基于特異結(jié)合黃曲霉毒素單域重鏈抗體的親和吸附材料的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于單域重鏈抗體（又稱納米抗體技術(shù)）的免疫親和吸附材料， 特別是針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料。 技術(shù)背景
[0002] 黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌產(chǎn)生的劇毒次級代謝 產(chǎn)物。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，為二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃曲霉毒素^仏?81)、 B2(AFB2) 々(AFGi)、G2(AFGi)等。在天然污染的食品和飼料中，AFBi的污染最為常 見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物。世界各國 及地區(qū)指定了嚴(yán)格的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，例如歐盟嬰幼兒食品中AFBi允許量<0. 10 μ g/ kg 〇
[0003] 現(xiàn)有的黃曲霉毒素檢測方法主要有儀器分析法、免疫分析法以及薄層層析法。其 中儀器分析法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是對于分析樣品前處理要求較 高，需要盡量去除樣品中的雜質(zhì)以減少對后續(xù)檢測的干擾。傳統(tǒng)的前處理方法有液相萃取、 固相萃取等，處理過程繁瑣且特異性不高。親和層析技術(shù)基于配基與待測物質(zhì)之間特異性 的識別，可通過一步操作實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合樣品中待測物的分離純化。目前使用的黃曲霉毒 素親和純化介質(zhì)一般采用多克隆抗體或單克隆抗體作為配基，存在不耐有機(jī)試劑、活性迅 速降低的問題。因此，需要開發(fā)活性高、穩(wěn)定性好的新型配基替換傳統(tǒng)抗體。單域重鏈抗體 是由羊駝重鏈抗體的可變區(qū)組成，又稱為納米抗體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產(chǎn)等特 性，相較于傳統(tǒng)抗體具有明顯的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料及其應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料包括載體和配基，所述配基為單域重鏈抗 體，具有SEQ ID Ν0. :1所示的氨基酸序列。該配基可特異性識別黃曲霉毒素。
[0007] 所述配基還可以為在前述單域重鏈抗體基礎(chǔ)上通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改 造所獲得的能與黃曲霉毒素特異性結(jié)合的抗體。
[0008] 所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。
[0009] 上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備方法，其特征為：
[0010] 所述載體為磁珠時(shí)，制備方法為：取lmg羧基磁珠于離心管中，加入500~ 1000 μ 1活化緩沖液（10mM，NaH2P04, pH6. 0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩 沖液洗滌2遍。分別加入1~5mg碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)，渦旋混合 后，靜置30min。用偶聯(lián)緩沖液（10mM，Na2HP04, pH 7. 4)洗滌磁珠3遍，加入抗黃曲霉毒素 單域重鏈抗體，室溫反應(yīng)2~6h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠； [0011] 所述載體為瓊脂糖凝膠微球時(shí)，制備方法為：將CNBr活化的干膠用0. 1M HC1洗滌 10~15次，每次平衡5~lOmin。用偶聯(lián)緩沖液（10mM，Na2HP04, pH 7. 4)洗滌5~15次， 加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室溫反應(yīng)2~10h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重 鏈抗體的免疫親和吸附材料；
[0012] 所述載體為硅膠微球時(shí)，制備方法為：將硅膠微球用純水和磷酸緩沖液（PBS， 10mM，pH 6. 0)交替洗滌5~10次，用PBS緩沖液懸浮硅膠微球，加入抗黃曲霉毒素單域 重鏈抗體，混勾，加入終濃度1~l〇mg/ml的碳二亞胺（EDC)，迅速混勾，4°C攪拌反應(yīng)12~ 24h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
[0013] 將上述免疫親和吸附材料（載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球）裝填至層析柱， 即得到黃曲霉毒素免疫親和層析柱，方法為：根據(jù)層析柱容量，取適量上述免疫親和吸附材 料于層析柱，加入5~10倍柱床體積的PBS (10mM，pH 7. 4)洗滌后，4°C，保存于20%乙醇 溶液。
[0014] 共價(jià)偶聯(lián)了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫磁珠無需裝柱，直接吸附后磁鐵分 離。
[0015] 本發(fā)明還涉及裝載有所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的親和層析柱。
[0016] 上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的應(yīng)用，用所述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料 對樣品提取液進(jìn)行凈化，富集黃曲霉毒素 （AFBp AFB2、AFGiS AFG 2)。黃曲霉毒素免疫親和 吸附材料在去除黃曲霉毒素、凈化黃曲霉毒素污染物料中的應(yīng)用。這種處理不以疾病診斷 治療為目的。當(dāng)免疫吸附材料的載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球時(shí)，方法為：首先用純水 清洗免疫吸附材料，加入樣品提取液，然后用純水淋洗，再用甲醇洗脫特異性吸附的黃曲霉 毒素，收集的洗脫液，即為凈化和富集后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測。當(dāng)載體為磁 珠時(shí)，方法為：將免疫磁珠加入純水中，磁力架回收磁珠，重復(fù)清洗3~5次，然后將免疫磁 珠加入樣品提取液中，混勻，磁力架回收磁珠，純水清洗1~3次后，甲醇洗脫特異性吸附的 黃曲霉毒素，收集的洗脫液，即為凈化和富集后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測。
[0017] 本發(fā)明針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列，該配基可特異性識別黃曲霉毒素。該單域重鏈抗體容易獲得，可 以通過生物學(xué)方法大量培養(yǎng)生產(chǎn)配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產(chǎn)方法， 大大降低了生產(chǎn)成本。生產(chǎn)過程無需接觸黃曲霉毒素，避免了對生產(chǎn)人員身體傷害。具有 耐酸堿、耐高溫以及易于生產(chǎn)等特性，這些特性對于黃曲霉毒素的低成本、可重復(fù)使用的免 疫學(xué)檢測方法有重要的實(shí)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備及應(yīng)用，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明， 這些具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0019] 實(shí)施例1 :
[0020] 抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體（即針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體）免疫文庫的構(gòu) 建
[0021] 將黃曲霉毒素隊(duì)與匙孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)共價(jià)偶聯(lián)， 得到黃曲霉毒素人工抗原AFBfKLH，取300 μ g AFBfKLH與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝 (Lama pacos)進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫。加強(qiáng)免疫采用150 μ g AFBfKLH與弗氏不完全佐劑 乳化，間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價(jià)，選擇血清 效價(jià)最高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取RNA。
[0022] RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進(jìn)行。以RNA為模板，oligo dT 為引物，參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
[0023] 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經(jīng)巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因 (采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件為， 98Γ，10s，55Γ，20s，72Γ，lmin，20 個(gè)循環(huán)，98Γ，10s，68Γ，lmin，72Γ延伸 lOmin。
[0024] 將第一輪PCR產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp~750bp的DNA片 段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-Sfil和AlpVHHRl-Notl，AlpVh-Sfil和 八1口￥冊1?2-如《，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98°(：，1〇8,50°(：，2〇8,72°(：，4〇8,5個(gè)循環(huán)，98°(：， 108,68°(：，408,30個(gè)循環(huán)，72°(：延伸101^11。經(jīng)0嫩片段回收試劑盒回收、定量，于-20°(：保 存?zhèn)溆?。將噬菌粒PHEN1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、 定量后，以1 : 3摩爾比，在16°C，過夜連接。
[0025] 表1文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物
[0026] 弓1物名稱_.序.歹丨」_ AlpVh-LD 5'- ( ?? GO ! GG?Χ (??(：?< i'GC - 3' AlpVh-Sfil 5,-tcgcggcccagccggccatggccCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG- 35AlpViillRl-Noll 5'- c^a^l^-ceuciiGGCi i C [ Ti GCTGYGGlGCG-3' AlpVHHR2-NotI 5、cgagtgcggccgcTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG- 3, (WyR 5'- CiG l/U O i G( 1 ?ν???ΑΑΓ??? ΓΓΓ- 3'
[0027] M13-R 5'- AGCGGAI A AC ΑΑΓ'? ! C ACAC AGGA- 3' pilHN-R _5'- GCCCCATTCAGATCCTCTTC- r
[0028] 注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識別序列
[0029] 連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10 μ L無菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TG1。取10 yL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2ΧΥΤ培養(yǎng)板，計(jì)算庫容。其 余部分全部涂布于24cmX24cm氨芐青霉素2XYT培養(yǎng)板，37°C，倒置培養(yǎng)12~16h。用 10mL，2 XYT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15~30 %甘油，分裝，-80°C保存 備用。
[0030] 根據(jù)計(jì)算的庫容量結(jié)果，接種10倍庫容量的活細(xì)胞于20mL的2XYT(含2%葡萄 糖，l〇〇yg/mL氨芐青霉素），30°C，220r/min培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 5,按感染復(fù)數(shù)20 : 1加入 輔助噬菌體，37°(：，22(^/11^11，6〇1^11。將培養(yǎng)物離心，用5〇1^的2\￥1'(含10(^8/1^氨芐 青霉素和50 μ g/mL卡那霉素）重懸沉淀，30°C，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清， 加入5XPEG/NaCl溶液，冰上放置lh或4°C過夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10% 甘油的磷酸緩沖液（PBS，0.01M，pH 7. 4)，即得到抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫，取 10 μ L測定滴度，其余分裝于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 實(shí)施例2:
[0032] 抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的淘選與鑒定
[0033] 采用固相親和淘選的方法從實(shí)施例1所得抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫 文庫中淘選針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體。將AFBi與卵清白蛋白（albumin，0VA)共價(jià) 偶聯(lián)，得到人工抗原AFB「OVA。每孔加入100 μ L用PBS稀釋的人工抗原AFB「OVA，4°C，包 被過夜，每輪淘選的包被濃度分別為100, 75, 50 μ g/mL ;吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加 入300 μ L 3% BSA-PBS，37°C，封閉2h ;PBS洗板6次，加入100 μ L噬菌體抗體文庫（約含 2X10nCFU)，37°C，孵育1. 5h ;吸出未結(jié)合的噬菌體，用PBST(含0. 5% Tween-20)洗板5次 (逐輪增加5次），再用PBS洗板10次（洗板次數(shù)逐輪增加5次）；以100 μ L洗脫液（甘氨 酸-鹽酸，ΡΗ2. 2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中