(huì)抑制SAS細(xì)胞的細(xì)胞增殖。通過(guò)MTT檢測(cè)法分析細(xì)胞存活率。**表示p〈0.01,***表示ρ〈0.001。(B-D)顯示活體外抑制EpCAM的表現(xiàn)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的(B)細(xì)胞群落形成、(C)遷移及(D)侵犯性。(E)抑制EpCAM的表現(xiàn)會(huì)降低活體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。以EpAb2-6單株抗體(10mg/kg)或PBS處理帶有SAS衍生性腫瘤異種移植的N0D/SCID小鼠，并測(cè)量腫瘤體積(η = 6)(數(shù)據(jù)以平均值土 SD表示，而P值是以t-檢定法分析)。誤差線為土SD。*表示Ρ〈0.05。(F)所示Kaplan-Meier存活曲線為經(jīng)以EpAb2-6及PBS處理的小鼠的長(zhǎng)時(shí)間存活期(每一組η = 6)。
[0038]圖5A-D顯示EpAb2_6會(huì)減小瘤球形成。以碘化丙啶(PI)染色通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析，EpAb2-6會(huì)增加(A)HCT116及(B)瘤球(HCT116球體細(xì)胞)中的異二倍體DNA的含量。(C)EpAb2-6會(huì)減小瘤球形成。(D)HCTl 16球體細(xì)胞以EpAb2-6處理6天，計(jì)算所得瘤球數(shù)目。
[0039]圖6顯示單獨(dú)使用EpAb2-6或EpAb2-6并與IFL組合使用對(duì)抗帶有HCTl 16腫瘤小鼠的效果。(A)帶HCT116衍生性結(jié)腸癌小鼠投予EpAb2-6、IFL、EpAb2-6與IFL的組合，及PBS0測(cè)量每一組的腫瘤大小(每一組的η = 6)。每一點(diǎn)表示平均值；誤差線為SD。(B)每一組的體重。(C)治療結(jié)束時(shí)，測(cè)量腫瘤重量。(D)在(C)中所述的分析結(jié)果代表性影像。*表不ρ〈0.05為顯著差異。
[0040]圖7顯示發(fā)展對(duì)抗EpCAM的擬人化抗體。(A)將EpAb2_6的⑶R嫁接至人類IgGl基本架構(gòu)上，以產(chǎn)生擬人化抗體EpAb2-6 (hEpAb2-6)。hEpAb2_6對(duì)人類癌細(xì)胞株的結(jié)合能力。以ELISA測(cè)量mEpAb2-6及hEpAb2-6與(B) SAS細(xì)胞及(C) CCD_1112Sk細(xì)胞的結(jié)合活性。正常小鼠IgG(NM-1gG)及正常人類IgG(人類IgG)是作為陰性對(duì)照組。(D)mEpAb2_6及hEpAb2-6對(duì)抗NNM、SAS及HCTl 16細(xì)胞的西方轉(zhuǎn)潰分析。以hEpAb2_6 (0-20 μ g/ml)處理(E)SAS細(xì)胞及(F) HCT116細(xì)胞6小時(shí)，并以膜聯(lián)蛋白V-FITC及碘化丙啶(PI)雙重染色通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析測(cè)量細(xì)胞死亡。
[0041]圖8A-B顯示EpAb2_6特異性B細(xì)胞抗原決定部位的鑒定。(A)吾人通過(guò)改變野生型 EGF-1 區(qū)域(Q54A/N55A)或 EGF-1I 區(qū)域(Q89A/N90A、D92A/G93A、L94A/Y95A、L94A、Y95A或D96A)胺基酸而構(gòu)筑各種不同的EpCAM突變。(B)各種不同的EpCAM突變體在HEK293細(xì)胞中表現(xiàn)。萃取出細(xì)胞蛋白質(zhì)之后，使用西方轉(zhuǎn)潰分析測(cè)定EpAb2-6及EpAb3-5等抗體對(duì)抗各種EpCAM突變體的反應(yīng)性。Y95及D96胺基酸取代會(huì)導(dǎo)致EpAb2_6單株抗體結(jié)合活性明顯的減損，其對(duì)應(yīng)在EGF-1I上的序列如㈧所示。
[0042]圖9顯示EpCAM的增加與腫瘤細(xì)胞的腫瘤啟始及自我更新能力有關(guān)。在球體腫瘤細(xì)胞及抗失巢凋亡腫瘤細(xì)胞中測(cè)到EpCAM的表現(xiàn)量增加。(A)視野影像下球體細(xì)胞、抗失巢凋亡細(xì)胞及附著性HCT116細(xì)胞中細(xì)胞型態(tài)明顯改變。上述細(xì)胞中EpCAM的表現(xiàn)(B)實(shí)時(shí)qPCR(左)及(C)流式細(xì)胞技術(shù)分析。(D)以三重復(fù)方式計(jì)算篩選具高表現(xiàn)EpCAM細(xì)胞及低表現(xiàn)EpCAM細(xì)胞比較兩者細(xì)胞的球體細(xì)胞形成數(shù)目。所示圖像是來(lái)自高表現(xiàn)EpCAM及低表現(xiàn)EpCAM細(xì)胞的瘤球的代表性影像。(E)評(píng)估球體細(xì)胞及附著性HCTl 16細(xì)胞在小鼠中的腫瘤啟始能力。腫瘤發(fā)生率及腫瘤體積計(jì)監(jiān)測(cè)35天。(F)經(jīng)蘇木精及曙紅(H&E)染色腫瘤部分的組織學(xué)分析(圖所顯示上方:相鄰鼠科骨骼肌間浸潤(rùn)前的侵犯性；下方:具有清楚界定的擴(kuò)張性腫瘤界線，而不是組織浸潤(rùn))。
[0043]圖10顯示EpCAM會(huì)升調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的改編基因(c_MYC、0CT4、NANOG及S0X2)表現(xiàn)及自我更新。(A)球體腫瘤細(xì)胞中EpCAM表現(xiàn)及改編基因表現(xiàn)的增加情況。球體及附著性HCTl 16細(xì)胞中EpCAM、c_Myc、0ct4、Nanog及Sox2表現(xiàn)的即時(shí)qPCR (左上圖)、西方轉(zhuǎn)潰(右上圖)，及免疫熒光染色(下圖)分析。(B)高表現(xiàn)EpCAM及低表現(xiàn)EpCAM的HCT116細(xì)胞中該等基因表現(xiàn)的即時(shí)qPCR分析。(C)通過(guò)即時(shí)qPCR分析HEK293細(xì)胞中EpCAM的異位表現(xiàn)及改編基因表現(xiàn)。(D)在剔除EpCAM基因的!fep3B細(xì)胞及HCT116細(xì)胞中EpCAM、c_Myc、0ct4、Nanog及Sox2 mRNA含量的即時(shí)qPCR分析。(E)抑制EpCAM會(huì)減小!fep3B及HCT116細(xì)胞中瘤球形成，量線=50微米。(F)剔除瘤球中EpCAM基因在活體外會(huì)影響自我更新能力。實(shí)驗(yàn)步驟示于上文。**為p〈0.01表示明顯差異。(G)通過(guò)打入不同細(xì)胞濃度進(jìn)入活體內(nèi)分析證明瘤球中剔除EpCAM基因會(huì)抑制腫瘤啟始能力。*為p〈0.01是以對(duì)數(shù)等級(jí)檢定分析。
[0044]圖11顯示EpCAM的表現(xiàn)與EMT進(jìn)展及腫瘤生成有關(guān)。(A)在剔除EpCAM基因的!fep3B細(xì)胞及HCT116細(xì)胞中E-鈣黏著素(E_cad)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)及中間絲蛋白(Vim)的免疫熒光染色。(B)在剔除EpCAM基因的Hep3B細(xì)胞及HCTl 16細(xì)胞中EMT基因表現(xiàn)的即時(shí)qPCR(左圖)及西方轉(zhuǎn)潰(右圖)分析。(C)在高表現(xiàn)EpCAM及低表現(xiàn)EpCAM分篩細(xì)胞中EMT基因表現(xiàn)的即時(shí)qPCR分析。(D及E)抑制EpCAM會(huì)抑制活體外腫瘤細(xì)胞的侵犯性(D)及細(xì)胞群落形成(E)。(F)抑制EpCAM會(huì)降低活體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。以皮下方式將2 X 16的HCT/LK0及HCT/EpCAM shRNA細(xì)胞注射至N0D/SCID小鼠中，每3天測(cè)量腫瘤體積(左圖)，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量腫瘤重量(右圖)(n = 6)。(G)利用即時(shí)qPCR分析萃取自腫瘤的RNA (數(shù)據(jù)是以平均值土 SD表示，而以t-檢定分析P值。
[0045]圖12顯示細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(EpI⑶)參與調(diào)節(jié)自我更新及EMT基因。(A)細(xì)胞經(jīng)DAPT處理(50 μ Μ)或未處理后，HCT116細(xì)胞中EpI⑶在細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的雷射共焦免疫熒光照影成像分析。量線=1ym0 (B)293T/EpCAM-v5細(xì)胞以DAPT處理后的EpI⑶裂解的西方轉(zhuǎn)潰分析結(jié)果，而蛋白質(zhì)樣本是與EpICD或v5抗體進(jìn)行轉(zhuǎn)潰(黑色箭頭表示EpICD裂解)。(C-E)(C) DAPT會(huì)抑制EMT基因表現(xiàn)、(D)腫瘤侵犯性及(E)瘤球形成。(F) EpCAM過(guò)度表現(xiàn)會(huì)升調(diào)節(jié)c-Myc、0ct4、Nanog及Sox2的轉(zhuǎn)錄活性。以突光素酶分析法評(píng)估啟動(dòng)子活性。(G)DAPT會(huì)抑制EpCAM所誘發(fā)的c-Myc、0ct4、Nanog及Sox2轉(zhuǎn)錄活性。(H) EpI⑶誘發(fā)改編基因的轉(zhuǎn)錄活化作用。(1-J)染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)分析EpI⑶與HCTl 16及NNM細(xì)胞中c_MYC、0CT4、NANOG及S0X2基因外顯子結(jié)合后DNA活化情況。**為p〈0.01是表示顯著差異。
[0046]圖13顯示EpEX為活化EpCAM訊號(hào)的轉(zhuǎn)換子。(A) 293T轉(zhuǎn)染選殖體中EpEX291及全長(zhǎng)EpCAM蛋白質(zhì)表現(xiàn)的西方轉(zhuǎn)潰分析結(jié)果。(B)EpEX會(huì)誘發(fā)c_Myc、Nanog、0ct4及Sox2的啟動(dòng)子活性。細(xì)胞以pEpEX291轉(zhuǎn)染(左圖)，或添加可溶性EpEX(sEpEX ；2 μ g/ml)(右圖)，通過(guò)突光素酶分析法評(píng)估c-Myc、Nanog、0ct4及Sox2的啟動(dòng)子活性,對(duì)照組是使用BSA。(C) EpCAM表現(xiàn)細(xì)胞的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(EpEX)釋放。以免疫沉淀法及西方轉(zhuǎn)潰分析HCTl 16細(xì)胞培養(yǎng)上清液中EpEX釋放含量。(D)鑒別來(lái)自HCT/LK0及HCT/EpCAM shRNA細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的EpEX0 (E)HCTl 16細(xì)胞經(jīng)以DAPT(50 μ Μ)、TAPI (40 μ Μ)或兩者(D/T)處理24小時(shí)，該培養(yǎng)上清液與EpEX抗體進(jìn)行免疫沉淀作用，而整個(gè)細(xì)胞溶解液(whole cell lysate ；WCL)是與抗EpEX抗體(中間分格)或抗EpICD抗體(下面分格)進(jìn)行西方轉(zhuǎn)潰分析。黑色箭頭:可溶性EpICD ;灰色箭頭:中間型EpICD。(F)HCT116細(xì)胞以pEpEX291_v5 (0.5 μ g、2ug)轉(zhuǎn)染72小時(shí)(左圖)或以sEpEX(2.5 μ g/ml、5 μ g/ml)處理(右圖)，該細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞溶解物以上述西方轉(zhuǎn)潰技術(shù)進(jìn)行分析。
[0047]圖14顯示EpCAM(EpI⑶)與自我更新基因表現(xiàn)及腫瘤惡性的關(guān)聯(lián)性。(A)人類結(jié)腸直腸癌(HCRC)、鄰近正常黏膜組織及正常結(jié)腸組織等不同組織上EpEX及EpI⑶在細(xì)胞定位的免疫熒光照影成像。所示代表性影像為EpEX(綠色)及EpICD (紅色)的個(gè)別影像(上部分格)，合并影像(中間分格)及從個(gè)別影像(虛框處)的放大區(qū)域(下部分格)。箭頭是指在(HCRC) EpI⑶會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，而在(鄰近正常黏膜組織)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上EpEX與EpICD會(huì)有共位現(xiàn)象。通過(guò)人類結(jié)腸癌組織微數(shù)組進(jìn)行EpICD蛋白質(zhì)表現(xiàn)的免疫組織分析。(B)所示代表性影像為正常細(xì)胞及不同分化程度腫瘤細(xì)胞的隨機(jī)放大局部圖，及(C)EpICD表現(xiàn)的箱線圖，以t-檢定分析P值。圖14D顯示EpICD的細(xì)胞定位表現(xiàn)在細(xì)胞膜(M)、細(xì)胞質(zhì)(C)及細(xì)胞核(N)中。右邊影像是左邊影像框線區(qū)域的局部放大圖。(E)通過(guò)qPCR分析測(cè)定42位人類結(jié)腸癌病患中EpCAM、c-Myc、Nanog、0ct4及Sox2的mRNA表現(xiàn)含量。EpCAM與改編基因間的相關(guān)性是以斯皮爾曼氏分析法(Spearman’ s analysis)評(píng)估。
[0048]圖15為該等對(duì)抗癌細(xì)胞單株抗體的主要特征的綜整。
[0049]圖16為該等抗EpCAM單株抗體的主要特征的綜整。
[0050]圖17顯示EpAb2_6 VH及VL區(qū)域的胺基酸序列。
[0051]圖18顯示該等抗EpCAM單株抗體的動(dòng)力常數(shù)及結(jié)合親和力。
[0052]圖19顯示以EpAb2_6篩選的噬菌體展現(xiàn)肽序列的排列比較。

【具體實(shí)施方式】
[0053]除非另有定義，否則本文所使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)為熟知本發(fā)明所涵蓋技藝者慣常了解的意義。在有矛盾的情況下，本發(fā)明文件，包括定義將可以支配主控。
[0054]如本文所使用，「左右」、「約」或「大約」通常是指給定數(shù)值或范圍的20%內(nèi)，較佳是10 %內(nèi)，且更佳是5 %內(nèi)。本文給定的數(shù)量是大約的，其意指如果未表述說(shuō)明，該術(shù)語(yǔ)為「左右」、「約」或「大約」的意思。
[0055]縮寫:mAb意指單株抗體；NNM意指正常鼻黏膜；FACS意指流式細(xì)胞技術(shù)分析；ELISA意指酶聯(lián)免疫吸附分析；EMT意指上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；qRT_PCR意指定量即時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；ChIP意指染色質(zhì)沉淀作用；GAPDH意指甘油醛-3-磷酸脫氫酶；HUVEC意指人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；IHC意指免疫組織化學(xué)；CDR意指互補(bǔ)決定域。
[0056]如本文所使用，「調(diào)劑」通常應(yīng)指經(jīng)制備、制造、特制物質(zhì)的某物品。
[0057]如本文所使用，「抗體」一詞意指具有可特異性結(jié)合至特定抗原的能力的免疫球蛋白(Ig)分子或免疫球蛋白分子的片段。該Ig單體是由4條多肽鏈所組成的「Y」形分子，包括由雙硫鍵鏈接的2條相同重鏈及2條相同輕鏈。該Y形分子的臂桿上含有可結(jié)合抗原的位點(diǎn)，且因此可辨識(shí)特異性外來(lái)物體。該抗體的此區(qū)域被稱為Fab (fragment, antigenbinding)區(qū)域。
[0058]如本文所使用，「抗體」一詞不只是指全長(zhǎng)的抗體分子，也是指仍具有抗原結(jié)合能力的抗體分子片段。此等片段亦為技藝所熟知的，且經(jīng)常性地在活體外及活體內(nèi)使用?！缚贵w」一詞不只是指全長(zhǎng)的免疫球蛋白分子，亦指抗原結(jié)合活性片段，諸如眾所熟知的活性片段F(ab’ )2、Fab、Fv及 Fd。
[0059]抗原結(jié)合片段(Fab片段)是指在抗體上可與抗原結(jié)合的區(qū)域。其是由每條重鏈及輕鏈的一個(gè)固定域及一個(gè)可變域組成。該兩個(gè)可變域會(huì)與其特異性抗原上的抗原決定部位結(jié)合。Fe及Fab片段可以在實(shí)驗(yàn)室里制造產(chǎn)生。酵素木瓜蛋白酶可用以將免疫球蛋白的單體裂解成2個(gè)Fab片段及I個(gè)Fe片段。酵素胃蛋白酶會(huì)切在樞紐區(qū)域，因此會(huì)形成I個(gè)F(ab’)2片段及I個(gè)pFc’片段。酵素IdeS (源于化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白降解酵素，商品名為FabRICATORTM)在中性pH下會(huì)以序列特異性方式裂解IgG。該F(ab’)2片段通過(guò)溫和還原作用可以切成2個(gè)Fab’片段。
[0060]抗體的可變域是以Fv區(qū)域表示，且其是與抗原結(jié)合最重要的區(qū)域。
[0061]「Fv片段」是具有活性的抗體片段(Fv)，是由重鏈及輕鏈的可變部分組成。該「Fv片段」是由重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)通過(guò)強(qiáng)力非共價(jià)方式相互影響結(jié)合在一起而組成。因此，每一 Fv片段含有一個(gè)完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)，且為衍生自抗體分子的最小活性片段。
[0062]該重鏈及輕鏈的可變域可以融合在一起，而形成單鏈可變域(single-chainvariable fragment ；scFv),其只有Fab片段大小的一半,但仍保有親本免疫球蛋白原有的特異性。
[0063]咸已報(bào)導(dǎo)，「完全地」人類抗體可避免某些經(jīng)擬人化抗體及嵌合抗體的副作用。有兩種成功的方法是經(jīng)確認(rèn)的一產(chǎn)生抗體的噬菌體表現(xiàn)技術(shù)及用以產(chǎn)生更多似人類抗體的老鼠遺傳工程技術(shù)。可使用噬菌體表現(xiàn)技術(shù)，如此可變的抗體區(qū)域便可以表現(xiàn)在絲狀噬菌體抗體上。
[0064]技藝中現(xiàn)已為大家接受的是哺乳類抗體的非CDR區(qū)域可經(jīng)同質(zhì)特異性或異質(zhì)特異性抗體的類似區(qū)域置換，但仍保有原抗體的抗原決定部位特異性。此在「擬人化」抗體的發(fā)展及用途上最為明確地顯露，其中為了產(chǎn)生具有功能的抗體，是將非人類CDR以共價(jià)方式結(jié)合至人類FR及/或Fc/pFc’區(qū)域。因此，(例如)PCT國(guó)際公開案W092/04381揭示經(jīng)擬人化鼠科RSV抗體的產(chǎn)生及用途，其中至少一部分的鼠科FR區(qū)域業(yè)經(jīng)人類來(lái)源的FR區(qū)域置換。此等抗體(包括具有抗原結(jié)合能力的全長(zhǎng)抗體片段)常被稱為「嵌合」抗體。所產(chǎn)生的此等嵌合抗體的其中抗體的某些或全部FR區(qū)域業(yè)經(jīng)其他同構(gòu)型人類FR區(qū)域置換。
[0065]非人類(例如鼠科)抗體的經(jīng)擬人化形式為含有衍生自非人類免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體其他抗原結(jié)合次序列)。經(jīng)擬人化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中該接受者的互補(bǔ)決定域(CDR)的殘基是被諸如具有所需特異性、親和力及容量的小鼠、大鼠或兔子的非人類物種者(供應(yīng)者抗體)的CDR的殘基置換。在某些例子中，人類免疫球蛋白的Fv架構(gòu)殘基是被對(duì)應(yīng)的非人類殘基所置換。經(jīng)擬人化抗體亦包括既非發(fā)現(xiàn)在接受者抗體亦非發(fā)現(xiàn)在外來(lái)CDR或架構(gòu)序列的殘基。一般而言，經(jīng)擬人化抗體會(huì)包括實(shí)質(zhì)上至少一個(gè)及典型地兩個(gè)所有的可變域，其中所有或?qū)嵸|(zhì)所有的CDR區(qū)域是對(duì)應(yīng)在非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)域，且所有或?qū)嵸|(zhì)所有的FR區(qū)域?yàn)槿祟惷庖咔虻鞍滓恢滦孕蛄械腇R區(qū)域。該擬人化抗體最佳亦包括至少一部分的免疫球蛋白固定域(Fe)，典型地是人類免疫球蛋白的固定域[Joneset al., Nature, 321:522-525(1986) ；Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988);及Presta, Curr.0p.Struct.B1l., 2:593-596(1992)]。
[0066]將非人類抗體進(jìn)行擬人化的方法是技藝中所熟知的。通常地，經(jīng)擬人化抗體具有一或多個(gè)并入其中的非人類來(lái)源的胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基常被稱為「輸入」殘基，該等典型地是取自「輸入」可變域。擬人化作用基本上是根據(jù)Winter 及共事者的方法[Joneset al., Nature, 321:522-525 (1986) ；Riechmannetal., Nature, 332:323-329 (1988);及 Verhoeyenet al., Science,
[0067]239:1534-1536 (1988)]，通過(guò)將嚿齒類動(dòng)物⑶R或⑶R序列取代人類抗體的對(duì)應(yīng)序列加以進(jìn)行的。因此，此等「擬人化」抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利案4，816，567)，其中實(shí)質(zhì)上不超過(guò)一個(gè)完整人類可變域是經(jīng)非人類物種的對(duì)應(yīng)序列所取代。實(shí)務(wù)上，擬人化抗體通常地是人類抗體，其中某些⑶R殘基及可能某些FR殘基是經(jīng)嚙齒類動(dòng)物抗體中類似位置處的殘基所取代。
[0068]人類抗體亦可利用各種技藝中已知的技術(shù)產(chǎn)生，包括噬菌體表現(xiàn)庫(kù)技術(shù)。Cole等人及Boerner等人的技術(shù)亦可用在制備人類單株抗體[Coleetal., MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p77(1985)及 Boerneretal.，J.1mmunol.，147 (I): 86-95 (1991)]。類似地，人類抗體可通過(guò)將人類免疫球蛋白基因座引入至其中該內(nèi)源性免疫球蛋白基因業(yè)經(jīng)部分或全部失活的轉(zhuǎn)殖基因動(dòng)物(例如小鼠)中而加以制造。當(dāng)激敏后，可以觀察到人類抗體的產(chǎn)生，其在所有方面是與人類中所見者極為類似，包括基因重新排列、組合及抗體的全部型態(tài)。此方法(例如)是描述在美國(guó)專利案5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016。此完全性人類單株抗體或擬人化單株抗體具有特別用途是在于該等抗體不會(huì)引發(fā)對(duì)抗抗體本身的免疫反應(yīng)。參見美國(guó)專利案7，622，113，該案是以全文并入本文參考。
[0069]該抗體可經(jīng)標(biāo)記化及固定在固體支撐物上。當(dāng)本文所使用的「標(biāo)記物」一詞是指以直接方式或間接方式共軛至抗體上的可偵測(cè)性化合物或組合物，如此即可產(chǎn)生「經(jīng)標(biāo)記」抗體。該標(biāo)記物本身可以具有偵測(cè)性的(例如，放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或以酵素性質(zhì)標(biāo)記物的例子而言，該標(biāo)記物可催化受質(zhì)化合物或組合物發(fā)生具有偵測(cè)性的化學(xué)性變化。
[0070]實(shí)施例
[0071]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的裝置、方法及其相關(guān)結(jié)果如下所示，但非意欲限制本發(fā)明范疇。注意的是為方便讀者，實(shí)施例中使用了標(biāo)題或次標(biāo)題，但絕非限制本發(fā)明范疇。再者，本文提出及揭示某些理論，然而不論該等理論是對(duì)或錯(cuò)，絕非限制本發(fā)明范疇，只要本發(fā)明是根據(jù)本發(fā)明據(jù)以實(shí)施，不考慮任何特別理論或作用流程為何。
[0072]材料與方法
[0073]細(xì)胞株與培養(yǎng)。使用下列人類細(xì)胞株:口腔癌癥(FaDu及SAS)、鼻咽癌(NPC039)、卵巢癌(SK0V-3)、肺癌(CL1-5、H441 及 H520)、胰臟癌(MIA PaCa-2)、結(jié)腸直腸癌(C0L0205、HCTl 16 及 SW620)、肝細(xì)胞癌(Hep3B 及 Mahlavu)、腎細(xì)胞癌(A498)、前列腺癌(PC3)、(XD-1112Sk(人類正常包皮細(xì)胞)及正常鼻黏膜上皮細(xì)胞(NNM)的原代培養(yǎng)。NPC細(xì)胞是在吾人的實(shí)驗(yàn)室建立的(Lin等人.(1993)「七種新建立鼻咽癌細(xì)胞株」Lab.1nvest.68，716-727)。Mahlavu 細(xì)胞是 Michael Hsiao 博士(基因體研究中心，中央研究院)贈(zèng)與。正常鼻黏膜上皮細(xì)胞(NNM)的原代培養(yǎng)是采自罹患鼻息肉患者的手術(shù)(Lee等人.，(2007)「愛波斯坦-巴爾病毒感染對(duì)于在鼻咽癌的整體基因的效應(yīng)」Funct.1ntergr.Genomics 7,79-93)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)是購(gòu)買于(龍沙公司(Lonza),Walkersville鎮(zhèn)，馬里蘭州)，且在EBM-2培養(yǎng)基(龍沙公司(Lonza)，Walkersville鎮(zhèn)，馬里蘭州)中生長(zhǎng)。人類口腔癌細(xì)胞株SAS獲自日本研究生物資源庫(kù)(東京，日本)，該等細(xì)胞是在5% C02、37°C下培養(yǎng)在經(jīng)補(bǔ)充含有10% FBS的杜爾貝克氏改良的伊格氏培養(yǎng)基(Dulbecco’ s Modified Eagle，s medium ；DMEM)中。楊泮池(Pan-Chyr Yan)博士所提供的肺腺癌細(xì)胞(CL1-5) (Chu等人.，(1997)「從人類肺腺癌細(xì)胞株挑選具侵略性及轉(zhuǎn)移性的次細(xì)胞群」Am J Respir Cell Mol B1l.17，353-60)是培養(yǎng)在補(bǔ)充含有10% FBS的RPMI培養(yǎng)基中。其他細(xì)胞株是購(gòu)自ATCC并培養(yǎng)在經(jīng)補(bǔ)充含有5%或10%胎牛血清(FBS)的杜爾貝克氏改良的伊格氏培養(yǎng)基(DMEM)中(置于37°C、5%的CO2潮濕培養(yǎng)箱中)。該等細(xì)胞是根據(jù)ATCC的步驟培養(yǎng)，且在細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過(guò)少于6個(gè)月的繼代培養(yǎng)。
[0074]單株抗體的產(chǎn)生及IgG的純化。依循下列僅稍作修改的標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生對(duì)抗SAS細(xì)胞及EpCAM抗原的單株抗體(Wu等人.(2003).「登革熱2型病毒(DEN-2)血清型特異性B細(xì)胞抗原決定部位的鑒定及利用以抗原決定部位為主的肽抗原的DEN-2經(jīng)免疫動(dòng)物血清樣本的偵測(cè)」J.Gen.Virol.84，2771-2779 ;Liu等人.(2011)「通過(guò)抗登革熱病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白I的自體抗體的人類內(nèi)皮細(xì)胞抗原的分子擬態(tài)」J.B1l.Chem.286，9726-36)。簡(jiǎn)而言之，雌性BALB/cJ小鼠以腹膜內(nèi)方式以3周間隔時(shí)間利用SAS進(jìn)行免疫4次。在最后追加劑的第4天，從經(jīng)免疫小鼠脾臟獲取脾臟細(xì)胞，并通過(guò)50%聚乙二醇(GIBC0，CA，USA)與NSI/l-Ag4-l多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。將經(jīng)融合細(xì)胞懸浮在補(bǔ)充含有次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸腺卩密唳(hypoxanthine-aminopterin-thymidine ；HAT) (SIGMA?,圣路易斯市，密蘇里州)及雜交瘤選殖因子(ICN，奧羅拉市，俄亥俄州)的DMEM培養(yǎng)基中，而后培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)盤中。而后通過(guò)有限稀釋法對(duì)該等SAS為陽(yáng)性但NNM為陰性的雜交瘤進(jìn)行次選殖，并保存在液態(tài)氮中。經(jīng)姥鮫烷(pristane)灌注的BALB/cJ小鼠會(huì)產(chǎn)生腹水，而以蛋白G瓊脂糖4G凝膠(GE Healthcare B1sciences,匹茲堡市，賓夕法尼亞州)純化出單株抗體。
[0075]ELISA0以SAS( 口腔癌細(xì)胞)、NPC、HCT116(結(jié)腸癌細(xì)胞)、SK0V3(卵巢癌細(xì)胞株)、NNM及HUVEC細(xì)胞接種於96孔培養(yǎng)盤中(Corning Costar,聖路易斯市，密蘇里州)。該等培養(yǎng)盤以2%多聚甲醛固定並以1%牛血清白蛋白阻斷。將0CAb9-l加至該等培養(yǎng)盤中並培養(yǎng)I小時(shí)。而後用含有0.1% (重量體積比)TWEEN?: 20的PBS (PBSTai)清洗該等培養(yǎng)盤，並與經(jīng)共軛辣根過(guò)氧化酶的抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch實(shí)驗(yàn)室)再培養(yǎng)I小時(shí)。清洗後，該等培養(yǎng)盤與受質(zhì)溶液鄰-苯二胺二鹽酸鹽(SIGMA?)培養(yǎng)。通過(guò)添加3N鹽酸終止反應(yīng),並以微量盤計(jì)讀儀讀取490nm處的讀值。
[0076]流式細(xì)胞技術(shù)。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(ImM) (INVITR0GEN?) 1-3分鐘將SAS、
HCTl 16及NNM細(xì)胞解離分開。用經(jīng)活化熒光細(xì)胞分篩緩沖液(含有I %胎牛血清的PBS)清洗細(xì)胞，而后在4°C下與稀釋范圍為0.00001至I μ g/ml的0CAb9_l及EpAb培養(yǎng)在經(jīng)活化熒光細(xì)胞分篩緩沖液中I小時(shí)。與作為第二抗體的經(jīng)共軛藻紅蛋白的山羊抗小鼠IgG(稀釋 1:250 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove,賓夕法尼亞州)在 4°C下培養(yǎng)30分鐘。最后清洗之后，該等細(xì)胞再以溶在PBS的1% FBS進(jìn)行懸浮，并以流式細(xì)胞儀(BD，圣荷西市，加州)進(jìn)行分析。
[0077]免疫熒光染色。培養(yǎng)在蓋玻片上的細(xì)胞是以多聚甲醛固定、清洗，而后以含有溶在PBS的I %牛血清白蛋白阻斷10分鐘。將細(xì)胞與溶在I %牛血清白蛋白的第一抗體培養(yǎng)在室溫下。I小時(shí)培養(yǎng)后，細(xì)胞經(jīng)清洗并與異硫氰酸突光素(fluorescein isoth1cyanate ；FITC)山羊抗小鼠抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、Alexafluor488 山羊抗小鼠抗體或Alexaf lour568山羊抗兔子(INVITR0GEN?)抗體培養(yǎng)。加入4’，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以便進(jìn)行核復(fù)染染色。
[0078]免疫組織化學(xué)分析。將老鼠腫瘤組織或人類組織微數(shù)組(Pantomics公司，舊金山，加州)與抗體培養(yǎng)，而后與經(jīng)共軛辣根過(guò)氧化酶(HRP)的第二抗體培養(yǎng)。該等部分最后與二胺基聯(lián)苯胺培養(yǎng)并以蘇木精(hematoxylin)進(jìn)行復(fù)染。人類結(jié)腸癌組織微陣列及15種癌癥組織分析(TMA BC05011及TMA MTU391)主要類型是購(gòu)自ΒΙ0ΜΑΧ?。利用HistoQuestsoftware (TissueGnostics,維也納,奧地利)定量Ep1)的表現(xiàn)。通過(guò)具有控制濾片、照相機(jī)及機(jī)動(dòng)平臺(tái)(M§rzh§user，韋茲拉爾，德國(guó))的AQuest軟件(TissueGnostics,維也納，奧地利)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)擷取。以影像細(xì)胞學(xué)而言，所有影像均是利用Tissue-Faxs圖像分析軟件(TissueGnostics,維也納,奧地利)獲得。
[0079]標(biāo)靶蛋白的鑒定。SAS細(xì)胞以補(bǔ)充含有蛋白酶抑制劑雞尾酒錠片(Roche，印第安納波利斯市，印第安納州)的裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.4,150mM NaCl,l%NP-40)進(jìn)行裂解。將上清液施加至與0CAb9-l偶合的蛋白質(zhì)G瓊脂糖凝膠(GE HealthcareB1sciences,匹茲堡市，賓夕法尼亞州)。清洗之后，用沖脫緩沖液(0.2 M甘胺酸，pH
2.5，150mM NaCl 及 1% NP-40)沖脫與 0CAb9_l 結(jié)合的蛋白質(zhì)，并以 IM Tris-HCl，pH 9.1中和沖脫液(Liu等人.，2011)。該沖脫液通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行離析。從凝膠上切下感興趣的條紋帶，以溶在25mM碳酸氫銨(ammonium bicarbonate ；ABC)的50mM 二硫蘇糖醇(dith1erythreitol ；DTE)在pH 8.5、37°C下進(jìn)行還原作用I小時(shí)，并在室溫下以溶在ABC的10mM碘乙酰胺(1doacetamide ；IAA)進(jìn)行烷基化I小時(shí)。以溶在ABC的50%乙腈清洗后，將該凝膠浸泡在100%乙腈中，并與0.02 Ug胰蛋白酶在37°C下培養(yǎng)16小時(shí)。該經(jīng)消化的肽以溶在5% TFA的50%乙腈萃取，并以濃縮器(Eppendorf，漢堡市，德國(guó))濃縮。該樣本以中央研究院蛋白質(zhì)組學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究所核心設(shè)備中心的LC-MC/MS定序加以分析。
[0080]免疫沉淀及西方轉(zhuǎn)潰分析。用補(bǔ)充含有蛋白酶抑制劑混合錠(Roche，印第安納波利斯市，印第安納州)的RIPA緩沖液(0.0lM磷酸鈉(pH 7.2), 150mM NaCl,2mM EDTA, 50mMNaF, I % Nonidet P_40，I %脫氧膽酸鈉，及0.1 % SDS)萃取細(xì)胞，并在4°C下以20，OOOg的速度旋轉(zhuǎn)離心30分鐘。上清液利用抗EpCAM抗體進(jìn)行免疫沉淀作用。使用經(jīng)共軛HRP的第二抗體(Jackson Immuno Research Labs, West Grove,賓夕法尼亞州)，且利用經(jīng)強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光藥劑(enhanced chemiluminescence reagents ；ECL) (Thermo Scientific,羅克福德市，伊利諾伊州)將訊號(hào)顯影。
[0081]細(xì)胞凋亡分析。細(xì)胞分別地接種，并以0-20 μ g/ml單株抗體處理6小時(shí)。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC及PI偵測(cè)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞，并以流式細(xì)胞儀(BD免疫細(xì)胞分析系統(tǒng)，圣荷西市，加州)進(jìn)行分析。早期細(xì)胞凋亡作用是以膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡偵測(cè)套組II (BDPharmingen，拉霍亞市，加州)測(cè)量，細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核是以碘化丙啶(PI)染色。
[0082]用以分析抗腫瘤功效的動(dòng)物模式。帶有SAS衍生性口腔癌異種移植(?75_3)的SCID小鼠在尾部靜脈處以靜脈注射方式注射EpAb2-6或等體積的PBS。經(jīng)由尾部靜脈注射方式施與治療，每周2次10mg/kg,連續(xù)4周，總劑量80mg/kg。每周以測(cè)徑尺(caliper)測(cè)量腫瘤2次，且常規(guī)性地觀察小鼠重量減少情況，以作為藥劑毒性的表征。腫瘤體積是以長(zhǎng)度X (寬度)2X0.52計(jì)算得之。以組合式治療腫瘤模式而言，根據(jù)不同治療的方案(EpAb2-6、IFL、EpAb2_6加上IFL，及PBS對(duì)照組)，將帶有HCT116衍生性結(jié)腸癌異種移植(?50mm3)的SCID分成4組。以僅接受EpAb2_6的組別而言，小鼠經(jīng)由尾部靜脈以靜脈注射方式(1.V.)注射20mg/kg劑量，每周2次施與EpAb2-6單品療法達(dá)4周(每周X 4)。以僅接受 IFL 的組別而言，IFL(25mg/kg 的 5-FU+lOmg/kg 的亞葉酸I丐(Ieucovorin) +10mg/kg伊利替康(irinotecan))是通過(guò)靜脈注射方式(1.V.)每周施與2次達(dá)4周(每周X 4)。以組合式治療組別而言，EpAb2-6是在IFL前24小時(shí)投予；EpAb2_6及IFL兩者一如其他兩組是以相同的劑量周期給藥。EpAb2-6組合IFL的程序是改良自先前報(bào)導(dǎo)(Azrak RG等人.(2004)「伊利替康及5-氟尿嘧啶間的治療合作對(duì)抗人類腫瘤異種移植」Clin CancerRes.10，1121-9 ;Kim等人.(2010)「除F0LFIRI方案外，樹突細(xì)胞疫苗可經(jīng)由鼠科結(jié)腸直腸癌癥模式抑制免疫抑制細(xì)胞增進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)」Vaccine 28，7787-7796)。
[0083]抗EpCAM抗體的選殖及⑶R定序。利用TRIzol試劑(INVITROGEN?)從雜交瘤細(xì)胞中萃取出總 RNA,并以 NucleoTrap mRNA 迷你套組(Macherey-Nagel GmbH&C0.KG.)分離出mRNA。經(jīng)純化mRNA以寡(dT)作引子在ThermoScript RT-PCR系統(tǒng)(INVITROGEN?)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。通過(guò)PCR以各種引子組自cDNA產(chǎn)物擴(kuò)增可變重鏈域及可變輕鏈域(VH及VL)。利用TA套組(Promega，麥迪遜市，威斯康星州)選殖該等PCR產(chǎn)物，并以DNA定序法測(cè)定該等VH及VL序列。Software Vector NTI (InforMax)是作為序列分析之用。從該等序列,將架構(gòu)區(qū)域(FR)及互補(bǔ)決定域(OTR)通過(guò)與見于Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)者加以比較及與見于ImMunoGeneTics數(shù)據(jù)庫(kù)者校準(zhǔn)而進(jìn)行分析，(Lefranc等人.(2009)「IMGT,國(guó)際ImMunoGeneTics信息系統(tǒng)」Nucleic Acids Res.37，D1006-12)。
[0084]擬人化EpAb2-6的構(gòu)筑及表現(xiàn)。擬人化EpAb2_6 VH分別是由編號(hào)DI164282基因的經(jīng)修飾FRl至FR4及EpAb2-6 VH的CDRl至CDR3所組成。擬人化EpAb2_6 VL CDR則是由編號(hào)GM882764基因的經(jīng)修飾FR及EpAb2_6VL的⑶R所組成。將所得VH選殖至帶有訊號(hào)肽及人類IgGl固定域的經(jīng)修飾表現(xiàn)載體pcDNA3.1 (INVITROGEN?)上。而VL是選殖至經(jīng)修飾載體pSecTag (INVITROGEN?)上。該VH及VL質(zhì)體共轉(zhuǎn)染至CHO-Kl細(xì)胞中并通過(guò)G418及嘌呤霉素篩選2-3周。其轉(zhuǎn)型細(xì)胞在96孔培養(yǎng)盤中進(jìn)行有限稀釋。2周后，穩(wěn)定性細(xì)胞選殖體會(huì)在麥考伊氏5A (McCoy’s 5A)培養(yǎng)基(SIGMA_ALDRICH?)中產(chǎn)生擬人化抗體，并以ELISA加以鑒定。擬人化抗體是利用CELLine AD 1000 (INTEGRA B1sciences，瑞士)根據(jù)制造商的建議所產(chǎn)生的。
[0085]噬菌體表現(xiàn)生物淘洗法。噬菌體表現(xiàn)生物淘洗法步驟是根據(jù)先前報(bào)告進(jìn)行的(Wu等人.，2003 ;Liu等人.，2011)。簡(jiǎn)而言之，ELISA盤以100 μ g/ml的單株抗體涂布。將100 μ g/ml單株抗體的樣本加至培養(yǎng)盤孔中，并在4°C下培養(yǎng)6小時(shí)。清洗及阻斷后，將噬菌體表現(xiàn)肽庫(kù)(New England B1Labs公司)稀釋成4X101Q pfu的卩遼菌體并在室溫下培養(yǎng)50分鐘。清洗后，用10ml的0.2M甘胺酸/HCl (pH 2.2)沖脫經(jīng)結(jié)合的噬菌體，并以15ml的I M Tris/HCl(pH 9.1)加以中和。經(jīng)沖脫的噬菌體在ER2738 (New England B1labs公司，麻薩諸塞州，美國(guó))中進(jìn)行擴(kuò)增以便隨后重復(fù)循環(huán)的挑選工作。該噬菌體是在LB/IPTG/X-Gal培養(yǎng)皿上進(jìn)行定量。第二輪及第三輪的生物淘洗步驟與第一輪是相同的，但用在生物淘洗時(shí)是添加2 X 111Pfu經(jīng)擴(kuò)增噬菌體。
[0086]通過(guò)EpCAM突變株鑒定EpAb2_6抗原決定部位。吾人使用重組表現(xiàn)質(zhì)體pcDNA?3.1/V5-His以產(chǎn)生EpCAM突變株。通過(guò)衍生自pcDNA?3.l/V5_His作為模板的定點(diǎn)導(dǎo)向突變作用產(chǎn)生各式的EpCAM突變株。利用pfu ultra DNA聚合酶(MERCK)進(jìn)行PCR，且所有突變構(gòu)筑體均定序加以確認(rèn)。生長(zhǎng)在6孔培養(yǎng)盤中的80% -90%滿的HEK293細(xì)胞以各式EpCAM質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染2天后，以PBS清洗該等細(xì)胞。用補(bǔ)充含有蛋白酶抑制劑混合錠的RIPA緩沖液萃取細(xì)胞，并在4°C下以20，OOOg速度離心旋轉(zhuǎn)30分鐘。該野生型及經(jīng)突變重組蛋白質(zhì)是通過(guò)與I μ g/ml第一抗體(EpAb2-6或EpAb3_5)培養(yǎng),接著與經(jīng)共軛HRP的第二抗體(Jackson Tmmuno Research Labs, West Grove,賓夕法尼亞州)培養(yǎng)而進(jìn)行染色，該等訊號(hào)是利用經(jīng)強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光藥劑(ECL) (Thermo Scientific，羅克福德市，伊利諾伊州)進(jìn)行顯影。
[0087]表面電衆(zhòng)共振技術(shù)。通過(guò)表面電衆(zhòng)共振(BIAcore T100,Biacore公司)進(jìn)行鼠科及經(jīng)人化抗體的親和力分析。EpCAM抗原是固定在Series S Sensor Chip CM5(Biacore公司)上，并以10 μ 1/min的流速注入。該等單株抗體是在HBS-EP+緩沖液(Biacore公司)中稀釋，并以50 μ 1/min的流速注入1.5分鐘,并使其解離超過(guò)5分鐘。在每一單株抗體注入前，先注入1mM甘胺酸HCl，0.2M NaCl (pH2.5)完成芯片表面的再生作用。該等數(shù)據(jù)是用整體擬合1:1結(jié)合模式通過(guò)BIAevaluat1n軟件進(jìn)行分析。
[0088]RNA萃取及定量實(shí)時(shí)RT-PCR。利用ULTRASPEC RNA分離試劑(B1tecxLaboratories,休斯敦市,德州)從細(xì)胞株中制備出總RNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，利用Super-Script III RNaseH-反轉(zhuǎn)錄酶(INVITROGEN?,卡爾斯巴德市,加州)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。選殖、定量RT-PCR時(shí)所用的正向及反向引子列示在表I中。利用LightCycler480系統(tǒng)(Roche Applied Science)進(jìn)行定量RT-PCR。每一樣本的基因表現(xiàn)含量是以同一樣本的GAPDH的表現(xiàn)含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該等反應(yīng)進(jìn)行三重復(fù)，并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)誤差值(S.D.)。
[0089]表I
[0090]

【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)分離單株抗體或其抗原結(jié)合片段，其對(duì)于位在上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)的EGF 樣區(qū)域 II (SEQ ID NO:1)內(nèi)的 KPEGALQNNDGLYDPDCDE (SEQ ID NO:63)序列內(nèi)的抗原決定部位具有特異性結(jié)合親和力。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于:當(dāng)EpCAM的EGF樣區(qū)域II內(nèi)的胺基酸95位置處的酪胺酸(Y95)或胺基酸96位置處的天門冬胺酸((D96)或酪胺酸(Y95)及天門冬胺酸(D96)兩者發(fā)生突變時(shí)，則該結(jié)合親和力會(huì)消失。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其包括: (a)一重鏈可變域，其包括: ⑴包括SEQ ID NO:4的互補(bǔ)決定域I(CDRl)； (ii)包括SEQID N0:5的互補(bǔ)決定域2(CDR2);及 (iii)包括SEQID NO: 6的互補(bǔ)決定域3 (CDR3);及 (b)一輕鏈可變域，其包括:
(i)包括SEQ ID NO:7 的 CDRl ；
(ii)包括SEQ ID NO:8 的 CDR2 ;及
(iii)包括SEQ ID NO:9 的 CDR3。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該結(jié)合片段包括該抗體的Fv片段。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該結(jié)合片段包括該抗體的Fab片段。
6.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段是經(jīng)擬人化。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該重鏈可變域包括SEQID N0:24胺基酸序列，且該輕鏈可變域包括SEQ ID NO: 25胺基酸序列。
8.—種經(jīng)分離單鏈可變片段，其包括: (a)包括SEQID NO:2胺基酸序列的重鏈可變域及包括SEQ ID NO:3胺基酸序列的輕鏈可變域，或包括SEQ ID NO:24胺基酸序列的重鏈可變域及包括SEQ ID N0:25胺基酸序列的輕鏈可變域 '及 (b)鏈接該重鏈可變域及該輕鏈可變域的鏈接肽。
9.一種經(jīng)分離單株抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體特征在于: (a)對(duì)包括SEQID NO:1胺基酸序列的上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)具有特異性結(jié)合親和力； (b)對(duì)可以表現(xiàn)EpCAM的癌細(xì)胞具有特異性結(jié)合親和力，該等癌細(xì)胞是選自由口腔癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞所組成的群；及 (c)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及正常鼻黏膜上皮細(xì)胞不具結(jié)合親和力。
10.如權(quán)利要求9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段在活體內(nèi)呈現(xiàn)出可誘發(fā)該等癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡及/或抑制該等癌細(xì)胞生長(zhǎng)的特征。
11.如權(quán)利要求9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段對(duì)于位在上皮細(xì)胞黏著分子(EpCAM)的EGF樣區(qū)域 II (SEQ ID NO:1)內(nèi)的KPEGALQNNDGLYDH)CDE (SEQID NO:63)序列內(nèi)的抗原決定部位具有特異性結(jié)合親和力。
12.如權(quán)利要求9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其包括: (a)包括SEQ ID NO:2胺基酸序列的重鏈可變域及包括SEQ ID NO:3胺基酸序列的輕鏈可變域；或 (b)包括SEQ ID NO: 24胺基酸序列的重鏈可變域及包括SEQ ID NO: 25胺基酸序列的輕鏈可變域。
13.如權(quán)利要求9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段是經(jīng)擬人化。
14.一種在抑制癌細(xì)胞及/或腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)的方法,其包含: 投與一所需個(gè)體一組合物包含: (a)如權(quán)利要求10所述的抗體或抗原結(jié)合片段'及 (b)醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑； 其中該等癌細(xì)胞及/或腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞可表現(xiàn)EpCAM。
15.一種在活體外偵測(cè)及/或診斷可表現(xiàn)EpCAM的癌細(xì)胞的方法，該方法包括: (a)自病患取得細(xì)胞或組織樣本； (b)將該細(xì)胞或組織樣本與權(quán)利要求9所述的抗體或結(jié)合片段接觸； (c)分析該抗體或結(jié)合片段與該細(xì)胞或組織樣本的結(jié)合；及 (d)與正常對(duì)照組的結(jié)合作比較，以判定個(gè)體中可表現(xiàn)EpCAM的癌細(xì)胞的存在。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包括: (a)包括SEQID NO: 24胺基酸序列的重鏈可變域及包括SEQ ID NO: 25胺基酸序列的輕鏈可變域；或 (b)包括SEQID NO:2胺基酸序列的重鏈可變域及包括SEQ ID NO:3胺基酸序列的輕鏈可變域。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合片段是經(jīng)擬人化。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該等癌細(xì)胞是選自由口腔癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞所組成的群。
19.如權(quán)利要求1或9任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其是經(jīng)可偵測(cè)化合物或酵素加以標(biāo)記，或經(jīng)囊封在脂質(zhì)體內(nèi)。
20.一種組合物，其包括: (a)如權(quán)利要求6或10任一項(xiàng)所述的經(jīng)分離抗體或抗原結(jié)合片段； (b)抗癌藥劑；及 (C)醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK104168916SQ201380012187
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月2日
【發(fā)明者】吳漢忠, 廖美英, 林政緯 申請(qǐng)人:中央研究院