專(zhuān)利名稱(chēng)：：結(jié)合于psca蛋白的抗體以及相關(guān)分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文所描述的發(fā)明涉及結(jié)合于被稱(chēng)為PSCA的蛋白質(zhì)的抗體及其結(jié)合片段、及由其工程化改造得到的分子。本發(fā)明還涉及用于治療表達(dá)PSCA的癌的診斷、預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療方法和組合物。
背景技術(shù)：
：癌癥是僅次于冠心病的第二大人類(lèi)死亡原因。世界范圍內(nèi)每年有數(shù)百萬(wàn)人死于癌癥。僅在美國(guó)，如美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的報(bào)告，癌癥每年造成50萬(wàn)以上的人死亡，同時(shí)每年有120萬(wàn)人被新診斷患有癌癥。雖然死于心臟病的人數(shù)明顯減少，但死于癌癥的人數(shù)正在逐漸上升。在下世紀(jì)初，預(yù)計(jì)癌癥將成為頭號(hào)死亡原因。世界范圍內(nèi)，有幾種癌癥是主要的殺手。尤其是肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌和膀胱癌，它們是癌癥死亡的主要原因。這些癌以及事實(shí)上所有其它癌都具有相同的致命特征。幾乎沒(méi)有例外地，轉(zhuǎn)移性癌疾病是致命的。此外，即便對(duì)于那些在原發(fā)性癌中存活下來(lái)的癌癥患者而言，一般經(jīng)驗(yàn)顯示，他們的生活都發(fā)生了顯著的改變。許多癌癥患者由于擔(dān)心復(fù)發(fā)或治療失敗而產(chǎn)生了強(qiáng)烈的焦慮感。許多癌癥患者在治療后身體虛弱。此外，許多癌癥患者會(huì)經(jīng)歷復(fù)發(fā)。世界范圍內(nèi)，前列腺癌是男性第四大流行癌癥。在北美和北歐，它幾乎是男性中最常見(jiàn)的癌癥，同時(shí)是造成男性癌癥死亡的第二大原因。僅在美國(guó)，每年有30,000以上的男性死于這種疾病—僅次于肺癌。除了這些數(shù)字?jǐn)?shù)值巨大，還沒(méi)有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的有效治療方法。外科前列腺切除術(shù)、放療、激素注射治療、手術(shù)閹割和化療仍然是主要的治療手段。不幸的是，這些治療方法對(duì)于許多人無(wú)效，并且常常會(huì)帶來(lái)不快結(jié)果。就診斷而言，缺乏能準(zhǔn)確檢測(cè)早期局限性腫瘤的前列腺腫瘤標(biāo)記仍舊是這種疾病診斷和治療中的一個(gè)重要限制。盡管血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測(cè)已經(jīng)成為一種有效工具，但廣泛認(rèn)為它在一些重要方面缺乏特異性和通用性。通過(guò)產(chǎn)生可再現(xiàn)小鼠中疾病不同階段的前列腺癌異種移植物促進(jìn)了其它前列腺癌特異性標(biāo)記的鑒定。LAPC(洛杉磯前列腺癌)異種移植物是在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中有存活傳代的前列腺癌異種移植物，并顯示出模擬從雄激素依賴(lài)轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に夭灰蕾?lài)性(Klein等，1997，Nat.Med.3402)。最近鑒定的前列腺癌標(biāo)記包括PCTA-1(Su等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA937252)、前列腺特異性膜(PSM)抗原(Pinto等，ClinCancerRes1996-9-2(9)1445-51)、STEAP(Hubert等，ProcNatlAcadSciUSA.1999-12-7；96(25)14523-8)和前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)(Reiter等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA951735)。盡管以前鑒定的標(biāo)記如PSA、PSM、PCTA和PSCA具有有助于診斷和治療前列腺癌的作用，但還需要鑒定出前列腺癌和相關(guān)癌癥的其它標(biāo)記和治療靶以進(jìn)一步促進(jìn)診斷和治療。腎細(xì)胞癌(RCC)占到成人惡性腫瘤的約3％。一旦腺瘤的直徑達(dá)到2-3cm就可能惡化。在成人中，兩種主要的惡性腎腫瘤是腎細(xì)胞腺癌和腎盂或輸尿管移行細(xì)胞癌。估計(jì)在美國(guó)腎細(xì)胞腺癌的發(fā)病率超過(guò)29,000例，并且1998年有超過(guò)11,600名患者死于這種疾病。移行細(xì)胞癌較為少見(jiàn)，其在美國(guó)的發(fā)病率約為每年500例。數(shù)十年來(lái)，手術(shù)一直是腎細(xì)胞腺癌的主要治療方法。直到最近，轉(zhuǎn)移性疾病還很難用任何全身療法來(lái)控制。隨著最近全身療法尤其是免疫療法的發(fā)展，持續(xù)性應(yīng)答可能會(huì)在合適的患者中進(jìn)攻轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌。不過(guò)，仍然需要治療這些患者的有效方法。在美國(guó)所有的新癌癥病例中，膀胱癌在男性中約占5％(第五種最常見(jiàn)的瘤)，在女性中占3％(第八種最常見(jiàn)的瘤)。該發(fā)病率緩慢增加，且隨著老年人口的增加這一數(shù)字也在升高。在1998年，估計(jì)有54,500病例，其中包括39,500名男性和15,000名女性。在美國(guó)，這種年齡調(diào)整發(fā)病率為每100,000男性32人，每100,000女性8人。歷史上男性/女性3∶1的比例可能會(huì)由于女性吸煙而降低。估計(jì)1998年有11,000人死于膀胱癌(7,800名男性和3,900名女性)。膀胱癌的發(fā)病率和死亡率隨著年齡增加而急劇上升，并且隨著人口老齡化而成為日益嚴(yán)重的問(wèn)題。大多數(shù)膀胱癌在膀胱中會(huì)復(fù)發(fā)。膀胱癌通過(guò)經(jīng)尿道膀胱切除術(shù)(TUR)和膀胱內(nèi)化療或免疫療法的組合來(lái)治療。膀胱癌的多病灶和復(fù)發(fā)特性指出了TUR的局限性。大多數(shù)肌肉浸潤(rùn)性癌癥不能僅通過(guò)TUR治愈。根治性膀胱切除術(shù)和尿流改道術(shù)是最有效的根治這種癌癥的方法，但會(huì)對(duì)泌尿和性功能造成不可否認(rèn)的影響。顯然還需要對(duì)膀胱癌患者有益的治療方法。估計(jì)2000年美國(guó)共發(fā)生130,200例結(jié)腸直腸癌，包括93,800例結(jié)腸癌和36,400例直腸癌。結(jié)腸直腸癌是男性和女性中的第三大癌癥。在1992-1996年間其發(fā)病率顯著減低(每年降低2.1％)。研究表明，這些降低是由于檢查和息肉切除增加，從而防止了息肉發(fā)展成浸潤(rùn)性癌癥。估計(jì)2000年有56,300人死亡(47,700人死于結(jié)腸癌，8,600人死于直腸癌)，占美國(guó)癌癥死亡總?cè)藬?shù)的約11％。目前，外科手術(shù)是最常見(jiàn)的治療結(jié)腸直腸癌的方法，對(duì)于還未擴(kuò)散的癌癥經(jīng)常采用這種方法。對(duì)于大多數(shù)已經(jīng)深度腸壁穿孔或已經(jīng)擴(kuò)散到淋巴結(jié)的癌癥患者，通常在手術(shù)前或手術(shù)后進(jìn)行化療，或化療加放療。對(duì)結(jié)腸癌有時(shí)也需要永久性結(jié)腸造口術(shù)(在腹部形成一開(kāi)口以排除人體廢物)，同時(shí)直腸癌也偶爾需要這種手術(shù)。仍需要有效的診斷和治療結(jié)腸直腸癌的方法。估計(jì)2000年新增164,100例肺和支氣管癌癥，占美國(guó)總癌癥診出人數(shù)的14％。肺和支氣管癌癥癥的發(fā)病率在男性中顯著降低，從1984年的86.5/100,000降低到1996年的70.0。在20世紀(jì)90年代，女性中發(fā)病率的增加勢(shì)頭開(kāi)始放慢。在1996年，女性中的發(fā)病率為42.3/100,000。估計(jì)2000年肺和支氣管癌癥造成156,900人死亡，占總癌癥死亡人數(shù)的28％。1992-1996年間，肺癌的死亡率在男性中顯著降低(每年降低1.7％)，而在女性中該比例卻顯著上升(每年0.9％)。從1987年以來(lái)，相比乳腺癌，每年有更加多的女性死于肺癌，而乳腺癌在過(guò)去40年中都是女性癌癥死亡的主要原因。肺癌發(fā)病率和死亡率降低很大可能與過(guò)去30年吸煙率降低有關(guān)；然而，女性吸煙率的降低滯后于男性。需要關(guān)注的是，盡管成年人的吸煙率已經(jīng)慢慢降低，但青年人的吸煙率卻又在升高。肺和支氣管癌癥的治療方案是由癌癥的類(lèi)型和階段決定的，其中包括手術(shù)、放療和化療。對(duì)許多局限性癌癥而言，通常選擇手術(shù)治療。由于這種疾病通常隨發(fā)現(xiàn)時(shí)間而擴(kuò)散，放療和化療通常需要與手術(shù)聯(lián)合使用?？蛇x擇化療本身或與結(jié)合放療來(lái)治療小細(xì)胞肺癌；采用這種方案時(shí)，大多數(shù)患者的癥狀會(huì)緩解，其中有些是長(zhǎng)效的。然而，仍舊需要有效的治療和診斷肺和支氣管癌癥的方法。2000年，估計(jì)美國(guó)婦女中有182,800例新發(fā)乳腺癌病例。此外，估計(jì)2000年在男性中新診斷出約1,400例乳腺癌病例。在20世紀(jì)80年代，女性中乳腺癌的發(fā)病率每年增加約4％，而在90年代該發(fā)病率比較平穩(wěn)，約為每100,000人110.6例。僅在美國(guó)，估計(jì)2000年有41,200人(40,800名女性，400名男性)死于乳腺癌。乳腺癌在女性癌癥死亡中位居第二位。根據(jù)最新數(shù)據(jù)，無(wú)論是白人還是黑人，該死亡率在1992-1996年間顯著降低，同時(shí)在年輕婦女中降低程度最大。這些降低可能是由于早期檢查和治療方法改進(jìn)的結(jié)果。考慮到醫(yī)療環(huán)境和患者的狀況，乳腺癌的治療方法可包括局部病灶切除術(shù)(局部切除腫瘤)并除去手臂下的淋巴結(jié)；乳房切除術(shù)(手術(shù)切除乳房)并除去手臂下的淋巴結(jié)；放療；化療；或激素療法。通?？陕?lián)合使用兩種或多種方法。大量研究顯示，對(duì)于早期疾病，局部病灶切除術(shù)加放療后的長(zhǎng)期存活率與乳房改良根治術(shù)后的存活率類(lèi)似。重建技術(shù)的重大進(jìn)步能夠在乳房切除術(shù)后提供一些關(guān)于乳房再造術(shù)的選項(xiàng)。最近，這種再造術(shù)已經(jīng)與乳房切除術(shù)同時(shí)進(jìn)行。局部切除導(dǎo)管原位癌(DCIS)及周?chē)m量正常乳房組織可防止DCIS復(fù)發(fā)。照射乳房和/或他莫昔芬治療可降低剩余乳房組織發(fā)生DCIS的機(jī)會(huì)。這是重要的，因?yàn)槿绻鸇CIS不治療的話將發(fā)展成浸潤(rùn)性乳腺癌。而且，這些治療方法有嚴(yán)重的副作用或后遺癥。因此，需要有治療乳腺癌的有效方法。估計(jì)2000年在美國(guó)新發(fā)23,100例卵巢癌。這占所有婦科癌癥的4％并且是第二大婦科癌癥。1992-1996年間，卵巢癌發(fā)病率顯著降低。卵巢癌的結(jié)果是，估計(jì)2000年有14,000人死亡。相比婦女生殖系統(tǒng)的其它癌癥，卵巢癌造成更多人死亡。治療卵巢癌的方法有手術(shù)、放療和化療。手術(shù)通常包括除去一側(cè)或兩側(cè)的卵巢、輸卵管(輸卵管-卵巢切除術(shù))以及子宮(子宮切除術(shù))。在一些非常早期的腫瘤中，只有有關(guān)卵巢會(huì)被切除，尤其是對(duì)于那些希望生孩子的年輕女性。在晚期疾病中，需要除去腹內(nèi)所有疾病部位以增強(qiáng)化療效果。有效治療卵巢癌的方法仍是重要需求。估計(jì)2000年在美國(guó)新發(fā)28,300例胰腺癌。在過(guò)去20年中，男性胰腺癌的發(fā)病率有所降低。女性發(fā)病率仍保持幾乎恒定，但也可能開(kāi)始減低。估計(jì)2000年在美國(guó)胰腺癌造成28,200人死亡。在過(guò)去20年中，男性中死亡率有輕微但明顯的降低(每年約降低0.9％)，而該比例在女性中輕微升高?？赏ㄟ^(guò)手術(shù)、放療和化療來(lái)治療胰腺癌。在大多數(shù)患者中，這些治療方法可延長(zhǎng)存活時(shí)間和/或緩解癥狀，但不可能全部治愈。迫切需要有其它治療和診斷癌癥的方法。這些方法包括將抗體、疫苗和小分子用作治療形式(modality)。此外，還需要將這些形式用作癌癥治療和研究所有領(lǐng)域中診斷、檢測(cè)、監(jiān)測(cè)的研究工具，和技術(shù)發(fā)展水平。人們已認(rèn)識(shí)到單克隆抗體(MAbs)的治療用途(G.Kohler和C.Milstein，Nature256495-497(1975))。目前，單克隆抗體已獲批準(zhǔn)用于移植、癌癥、傳染病、心血管疾病和炎癥的治療中。不同的同種型具有不同的效應(yīng)子功能。這些功能上的不同對(duì)應(yīng)于各種免疫球蛋白同種型的不同三維結(jié)構(gòu)(P.M.Alzari等，AnnualRev.Immunol.，6555-580(1988))。由于將小鼠用于免疫和識(shí)別大多數(shù)異質(zhì)的人抗原中十分便利，針對(duì)具有治療潛力的人靶標(biāo)的MAbs通常均為鼠源性。然而，鼠MAbs在人類(lèi)治療中本身具有缺陷。由于MAbs在人體中的循環(huán)半衰期比人抗體短，需要更頻繁地給予MAbs。更關(guān)鍵的是，重復(fù)將鼠抗體給予人免疫系統(tǒng)會(huì)造成人免疫系統(tǒng)通過(guò)將小鼠蛋白質(zhì)識(shí)別為異質(zhì)物并產(chǎn)生人抗小鼠抗體(HAMA)的應(yīng)答。這種HAMA應(yīng)答會(huì)造成過(guò)敏反應(yīng)，并從免疫系統(tǒng)中迅速清除鼠源抗體，從而使得采用鼠源抗體的治療無(wú)效。為了避免這種影響，已進(jìn)行了在小鼠中建立人免疫系統(tǒng)的嘗試。在初期的嘗試中希望建立能以具有人序列的抗體應(yīng)答抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠(參見(jiàn)Bruggemann等，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA866709-6713(1989))，但卻受限于能由可用的克隆載體所穩(wěn)定保持的DNA的量。采用酵母人工染色體(YAC)克隆載體開(kāi)辟了將人Ig座位的大種系片段導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的道路。基本上大部分人V、D和J區(qū)域基因以在人基因組中發(fā)現(xiàn)的相同間隔排列，并采用YAC將人恒定區(qū)導(dǎo)入小鼠。已知一種此類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠品系稱(chēng)作XenoMouse(r)小鼠，其可購(gòu)自Abgenix，Inc.(FremontCA)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了結(jié)合于PSCA蛋白和PSCA蛋白多肽片段的抗體及其結(jié)合片段和它們經(jīng)工程化改造所得到的分子。本發(fā)明包括多克隆和單克隆抗體、鼠和其它哺乳動(dòng)物抗體、嵌合抗體、人化和全長(zhǎng)人抗體、以及用可檢測(cè)標(biāo)記或治療劑標(biāo)記的抗體。在某些實(shí)施方式中，前提是圖3的核酸序列不被整個(gè)編碼和/或圖2的氨基酸序列不被整個(gè)制備。在某些實(shí)施方式中，編碼圖3的整個(gè)核酸序列和/或制備圖2的整個(gè)氨基酸序列，兩者中的任一均為各自的人單位劑型。本發(fā)明還提供了檢測(cè)各種生物樣品中PSCA多核苷酸和蛋白質(zhì)的存在及狀態(tài)的方法，以及鑒定表達(dá)PSCA的細(xì)胞的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了監(jiān)測(cè)含有或疑有某些生長(zhǎng)失調(diào)形式如癌癥的組織或血液樣品中的PSCA基因產(chǎn)物的方法。本發(fā)明還提供了各種免疫原性或治療性組合物以及治療表達(dá)PSCA的癌癥(如表I中列出的組織的癌癥)的方法，包括針對(duì)抑制PSCA轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工或發(fā)揮功能的療法，以及癌癥疫苗。一方面，本發(fā)明提供了組合物和包含組合物的方法，以治療病人表達(dá)PSCA的癌癥，其中所述組合物包含適合人使用的載體和人單位劑量的一種或多種抑制PSCA制造或功能的試劑。優(yōu)選所述載體是單一人載體。在本發(fā)明的另一方面，所述試劑是與PSCA蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)的部分。這種部分的非限制性例子包括但不限于抗體(如單鏈、單克隆、多克隆、人源化、嵌合或人抗體)、其功能等價(jià)物(包括天然產(chǎn)生或合成的)以及它們的組合。所述抗體可與診斷性或治療性部分綴合。在另一方面，所述試劑是上面定義的小分子。圖1。PSCA(也稱(chēng)為PSCAv.1”或“PSCA變體1”)的cDNA和氨基酸序列示于圖1A。起始的甲硫氨酸用下劃線表示。開(kāi)放閱讀框從18號(hào)氨基酸延伸到389號(hào)氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體2(也稱(chēng)為“PSCAv.2”)的cDNA和氨基酸序列示于圖1B中。起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開(kāi)放閱讀框從56號(hào)氨基酸延伸到427號(hào)氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體3(也稱(chēng)為“PSCAv.3”)的cDNA和氨基酸序列示于圖1C中。起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開(kāi)放閱讀框從423號(hào)氨基酸延伸到707號(hào)氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體4(也稱(chēng)為“PSCAv.4”)的cDNA和氨基酸序列示于圖1D中。起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開(kāi)放閱讀框從424號(hào)氨基酸延伸到993號(hào)氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體5(也稱(chēng)為“PSCAv.5”)的cDNA和氨基酸序列示于圖1E中。起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開(kāi)放閱讀框從910號(hào)氨基酸延伸到1479號(hào)氨基酸，其中包括了終止密碼子。PSCA變體6(也稱(chēng)為“PSCAv.6”)的cDNA和氨基酸序列示于圖1F中。起始甲硫氨酸的密碼子用下劃線表示。開(kāi)放閱讀框從83號(hào)氨基酸延伸到427號(hào)氨基酸，其中包括了終止密碼子。圖1G。PSCAv.2、PSCAv.7至v.18的SNP變體。PSCAv.7至v.18蛋白質(zhì)含有123個(gè)氨基酸。變體PSCAv.7至v.18是有一個(gè)核苷酸不同于PSCAv.2的變體，并編碼與v.2相同的蛋白質(zhì)。雖然分別顯示了這些SNP變體，但它們也可以上面圖1A-1F中列出的任何組合和任何轉(zhuǎn)錄變體存在。圖1H。PSCAv.4、PSCAv.19至v.30的SNP變體。PSCAv.19至v.30蛋白質(zhì)含有189個(gè)氨基酸。變體PSCAv.19至v.30是有一個(gè)核苷酸不同于PSCAv.4的變體。PSCAv.9、v.10、v.11、v.24和v.25蛋白質(zhì)只有一個(gè)氨基酸不同于PSCAv.1。PSCAv.23、v.28、v.29和v.30編碼與v.4相同的蛋白質(zhì)。雖然分別顯示了這些SNP變體，但它們也可以任何組合和以任何轉(zhuǎn)錄變體v.3和v.4存在。圖1I。PSCA變體的表達(dá)。(1I(a))設(shè)計(jì)引物來(lái)區(qū)分PSCAv.1/v.2/v.4、PSCAv.3和PSCAv.5。圖中在外顯子上方用小箭頭標(biāo)示出的是引物A和B，通過(guò)這些引物得到PSCAv.1/v.2/v.4的425bp的PCR產(chǎn)物、PSCAv.3的300bp的PCR產(chǎn)物和PSCAv.5的910bp的PCR產(chǎn)物。(1I(b))制備的第一鏈cDNA，其得自正常膀胱、腦、心、腎、肝、肺、前列腺、脾、骨骼肌、睪丸、胰、結(jié)腸、胃、前列腺癌混合物、膀胱癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌。通過(guò)PCR用肌動(dòng)蛋白的引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用變體特異性引物以30輪擴(kuò)增進(jìn)行半定量PCR。結(jié)果顯示，PSCAv.5主要在乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌中表達(dá)，而在結(jié)腸癌和肺癌表達(dá)水平較低。在前列腺癌、膀胱癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌中檢出PSCAv.1/v.2/v.4的PCR產(chǎn)物。在正常組織中，僅在前列腺和胃中檢出PSCAv.1/v.2/v.4的PCR產(chǎn)物，在腎和肺中水平較低，而未在任何正常組織中檢出PSCAv.5。未在任何測(cè)試樣品中檢出PSCAv.3的PCR檢測(cè)產(chǎn)物。圖1J。PSCAv.4和PSCAv.5的表達(dá)。1J(a)設(shè)計(jì)如圖中箭頭所示標(biāo)記為B和C的引物來(lái)區(qū)分PSCAv.4和PSCAv.5。PSCAv.4特異性引物產(chǎn)生了460bp的PCR產(chǎn)物、而PSCAv.5特異性引物產(chǎn)生了大小為945bp的PCR產(chǎn)物。1J(b)制備的第一鏈cDNA得自正常膀胱、腦、心、腎、肝、肺、前列腺、脾、骨骼肌、睪丸、胰、結(jié)腸、胃、前列腺癌混合物、膀胱癌和多種異種移植物混合物(前列腺癌、腎癌和膀胱癌異種移植物)。通過(guò)PCR用肌動(dòng)蛋白的引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用變體特異性引物以30輪擴(kuò)增進(jìn)行半定量PCR。結(jié)果顯示，PSCAv.4在前列腺癌、膀胱癌以及多種異種移植物混合物、正常腎臟和前列腺中表達(dá)。僅在正常前列腺和膀胱癌中檢出PSCAv.5。圖2。PSCA抗體的氨基酸。圖2A。Ha1-4.117VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2B。Ha1-4.117VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2C。Ha1-4.120VH的氨基酸序列。圖2D。Ha1-4.120VL氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2E。Ha1-5.99VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2F。Ha1-5.99VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2G。Hal-4.121VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2H。Ha1-4.121VLc.5的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2I。Ha1-4.121VLc.26的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2J。Ha1-1.16VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2K。Ha1-1.16VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2L。Ha1-4.5VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2M。Ha1-4.5VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2N。Ha1-4.40VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖20。Ha1-4.40VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2P。Ha1-4.37VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2Q。Ha1-4.37VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2R。Ha1-1.43VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2S。Ha1-1.43VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖2T。Ha1-1.152VH的氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖2U。Ha1-1.152VL的氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3。PSCA抗體的核苷酸和氨基酸序列。圖3A。Ha1-4.117VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3B。Ha1-4.117VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3C。Ha1-4.120VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3D。Ha1-4.120VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3E。Ha1-5.99VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3F。Ha1-5.99VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3G。Ha1-4.121VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3H。Ha1-4.121VLc.5的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3I。Ha1-4.121VLc.26的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3J。Ha1-1.16VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3K。Ha1-1.16VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3L。Ha1-4.5VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3M。Ha1-4.5VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3N。Ha1-4.40VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖30。Ha1-4.40VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3P。Ha1-4.37VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3Q。Ha1-4.37VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3R。Ha1-1.43VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3S。Ha1-1.43VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖3T。Ha1-1.152VH的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為重鏈恒定區(qū)。圖3U。Ha1-1.152VL的cDNA和氨基酸序列。下劃線處為輕鏈恒定區(qū)。圖4。PSCA抗體與種系V-D-J序列的的比對(duì)。圖4A。Ha1-4.117VH(SEQIDNO13)與人VH4-31的比對(duì)。圖4B。Ha1-4.117VL(SEQIDNO14)與人L19的比對(duì)。圖4C。Ha1-4.120VH(SEQIDNO15)與人VH4-31的比對(duì)。圖4D。Ha1-4.120VL(SEQIDNO16)與人02的比對(duì)。圖4E。Ha1-5.99VH(SEQIDNO17)與人VH4-34的比對(duì)。圖4F。Ha1-5.99VL(SEQIDNO18)與人A27的比對(duì)。圖4G。Ha1-4.121VH(SEQIDNO19)與人VH4-34的比對(duì)。圖4H。Ha1-4.121c.5VL(SEQIDNO20)與人08的比對(duì)。圖4I。Ha1-4.121c.26VL(SEQIDNO21)與人A3的比對(duì)。圖4J。Ha1-1.16VH(SEQIDNO22)與人VH6-1的比對(duì)。圖4K。Ha1-1.16VL(SEQIDNO23)與人B3的比對(duì)。圖4L。Ha1-4.37VH(SEQIDNO28)與人VH4-31的比對(duì)。圖4M。Ha1-4.37VL(SEQIDNO29)與人O2的比對(duì)。圖5。重組小鼠、大鼠和人細(xì)胞系中PSCA蛋白的表達(dá)。所示的小鼠、大鼠和人細(xì)胞系用載有人PSCAcDNA和新霉素抗性基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染或用僅載有新霉素抗性基因的對(duì)照病毒感染。在G418的存在下篩選穩(wěn)定的重組細(xì)胞系。采用1G8抗-PSCAMAb(5μg/ml)染色的FACS測(cè)定PSCA的表達(dá)。所示為各細(xì)胞系中的FACS分布圖，顯示熒光漂移僅在受PSCA感染的細(xì)胞系中存在，指示PSCA在細(xì)胞表面表達(dá)。這些細(xì)胞系可在MAb開(kāi)放中用作免疫源、MAb篩選試劑，以及用在功能分析中。圖6。獲自大腸桿菌的PSCA蛋白的純化。用編碼PSCAcDNA21-94氨基酸的pET-21b載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21pLysS。通過(guò)用IPTG誘導(dǎo)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)來(lái)表達(dá)PSCA蛋白，并從裂解細(xì)菌的可溶性或不溶性部分中用親和層析法純化該蛋白。所示為洗脫部分的SDS-PAGE考馬斯藍(lán)染色凝膠。該蛋白質(zhì)可用作MAb和pAb免疫原以及用作抗體篩選試劑。圖7。由293T細(xì)胞表達(dá)的重組糖基化PSCA蛋白的純化。用載有編碼PSCAcDNA28-100氨基酸的psecTag2載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過(guò)用潮霉素B進(jìn)行藥物篩選建立穩(wěn)定的重組PSCA-分泌型細(xì)胞系。通過(guò)采用1G8MAb的親和層析法純化存在于條件培養(yǎng)基中的PSCA蛋白。所示為低pH洗脫部分的考馬斯藍(lán)染色SDS-PAGE凝膠。在內(nèi)源表達(dá)的PSCA中觀察到的寬分子量蛋白質(zhì)拖尾指示了重組PSCA蛋白的糖基化。圖8。獲自大腸桿菌的GST-PSCA蛋白的純化。用編碼融合于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的PSCA的18-98氨基酸的pGEX-2T轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21DE3。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物中用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)GST-PSCA蛋白，并從裂解的細(xì)菌中用谷胱甘肽葡聚糖基質(zhì)親和層析法來(lái)純化該蛋白。所示為含有GST-PSCA的谷胱甘肽洗脫部分的SDS-PAGE考馬斯藍(lán)染色凝膠。表明存在完整的GST-PSCA融合蛋白和少量含GST的降解產(chǎn)物。該蛋白質(zhì)可用作MAb和pAb免疫原以及用作Ab篩選試劑。圖9。采用FACS的人PSCA抗體篩選。采用ELISA測(cè)定上清液中抗體濃度。將(純)50μl/孔加入96孔FACS板中，并進(jìn)行系列稀釋。加入表達(dá)PSCA的細(xì)胞(內(nèi)源或重組，50,000個(gè)細(xì)胞/孔)，在4℃下孵育該混合物2小時(shí)。孵育后，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞，然后于4℃下在100μl檢測(cè)抗體(抗-hIgG-PE)中孵育45分鐘。孵育結(jié)束后，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞，甲醛固定，用FACScan分析。采用CellQuestPro軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)心直方圖表示獲自陰性對(duì)照細(xì)胞的數(shù)據(jù)，空心直方圖表示獲自PSCA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)據(jù)。圖10。通過(guò)FACS測(cè)定的PSCAMAb相對(duì)親和力等級(jí)。在4℃下，將21個(gè)系列1∶2稀釋的各個(gè)PSCA抗體與SW780細(xì)胞(50,000個(gè)細(xì)胞/孔)孵育過(guò)夜(MAb終濃度為40nM-0.038pM)。孵育結(jié)束后，洗滌細(xì)胞，于抗-hIgG-PE檢測(cè)抗體共同孵育。洗去未結(jié)合的二抗后，用FACS分析細(xì)胞，采用CellQuestPro軟件得出各點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度。采用S型劑量響應(yīng)(可變斜率)公式，以GraphpadPrism軟件計(jì)算親和力。圖中所示為描述PSCAMAb4.121結(jié)合滴度的代表性FACS分析。圖11。293T細(xì)胞中小鼠和獼猴PSCA的表達(dá)以及采用抗人PSCAMAb的識(shí)別。用載有小鼠PSCAcDNA、猿猴PSCAcDNA的pCDNA3.1載體或空載體(新，neo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后2天，收集細(xì)胞并用人抗PSCAMAbHa1-4.117或小鼠MAb1G8(5μg/ml)染色。所示為FACS分布圖，顯示了由人PSCA蛋白產(chǎn)生的MAbHa1-4.117結(jié)合于在293T細(xì)胞中表達(dá)的小鼠和猿猴PSCA蛋白。小鼠1G8MAb結(jié)合于猿猴PSCA，但不結(jié)合小鼠PSCA。該結(jié)果表明可與其它物種的抗原交叉反應(yīng)的所選MAb的能力。交叉反應(yīng)的MAb可用于那些物種的表達(dá)和毒性研究中。圖12。與MAb4.121共同孵育后的PSCA內(nèi)化作用。在4℃下，將PSCAMAb4.121與PC3-PSCA共同孵育90分鐘，以使所述抗體結(jié)合于所述細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞分成兩等份，在37℃(使得抗體內(nèi)化)或4℃(無(wú)內(nèi)化對(duì)照)下孵育。在37℃或4℃下孵育后，用酸洗去除結(jié)合于細(xì)胞表面的殘留PSCAMAb4.121。隨后的檢測(cè)二抗?jié)B透和孵育使得內(nèi)化的PSCAMAb4.121得以檢測(cè)。采用FACS分析細(xì)胞或在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。在37℃下孵育2小時(shí)后，約30％的PSCAMAb4.121被內(nèi)化。圖13。PSCA表達(dá)細(xì)胞中的PSCA抗體介導(dǎo)皂草素依賴(lài)性殺傷。在第一天時(shí)將B300.19細(xì)胞(750個(gè)細(xì)胞/孔)接種入96孔板。第二天在各孔中加入等體積的含2×濃度的指示一抗和2倍過(guò)量的連接有皂草素毒素的抗人(Hum-Zap)或抗山羊(山羊-Zap)多克隆抗體(AdvancedTargetingSystems，SanDiego，CA)。在37℃下孵育細(xì)胞5天。孵育期結(jié)束后，向各孔中加入MTS(Promega)，并繼續(xù)孵育4小時(shí)。測(cè)定450nM的OD。圖13(A)中的結(jié)果顯示在B300.19-PSCA細(xì)胞中存在PSCA抗體HA1-4.121和HA1-4.117介導(dǎo)的皂草素依賴(lài)性細(xì)胞毒性，而在對(duì)照非特異性IgG1抗體中則無(wú)作用。圖13(B)中的結(jié)果顯示加入不能識(shí)別人Fc的皂草素結(jié)合的二抗，不能介導(dǎo)細(xì)胞毒作用。圖14。PSCAMAb的補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒作用。用RHB緩沖液(RPMI1640，GibcoLifeTechnologies，20mMHEPES)稀釋PSCA抗體(0-50μg/ml)。在RHB緩沖液中洗滌表達(dá)B300.19-PSCA的細(xì)胞，以106個(gè)細(xì)胞/ml的密度重新懸浮。在典型試驗(yàn)中，將50μlPSCA抗體、50μl稀釋的兔補(bǔ)體血清(Cedarlane，Ontario，Can)和50μl的細(xì)胞懸液同時(shí)加入到平底組織培養(yǎng)96孔板中。在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育混合物2小時(shí)以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。將50μl的Alamar藍(lán)(BiosourceIntl.Camarillo，CA)加入各孔中，在37℃下繼續(xù)孵育4-5小時(shí)。用96孔熒光計(jì)在530nm處激發(fā)、590nm處發(fā)射讀取各孔的熒光值。結(jié)果顯示具有IgG1(HA1-4.121)或IgG2同種型(HA1-5.99.1)而不是IgG4同種型(HAl-6.46)的PSCA抗體能介導(dǎo)靶細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性裂解。圖15。通過(guò)胃蛋白酶消化產(chǎn)生MAbHa1-4.121的F(ab’)2片段。將20mg的MAbHa1-4.121的20mM醋酸鈉緩沖液(pH4.5)與和不與固定化的胃蛋白酶(Pierce.RockfordIL)孵育指定的時(shí)間。通過(guò)蛋白A層析去除完整的MAb和消化的Fc片段。所示為完整的未經(jīng)消化、未被還原的MAb、在指定時(shí)間取出的未還原等份的經(jīng)消化的材料以及最終消化F(ab’)2產(chǎn)物的還原樣品的PAGE考馬斯染色凝膠。圖16。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定的重組抗PSCA人MAb于PSCA的結(jié)合。(16A)用編碼抗PSCA人MAb重鏈和輕鏈的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48小時(shí)后收集上清，分析與PSCA的結(jié)合。(16B)從雜交瘤上清液中純化抗PSCA人MAb并用于PSCA結(jié)合分析。如下測(cè)試PSCA的結(jié)合性。將PC3親本或PC3-PSCA細(xì)胞與如上所述的抗PSCA人MAbs在冰上一起孵育30分鐘。洗滌細(xì)胞，與PE結(jié)合的抗人Ig在冰上共同孵育30分鐘。洗滌細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。圖17。通過(guò)免疫組化法對(duì)PSCA蛋白的檢測(cè)。使用抗體HA1-4.117檢測(cè)PSCA蛋白在獲自癌癥患者的腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)。將經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切成4微米的切片，置于玻璃載玻片上。對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、重新水化并用抗原回收溶液(AntigenRetrievalCitraSolution；BioGenex，4600NorrisCanyonRoad，SanRamon，CA，94583)在高溫下處理。然后在4℃下將切片孵育在熒光素結(jié)合的人單克隆抗PSCA抗體Ha1-4.117中16小時(shí)。在緩沖液中洗滌所述載玻片3次，再與兔抗熒光素共同孵育1小時(shí)，在緩沖液中洗滌后，浸漬在DAKOEnVision+TM過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔免疫球蛋白二抗(DAKOCorporation，Carpenteria，CA)中30分鐘。然后在緩沖液中洗滌切片，用DAB試劑盒(SIGMAChemicals)顯影，用蘇木精復(fù)染，采用亮視野顯微術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示PSCA在前列腺癌(圖A、圖B)、膀胱移行細(xì)胞癌(圖C)和胰導(dǎo)管腺癌(圖D)的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果表明PSCA在人癌癥中表達(dá)，抗這一抗原的抗體可用作診斷試劑。圖18。PSCAMAbHa1-4.120對(duì)皮下前列腺癌異種移植物生長(zhǎng)的抑制。將LAPC-9AI腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)注射入雄性SCID小鼠皮下。將小鼠隨機(jī)分組(各組中的n＝10)，按照指示在第0天時(shí)，通過(guò)腹膜內(nèi)注射(i.p.)HA1-4.120或同種型MAb對(duì)照開(kāi)始治療。每周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行2次治療，總共給藥7次，直至研究的第28天。按照指示每3-4天用測(cè)徑儀檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Ha1-4.120顯著地抑制了SCID小鼠中皮下植入的人前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)(p＜0.05)。圖19。PSCAMAbHa1-5.99對(duì)SCID小鼠中建立的前列腺癌異種移植物生長(zhǎng)的抑制。將LAPC-9AI腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)注射入雄性SCID小鼠皮下。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組(各組中的n＝10)，按照指示腹膜內(nèi)注射(i.p.)HA1-5.99.1或同種型MAb對(duì)照開(kāi)始治療。每周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行2次治療，總共給藥5次，直至研究的第14天。按照指示每3-4天用測(cè)徑儀檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)果顯示全人抗PSCA單克隆抗體Ha1-5.99顯著抑制了皮下植入SCID小鼠的建立的非雄激素依賴(lài)性人前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)(p＜0.05)。圖20。PSCAMAbHA1-4.121對(duì)建立的雄激素依賴(lài)性人前列腺癌異種移植物生長(zhǎng)的抑制。將LAPC-9AD腫瘤細(xì)胞(2.5×106個(gè)細(xì)胞)注射入雄性SCID小鼠皮下。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到40mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組(各組中的n＝10)，按照指示腹膜內(nèi)注射(i.p.)高濃度的HA1-4.121或同種型MAb對(duì)照開(kāi)始治療。每周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行2次治療，總共給藥7次，直至研究的第21天。按照指示每3-4天用測(cè)徑儀檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究的結(jié)果顯示Ha1-4.121抑制了皮下植入SCID小鼠中的建立的人雄激素依賴(lài)性前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)。結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上為顯著的是300μg劑量組第14、17和21天(p＜0.05，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，雙尾α＝0.05)和700μg劑量組第10、14、17和21天(p＜0.05，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，雙尾α＝0.05)。圖21。將獲自患者的雄激素依賴(lài)性LAPC-9AD腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)注射入雄性SCID小鼠前列腺的背瓣。使腫瘤生長(zhǎng)約10天，對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。在植入腫瘤10天后用500μg人HA1-4.117、HA1-4.121或同種型對(duì)照開(kāi)始治療。每周2次經(jīng)腹膜內(nèi)遞送抗體，總共給藥7次。最后一次給藥4天后，處死動(dòng)物，取出原發(fā)腫瘤并稱(chēng)重。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Ha1-4.121(p＜0.01)和Ha1-4.117(p＜0.05)顯著抑制了常位(orthotopically)移植入SCID小鼠的LAPC-9AD前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)。圖22。PSCAMAbHA1-4.121對(duì)帶有已建立的常位人雄激素依賴(lài)性前列腺腫瘤的SCID小鼠存活時(shí)間的延長(zhǎng)。將獲自患者的雄激素依賴(lài)性LAPC-9AD腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)注射入雄性SCID小鼠前列腺的背瓣中。使腫瘤生長(zhǎng)約9天，對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。隨機(jī)分入存活組的動(dòng)物包括同種型MAb對(duì)照的11只小鼠和HA1-4.121治療組的12只小鼠。每周2次用1000μgHa1-4.121或1000μg同種型MAb對(duì)照經(jīng)腹膜內(nèi)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，共給藥9次。結(jié)果顯示HA1-4.121顯著(對(duì)數(shù)分級(jí)檢驗(yàn)p＜0.01)延長(zhǎng)了帶有人雄激素依賴(lài)性前列腺腫瘤的SCID小鼠的存活時(shí)間。在最后一次治療后110天，HA1-4.121治療組中的2只小鼠保持無(wú)可觸知的腫瘤的狀態(tài)。圖23。HA1-4.21和泰索帝(taxotere)聯(lián)合治療對(duì)前列腺腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的增強(qiáng)。將LAPC-9AI腫瘤細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物)皮下注射入雄性SCID小鼠。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到65mm3時(shí)，按照指示將動(dòng)物隨機(jī)編成4個(gè)不同的組(各組中的n＝10)。在第0天時(shí)開(kāi)始每周2次以500μg的劑量腹膜內(nèi)給予Ha1-4.121或同種型MAb對(duì)照，總共給藥6次。在第17天時(shí)給予最后一劑。在第0、3和7天時(shí)以5mg/kg的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)給予泰索帝。每3-4天用測(cè)徑儀檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究的結(jié)果顯示與單用對(duì)照抗體治療第28天相比，Ha1-4.121作為單用的藥劑對(duì)SCID小鼠中非雄激素依賴(lài)性前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)抑制達(dá)45％(ANOVA/Tukey檢驗(yàn)p＜0.05)。與單獨(dú)給予對(duì)照抗體治療相比，給予同種型MAb對(duì)照加上泰索帝對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制達(dá)28％，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。與單獨(dú)的對(duì)照抗體相比，聯(lián)合給予HA1-4.121和泰索帝具有增強(qiáng)的效果并使得腫瘤生長(zhǎng)的抑制達(dá)到69％(ANOVA/Tukey檢驗(yàn)p＜0.01)。當(dāng)將HA1-4.121與泰索帝的聯(lián)合組與HA1-4.121或同種型MAb對(duì)照加上泰索帝組相比時(shí)，均顯示出了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(ANOVA/Tukey檢驗(yàn)p＜0.05)。圖24。人PSCAMAb在SCID小鼠/人HPAC中對(duì)胰腺癌異種移植物生長(zhǎng)的抑制。將胰腺癌細(xì)胞(2×106個(gè)/小鼠)皮下注射入免疫缺陷型ICRSCID小鼠(TaconicFarm，Germantown，NY)。將小鼠隨機(jī)分組(n＝10只動(dòng)物/組)，于同一天用指定的人PSCA單克隆抗體開(kāi)始治療。每周2次經(jīng)腹膜內(nèi)遞送抗體(500mg/小鼠)，總共給藥8次。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Ha1-4.121、Ha1-4.117和Ha1-1.16顯著抑制了移植在SCID小鼠皮下的人胰腺癌異種移植物的生長(zhǎng)。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(雙尾，α＝0.05)。圖25。PSCAMAbHA1-4.121對(duì)SCID小鼠常位移植胰腺腫瘤生長(zhǎng)的抑制。將HPAC細(xì)胞(3.0×106個(gè)細(xì)胞)常位移植入SCID小鼠的胰腺中。按照指示將小鼠隨機(jī)分配為3組(每組的n＝9)。在移植當(dāng)天用HA1-4.121(250μg或1000μg)或同種型MAb對(duì)照(1000μg)開(kāi)始治療。每周2次腹膜內(nèi)給予抗體，總共給藥10次。最后一劑13天后，處死動(dòng)物，取出原發(fā)腫瘤并稱(chēng)重。本研究的結(jié)果顯示所測(cè)試的兩種劑量水平的HA1-4.121均顯著抑制了SCID小鼠中人胰腺癌異種移植物的常位生長(zhǎng)。250μg和1000μgAGS-PSCA分別抑制了腫瘤生長(zhǎng)達(dá)66％和70％(Kruskal-Wallis/Tukey檢驗(yàn)分別為p＜0.01和p＜0.01)。圖26。PSCAMAbHA1-4.121對(duì)轉(zhuǎn)移灶的抑制。在尸體解剖中，在對(duì)照抗體治療組中觀察到可見(jiàn)的向淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移灶。在兩個(gè)HA1-4.121治療組中均未觀察到可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移灶。從所有動(dòng)物中取出淋巴結(jié)、肺和肝，組織學(xué)檢測(cè)移行性腫瘤的存在。用人細(xì)胞角蛋白對(duì)取自各動(dòng)物肺和淋巴結(jié)的切片進(jìn)行染色，顯微鏡下確定轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。組織學(xué)分析結(jié)果顯示用HA1-4.121治療的動(dòng)物中的淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移灶顯著減少(p＝0.0152，由Fishers精確性檢驗(yàn)測(cè)得)。轉(zhuǎn)移和侵入的發(fā)生率在用兩種濃度HA1-4.121治療的動(dòng)物中也顯著降低(p＝0.0152，由Fishers精確性檢驗(yàn)測(cè)得)。僅用1.0mg劑量的HA1-4.121治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著降低(p＝0.0498，由Fishers精確性檢驗(yàn)測(cè)得)。圖27。人PSCAMAb在SCID小鼠中對(duì)SW780膀胱腫瘤生長(zhǎng)的抑制。將人SW780膀胱癌細(xì)胞(2×106個(gè)/小鼠)皮下注射入免疫缺陷型ICRSCID小鼠(TaconicFarm，Germantown，NY)。將小鼠隨機(jī)分組(n＝10只動(dòng)物/組)，在同一天用所示的人PSCAMAb開(kāi)始治療。每周2次腹膜內(nèi)遞送抗體(250mg/小鼠)，總共給藥7次。結(jié)果顯示HA1-4.117(p＝0.014)、HA1-4.37(p＝0.0056)、HA1-1.78(p＝0.001)、Ha1-5.99(p＝0.0002)和HA1-4.5(p＝0.0008)顯著抑制了SCID小鼠中皮下植入的SW780膀胱腫瘤的生長(zhǎng)。用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(雙尾，α＝0.05)。發(fā)明詳述章節(jié)概述I.)定義II.)PSCA多核苷酸II.A.)PSCA多核苷酸的用途II.A.1.)監(jiān)測(cè)遺傳異常II.A.2.)反義實(shí)例II.A.3.)引物和引物對(duì)II.A.4.)分離編碼PSCA的核酸分子II.A.5.)重組核酸分子和宿主-載體系統(tǒng)III.)PSCA相關(guān)蛋白III.A.)帶有基序的蛋白質(zhì)的實(shí)例III.B.)PSCA相關(guān)蛋白的表達(dá)III.C.)PSCA相關(guān)蛋白的修飾III.D.)PSCA相關(guān)蛋白的用途IV.)PSCA抗體V.)PSCA細(xì)胞免疫應(yīng)答VI.)PSCA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物VII.)檢測(cè)PSCA的方法VIII.)監(jiān)測(cè)PSCA-相關(guān)基因狀態(tài)及其產(chǎn)物的方法IX.)鑒定與PSCA相互作用的分子X(jué).)治療方法和組合物X.A.)抗癌疫苗X.B.)PSCA作為抗體療法的靶標(biāo)X.C.)PSCA作為細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶標(biāo)X.C.1.小基因疫苗X.C.2.CTL肽和輔助肽的組合X.C.3.CTL肽和T細(xì)胞引發(fā)劑的組合X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脈沖的DC的疫苗組合物X.D.)過(guò)繼免疫治療X.E.)出于治療或預(yù)防目的的疫苗接種XI.)PSCA的診斷和預(yù)后實(shí)施方案XII.)抑制PSCA蛋白的功能XII.A.)用胞內(nèi)抗體抑制PSCAXII.B.)用重組蛋白抑制PSCAXII.C.)抑制PSCA轉(zhuǎn)錄或翻譯XII.D.)治療方法的總體考慮XIII.)PSCA調(diào)節(jié)劑的鑒定、特性分析和用途XIV.)RNAi和小干擾RNA的治療用途(siRNAs)XV.)試劑盒/制品的生產(chǎn)I.)定義除非另有說(shuō)明，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)、符號(hào)以及其它科學(xué)名詞或術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練技術(shù)人員常規(guī)理解的含義。一些情況下，具有常規(guī)理解的術(shù)語(yǔ)在這里被定義以便澄清和/或用來(lái)參考，本文在的這種定義不應(yīng)該被解釋為它與本領(lǐng)域的通常理解的含義有實(shí)質(zhì)性區(qū)別。這里描述或引用的許多技術(shù)和方法是容易理解的并且通?？捎删ū绢I(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行，例如廣泛采用的在Sambrook等的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloningALaboratoryManual)(第二版，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress，冷泉港，紐約)中所述的分子克隆法。除非另有說(shuō)明，使用市售試劑盒和試劑的方法宜通常按照制造商規(guī)定的過(guò)程和/或參數(shù)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“晚期前列腺癌”、“局部晚期前列腺癌”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”是指已經(jīng)擴(kuò)展突破前列腺包膜的前列腺癌，包括美國(guó)泌尿?qū)W會(huì)(AUA)系統(tǒng)定義的第C期疾病、Whitmore-Jewett系統(tǒng)定義的第C1-C2期疾病和TNM(腫瘤、結(jié)節(jié)、轉(zhuǎn)移)系統(tǒng)定義的第T3-T4期及N+期疾病。通常不推薦對(duì)局部晚期疾病患者進(jìn)行手術(shù)，相比臨床局限性(器官局限性)前列腺癌患者，這些患者的手術(shù)結(jié)果基本上都不好。在臨床上可通過(guò)前列腺的外側(cè)緣上有可觸及的硬化或前列腺底部不對(duì)稱(chēng)或硬化來(lái)確定局部晚期疾病。如果腫瘤侵入或透過(guò)前列腺包膜，擴(kuò)展到手術(shù)邊緣或侵入精囊，局部晚期前列腺癌目前通過(guò)根治性前列腺切除術(shù)進(jìn)行病理學(xué)檢查作出診斷。“改變天然糖基化模式”在這里是指刪除在天然PSCA序列上發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)糖部分(通過(guò)除去潛在的糖基化位點(diǎn)或通過(guò)化學(xué)和/或酶方法刪除糖基化位點(diǎn))，和/或加入一個(gè)或多個(gè)天然PSCA序列中不存在的糖基化位點(diǎn)。此外，該短語(yǔ)包括天然蛋白質(zhì)糖基化的性質(zhì)改變，包括存在的各種糖部分的性質(zhì)和比例的改變。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指與另一分子(例如PSCA相關(guān)蛋白)結(jié)構(gòu)類(lèi)似或共同具有類(lèi)似或相應(yīng)屬性的分子。例如，PSCA蛋白的類(lèi)似物可被特異性結(jié)合PSCA的抗體或T細(xì)胞特異性結(jié)合。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣泛含義使用。因此，“抗體”可以是天然產(chǎn)生的或人造的，如通過(guò)常規(guī)雜交瘤技術(shù)制造的單克隆抗體?？?PSCA抗體包括單克隆和多克隆抗體，以及含有這些抗體的抗原結(jié)合域和/或一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)″抗體″是指特異性結(jié)合PSCA和/或具有所需生物活性的任何形式的抗體或其片段，該定義具體覆蓋了單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們特異性結(jié)合PSCA和/或顯示所需生物活性。本文所提供的方法和組合物中可使用任何特異性抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括如下的分子該分子包含相互結(jié)合的輕鏈免疫球蛋白的至少一個(gè)可變區(qū)和重鏈分子的至少一個(gè)可變區(qū)，以形成對(duì)靶抗原的特異性結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體是IgG抗體。例如，所述抗體是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。用于本發(fā)明方法和組合物的抗體可在細(xì)胞培養(yǎng)物、噬菌體或各種動(dòng)物中產(chǎn)生，所述的動(dòng)物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、綿羊、狗、貓、猴、猩猩、猿。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是哺乳動(dòng)物抗體?？刹捎檬删w技術(shù)分離原始的抗體或產(chǎn)生具有改變的特異性或親和力特性的變體。這些技術(shù)是常規(guī)的，且在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體是采用本領(lǐng)域已知的重組方法產(chǎn)生的。例如，可通過(guò)用包含編碼抗體的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生重組抗體。可用一種或多種載體在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)至少一個(gè)VL和一個(gè)VH區(qū)的DNA序列。抗體發(fā)生和生產(chǎn)重組方法的示例性描述包括Delves，ANTIBODIESPRODUCTIONESSENTIALTECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard等，MONOCLONALANTIBODIES(OxfordUniversityPress，2000)；Goding，MONOCLONALANTIBODIESPRINCIPLESANDPRACTICE(AcademicPress，1993)；CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY(JohnWiley&Sons，最近的版本)?？赏ㄟ^(guò)重組方法來(lái)修飾本發(fā)明的抗體，從而提高該抗體在介導(dǎo)所需功能中的更大效應(yīng)。因此，采用重組方法通過(guò)取代來(lái)修飾本發(fā)明的抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，所述取代是保守取代。例如，可用不同的殘基取代抗體恒定區(qū)中的至少一個(gè)氨基酸。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利5,624,821、美國(guó)專(zhuān)利6,194,551、專(zhuān)利申請(qǐng)WO9958572；以及Angal等，Mol.Immunol.30105-08(1993)。對(duì)氨基酸的修飾包括氨基酸的缺失、插入、取代。在某些情況下，進(jìn)行這些變化是為了減少不良活性，例如，補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性。經(jīng)常性將抗體與提供可檢測(cè)信號(hào)的底物共價(jià)或非共價(jià)連接。已知很多種類(lèi)的標(biāo)記和連接技術(shù)，科技和專(zhuān)利文獻(xiàn)對(duì)它們作了廣泛的報(bào)道?？珊Y選這些抗體以用于結(jié)合正?；蛴腥毕莸腜SCA。參見(jiàn)例如，ANTIBODYENGINEERINGAPRACTICALAPPROACH(OxfordUniversityPress，1996)?？赏ㄟ^(guò)以下體外分析法來(lái)識(shí)別具有所需生物活性的適宜抗體，這些分析法包括但不限于增殖、遷移、黏附、軟瓊脂生長(zhǎng)、血管生成、細(xì)胞-細(xì)胞通訊、凋亡、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及以下體內(nèi)分析法，例如腫瘤生長(zhǎng)抑制。本文提供的抗體還可用于診斷用途。作為捕獲或非中和抗體，可對(duì)它們結(jié)合特異性抗原而不抑制受體結(jié)合或該抗原的生物活性的能力進(jìn)行篩選。作為中和抗體，所述抗體可用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析。它們還可用于PSCA或其受體的定量?！翱贵w片段”被定義為與其靶分子結(jié)合的免疫球蛋白分子的至少部分可變區(qū)，即抗原結(jié)合區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，它特別包括單個(gè)抗-PSCA抗體及其克隆(包括激動(dòng)、拮抗和中和抗體)和具有多表位特異性的抗-PSCA抗體組合物。本文的方法和組合物中的抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體?？贵w可為抗原結(jié)合抗體片段，所述抗體片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈可變區(qū)等。可采用本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)產(chǎn)生完整分子的片段，包括酶消化和重組方法。如本文所用，可使用任何形式的“抗原”來(lái)產(chǎn)生對(duì)PSCA特異性的抗體。因此，引發(fā)性抗原(elicitingantibody)可為單抗原表位、多抗原表位或單獨(dú)使用或與本領(lǐng)域已知的一種或多種免疫原性增強(qiáng)劑聯(lián)用的全蛋白。該引發(fā)性抗原可為分離的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面蛋白(例如，用抗原的至少一部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行免疫)或可溶性蛋白(例如，僅用蛋白質(zhì)胞外區(qū)部分免疫)。可在遺傳工程化改造的細(xì)胞中產(chǎn)生所述抗原。編碼該抗原的DNA可為基因組的或非基因的(例如，cDNA)和編碼至少部分胞外區(qū)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“部分”是指用于構(gòu)建感興趣抗原的免疫原性抗原表位的恰如其分的最少數(shù)量氨基酸或核酸?？刹捎眠m于轉(zhuǎn)化感興趣細(xì)胞的任何遺傳載體，包括但不限于腺病毒載體、質(zhì)粒和非病毒載體，例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本文的方法和組合物中的抗體特異性結(jié)合感興趣PSCA胞外區(qū)的至少一部分。本文提供的抗體或抗原及其結(jié)合片段可結(jié)合于“生物活性劑”。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物活性劑”是指結(jié)合抗原和/或促進(jìn)或介導(dǎo)所需生物學(xué)效應(yīng)以增強(qiáng)細(xì)胞殺傷毒性的任何合成或天然存在的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的結(jié)合片段是生物學(xué)活性片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”是指能結(jié)合所需抗原表位和直接或間接賦予生物效應(yīng)的抗體或抗體片段。直接作用包括但不限于調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制生長(zhǎng)信號(hào)，調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制抗凋亡信號(hào)，調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制凋亡或壞死信號(hào)，調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制ADCC級(jí)聯(lián)反應(yīng)，和調(diào)節(jié)、刺激和/或抑制CDC級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在本發(fā)明的方法和組合物中還可使用“雙特異性”抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“雙特異性抗體”是指對(duì)至少兩種不同的抗原表位具有結(jié)合特異性的抗體，通常為單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表位來(lái)自同一抗原。在另一實(shí)施方式中，所述表位來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同的抗原。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可通過(guò)使兩種免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)共表達(dá)的方法來(lái)產(chǎn)生雙特異性抗體。參見(jiàn)，例如，Milstein等，Nature305537-39(1983)。或者，可用化學(xué)連接法制備雙特異性抗體。參見(jiàn)，例如，Brennan等，Science22981(1985)。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。參見(jiàn)例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A。906444-48(1993)，Gruber等，J.Immunol.1525368(1994)。本文的單克隆抗體具體包括″嵌合″抗體以及該抗體的片段，只要它們特異性結(jié)合靶抗原和/或具有所需的生物活性，該嵌合抗體中的部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w家族或亞家族的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分則與衍生自另一特定物種或?qū)儆诹硪豢贵w家族或亞家族的抗體的相應(yīng)序列相同或同源(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851-6855(1984))。術(shù)語(yǔ)“化療劑”是指所有有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的化學(xué)化合物?；焺┑姆窍拗菩岳影ㄍ榛瘎?，例如氮芥、氮丙啶化合物和烷基磺酸酯；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如長(zhǎng)春花屬生物堿和鬼臼毒素衍生物、細(xì)胞毒性抗生素、破壞或干擾DNA表達(dá)的化合物、以及生長(zhǎng)因子受體拮抗劑。此外，化療劑包括細(xì)胞毒劑(如本文所定義)、抗體、生物分子和小分子。術(shù)語(yǔ)“密碼子優(yōu)化序列”是指通過(guò)置換在特定種類(lèi)宿主中使用頻率低于約20％的密碼子而優(yōu)化的核苷酸序列。除密碼子最優(yōu)化之外，通過(guò)去除假聚腺苷化序列、去除外顯子/內(nèi)含子剪接信號(hào)、去除轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列和/或優(yōu)化GC含量而最優(yōu)化在給定的宿主中的表達(dá)的核苷酸序列在這里被稱(chēng)為“表達(dá)增強(qiáng)序列”?！敖M合文庫(kù)”是通過(guò)化學(xué)合成或生物合成將許多化學(xué)“構(gòu)件”(如試劑)組合而產(chǎn)生的不同化合物的集合。例如，線性組合化學(xué)文庫(kù)，如多肽(如突變蛋白)文庫(kù)，是用所有可能的方法將一組叫做氨基酸的化學(xué)構(gòu)件組合成給定的化合物長(zhǎng)度(即多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)而形成的。大多數(shù)化合物是通過(guò)這種化學(xué)構(gòu)件的組合混合合成的(Gallop等，J.Med.Chem.37(9)1233-1251(1994))。組合文庫(kù)的制備和篩選是精通精通本領(lǐng)域是技術(shù)人員熟知的。這種組合化學(xué)文庫(kù)包括但不限于，肽文庫(kù)(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5,010,175號(hào)，F(xiàn)urka，Pept.Prot.Res.37487-493(1991)，Houghton等，Nature，35484-88(1991))、類(lèi)肽(PCT公布WO91/19735)、編碼肽(PCT公布WO93/20242)、隨機(jī)生物寡聚物(PCT公布WO92/00091)、苯并二氮雜(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,288,514)、diversomers如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮雜和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA906909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有β-D-葡萄糖支架的非肽的肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))、小化合物的類(lèi)似有機(jī)綜合體文庫(kù)(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))、oligocarbarnate(Cho等，Science2611303(1993))，和/或肽酰膦酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))。通?？梢?jiàn)Gordon等，J.Med.Chem.371385(1994)，核酸文庫(kù)(見(jiàn)例如Stratagene，Corp.)、肽核酸文庫(kù)(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,539,083)、抗體文庫(kù)(見(jiàn)例如Vaughn等，NatureBiotechnology14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖類(lèi)文庫(kù)(見(jiàn)例如Liang等，Science2741520-1522(1996)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,593,853)，以及小有機(jī)分子文庫(kù)(見(jiàn)例如苯并二氮雜，Baum，C&EN，1-18，第33頁(yè)(1993)；類(lèi)異戊二烯，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinone)和間噻嗪烷酮(metathiazanone)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,549,974；吡咯烷，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,506,337；苯并二氮雜，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,288,514；等等)。制備組合文庫(kù)的裝置可通過(guò)商業(yè)獲得(見(jiàn)例如357NIPS，390NIPS，AdvancedChemTech，LouisvilleKY；Symphony，Rainin，Woburn，MA；433A，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA；9050，Plus，Millipore，Bedford，NIA)。還開(kāi)發(fā)了許多熟知的機(jī)器系統(tǒng)來(lái)解決相化學(xué)(phasechemistry)問(wèn)題。這些系統(tǒng)包括自動(dòng)工作站，如TakedaChemicalIndustries，LTD.(日本大阪)開(kāi)發(fā)出的自動(dòng)合成儀，以及采用模擬化學(xué)家手工合成操作的機(jī)器臂的機(jī)器系統(tǒng)(ZymateH，ZymarkCorporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，PaloAlto，Calif.)。上述任何裝置都適用于本發(fā)明。對(duì)精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，改進(jìn)這些裝置(如果需要的話)的特性和運(yùn)行方式使它們能夠按本文所述進(jìn)行運(yùn)作。此外，許多組合文庫(kù)自身可通過(guò)商業(yè)獲得(見(jiàn)例如ComGenex，Princeton，NJ；Asinex，Moscow，RU；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；ChemStar，Ltd，Moscow，RU；3DPharmaceuticals，Exton，PA；MartekBiosciences，Columbia，MD；等等)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“保守取代”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸取代，且進(jìn)行該取代通常不會(huì)改變所得分子的生物活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到通常在多肽非必需區(qū)中的單個(gè)氨基酸取代不會(huì)實(shí)質(zhì)性改變生物活性(參見(jiàn)例如，Watson等，MOLECULARBIOLOGYOFTHEGENE，TheBenjamin/CummingsPub.Co.，第224頁(yè)(第4版，1987))。優(yōu)選按照表III(a-b)中所述進(jìn)行這些示例性取代。例如，這些改變可包括用異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)和亮氨酸(L)取代其它這些疏水性氨基酸；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷胺酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)，反之亦然。其它取代也可被認(rèn)為是保守性的，這取決于具體氨基酸所處的環(huán)境和它在該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)常可互換，就如丙氨酸(A)和纈氨酸(V)也可互換。相對(duì)疏水的甲硫氨酸(M)常可與亮氨酸和異亮氨酸互換，有時(shí)也可與纈氨酸互換。賴(lài)氨酸(K)和精氨酸(R)在氨基酸殘基的顯著特征為其電荷且這兩種氨基酸殘基的差異pK并不顯著的位置上?？苫Q。在特定的環(huán)境下還有可被認(rèn)為是“保守性”的其它變化(參見(jiàn)例如本文的表III(a)；“Biochemistry”第2版第13-15頁(yè)。LubertStryer編(StanfordUniversity)；Henikoff等，PNAS1992，卷89，10915-10919；Lei等，JBiolChem1995五月19；270(20)11882-6)。其它取代也是被允許的，并可憑經(jīng)驗(yàn)或根據(jù)已知的保守取代決定。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”是指抑制或阻止細(xì)胞表達(dá)活性、細(xì)胞功能和/或造成細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)包括放射性同位素化學(xué)治療劑，以及毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。細(xì)胞毒劑的例子包括但不限于金他汀(auristatin)、金霉素、美登醇(maytansinoid)、釔、鉍、篦麻毒素、篦麻毒素A-鏈、康勒他丁(combrestatin)、朵卡霉素(duocarmycin)、多羅他汀(dolostatins)、阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、順鉑、cc1065、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、鬼臼噻吩甙、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、二羥基炭疽菌素二酮、放線菌素、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、白樹(shù)毒素、米托潔林、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、酚霉素、居里菌素(curicin)、巴豆毒素、刺孢霉素、Sapaonariaofficinalis抑制劑以及糖皮質(zhì)激素和其它化學(xué)治療劑，以及放射性同位素，如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和Lu的放射性同位素，包括Lu177。抗體也可與能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)化成其活性形式的抗癌前藥活化酶偶聯(lián)。本文所用的術(shù)語(yǔ)″雙體″是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中連接于輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)。通過(guò)使用短至不能使同一鏈中兩個(gè)區(qū)域間配對(duì)的接頭，所述區(qū)域被迫與另一鏈中的互補(bǔ)區(qū)域配對(duì)，并產(chǎn)生了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙體在以下文獻(xiàn)中有更全面的描述例如，歐洲專(zhuān)利404,097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-48(1993)?！盎虍a(chǎn)物”在本文中是指肽/蛋白質(zhì)或mRNA。例如，“本發(fā)明的基因產(chǎn)物”在本文中有時(shí)是指″癌的氨基酸序列″、″癌蛋白″、“表I所列癌的蛋白質(zhì)”、″癌的mRNA″、“表I所列癌的mRNA”等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌蛋白由圖1的核酸編碼。所述癌蛋白可以是片段，或者可以是由圖1的核酸編碼的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌氨基酸序列被用來(lái)確定序列的相同性或類(lèi)似性。另一實(shí)施方案中，該序列是由圖1的核酸編碼的天然存在蛋白質(zhì)的等位變體。另一實(shí)施方案中，該序列是本文進(jìn)一步描述的序列變體。在本發(fā)明的方法和組合物中可使用“異源偶聯(lián)”抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“異源偶聯(lián)抗體”是指兩個(gè)共價(jià)連接的抗體?？捎煤铣傻鞍踪|(zhì)化學(xué)中已知的方法來(lái)制備這些抗體，包括使用交聯(lián)劑。參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利4,676,980。用來(lái)測(cè)定特定核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在、不存在、定量或其它性質(zhì)的“高通量篩選”試驗(yàn)是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。類(lèi)似地，結(jié)合試驗(yàn)和報(bào)告基因試驗(yàn)也是熟知的。因此，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,559,410揭示了蛋白質(zhì)的高通量篩選法；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,585,639揭示了檢測(cè)核酸結(jié)合的高通量篩選法(即用陣列檢測(cè))；而美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,576,220和5,541,061揭示了檢測(cè)配體/抗體結(jié)合的高通量篩選法。此外，高通量篩選系統(tǒng)可通過(guò)商業(yè)獲得(見(jiàn)例如AmershamBiosciences，Piscataway，NJ；ZymarkCorp.，Hopkinton，MA；AirTechnicalIndustries，Mentor，OH；BeckmanInstruments，Inc.Fullerton，CA；PrecisionSystems，Inc.，Natick，MA；等等)。這些系統(tǒng)通常自動(dòng)完成全部過(guò)程，包括所有樣品和試劑的吸取、液體分配、定時(shí)培育以及最后在適合檢測(cè)的檢測(cè)器上閱讀微板。這些可配制系統(tǒng)提供高通量并能快速啟動(dòng)，并且是高度靈活和客戶(hù)定制。這種系統(tǒng)的制造商提供了各種高通量系統(tǒng)的詳細(xì)方案說(shuō)明。因此，例如ZymarkCorp.提供了描述用來(lái)檢測(cè)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、配體結(jié)合等進(jìn)行調(diào)節(jié)的篩選系統(tǒng)的技術(shù)說(shuō)明小冊(cè)子。術(shù)語(yǔ)“同系物”是指通過(guò)例如在相應(yīng)位置具有化學(xué)性質(zhì)相同或類(lèi)似的殘基的序列而顯示與另一分子同源的分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供的抗體是“人抗體”。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”是指輕鏈和重鏈序列(包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))的整個(gè)序列基本上都來(lái)自人基因的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)三源雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞技術(shù)(參見(jiàn)例如，Kozbor等，Immunol.Today472(1983))，EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)(參見(jiàn)例如，Cole等，MONOCLONALANTIBODYANDCANCERTHERAPY77-96(1985))或使用噬菌體展示(參見(jiàn)例如，Marks等，J.Mol.Biol.222581(1991))制備人單克隆抗體。在某一具體的實(shí)施方式中，所述人抗體在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。制備這些部分人抗體至全長(zhǎng)人抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，任何此類(lèi)技術(shù)均可使用。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，在經(jīng)工程化改造以表達(dá)人重鏈和輕鏈抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備全長(zhǎng)人抗體序列。制備轉(zhuǎn)基因小鼠的一個(gè)示例性描述見(jiàn)專(zhuān)利申請(qǐng)WO02/43478和美國(guó)專(zhuān)利6,657,103(Abgenix)及其后續(xù)申請(qǐng)。然后可融合轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源的、能產(chǎn)生所需抗體的B細(xì)胞以制備連續(xù)產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞系。參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；和5,545,806；以及Jakobovits，Adv.DrugDel.Rev.3133-42(1998)；Green等，J.Exp.Med.188483-95(1998)。“人白細(xì)胞抗原”或“HLA”是人I型或II型主要組織相容性復(fù)合物(MHC)蛋白(參見(jiàn)例如，Stites等，IMMUNOLOGY，第8版，LangePublishing，LosAltos，CA(1994)。本文所用的術(shù)語(yǔ)″人源化抗體″是指含有來(lái)自非人(例如，小鼠和人抗體)的抗體序列的抗體形式。這些抗體是含有源自非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗體。通常，所述人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)和通常兩個(gè)可變區(qū)的基本上全部，在這些可變區(qū)中對(duì)應(yīng)于那些非人免疫球蛋白的全部或基本上全部超變環(huán)和全部或基本上全部FR區(qū)是人免疫球蛋白序列中的那些。所述人源化抗體還會(huì)任選地包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少部分，所述Fc通常為人免疫球蛋白的Fc。參見(jiàn)例如，Cabilly的美國(guó)專(zhuān)利4,816,567；Queen等(1989)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA8610029-10033；和ANTIBODYENGINEERINGAPRACTICALAPPROACH(OxfordUniversityPress1996)。術(shù)語(yǔ)“雜交”等用于多核苷酸時(shí)是指常規(guī)雜交條件，優(yōu)選例如在50％甲酰胺/6×SSC/0.1％SDS/100mg/mlssDNA中雜交，其中，雜交溫度高于37℃，同時(shí)用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌的溫度高于55℃。短語(yǔ)″分離的″或″生物純的″是指基本上或完全不含在天然狀態(tài)時(shí)通常所伴隨物質(zhì)的成分。因此，本發(fā)明所述的分離的肽優(yōu)選不含在天然環(huán)境中通常伴隨該肽的物質(zhì)。例如，一種多核苷酸當(dāng)與PSCA基因之外的基團(tuán)或編碼PSCA基因產(chǎn)物或其片段之外的多肽的基因相對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)的污染性多核苷酸基本分離時(shí)則稱(chēng)為是“分離的”。熟練的技術(shù)人員可方便地采用核酸分離方法來(lái)獲得分離的PSCA多核苷酸。例如，當(dāng)采用物理、機(jī)械或化學(xué)方法除去細(xì)胞成分中PSCA蛋白中通常伴隨的蛋白質(zhì)，則稱(chēng)為PSCA蛋白是“分離的”。熟練的技術(shù)人員可方便地采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法以獲得分離的PSCA蛋白?；蛘呖赏ㄟ^(guò)化學(xué)方法制備分離的蛋白質(zhì)。適宜的“標(biāo)記”包括放射性核素、酶、底物、輔助因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等。教述這些標(biāo)記的使用的專(zhuān)利包括美國(guó)專(zhuān)利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。此外，本文提供的抗體可用作熒光體的抗原結(jié)合成分。參見(jiàn)例如，Zeytun等，Nat.Biotechnol.211473-79(2003)。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指任何分類(lèi)為哺乳動(dòng)物的生物，包括小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬和人。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移性前列腺癌”和“轉(zhuǎn)移性疾病”指已經(jīng)擴(kuò)散到局部淋巴結(jié)或擴(kuò)散到遠(yuǎn)處部位的前列腺癌，包括AUA系統(tǒng)的第D期疾病和TNM系統(tǒng)的第TxNxM+期疾病。對(duì)于局部晚期前列腺癌病例，通常不對(duì)轉(zhuǎn)移性疾病患者進(jìn)行手術(shù)，而激素(雄激素消融)療法是優(yōu)選的治療方法。轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者最終會(huì)在治療開(kāi)始后的12-18個(gè)月內(nèi)發(fā)展成雄激素難治狀態(tài)。這些雄激素難治患者中幾乎有半數(shù)會(huì)在發(fā)展到這一階段后6個(gè)月內(nèi)死亡。前列腺癌轉(zhuǎn)移的最常見(jiàn)部位是骨。前列腺癌骨轉(zhuǎn)移通常是成骨性而不是溶骨性(即導(dǎo)致凈骨形成)。骨轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)在脊柱中，然后是股骨、骨盤(pán)，肋架，顱骨和肱骨。其它常見(jiàn)轉(zhuǎn)移部位包括淋巴結(jié)、肺、肝和腦。轉(zhuǎn)移性前列腺癌通常通過(guò)手術(shù)切開(kāi)或腹腔鏡盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)、全身放射性核素掃描、骨骼X線照相術(shù)和/或骨病灶活組織檢查來(lái)診斷。術(shù)語(yǔ)″調(diào)節(jié)劑″或″檢測(cè)化合物″或″藥物候選物″或語(yǔ)法上的等價(jià)表述在這里描述將被檢測(cè)以了解直接或間接改變癌的表型或癌序列(例如核酸或蛋白質(zhì)序列)的表達(dá)的能力，或癌序列的效應(yīng)(例如產(chǎn)生信號(hào)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用等)的任何分子，例如蛋白質(zhì)、寡肽、小有機(jī)分子、多糖、多核苷酸等。一方面，調(diào)節(jié)劑將中和本發(fā)明的癌蛋白的效應(yīng)?！逯泻汀迨侵傅鞍踪|(zhì)的活性以及隨后對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)被抑制或阻遏。在另一方面，調(diào)節(jié)劑使所述蛋白質(zhì)水平正常化可中和本發(fā)明的基因及其相應(yīng)蛋白質(zhì)的功效。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑改變表達(dá)特征，或這里提供的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，或改變下游效應(yīng)子途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)劑抑制癌癥表型，例如正常組織指紋。另一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)癌癥表型。通常用不同的試劑濃度平行進(jìn)行檢測(cè)多個(gè)混合物以獲得對(duì)不同濃度的差異應(yīng)答反應(yīng)。通常，將這些濃度之一即零濃度或低于檢測(cè)水平的濃度作為陰性對(duì)照。調(diào)節(jié)劑、候選藥物或檢測(cè)化合物包括多種類(lèi)別的化學(xué)試劑，但它們通常是有機(jī)分子，優(yōu)選分子量大于100小于約2,500道爾頓的小有機(jī)化合物。優(yōu)選的小分子小于2000，或小于1500，或小于1000，或小于500D。候選試劑包含在結(jié)構(gòu)上與蛋白質(zhì)相互作用必需的官能團(tuán)，具體說(shuō)是氫鍵，且通常包含至少一個(gè)胺基、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。所述候選試劑通常包含碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的芳香性結(jié)構(gòu)或芳香性聚合結(jié)構(gòu)。調(diào)節(jié)劑還包括以下生物分子，如肽類(lèi)、糖類(lèi)、脂肪酸、類(lèi)固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或其組合。特別優(yōu)選的是肽。一種類(lèi)別的調(diào)節(jié)劑是肽，例如含有約5-35個(gè)氨基酸，優(yōu)選含有約20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選含有約7-15個(gè)氨基酸的肽。優(yōu)選癌癥調(diào)節(jié)蛋白是可溶的，包括一個(gè)非跨膜區(qū)和/或一個(gè)N-末端Cys以助溶解。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段的C-末端被保留作為游離酸同時(shí)N-末端是游離的胺以助偶合，即與半胱氨酸偶合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的癌蛋白與這里所述的免疫原性劑綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌蛋白與BSA綴合。本發(fā)明的肽，例如優(yōu)選長(zhǎng)度的肽，可相互結(jié)合或與其它氨基酸結(jié)合以形成較長(zhǎng)的肽/蛋白質(zhì)。這種調(diào)節(jié)肽可被消化成天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(如上文所述)、隨機(jī)肽或“偏置(biased)”隨機(jī)肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于肽/蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑是這里定義的抗體及其片段。癌癥的調(diào)節(jié)劑也可以是核酸。核酸調(diào)節(jié)劑可以是天然產(chǎn)生的核酸、隨機(jī)核酸或″偏置″隨機(jī)核酸。例如，原核或真核基因組的消化產(chǎn)物可用于上述蛋白質(zhì)的相應(yīng)類(lèi)似物中。本文中術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指獲自一群基本上均質(zhì)性抗體的抗體，即包含一群相同的抗體但可能存在少量天然產(chǎn)生的突變體的抗體。單克隆抗體是高度特異性的，其直接針對(duì)單一抗原表位。相反，常規(guī)(多克隆)抗體制劑通常包括針對(duì)(或特異性針對(duì))不同表位的多種抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多克隆抗體多個(gè)單克隆抗體，它們具有對(duì)含有多個(gè)抗原表位的單個(gè)抗原具有不同表位特異性、親和力或親合力。修飾語(yǔ)″單克隆的″是指所述抗體的性狀是獲自基本上同源的抗體群，且不是解釋為需要通過(guò)任何特殊的方法來(lái)產(chǎn)生該抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可采用由Kohler等，Nature256495(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)來(lái)制備，或可通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利4,816,567)來(lái)制備。也可采用例如Clackson等，Nature352624-628(1991)和Marks等，.J.Mol.Biol.222581-597(1991)所描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離出″單克隆抗體″。這些單克隆抗體通常以至少約1μM的Kd結(jié)合，更通常至少約為300nM，通常至少約為30nM，優(yōu)選至少約為10nM，更優(yōu)選至少約為3nM或更佳，通常通過(guò)ELISA測(cè)定?！盎颉保鏟SCA相關(guān)蛋白的生物學(xué)基序中指組成蛋白質(zhì)一級(jí)序列一部分的任何氨基酸模式，該模式與某具體功能(例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-DNA相互作用等)或修飾(例如磷酸化、糖基化或酰胺化修飾)、或定位(例如分泌序列、核定位序列等)或與產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫性相關(guān)的序列有關(guān)?；蚩梢允桥B的或能夠排列成通常與某種功能或特性有關(guān)的某種位置。在HLA基序中，“基序″是指確定長(zhǎng)度的肽中殘基的模式，對(duì)I類(lèi)HLA基序而言通常是約8-13個(gè)氨基酸的肽，對(duì)II類(lèi)HLA基序而言通常是約6-25個(gè)氨基酸的肽，它可被特定的HLA分子識(shí)別。由各自的人HLA等位基因編碼的各個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)合HLA的肽基序通常不同，且主要(primary)和次要(secondary)錨定殘基的模式也不同。常見(jiàn)的基序列于表V中?！八幱觅x形劑”包括佐劑、載體、pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑等物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的”是指無(wú)毒的、惰性的和/或與人或其它哺乳動(dòng)物生理上相容的組合物。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”表示長(zhǎng)度至少為10個(gè)堿基或堿基對(duì)的核糖核苷酸或脫氧核苷或修飾形式的兩種核苷酸類(lèi)型的聚合形式，指包括DNA和/或RNA的單鏈和雙鏈形式。在本領(lǐng)域中，該術(shù)語(yǔ)通常與“寡核苷酸”互換使用。多核苷酸可包括這里揭示的核苷酸序列，如圖1所示，其中的胸腺嘧啶(T)也可以是尿嘧啶(U)；這種定義涉及DNA和RNA化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的區(qū)別，具體地說(shuō)，RNA中四個(gè)主要堿基之一是尿嘧啶(U)而不是胸腺嘧啶(T)。術(shù)語(yǔ)“多肽”表示至少約4、5、6、7或8個(gè)氨基酸的聚合物。在該說(shuō)明書(shū)中使用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)三字母或單字母符號(hào)。在本領(lǐng)域中，該術(shù)語(yǔ)通常與“肽”或“蛋白質(zhì)”互換使用。HLA“主要錨定殘基(primaryanchorresidue)”是沿肽序列特定位置上的一個(gè)氨基酸認(rèn)為其能夠提供免疫原性肽和HLA分子之間的接觸點(diǎn)。確定長(zhǎng)度的肽內(nèi)1-3個(gè)，通常是2個(gè)主要錨定殘基限定了免疫原性肽的一個(gè)“基序”。這些殘基被認(rèn)為適合與HLA分子的結(jié)合溝緊密接觸，同時(shí)將它們的側(cè)鏈插入結(jié)合溝的特定口袋中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，HLAI類(lèi)分子的主要錨定殘基位于位置2(從氨基末端位置算起)并位于本發(fā)明所述肽表位羧基末端第8、9、10、11或12殘基位置上?；蛘撸硪粚?shí)施方案中，結(jié)合HLAII類(lèi)分子的肽的主要錨定殘基相互間隔而不是在肽的末端，這里的肽的長(zhǎng)度通常至少有9個(gè)氨基酸。各個(gè)基序和超基序(supermotif)的主要錨位置列于表IV(a)。例如，可通過(guò)改變表IV所示主要和/或次要錨位置中的特定殘基的存在或缺失來(lái)產(chǎn)生類(lèi)似物肽。這種類(lèi)似物被用來(lái)調(diào)節(jié)包含特定HLA基序或超基序的肽的結(jié)合親和力和/或細(xì)胞群覆蓋(populationcoverage)范圍。“放射性同位素”包括但不限于以下這些(在表IV(I))中還列出了非限制性的示范用途)。″隨機(jī)″或語(yǔ)法等價(jià)表述在這里用于核酸和蛋白質(zhì)，表示每種核酸和肽分別都由基本上隨機(jī)(連接)的核苷酸和氨基酸構(gòu)成。這些隨機(jī)肽(或這里討論的核酸)可在任何位置摻入任何核苷酸或氨基酸?？稍O(shè)計(jì)合成方法來(lái)產(chǎn)生隨機(jī)蛋白質(zhì)或核酸，以在序列長(zhǎng)度上形成所有或大多數(shù)可能的組合，從而形成隨機(jī)的候選生物活性蛋白質(zhì)試劑文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫(kù)是“完全隨機(jī)化的”，在任何位置都沒(méi)有優(yōu)選序列或恒定的序列。另一實(shí)施方案中，文庫(kù)是“偏置隨機(jī)”文庫(kù)。即序列中的一些位置或保持恒定，要么選自數(shù)目有限的可能殘基。例如，核苷酸或氨基酸殘基可在規(guī)定的類(lèi)別(例如疏水性氨基酸、親水性殘基，空間偏置(小的或大的)殘基)中隨機(jī)選擇以形成核酸結(jié)合域，形成交聯(lián)用的半胱氨酸，SH-3結(jié)構(gòu)域用的脯氨酸，磷酸化位點(diǎn)等用的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或組氨酸，或者對(duì)于嘌呤等亦是如此?！爸亟M體”DNA或RNA分子是在體外制作的DNA或RNA分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)″單鏈Fv″或″scFv″或“單鏈”抗體是指包含抗體VH和VL區(qū)的抗體片段，其中這些區(qū)域是存在于一個(gè)多肽鏈中的。通常，F(xiàn)v多肽還包含VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，該接頭使得所述sFv可形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對(duì)于sFv而言，可參見(jiàn)Pluckthun，THEPHARMACOLOGYOFMONOCLONALANTIBODY，卷113，Rosenburg和Moore編Springer-Verlag，NewYork，第269-315頁(yè)(1994)?！靶》肿印钡姆窍拗菩岳影ㄅcPSCA結(jié)合或相互作用的化合物、配體(包括激素類(lèi)、神經(jīng)肽類(lèi)、趨化因子、添味劑、磷脂以及結(jié)合并優(yōu)選抑制PSCA蛋白功能的其功能等價(jià)物)。這種非限制性小分子的分子量宜小于約約10kDa，更優(yōu)選小于約9、約8、約7、約6、約5或約4kDa。在某些實(shí)施方案中，小分子能物理性與PSCA蛋白締合或結(jié)合PSCA蛋白；未在天然產(chǎn)生的代謝途徑中被發(fā)現(xiàn)；和/或相比非水性溶液更易溶于水溶液。本文所用的術(shù)語(yǔ)“特異性”是指抗體對(duì)靶抗原表位的選擇性結(jié)合?？稍诮o定的條件下，將抗體和適宜抗原的結(jié)合與抗體和無(wú)關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合相比，來(lái)測(cè)試抗體的結(jié)合特異性。如果所述抗體與適宜抗原的結(jié)合至少比其與無(wú)關(guān)抗原或抗原混合物結(jié)合高出2、5、7和更優(yōu)選10倍，則認(rèn)為其是特異性的。在一個(gè)實(shí)施方式中，特異性抗體是一種僅結(jié)合PSCA抗原而不結(jié)合無(wú)關(guān)抗原的抗體。在另一實(shí)施方式中，特異性抗體是一種結(jié)合人PSCA抗原但不與該P(yáng)SCA抗原具有結(jié)合70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多氨基酸同源性的非人PSCA抗原結(jié)合的抗體。在另一實(shí)施方式中，特異性抗體是一種結(jié)合人PSCA抗原和結(jié)合小鼠PSCA抗原、但與人抗原結(jié)合程度更高的抗體。在另一實(shí)施方式中，特異性抗體是一種結(jié)合人PSCA抗原和結(jié)合靈長(zhǎng)類(lèi)PSCA抗原、但與人抗原結(jié)合程度更高的抗體。在另一實(shí)施方式中，所述特異性抗體結(jié)合人PSCA抗原和任何非人PSCA抗原但與人抗原或其任何組合結(jié)合程度更高的抗體。雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格性”易由本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來(lái)確定，且通?？筛鶕?jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度憑借經(jīng)驗(yàn)來(lái)計(jì)算。通常，探針越長(zhǎng)，合適退火需要的溫度越高，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決于當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于解鏈溫度的環(huán)境下時(shí)變性的核酸序列重退火的能力。探針和可雜交序列之間所需同源性程度越高則可使用相對(duì)較高的溫度。其結(jié)果是，相對(duì)較高的溫度使反應(yīng)條件越嚴(yán)格，而溫度越低則反應(yīng)條件的嚴(yán)格度越低。雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)解釋可見(jiàn)Ausubel等，《分子生物學(xué)最新方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，WileyIntersciencePublishers，(1995)。本文定義的“嚴(yán)格條件”或“高嚴(yán)格條件”可通過(guò)以下特征來(lái)鑒定，但不限于此，它們是(1)洗滌時(shí)采用低離子強(qiáng)度和高溫，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，溫度為50℃；(2)雜交過(guò)程中使用甲酰胺等變性劑，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)和750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，溫度為42℃；或(3)使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×登哈特溶液、超聲處理的鮭精DNA(50mg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，溫度為42℃，42℃用0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)洗滌并在55℃用50％甲酰胺洗滌，然后用在55℃用含有EDTA的0.1×SSC以高嚴(yán)格性洗滌?！逯械葒?yán)格條件″描述在，但不限于，Sambrook等在《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(MolecularCloningALaboratoryManual，NewYorkColdSpringHarborPress，1989)中的描述，并且包括使用嚴(yán)格程度低于上述條件的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是在65℃在含有以下成分的溶液中培養(yǎng)一夜1％牛血清、0.5％磷酸鈉pH7.5、1.25mMEDTA和7％SDS5×SSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)，然后在約50℃用2×SSC/1％SDS和在50℃用0.2×SSC/0.1％SDS洗滌濾膜。熟練的技術(shù)人員將了解如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)探針長(zhǎng)度等因素。HLA“超基序”是由兩個(gè)或多個(gè)HLA等位基因編碼的HLA分子共享的肽結(jié)合特異性。不同種族人群中HLA-超型的所有表型頻率列于表IV(f)。各種超型(supertype)的非限制性組成如下A2A*0201，A*0202，A*0203，A*0204，A*0205，A*0206，A*6802，A*6901，A*0207A3A3，A11，A31，A*3301，A*6801，A*0301，A*1101，A*3101B7B7，B*3501-03，B*51，B*5301，B*5401，B*5501，B*5502，B*5601，B*6701，B*7801，B*0702，B*5101，B*5602B44B*3701，B*4402，B*4403，B*60(B*4001)，B61(B*4006)A1A*0102，A*2604，A*3601，A*4301，A*8001A24A*24，A*30，A*2403，A*2404，A*3002，A*3003B27B*1401-02，B*1503，B*1509，B*1510，B*1518，B*3801-02，B*3901，B*3902，B*3903-04，B*4801-02，B*7301，B*2701-08B58B*1516，B*1517，B*5701，B*5702，B58B62B*4601，B52，B*1501(B62)，B*1502(B75)，B*1513(B77)不同HLA-超型組合計(jì)算出的人群覆蓋率列于表IV(g)中?！爸委煛被颉爸委煹摹币约罢Z(yǔ)法上相關(guān)的術(shù)語(yǔ)在本文中是指對(duì)任何疾病后果的任何改善，如存活時(shí)間延長(zhǎng)、發(fā)病率降低和/或副作用減輕，這些是更換治療模式的副產(chǎn)品；在本領(lǐng)域中很容易理解，雖然不要求完全根治疾病，但能完全根除疾病則是優(yōu)選的結(jié)果?！稗D(zhuǎn)基因動(dòng)物”(例如小鼠或大鼠)是具有含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因被引入動(dòng)物或在出生前(例如胚胎階段)被引入動(dòng)物的祖先?！稗D(zhuǎn)基因”是被整合入細(xì)胞的基因組內(nèi)的DNA，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。HLA或細(xì)胞免疫應(yīng)答“疫苗”在這里表示含有或編碼一種或多種本發(fā)明的肽的組合物。有許多此類(lèi)疫苗的實(shí)例，如一種或多種肽的混合物；多表位(polyepitopic)肽所含的一種或多種本發(fā)明的肽；或編碼這種單獨(dú)的肽或多肽的核酸，例如編碼多表位肽的小基因?！耙环N或多種肽”可包含1-150或更多中的任何整數(shù)，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150或更多本發(fā)明的肽。所述肽或多肽可任選被修飾，如通過(guò)脂化、加入靶序列或其它序列。本發(fā)明的HLAI類(lèi)肽可與HLAII類(lèi)肽混合或連接以易于活化細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞的活化。HLA疫苗可包含肽-脈沖的抗原呈遞細(xì)胞，例如樹(shù)突細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“變體”是指顯示不同于所述類(lèi)型或正常類(lèi)型的變化的分子，如在明確描述的蛋白質(zhì)(如圖1所示的PSCA蛋白)的相應(yīng)位置上含有一個(gè)或多個(gè)不同氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。變體蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是類(lèi)似物。剪接同種型和單核苷酸多態(tài)性(SNP)是變體的其它例子。本發(fā)明的“PSCA相關(guān)蛋白”包括這里特別描述的那些，以及等位變體、保守取代變體、類(lèi)似物和同系物，它們可按照這里列出的方法或本領(lǐng)域容易獲得的方法無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)便可分離/產(chǎn)生并作特征性鑒定。也包括將不同PSCA蛋白或其片段的部分組合產(chǎn)生的融合蛋白以及PSCA蛋白和異源多肽形成的融合蛋白。這種PSCA蛋白統(tǒng)稱(chēng)為PSCA相關(guān)蛋白、本發(fā)明的蛋白質(zhì)或PSCA。術(shù)語(yǔ)“PSCA相關(guān)蛋白”是指有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或25個(gè)以上氨基酸；或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、330、335、339或更多氨基酸的多肽片段或PSCA蛋白質(zhì)序列。II.)PSCA多核苷酸本發(fā)明的一個(gè)方面提供了與所有或部分PSCA基因、mRNA和/或編碼序列相對(duì)應(yīng)或互補(bǔ)的多核苷酸，優(yōu)選以分離形式，包括編碼PSCA相關(guān)蛋白及其片段的多核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及有關(guān)分子、與PSCA基因或mRNA序列或其部分相互補(bǔ)的多核苷酸或寡核苷酸、以及與PSCA基因、mRNA或與編碼PSCA的多核苷酸(統(tǒng)稱(chēng)為“PSCA多核苷酸”)雜交的多核苷酸或寡核苷酸。在章節(jié)提及的所有情況下，圖1中T也可以是U。PSCA多核苷酸的實(shí)例包括具有圖1所示序列的PSCA多核苷酸，圖1所示的PSCA的核苷酸序列，其中將T換成U；具有圖1所示序列的多核苷酸的至少10個(gè)毗連核苷酸；或具有圖1所示序列但將T換成U的多核苷酸的至少10個(gè)毗連核苷酸。編碼PSCA蛋白相對(duì)長(zhǎng)部分的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可通過(guò)多種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生編碼圖1所示或圖3所示PSCA蛋白或“變體”的約氨基酸1(或20或30或40等)到約氨基酸20(約30或40或50等)的多核苷酸。這些多核苷酸片段可包括圖1中所示PSCA序列中的任何部分。II.A.)PSCA多核苷酸的用途II.A.1.遺傳異常的監(jiān)測(cè)上面所述的多核苷酸有多種不同用途。人PSCA基因的染色體定位圖列于題為“PSCA的染色體繪圖”的實(shí)施例中。例如，由于這種染色體的PSCA基因圖，編碼PSCA蛋白不同區(qū)域的多核苷酸被用來(lái)確定該染色體部位的細(xì)胞遺傳異常，例如鑒定為與各種癌癥有關(guān)的異常。在某些基因中，包括重排在內(nèi)的多種染色體異常已經(jīng)被鑒定為許多不同癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)的細(xì)胞遺傳異常(見(jiàn)例如Krajinovic等，Mutat.Res.382(3-4)81-83(1998)；Johansson等，Blood86(10)3905-3914(1995)和Finger等，P.N.A.S.85(23)9158-9162(1988))。因此，編碼PSCA蛋白特定區(qū)域的多核苷酸最可能是用來(lái)描繪編碼可能會(huì)造成惡性表型的PSCA的染色體區(qū)域中的細(xì)胞遺傳異常的比原先可能更精確的新工具。文中，這些多核苷酸滿足了本領(lǐng)域?qū)μ岣呷旧w篩選的靈敏度以鑒定出更加精細(xì)和更不常見(jiàn)的染色體異常的需求(見(jiàn)例如Evans等，Am.J.Obstet.Gynecol171(4)1055-1057(1994))。此外，已證明PSCA在前列腺和其它癌中高表達(dá)，PSCA多核苷酸被用于評(píng)定正常組織和癌組織中PSCA基因產(chǎn)物狀況的方法。通常，編碼PSCA蛋白特定區(qū)域的多核苷酸被用來(lái)評(píng)定PSCA基因特定區(qū)域(如含有一個(gè)或多個(gè)基序的區(qū)域)是否存在紊亂(如缺失、插入、點(diǎn)突變或?qū)е驴乖詥适У淖兓?。示范性的檢測(cè)法包括RT-PCR測(cè)定和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(見(jiàn)例如Marrogi等，J.Cutan.Pathol.26(8)369-378(1999)，它們都利用編碼蛋白質(zhì)特定區(qū)域的多核苷酸來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)的這些區(qū)域。II.A.2.反義實(shí)施方式與這里所述本發(fā)明的實(shí)施方案有關(guān)的其它具體的核酸是基因組DNA、cDNA、核酶和反義分子，以及基于可替換主鏈或包含可替換堿基的核酸分子，它們可以來(lái)自天然來(lái)源或者是合成的，并且包括能夠抑制RNA或PSCA蛋白質(zhì)表達(dá)的分子。例如，反義分子可以是RNA或其它分子，包括肽核酸(PNA)或非核酸分子，如以堿基對(duì)依賴(lài)方式特異性結(jié)合DNA或RNA的硫代磷酸酯衍生物。熟練的技術(shù)人員可用這里所述的PSCA多核苷酸和多核苷酸序列容易獲得這些類(lèi)型的核酸分子。反義技術(shù)需要使用結(jié)合細(xì)胞內(nèi)靶多核苷酸的外源寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)″反義″是指這種寡核苷酸與它們的胞內(nèi)靶(例如PSCA)互補(bǔ)。見(jiàn)例如JackCohen，Oligodeoxynucleotides，AntisenseInhibitorsofGeneExpression，CRCPress，1989；和Synthesis11-5(1988)。本發(fā)明的PSCA反義寡核苷酸包括衍生物，如S-寡核苷酸(硫代磷酸酯衍生物或S-oligo，見(jiàn)JackCohen，同上)，這種物質(zhì)具有增強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。S-oligo(核苷硫代磷酸酯)是寡核苷酸(O-oligo)的等電子類(lèi)似物，其中磷酸基的非橋接氧原子被硫原子替代。本發(fā)明的S-oligo可用硫原子轉(zhuǎn)移劑3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物處理相應(yīng)的O-oligo來(lái)制備。見(jiàn)例如Iyer，R.P.等，J.Org.Chem.554693-4698(1990)；和Iyer，R.P.等，J.Am.Chem.Soc.1121253-1254(1990)。本發(fā)明的其它PSCA反義寡核苷酸包括本領(lǐng)域已知的嗎啉代反義寡核苷酸(見(jiàn)例如Partridge等，1996，Antisense&NucleidAcidDrugDevelopment6169-175)。本發(fā)明的PSCA反義寡核苷酸通?？梢允桥cPSCA基因組序列的前100個(gè)5’密碼子和后100個(gè)3’密碼子或相應(yīng)的mRNA互補(bǔ)或穩(wěn)定雜交的RNA或DNA。盡管互補(bǔ)性程度高是優(yōu)選的，但不要求完全互補(bǔ)。使用與該區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸能夠與PSCAmRNA選擇性雜交而不與蛋白激酶其它調(diào)節(jié)亞基的mRNA雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PSCA反義寡核苷酸是含有與PSCAmRNA雜交的序列的反義DNA分子的15至30個(gè)殘基的片段。任選地，PSCA反義寡核苷酸是與PSCA前10個(gè)5’密碼子或后10個(gè)3’密碼子互補(bǔ)的30-個(gè)殘基的寡核苷酸?；蛘撸龇戳x分子被修飾以便用核酶來(lái)抑制PSCA表達(dá)，見(jiàn)例如L.A.Couture&D.T.Stinchcomb；TrendsGenet12510-515(1996)。II.A.3.引物和引物對(duì)本發(fā)明這些核苷酸的其它具體實(shí)施方案包括能夠特異性擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸或其任何特定部分的引物和引物對(duì)，以及與本發(fā)明的核酸分子或其任何部分選擇性或特異性雜交的探針。探針可用可檢測(cè)標(biāo)記標(biāo)識(shí)，如放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶標(biāo)記。這種探針和引物被用來(lái)檢測(cè)樣品中是否存在PSCA多核苷酸并被作為檢測(cè)表達(dá)PSCA蛋白的細(xì)胞的工具。這種探針的例子包括含有全部或部分圖1所示人PSCAcDNA序列的多肽。能夠特異性擴(kuò)增PSCAmRNA的引物對(duì)的例子也在實(shí)施例中描述。熟練的技術(shù)人員將了解，可基于這里提供的序列來(lái)制備大量不同的引物和探針并將它們用來(lái)有效擴(kuò)增和/或檢測(cè)PSCAmRNA。本發(fā)明的PSCA多核苷酸可用于許多目的，其中包括但不限于將它們用作擴(kuò)增和/或檢測(cè)PSCA基因、mRNA或其片段的探針和引物；作為診斷和/或預(yù)測(cè)前列腺癌以及其它癌癥的試劑；作為能夠引導(dǎo)PSCA多肽表達(dá)的編碼序列；作為調(diào)節(jié)或抑制PSCA基因表達(dá)和/或PSCA轉(zhuǎn)錄物翻譯的工具；以及作為治療劑。本發(fā)明包括使用這里所述的任何探針鑒定并分離來(lái)自天然來(lái)源(如人或其它哺乳動(dòng)物)的PSCA或PSCA相關(guān)核酸序列，以及分離的核酸序列本身，所述序列可包含在所用探針中發(fā)現(xiàn)的全部或大多數(shù)序列。II.A.4.PSCA-編碼的核酸分子的分離這里所述的PSCAcDNA序列能夠分離編碼PSCA基因產(chǎn)物的其它多核苷酸，以及分離編碼PSCA基因產(chǎn)物同系物、交替剪切同種型、等位變體和PSCA基因產(chǎn)物突變形式的多核苷酸，以及編碼PSCA相關(guān)蛋白類(lèi)似物的多核苷酸。已經(jīng)熟知各種用來(lái)分離編碼PSCA基因的全長(zhǎng)cDNA的分子克隆方法(見(jiàn)例如Sambrook，J.等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第二版)，ColdSpringHarborPress，NewYork，1989；Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，WileyandSons，1995)。例如，可用市售的克隆系統(tǒng)(例如LambdaZAPExpress，Stratagene)方便地進(jìn)行λ噬菌體克隆法?？捎脴?biāo)記的PSCAcDNA或其片段作為探針來(lái)鑒定含有PSCA基因cDNA的噬菌體克隆。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可合成PSCAcDNA(例如圖1)或其部分并將其用作探針來(lái)檢索與PSCA基因相對(duì)應(yīng)的重疊和全長(zhǎng)cDNA?？赏ㄟ^(guò)用PSCADNA探針或引物篩選基因組DNA文庫(kù)、細(xì)菌人造染色體文庫(kù)(BAC)、酵母人造染色體文庫(kù)(YAC)等來(lái)分離PSCA基因本身。II.A.5.重組核酸分子和宿主-載體系統(tǒng)本發(fā)明還提供了含有PSCA多核苷酸、其片段、類(lèi)似物或同系物的重組DNA或RNA分子，包括但不限于噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、YAC、BAC、以及本領(lǐng)域熟知的各種病毒和非病毒載體，以及被這種重組DNA或RNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。產(chǎn)生這種分子的方法可熟知的(見(jiàn)例如Sambrook等，1989，同上)。本發(fā)明還提供的宿主-載體系統(tǒng)含有能在合適的原核或真核宿主細(xì)胞內(nèi)(表達(dá))的含有PSCA多核苷酸、其片段、類(lèi)似物或同系物的重組DNA。合適的真核宿主細(xì)胞的例子包括酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞護(hù)動(dòng)物細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如可被桿狀病毒感染的細(xì)胞，如Sf9或HighFive細(xì)胞)。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包括各種前列腺癌細(xì)胞系，如DU145和TsuPr1，其它可轉(zhuǎn)染或可轉(zhuǎn)導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞系，原代細(xì)胞(PrEC)，以及許多通常用來(lái)表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS、CHO、293、293T細(xì)胞)。更具體地說(shuō)，可用任何一種本領(lǐng)域通常使用并被廣泛了解的宿主-載體系統(tǒng)，利用含有PSCA編碼序列或其片段、類(lèi)似物或同系物的多核苷酸來(lái)產(chǎn)生PSCA蛋白殘基片段?？色@得許多適合表達(dá)PSCA蛋白或其片段的宿主-載體系統(tǒng)，見(jiàn)例如Sambrook等，1989，同上；《分子生物學(xué)最新方法》，1995，同上)。用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的優(yōu)選的載體包括但不限于pcDNA3.1myc-His-tag(Invitrogen)和反轉(zhuǎn)錄病毒載體pSRtkneo(Muller等，1991，MCB111785)。使用這些表達(dá)載體，能夠在一些前列腺癌和非前列腺細(xì)胞系中表達(dá)PSCA，其中包括例如293、293T、rat-1、NIH3T3和TsuPr1細(xì)胞。本發(fā)明的宿主-載體系統(tǒng)可用來(lái)制造PSCA蛋白或其片段。這種宿主-載體系統(tǒng)可被用來(lái)研究PSCA和PSCA突變體或類(lèi)似物的功能特性。重組人PSCA蛋白或其類(lèi)似物或同系物或片段可用被編碼PSCA-相關(guān)核苷酸的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)制造。例如，293T細(xì)胞可被編碼PSCA或其片段、類(lèi)似物或同系物的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，從而PSCA相關(guān)蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá)，并可用標(biāo)準(zhǔn)純化方法(例如用抗-PSCA抗體親和純化)來(lái)分離重組PSCA蛋白。另一實(shí)施方案中，PSCA編碼序列白亞克隆入反轉(zhuǎn)錄病毒載體pSRMSVtkneo并用來(lái)感染各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如NIH3T3、TsuPr1、293和rat-1，以建立PSCA表達(dá)細(xì)胞系。也可用本領(lǐng)域熟知的各種其它表達(dá)系統(tǒng)。編碼連接到PSCA編碼序列讀框的前導(dǎo)肽的表達(dá)構(gòu)建物可用來(lái)產(chǎn)生分泌形式的重組PSCA蛋白。如這里所論述的，遺傳密碼的冗余性允許PSCA基因序列中存在變化。具體地說(shuō)，本領(lǐng)域已知特定種類(lèi)的宿主通常具有特定密碼子的偏愛(ài)，因此可以采納已知的所需宿主偏愛(ài)的序列。例如，優(yōu)選的類(lèi)似物密碼子序列通常用高頻密碼子代替罕用密碼子(即在所需宿主的已知序列中使用頻率不到20％的密碼子)。例如可利用在因特網(wǎng)上獲得的密碼子使用表(URL為dna.affrc.go.jp/~nakamura/cocon.html)可計(jì)算出特定種類(lèi)優(yōu)選的密碼子，。已知其它的序列修飾可增強(qiáng)細(xì)胞宿主內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)。這些修飾包括刪除編碼假聚腺苷化信號(hào)、外顯子/內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)的序列，和/或其它此類(lèi)充分了解的對(duì)基因表達(dá)有害的序列。序列的GC含量可被調(diào)節(jié)至給定細(xì)胞宿主的平均水平，該水平可參考在細(xì)胞宿主內(nèi)表達(dá)的已知基因來(lái)計(jì)算?？赡艿脑?，可對(duì)序列進(jìn)行修飾以避免預(yù)測(cè)的mRNA發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)。其它有用的修飾包括在開(kāi)放讀框開(kāi)始處加入翻譯啟動(dòng)共有序列，如Kozak所述，Mol.CellBiol.，95073-5080(1989)。熟練的技術(shù)人員知道以下一般原則，即真核核糖體無(wú)一例外地從最接近5’端的AUG密碼子開(kāi)始翻譯，該原則只在極少情況下失效(見(jiàn)例如KozakPNAS92(7)2662-2666，(1995)，和口KozakNAR15(20)8125-8148(1987))。III.)PSCA相關(guān)蛋白本發(fā)明的其它方面提供了PSCA相關(guān)蛋白。PSCA蛋白的具體實(shí)施方案包括具有圖1，優(yōu)選圖1A所示人PSCA全部或部分氨基酸序列的多肽。或者，PSCA蛋白的實(shí)施方式包括在圖1所示的PSCA氨基酸序列中有改變的變體、同系物或類(lèi)似物多肽。PSCA多核苷酸的實(shí)施方式包括具有圖1所示序列的PSCA多肽，圖1所示的PSCA的肽序列，其中將T換成U；具有圖1所示序列的多肽的至少10個(gè)毗連核苷酸；或具有圖1所示序列但將T換成U的多肽的至少10個(gè)毗連核苷酸。表II提供了氨基酸縮寫(xiě)。通?？稍诘鞍踪|(zhì)內(nèi)進(jìn)行保守性氨基酸取代而不改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象或功能。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)保守性取代。本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案包括大量本領(lǐng)域可接受的PSCA蛋白的變體或類(lèi)似物，如帶有氨基酸插入、缺失和取代的多肽。PSCA變體可用本領(lǐng)域已知的方法，例如定點(diǎn)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變來(lái)制造。定點(diǎn)誘變(Carter等，Nucl.AcidsRes.，134331(1986)；Zoller等，Nucl.AcidsRes.，106487(1987))、盒式誘變(Wells等，Gene，34315(1985))、限制選擇誘變(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA，317415(1986))或其它已知技術(shù)可在克隆的DNA上進(jìn)行來(lái)產(chǎn)生PSCA變體DNA。掃描氨基酸分析也可用來(lái)鑒定毗連序列上與特定生物活性如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸是相對(duì)較小的中性氨基酸。這種氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是該組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因?yàn)樗摩绿荚由蠜](méi)有側(cè)鏈并且不太可能改變變體的主鏈構(gòu)象。丙氨酸通常也是優(yōu)選的，因?yàn)樗亲畛Ｒ?jiàn)的氨基酸。此外，它通常發(fā)現(xiàn)于被埋沒(méi)及被暴露的位置(Creighton，Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976))。如果丙氨酸取代未產(chǎn)生適量的變體，則可使用等構(gòu)氨基酸。如本文的定義，PSCA變體、類(lèi)似物或同系物的至少一個(gè)可鑒別的屬性是具有一個(gè)表位能與含有圖1氨基酸序列的PSCA蛋白起“交叉反應(yīng)”。在該句中，“交叉反應(yīng)”是指特異性結(jié)合PSCA變體的抗體或T細(xì)胞也特異性結(jié)合具有圖1所示氨基酸序列的PSCA蛋白。當(dāng)一多肽不再含有任何能夠被特異性結(jié)合起始PSCA蛋白的抗體或T細(xì)胞識(shí)別的表位時(shí)，該多肽不再是圖1所示蛋白質(zhì)的變體。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，識(shí)別蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合不同大小的表位，從集的約4或5個(gè)毗連或不毗連的氨基酸認(rèn)為是最小表位中典型的氨基酸數(shù)目。見(jiàn)例如Nair等，J.Immunol2000165(12)6949-6955；Hebbes等，MolImmunol(1989)26(9)865-73；Schwartz等，JImmunol(1985)135(4)2598-608。其它類(lèi)型的PSCA相關(guān)蛋白變體與圖1的氨基酸序列或其片段具有70％、75％、80％、85％或90％或更高的類(lèi)似性。其它特定類(lèi)型的PSCA蛋白變體或類(lèi)似物包含一種或多種這里所述的或本領(lǐng)域目前已知的PSCA生物基序。因此，本發(fā)明包括相比起始片段功能(例如免疫原性)特性已經(jīng)改變的PSCA片段的類(lèi)似物(核酸或氨基酸)。還知道這種基序或本領(lǐng)域已知的基序?qū)⒈挥糜趫D1的核酸或氨基酸序列。如這里所論述的，本發(fā)明的實(shí)施方案包括含有小于圖1所示PSCA蛋白全長(zhǎng)氨基酸序列的多肽。例如，本發(fā)明的典型實(shí)例包括含有圖1所示PSCA蛋白任何4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)或更多毗連氨基酸的肽/蛋白質(zhì)。PSCA相關(guān)蛋白是用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)或用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)剪接法產(chǎn)生的?；蛘呖捎弥亟M方法來(lái)產(chǎn)生編碼PSCA相關(guān)蛋白的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用核酸分子來(lái)產(chǎn)生PSCA蛋白的規(guī)定片段(或其變體、同系物或類(lèi)似物)。III.A.)帶有基序的蛋白質(zhì)的實(shí)施方式本文所揭示的本發(fā)明的其它示范性實(shí)施方案包括含有圖1所示PSCA多肽序列中所含的一個(gè)或多個(gè)生物基序的氨基酸殘基的PSCA多肽。本領(lǐng)域已知各種基序，并且可通過(guò)許多可公開(kāi)獲得的因特網(wǎng)站點(diǎn)(例如有以下URLpfam.wustl.edu/；searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html；psort.ims.u-tokyo.ac.jp/；cbs.dtu.dk/；ebi.ac.uk/interpro/scan.html；expasy.ch/tools/scnpsitl.html；EpimatrixTM和EpimerTM，BrownUniversity，brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html；以及BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/.)來(lái)評(píng)估這種基序的存在情況。在表V-XVIII和XXII-LI中列出并鑒定了帶有所有PSCA變體蛋白質(zhì)帶有基序的子序列。表IV(h)列出了基于pfam檢索(見(jiàn)URLpfam.wustl.edu/)的一些常見(jiàn)的基序。表IV(h)的欄(1)列出了(1)基序名稱(chēng)的縮寫(xiě)，(2)該基序家族不同成員之間的相同性百分比，(3)基序名稱(chēng)或描述，以及(4)最常見(jiàn)的功能；如果該基序與定位有關(guān)則還包括位置信息。鑒于上述PSCA基序與生長(zhǎng)失調(diào)有關(guān)并且由于PSCA在某些癌癥(見(jiàn)例如表I)中過(guò)度表達(dá)，含有上述一個(gè)或多個(gè)PSCA基序的多肽對(duì)于闡明惡性表型的具體特征是有用的。例如，已知酪蛋白激酶II、cAMP和依賴(lài)于camp的蛋白激酶以及蛋白激酶C是與惡性表型的發(fā)展有關(guān)的酶(見(jiàn)例如Chen等，LabInvest.，78(2)165-174(1998)；Gaiddon等，Endocrinology136(10)4331-4338(1995)；Hall等，NucleicAcidsResearch24(6)1119-1126(1996)；Peterziel等，Oncogene18(46)6322-6329(1999)和O’Brian，Oncol.Rep.5(2)305-309(1998))。此外，糖基化和肉豆蔻酰化也是與癌癥和癌發(fā)展有關(guān)的蛋白質(zhì)修飾(見(jiàn)例如Dennis等，Biochem.Biophys.Acta1473(1)21-34(1999)；Raju等，Exp.CellRes.235(1)145-154(1997))。酰胺化是另一種也與癌癥和癌發(fā)展有關(guān)的蛋白質(zhì)修飾(見(jiàn)例如Treston等，J.Natl.CancerInst.Monogr.(13)169-175(1992))。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)用本領(lǐng)域可接受的方法鑒定出的免疫反應(yīng)性表位(如表V-XVIII和XXII-LI中列出的方法)?？捎锰囟ǖ乃惴ㄨb定出PSCA蛋白內(nèi)能夠最佳結(jié)合特定HLA等位基因的肽來(lái)確定CTL表位(例如表IV；EpimatrixTM和EpimerTM，BrownUniversity，URLbrown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html；以及BIMAS，URLbimas.dcrt.nih.gov/)。此外，鑒定與HLA分子有足夠的結(jié)合親和力且與成為免疫原性表位有關(guān)的肽的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)便可進(jìn)行。此外，鑒定成為免疫原性表位的肽的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)便可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。本領(lǐng)域還知道產(chǎn)生這種表位的類(lèi)似物以調(diào)節(jié)免疫原性的原理。例如，我們可以從帶有CTL或HTL基序(見(jiàn)例如表IV的HLAI類(lèi)和HLAII類(lèi)基序/超基序)的表位開(kāi)始。通過(guò)取代一個(gè)指定位置的氨基酸并用為該位置指定的另一個(gè)氨基酸代替它可以產(chǎn)生類(lèi)似的表位。例如，基于表IV定義的堿基，我們可以用任何其它殘基，例如優(yōu)選的殘基，取代出有害的殘基；用優(yōu)選的殘基取代不太優(yōu)選的殘基；或用另一個(gè)優(yōu)選的殘基取代最初產(chǎn)生的優(yōu)選的殘基。取代可發(fā)生在某肽的主要錨定位置或肽內(nèi)的其它位置；見(jiàn)例如表IV。許多參考資料都反映了鑒定并產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)及其類(lèi)似物中的表位的技術(shù)。見(jiàn)例如Chesnut等的WO97/33602；Sette，Immunogenetics199950(3-4)201-212；Sette等，J.Immunol.2001166(2)1389-1397；Sidney等，Hum.Immunol.199758(1)12-20；Kondo等，Immunogenetics199745(4)249-258；Sidney等，J.Immunol.1996157(8)3480-90；和Falk等，Nature351290-6(1991)；Hunt等，Science2551261-3(1992)；Parker等，J.Immunol.1493580-7(1992)；Parker等，J.Immunol.152163-75(1994))；Kast等，1994152(8)3904-12；Borras-Cuesta等，Hum.Immunol.200061(3)266-278；Alexander等，J.Immunol.2000164(3)；164(3)1625-1633；Alexander等，PMID7895164，UI95202582；O’Sullivan等，J.Immunol.1991147(8)2663-2669；Alexander等，Immunity19941(9)751-761，以及Alexander等，Immunol.Res.199818(2)79-92。本發(fā)明的有關(guān)實(shí)施方案包括含有表IV(a)、IV(b)、IV(c)、IV(d)和IV(h)列出的不同基序，和/或一個(gè)或多個(gè)表V-XVIII和XXII-LI的預(yù)測(cè)的CTL表位，和/或一個(gè)或多個(gè)表XLVIII-LI的預(yù)測(cè)的HTL表位，和/或一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域已知的T細(xì)胞結(jié)合基序的組合的肽。優(yōu)選的實(shí)施方案在基序或多肽的間插序列中不含插入、缺失或取代。此外，也可以考慮在這些基序的任一側(cè)上有多個(gè)N-末端和/或C-末端氨基酸殘基的實(shí)例(例如，包括含有基序的多肽結(jié)構(gòu)的較大部分)。通常，基序任一側(cè)上N-末端和/或C-末端氨基酸殘基的數(shù)目為約1-100個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選5-50個(gè)氨基酸殘基。PSCA相關(guān)蛋白的實(shí)例可以有許多形式，優(yōu)選分離形式。純化的PSCA蛋白分子將基本上不含會(huì)削弱PSCA與抗體、T細(xì)胞或其它配體結(jié)合的其它蛋白質(zhì)或分子。分離和純化的類(lèi)型和程度將取決于所需用途。PSCA相關(guān)蛋白的實(shí)例包括純化的PSCA相關(guān)蛋白和功能化的可溶性PSCA相關(guān)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能化的可溶性PSCA蛋白或其片段保留被抗體、T細(xì)胞或其它配體結(jié)合的能力。本發(fā)明還提供了含有圖1所示PSCA氨基酸序列的生物活性片段的PSCA蛋白。這種蛋白質(zhì)具有原始PSCA蛋白的特性，例如能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生能特異性結(jié)合原始PSCA蛋白相關(guān)表位的抗體產(chǎn)生；能夠被這種抗體結(jié)合；能夠誘導(dǎo)HTL或CTL的活化；和/或能夠被同樣特異性結(jié)合原始蛋白質(zhì)的HTL或CTL識(shí)別。含有特別感興趣結(jié)構(gòu)的PSCA相關(guān)多肽可用本領(lǐng)域熟知的各種分析技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)和/或鑒定，這些技術(shù)包括，例如，Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf的分析方法，或基于免疫原性的方法。含有這種結(jié)構(gòu)的片段對(duì)于產(chǎn)生亞單位特異性抗-PSCA抗體或T細(xì)胞，或鑒定結(jié)合PSCA的細(xì)胞因子特別有用。例如，可用Hopp，T.P.和Woods，K.R.的方法(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783824-3828)生成親水性圖譜并鑒定免疫原性肽片段?？捎肒yte，J.和Doolittle，R.F.的方法(1982，J.Mol.Biol.157105-132)生成親水性圖譜并鑒定免疫原性肽片段。可用JaninJ.的方法(1979，Nature277491-492)生成可接觸殘基百分比(％)圖譜并鑒定免疫原性肽片段。用BhaskaranR.，PonnuswamyP.K.的方法(1988，Int.J.Pept.ProteinRes.32242-255)生成平均屈曲性圖譜并鑒定免疫原性肽片段?？捎肈eleage，G.，RouxB.的方法(1987，ProteinEngineering1289-294)生成β-轉(zhuǎn)角圖譜并鑒定免疫原性肽片段?？捎锰囟ㄋ惴ù_定CTL表位從而鑒定PSCA蛋白內(nèi)能夠最佳結(jié)合特定HLS等位基因的肽(例如，通過(guò)使用SYFPEITHI站點(diǎn)，其萬(wàn)維網(wǎng)URL地址為syfpeithi.bmi-heidelberg.com/；表IV(A)-(E)的列出的算法；EpimatrixTM和EpimerTM，BrownUniversity，URL(brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；以及BIMAS，URLbimas.dcrt.nih.gov/)。用上述算法可預(yù)測(cè)在本文人MHCI類(lèi)分子部分所述的來(lái)自PSCA的肽表位，例如HLA-A1、A2、A3、A11、A24、B7和B35(見(jiàn)例如表V-XVIII、XXII-LI)。具體地說(shuō)，PSCA蛋白的整個(gè)氨基酸序列以及其它變體的有關(guān)部分，即與該變體相對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)的HLAI類(lèi)點(diǎn)突變或外顯子兩側(cè)任一側(cè)上的9個(gè)側(cè)接殘基，和預(yù)測(cè)的HLAII類(lèi)點(diǎn)突變或外顯子兩側(cè)任一側(cè)上的14個(gè)側(cè)接殘基，被用于HLA肽基序檢索算法，該算法可在上述BioinformaticsandMolecularAnalysisSection(BIMAS)網(wǎng)址中找到；此外還有SYFPEITHI站點(diǎn)，其URL為syfpeithi.bmi-heidelberg.com/。HLA肽基序檢索算法是由KenParker博士根據(jù)HLAI類(lèi)分子，尤其是HLA-A2溝槽中的特定肽序列的結(jié)合建立的(見(jiàn)例如Falk等，Nature351290-6(1991)；Hunt等，Science2551261-3(1992)；Parker等，J.Immunol.1493580-7(1992)；Parker等，J.Immunol.152163-75(1994))。該算法能夠?qū)?lái)自完整蛋白質(zhì)序列的8-肽、9-肽和10-肽進(jìn)行定位和分級(jí)以便預(yù)測(cè)性地結(jié)合HLA-A2和許多其它HLAI類(lèi)分子(的能力)。許多HLAI類(lèi)結(jié)合肽是8-、9-、10或11-肽。例如，對(duì)I類(lèi)HLA-A2而言，該表位優(yōu)選在2位含有亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)并在C-末端含有纈氨酸(V)或亮氨酸(L)(見(jiàn)例如Parker等，J.Immunol.1493580-7(1992))。選出的PSCA預(yù)測(cè)的結(jié)合肽結(jié)果示于這里的表V-XVIII和XXII-LI。在表V-XVIII和XXII-XLVIII中顯示了選出的每個(gè)家族成員的候選(9-肽和10-肽)以及它們的位置、每個(gè)特定肽的氨基酸序列和估算的結(jié)合力評(píng)分。在表XLVIII-LI中顯示了選出的每個(gè)家族成員的候選15肽以及它們的位置，各具體肽的氨基酸序列和估算的結(jié)合力評(píng)分。結(jié)合力評(píng)分對(duì)應(yīng)于含肽復(fù)合體在37℃pH6.5的條件下解離的預(yù)計(jì)半衰期。預(yù)計(jì)具有最高結(jié)合評(píng)分的肽細(xì)胞表面的HLAI類(lèi)分子結(jié)合最緊密而半衰期最長(zhǎng)，因此給T細(xì)胞識(shí)別提供了最佳的免疫原性靶標(biāo)。肽與HLA等位基因的實(shí)際結(jié)合可通過(guò)抗原加工缺陷細(xì)胞系T2上HLA表達(dá)的穩(wěn)定情況來(lái)評(píng)估(見(jiàn)例如Xue等，Prostate3073-8(1997)和Peshwa等，Prostate36129-38(1998))。具體肽的免疫原性可通過(guò)體外在抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞)存在時(shí)CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的激活來(lái)評(píng)估。宜將每個(gè)通過(guò)BIMAS站點(diǎn)、EpimerTM和EpimatrixTM站點(diǎn)預(yù)測(cè)的表位，或由HLAI類(lèi)或II類(lèi)基序指定的表位將被“用于”本發(fā)明所述的PSCA蛋白，所述HLAI類(lèi)或II類(lèi)基序可用所述技術(shù)獲得或成為所述技術(shù)的一部分，如列于表IV(或用萬(wàn)維網(wǎng)站點(diǎn)URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/，或BIMAS，bimas.dcrt.nih.gov/確定)?！坝糜凇痹谖闹斜硎驹u(píng)價(jià)PSCA蛋白，例如通過(guò)視覺(jué)評(píng)價(jià)或通過(guò)基于計(jì)算機(jī)的模式找尋方法，精通相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員可方便地進(jìn)行。PSCA蛋白的每個(gè)帶有HLAI類(lèi)基序的8、9、10或11個(gè)氨基酸殘基的子序列，或帶有HLAII類(lèi)基序的9個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的子序列都屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。III.B.)PSCA相關(guān)蛋白的表達(dá)在下面的實(shí)施例描述的一個(gè)實(shí)施方案中，PSCA可在商品化的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(如293T細(xì)胞)內(nèi)方便地表達(dá)，商品表達(dá)載體例如有CMV-驅(qū)動(dòng)的編碼含C-末端6個(gè)組氨酸和MYC標(biāo)記的PSCA的表達(dá)載體(pcDNA3.1/mycHIS，Invitrogen或Tag5，GenHunterCorporation，NashvilleTN)。Tag5載體提供了一個(gè)IgGK分泌信號(hào)，可用于促進(jìn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生分泌的PSCA蛋白。例如，可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用鎳柱純化分泌到培養(yǎng)基中的HIS-標(biāo)記的PSCA。III.C.)PSCA相關(guān)蛋白的修飾PSCA相關(guān)蛋白的修飾，如共價(jià)修飾包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。共價(jià)修飾的一種類(lèi)型包括使PSCA多肽的靶氨基酸殘基與能夠和PSCA蛋白的所選側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生劑反應(yīng)。本發(fā)明范圍內(nèi)的PSCA多肽共價(jià)修飾的另一種類(lèi)型包括改變本發(fā)明蛋白質(zhì)的天然糖基化模式。PSCA共價(jià)修飾的另一種類(lèi)型包括以美國(guó)專(zhuān)利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中列舉的方式將PSCA多肽連接到多種非蛋白質(zhì)類(lèi)型聚合物之一，這些聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。本發(fā)明的PSCA相關(guān)蛋白可被修飾以形成含有融合到其它異源多肽或氨基酸序列的PSCA的嵌合分子。這種嵌合分子可通過(guò)化學(xué)或重組方法合成。嵌合分子可含有融合到其它腫瘤相關(guān)抗原或其片段的本發(fā)明的蛋白質(zhì)?；蛘?，本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)可含有PSCA序列(氨基酸或核酸序列)片段的融合物，這樣便形成了在其長(zhǎng)度上不與圖1所示氨基酸或核酸序列直接同源的分子。這種嵌合分子可含有多個(gè)相同的PSCA子序列。嵌合分子可包含帶有多組氨酸表位標(biāo)記(提供了固定的鎳可選擇性結(jié)合的表位)的PSCA相關(guān)蛋白與細(xì)胞因子或與生長(zhǎng)因子的融合物。該表位標(biāo)記通常置于PSCA蛋白的氨基-或羧基-末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合分子可包含PSCA相關(guān)蛋白與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的融合物。對(duì)于這種嵌合分子的二價(jià)形式(也成為″免疫粘附素″)，這種融合物可以是IgG分子的Fc區(qū)域。Ig融合物宜包含用PSCA多肽的可溶(跨膜結(jié)構(gòu)域被刪除或失活)形式代替Ig分子至少一個(gè)可變區(qū)的取代。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所示免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的絞鏈、CH2和CH3區(qū)，或絞鏈、CHI、CH2和CH3區(qū)。為制造免疫球蛋白融合物，可參見(jiàn)，例如，1995年6月27日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,428,130。III.D.)PSCA相關(guān)蛋白的用途本發(fā)明的蛋白質(zhì)有許多不同的用途。由于PSCA在前列腺癌和其它癌癥中高度表達(dá)，PSCA相關(guān)蛋白被用于評(píng)估正常組織和癌組織中PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)從而確定惡性表型的方法。通常，來(lái)自PSCA蛋白特定區(qū)域的多肽被用來(lái)評(píng)估那些區(qū)域(如含有一個(gè)或多個(gè)基序的區(qū)域)中是否存在錯(cuò)亂(如缺失、插入、點(diǎn)突變等)。示范性的試驗(yàn)利用靶向含有PSCA多肽序列中所含的一個(gè)或多個(gè)生物基序的氨基酸殘基的PSCA相關(guān)蛋白的抗體或T細(xì)胞，以評(píng)價(jià)正常組織和癌組織中該區(qū)域的特性，或引發(fā)對(duì)該表位的免疫應(yīng)答。或者，含有PSCA蛋白一個(gè)或多個(gè)生物學(xué)活性基序的氨基酸殘基的PSCA相關(guān)蛋白被用于篩選與PSCA的該區(qū)域相互作用的因子。PSCA蛋白片段/子序列對(duì)于產(chǎn)生或特征分析結(jié)構(gòu)域特異性抗體(例如識(shí)別PSCA蛋白胞外或胞內(nèi)表位的抗體)以鑒定結(jié)合PSCA或其特定結(jié)構(gòu)域的自己或細(xì)胞因子特別有用，并且在各種治療和診斷應(yīng)用中特別有用，包括但不限于診斷測(cè)定、癌疫苗和制備這種疫苗的方法。PSCA基因或其類(lèi)似物、同系物或片段編碼的蛋白質(zhì)有許多用途，包括但不限于產(chǎn)生抗體和用來(lái)鑒定結(jié)合PSCA基因產(chǎn)物的配體和其它試劑和細(xì)胞成分。產(chǎn)生的抗PSCA蛋白或其片段的抗體可用于診斷和預(yù)后測(cè)定，并被用于人以表達(dá)PSCA蛋白為特征的表I中列出的那些癌癥的成象方法。這種抗體可在胞內(nèi)表達(dá)并被用于治療這種癌癥患者的方法。PSCA-相關(guān)核酸或蛋白質(zhì)也被用來(lái)產(chǎn)生HTL或CTL應(yīng)答。使用了各種對(duì)于檢測(cè)PSCA蛋白有效的免疫試驗(yàn)，其中包括但不限于各種類(lèi)型的放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定(ELIFA)、免疫細(xì)胞化學(xué)法等等?？贵w可被標(biāo)記并被用作能夠檢測(cè)表達(dá)PSCA的細(xì)胞的免疫顯象劑(例如在放射閃爍成象法中)。PSCA蛋白對(duì)于產(chǎn)生癌癥疫苗也特別有用，這將在文中進(jìn)一步描述。IV.)PSCA抗體本發(fā)明的另一方面提供了結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白的抗體。優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白但在生理?xiàng)l件下不結(jié)合(或弱結(jié)合)不與PSCA相關(guān)的蛋白質(zhì)的肽或蛋白質(zhì)。文中，生理?xiàng)l件的例子包括1)磷酸緩沖鹽水；2)含25mMTris和150mMNaCl的Tris緩沖鹽水；或生理鹽水(0.9％NaCl)；4)動(dòng)物血清如人血清；或5)1)-4)中任一項(xiàng)的組合；這些反應(yīng)宜在pH7.5下發(fā)生，或在pH7.0-8.0的范圍內(nèi)發(fā)生，或在pH6.5-8.5的范圍內(nèi)發(fā)生；同時(shí)，這些反應(yīng)在4-37℃的溫度下發(fā)生。例如，結(jié)合PSCA的抗體可結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白，例如其同系物或類(lèi)似物。本發(fā)明的PSCA抗體對(duì)于癌癥(見(jiàn)例如表I)診斷和預(yù)后檢測(cè)以及成象方法特別有用。類(lèi)似地，這種抗體對(duì)于治療、診斷和/或預(yù)測(cè)前列腺和其它癌癥也是有用的，只要PSCA也在這些其它癌癥中表達(dá)或過(guò)度表達(dá)。此外，胞內(nèi)表達(dá)的抗體(例如單鏈抗體)在處理與PSCA的表達(dá)有關(guān)的癌癥(例如晚期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌)或其它晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥中也有治療作用。本發(fā)明還提供了各種用來(lái)檢測(cè)和量化OSCA和突變型PSCA相關(guān)蛋白的免疫試驗(yàn)。這種試驗(yàn)可包括一種或多種能夠適當(dāng)識(shí)別并結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白的PSCA抗體。這些試驗(yàn)可用本領(lǐng)域熟知的各種免疫測(cè)定模式進(jìn)行，其中包括各種類(lèi)型的放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定(ELIFA)等等。本發(fā)明的非抗體免疫測(cè)定還可包括T細(xì)胞免疫原性測(cè)定(抑制或刺激)以及主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合檢測(cè)。此外，本發(fā)明還提供了能夠檢測(cè)前列腺癌和其它表達(dá)PSCA的癌癥的免疫成象法，其中包括但不限于使用標(biāo)記的PSCA抗體的放射閃爍成象法。這種檢測(cè)法在臨床上用于表達(dá)PSCA的癌癥(如前列腺癌)的檢測(cè)、監(jiān)控和預(yù)測(cè)。PSCA抗體也被用于純化PSCA相關(guān)蛋白和分離PSCA同系物及相關(guān)分子的方法。例如，純化PSCA相關(guān)蛋白的方法包括在允許PSCA抗體結(jié)合PSCA相關(guān)蛋白的條件下將含有PSCA相關(guān)蛋白的裂解液或其它溶液與已與固體基質(zhì)偶聯(lián)的PSCA抗體一起孵育；洗滌該固體基質(zhì)以除去雜質(zhì)；并從偶聯(lián)的抗體洗脫P(yáng)SCA相關(guān)蛋白。本發(fā)明所述PSCA抗體的其它用途包括產(chǎn)生模擬PSCA蛋白的抗-獨(dú)特型抗體。各種制造抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，可通過(guò)用分離形式或免疫綴合形式的PSCA相關(guān)蛋白、肽或片段免疫哺乳動(dòng)物宿主來(lái)制備抗體(《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(AntibodiesALaboratoryManual)，CSHPress，Harlow和Lane編輯(1988)；Harlow，《抗體》(Antibodies)，ColdSpringHarborPress，NY(1989))。此外，也可使用PSCA的融合蛋白，如PSCAGST-融合蛋白。在一具體實(shí)施方案中，制造了包含圖1的全部或大部分氨基酸序列的GST融合蛋白，然后將其用作免疫原來(lái)產(chǎn)生合適的抗體。另一實(shí)施方案中，合成了PSCA相關(guān)蛋白并將其用作免疫原。此外，本領(lǐng)域已知的裸DNA免疫技術(shù)被用來(lái)(有或沒(méi)有純化的PSCA相關(guān)蛋白或PSCA表達(dá)細(xì)胞)產(chǎn)生對(duì)編碼的免疫原的免疫應(yīng)答(參見(jiàn)Donnelly等，1997，Ann.Rev.Immunol.15617-648)。可分析圖1中所示的PSCA蛋白的氨基酸序列以選擇出產(chǎn)生抗體的PSCA蛋白的特定區(qū)域。例如，可利用PSCA氨基酸序列的疏水性和親水性分析來(lái)鑒定PSCA結(jié)構(gòu)中的親水區(qū)域。具有免疫原性結(jié)構(gòu)的PSCA蛋白區(qū)域以及其它區(qū)域和結(jié)構(gòu)域可方便地用本領(lǐng)域已知的各種其它方法來(lái)鑒定，這些方法例如Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf的分析法?？捎肏opp，T.P.和Woods，K.R.的方法(1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783824-3828)生成親水性圖譜?？捎肒yte，J.和Doolittle，R.F.的方法(1982，J.Mol.Biol.157105-132)生成親水性圖譜?？捎肑aninJ.的方法(1979，Nature277491-492)生成可接觸殘基百分比(％)圖譜。用BhaskaranR.，PonnuswamyP.K.的方法(1988，Int.J.Pept.ProteinRes.32242-255)生成平均屈曲性圖譜。可用Deleage，G.，RouxB.的方法(1987，ProteinEngineering1289-294)生成β-轉(zhuǎn)角圖譜。因此，用這些程序或方法中的任何一種鑒定出的各個(gè)區(qū)域在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本文還通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步闡述了產(chǎn)生PSCA抗體的優(yōu)選方法。制備用作免疫原的蛋白質(zhì)或多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的。本領(lǐng)域還熟知制備蛋白質(zhì)與載體(如BSA、KLH或其它載體蛋白)的免疫原性綴合物的方法。一些情況下，采用直接結(jié)合，例如使用碳二亞胺試劑；其它情況下，例如由PierceChemicalCo.(Rockford，IL)提供的結(jié)合試劑是有效的。像本領(lǐng)域知曉的那樣，經(jīng)常通過(guò)在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)與合適的佐劑一起注射來(lái)施用PSCA免疫原。在免疫過(guò)程中，可通過(guò)抗體的滴度來(lái)確定是否形成足夠抗體。PSCA單克隆抗體可用各種本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)制造。例如，眾所周知，用Kohler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)或改進(jìn)技術(shù)使產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞不死化來(lái)制備了分泌所需單克隆抗體的不死細(xì)胞系。分泌所需抗體的不死細(xì)胞系通過(guò)以PSCA相關(guān)蛋白作為抗原的免疫測(cè)定來(lái)篩選。當(dāng)鑒定出合適的不死細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，可擴(kuò)充細(xì)胞并從體外培養(yǎng)物或從腹水液中制造抗體。本發(fā)明的抗體或片段可通過(guò)重組方法制造。特異性結(jié)合所需PSCA蛋白區(qū)域的區(qū)域也可在多物種來(lái)源的嵌合或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植抗體形式來(lái)生產(chǎn)。也可制造人源化或人PSCA抗體，且它們宜用于治療。通過(guò)用一個(gè)或多個(gè)非人抗體CDR來(lái)代替相應(yīng)的人抗體序列制備人源化鼠抗體或其它非人抗體的方法是熟知的(見(jiàn)例如Jones等，1986，Nature321522-525；Riechmann等，1988，Nature332323-327；Verhoeyen等，1988，Science2391534-1536)。也可參見(jiàn)Carter等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894285和Sims等，1993，J.Immunol.1512296。制造完全的人單克隆抗體的方法包括噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因方法(參見(jiàn)例如Vaughan等，1998，NatureBiotechnology16535-539)。完全的人PSCA單克隆抗體可利用人Ig基因大組合文庫(kù)通過(guò)克隆技術(shù)產(chǎn)生(即噬菌體展示)(Griffiths和Hoogenboom，“建立體外免疫系統(tǒng)來(lái)自噬菌體展示文庫(kù)的人抗體”(Buildinganinvitroimmunesystemhumanantibodiesfromphagedisplaylibraries)。引自Clark，M.編寫(xiě)的《用于男性診斷和治療的抗體分子的蛋白質(zhì)工程》(ProteinEngineeringofAntibodyMoleculesforProphylacticandTherapeuticApplicationsinMan)，NottinghamAcademic，第45-64頁(yè)，(1993)；Burton和Barbas，《來(lái)自組合文庫(kù)的人抗體》(HumanAntibodiesfromcombinatoriallibraries)。同上，第65-82頁(yè))。完全的人PSCA單克隆抗體也可用經(jīng)過(guò)工程構(gòu)建而含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)制造，如1997年12月3日公開(kāi)的Kucherlapati和Jakobovits等的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/24893所述(也可參見(jiàn)Jakobovits，1998，Exp.Opin.Invest.Drugs7(4)607-614；2000年12月19日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利6,162,963；2000年11月12日發(fā)表的6,150,584；和2000年9月5日發(fā)表的6,114598)。該方法避免了噬菌體展示技術(shù)要求的體外操縱，并可有效制造高親和性真正的人抗體。PSCA抗體與PSCA相關(guān)蛋白的反應(yīng)性可通過(guò)許多熟知的方法來(lái)建立，其中包括使用合適PSCA相關(guān)蛋白、表達(dá)PSCA的細(xì)胞或其提取物的Western印跡、免疫沉淀、ELISA和FACS分析。PSCA抗體或其片段可用可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記或與第二分子綴合。合適的可檢測(cè)標(biāo)記物包括但不限于放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。此外，用本領(lǐng)域通常了解的方法產(chǎn)生對(duì)兩個(gè)或多個(gè)PSCA表位的雙特異性抗體。均二聚(Homodimeric)抗體也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的交聯(lián)技術(shù)制得(例如，Wolff等，CancerRes.532560-2565)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所提供的稱(chēng)為Ha1-1.16、Ha1-5.99、Ha1-4.117、Ha1-4.20、Ha1-4.121、Hal-4.37的單克隆抗體是在2005年5月4日被送至美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并分別被給予保藏號(hào)PTA-6698、PTA-6703、PTA-6699、PTA-6700、PTA-6701和PTA-6702。V.)PSCA細(xì)胞免疫應(yīng)答T細(xì)胞識(shí)別抗原的機(jī)制已被闡明。有效的本發(fā)明的肽表位疫苗組合物能在全世界大多數(shù)人群中誘導(dǎo)治療性和預(yù)防性免疫應(yīng)答。為了解本發(fā)明的綴合物誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的價(jià)值和功效，提供對(duì)免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)的簡(jiǎn)單回顧。HLA-限制性T細(xì)胞識(shí)別HLA分子和作為配體的肽抗原的復(fù)合體(Buus，S.等，Cell471071，1986；Babbitt，B.P.等，Nature317359，1985；Townsend，A.和Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11403，1993)。通過(guò)研究單個(gè)氨基酸取代的抗原類(lèi)似物和天然加工的內(nèi)源結(jié)合肽的序列測(cè)定，已經(jīng)鑒定出了與HLA的特異性結(jié)合抗原分子所需基序相對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵殘基，列于表IV(也可參見(jiàn)例如，Southwood等，J.Immunol.1603363，1998；Rammensee等，Immunogenetics41178，1995；Rammensee等，SYFPEITHI，訪問(wèn)萬(wàn)維網(wǎng)的URL站點(diǎn)(134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm)；Sette，A.和Sidney，J.Curr.Opin.Immunol.10478，1998；Engelhard，V.H.，Curr.Opin.Immunol.613，1994；Sette，A.和Grey，H.M.，Curr.Opin.Immunol.479，1992；Sinigaglia，F(xiàn).和Hammer，J.Curr.Biol.652，1994；Ruppert等，Cell74929-937，1993；Kondo等，J.Immunol.1554307-4312，1995；Sidney等，J.Immunol.1573480-3490，1996；Sidney等，人Immunol.4579-93，1996；Sette，A.和Sidney，J.Immunogenetics1999-11；50(3-4)201-12，綜述)。此外，HLA-肽復(fù)合體的X射線晶體分析顯示，HLA分子的肽結(jié)合裂隙/溝內(nèi)的口袋可以等位基因特異性模式容納肽配體的殘基；這些殘基又決定了帶有它們的肽結(jié)合HLA的能力。(見(jiàn)例如Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13587，1995；Smith等，Immunity4203，1996；Fremont等，Immunity8305，1998；Stern等，Structure2245，1994；Jones，E.Y.Curr.Opin.Immunol.975，1997；Brown，J.H.等，Nature36433，1993；Guo，H.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA908053，1993；Guo，H.C.等，Nature360364，1992；Silver，M.L.等，Nature360367，1992；Matsumura，M.等，Science257927，1992；Madden等，Cell701035，1992；Fremont，D.H.等，Science257919，1992；Saper，M.A.，Bjorkman，P.J.和Wiley，D.C.，J.Mol.Biol.219277，1991)。因此，確定I類(lèi)和II類(lèi)等位基因特異性HLA結(jié)合基序，或者I類(lèi)或II類(lèi)超基序能夠鑒定出蛋白質(zhì)內(nèi)與特定HLA抗原結(jié)合的相關(guān)區(qū)域。因此，通過(guò)鑒定HLA基序可鑒定出基于表位的疫苗候選物；還可通過(guò)HlA-肽結(jié)合檢測(cè)進(jìn)一步評(píng)價(jià)這種候選物以確定與表位和它相應(yīng)的HLA分子有關(guān)的結(jié)合親和力和/或結(jié)合周期?？蛇M(jìn)行其它證實(shí)工作以在這些疫苗候選物中選擇在群體覆蓋和/或免疫原性上具有較佳特性的表位?？捎枚喾N方法來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的免疫原性，包括1)評(píng)價(jià)正常個(gè)體的原代T細(xì)胞培養(yǎng)物(見(jiàn)例如Wentworth，P.A.等，Mol.Immunol.32603，1995；Celis，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA912105，1994；Tsai，V.等，J.Immunol.1581796，1997；Kawashima，I.等，HumanImmunol.591，1998)。該過(guò)程包括當(dāng)存在抗原呈遞細(xì)胞時(shí)在體外用測(cè)試肽刺激正常人的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)數(shù)周。該肽的特異性T細(xì)胞在此期間將被激活，可用例如肽致敏靶細(xì)胞的淋巴因子-或51Cr-釋放試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。2)免疫HLA轉(zhuǎn)基因小鼠(見(jiàn)例如Wentworth，P.A.等，J.Immunol.2697，1996；Wentworth，P.A.等，Int.Immunol.8651，1996；Alexander，J.等，J.Immunol.1594753，1997)。例如，在該方法中，皮下給予Hla轉(zhuǎn)基因小鼠用弗氏不完全佐劑配的肽。免疫接種數(shù)周后取得脾細(xì)胞，在測(cè)試肽存在時(shí)體外培養(yǎng)約1周。用例如肽致敏靶細(xì)胞和表達(dá)內(nèi)源產(chǎn)生抗原的靶細(xì)胞的51Cr-釋放試驗(yàn)檢測(cè)肽特異性T細(xì)胞。3)證實(shí)已有效接種疫苗的免疫個(gè)體和/或慢性病患者中的記憶T細(xì)胞應(yīng)答(見(jiàn)例如Rehermann，B.等，J.Exp.Med.1811047，1995；Doolan，D.L.等，Immunity797，1997；Bertoni，R.等，J.Clin.Invest.100503，1997；Threlkeld，S.C.等，J.Immunol.1591648，1997；Diepolder，H.M.等，J.Virol.716011，1997)。因此，可通過(guò)培養(yǎng)由于疾病已經(jīng)接觸過(guò)抗原因此產(chǎn)生了“天然”免疫應(yīng)答，或接種過(guò)這種抗原的疫苗者的PBL來(lái)檢測(cè)記憶應(yīng)答。將患者的PBL在測(cè)試肽和抗原呈遞細(xì)胞(APC)存在時(shí)在體外培養(yǎng)1-2周以激活“記憶”T細(xì)胞，與“原初”T細(xì)胞作比較。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，使用包括與肽致敏靶細(xì)胞的51Cr釋放、T細(xì)胞增殖或淋巴因子釋放等試驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞活性。VI.)PSCA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物編碼PSCA相關(guān)蛋白的也可用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或″敲除″動(dòng)物，這種動(dòng)物然后可用于開(kāi)發(fā)和篩選有治療作用的試劑。根據(jù)已有技術(shù)，編碼PSCA的cDNA可用來(lái)克隆編碼PSCA的基因組DNA。然后可用克隆的基因組序列來(lái)產(chǎn)生含有表達(dá)編碼PSCA的DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，尤其是例如小鼠或大鼠之類(lèi)的動(dòng)物，的方法已成為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，并描述在，例如，1988年4月12日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利4,736,866和1989年9月26日發(fā)表的4,870,009。通常，特定的細(xì)胞將成為帶有組織特異性增強(qiáng)子的PSCA轉(zhuǎn)基因摻入的靶點(diǎn)。包含編碼PSCA的轉(zhuǎn)基因拷貝的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可被用來(lái)檢查編碼PSCA的DNA表達(dá)增強(qiáng)的效應(yīng)。這種動(dòng)物也可被用作藥劑的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，所述藥劑被認(rèn)為可提供例如與其過(guò)度表達(dá)有關(guān)的病理狀態(tài)的保護(hù)。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，相比具有該轉(zhuǎn)基因的未治療動(dòng)物，用藥劑治療的動(dòng)物病理狀態(tài)的發(fā)病率降低，這說(shuō)明該藥劑對(duì)該病理狀態(tài)有潛在治療作用?；蛘?，可用PSCA的非人同系物來(lái)構(gòu)建PSCA″敲除″動(dòng)物，所述動(dòng)物由于編碼PSCA的外源基因和引入動(dòng)物胚胎細(xì)胞的改變的編碼PSCA的基因組DNA之間的同源重組而導(dǎo)致編碼PSCA的基因缺陷或被改變。例如，根據(jù)已有技術(shù)，可用編碼PSCA的cDNA來(lái)克隆編碼PSCA的基因組DNA。部分編碼PSCA的基因組DNA的一部分可被刪除或被用另一基因(例如編碼可用來(lái)監(jiān)控整合的可選標(biāo)記的基因)替代。通常，載體中包含數(shù)千個(gè)堿基的未改變的側(cè)接DNA(同時(shí)在5’和3’末端)(見(jiàn)例如Thomas和Capecchi，Cell，51503(1987)關(guān)于同源重組載體的描述)。載體被引入胚胎干細(xì)胞系(例如通過(guò)電穿孔)并選擇引入的DNA已經(jīng)與內(nèi)源DNA同源重組的細(xì)胞(見(jiàn)例如Li等，Cell，69915(1992))。然后將選出的細(xì)胞注射到動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的胚泡以形成聚集嵌合體(見(jiàn)例如Bradley，引自E.J.Robertson編寫(xiě)的《畸胎癌和胚胎干細(xì)胞實(shí)際進(jìn)展》(TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsAPracticalApproach)(IRL，Oxford，1987)，第113-152頁(yè))。然后可將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性養(yǎng)育動(dòng)物，然后使所述胚胎足月妊娠以產(chǎn)生″敲除″動(dòng)物。在其生殖細(xì)胞內(nèi)帶有同源重組DNA的后代可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定并用來(lái)繁殖所有動(dòng)物細(xì)胞都含有同源重組DNA的動(dòng)物?？商卣麒b定敲除動(dòng)物它們抵抗疾病的能力或者由于缺乏PSCA多肽而發(fā)病。VII.)用于檢測(cè)PSCA的方法本發(fā)明的另一方面涉及檢測(cè)PSCA多核苷酸和PSCA相關(guān)蛋白的方法，以及鑒定表達(dá)PSCA的細(xì)胞的方法。PSCA的表達(dá)特征使其成為轉(zhuǎn)移疾病的診斷標(biāo)記物。因此，PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)便為預(yù)測(cè)包括發(fā)生晚期疾病的易感性、進(jìn)展速度和/或腫瘤侵襲性等各種因素提供了有用信息。如本文詳細(xì)討論的，患者樣品中PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)可用本領(lǐng)域熟知的各種方法來(lái)分析，其中包括免疫組織化學(xué)分析、包括原位雜交在內(nèi)的各種Northern印跡技術(shù)、RT-PCR分析(例如在激光捕獲顯微切割樣品上進(jìn)行RT-PCR)、Western印跡分析和組織陣列分析。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了檢測(cè)生物樣品(如血清、骨、前列腺、以及其它組織、尿、精液、細(xì)胞制品等)中的PSCA多核苷酸的試驗(yàn)?？蓹z測(cè)的PSCA多核苷酸包括，例如，PSCA基因或其片段、PSCAmRNA、PSCAmRNA交替剪接變體以及含有PSCA多核苷酸的重組DNA或RNA分子。許多擴(kuò)增和/或檢測(cè)PSCA多核苷酸存在的方法是本領(lǐng)域熟知的并且可用于本發(fā)明這個(gè)方面的實(shí)踐。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)生物樣品中PSCAmRNA的方法包括用至少一種引物通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄從樣品制造cDNA；用PSCA多核苷酸作為正義和反義引物擴(kuò)增如此制得的cDNA以擴(kuò)增其中的PSCAcDNA；以及檢測(cè)是否存在擴(kuò)增的PSCAcDNA?？扇芜x確定擴(kuò)增的PSCAcDNA序列。另一實(shí)施方案中，檢測(cè)生物樣品中PSCA基因的方法包括首先分離樣品的基因組DNA；用PSCA多核苷酸作為正義和反義引物擴(kuò)增分離的基因組DNA；以及檢測(cè)是否存在擴(kuò)增的PSCA基因。可從PSCA核苷酸序列(見(jiàn)例如圖1)設(shè)計(jì)出任意數(shù)目的合適正義和反義探針的組合，并用于此目的。本發(fā)明還提供了檢測(cè)組織或其它生物樣品(如血清、精液、骨、前列腺、尿、細(xì)胞制品等)中PSCA蛋白存在情況的試驗(yàn)。檢測(cè)PSCA相關(guān)蛋白的方法也是熟知的，包括例如免疫沉淀、免疫組織化學(xué)分析、Western印跡分析、分子結(jié)合檢測(cè)、ELISA、ELIFA等。例如，檢測(cè)生物樣品中PSCA相關(guān)蛋白存在情況的方法包括首先使樣品接觸PSCA抗體、抗體的PSCA-反應(yīng)性片段或含有PSCA抗體抗原結(jié)合區(qū)的重組蛋白；然后檢測(cè)樣品中PSCA相關(guān)蛋白的結(jié)合。鑒定表達(dá)PSCA的細(xì)胞的方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定表達(dá)PSCA基因的細(xì)胞的檢測(cè)法包括檢測(cè)細(xì)胞中是否存在PSCAmRNA。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定mRNA的方法是熟知的，其中包括，例如，使用互補(bǔ)DNA探針進(jìn)行雜交試驗(yàn)(如用標(biāo)記的PSCA核糖核酸探針原位雜交、Northern印跡以及相關(guān)技術(shù))和各種核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(如用PSCA的特異性互補(bǔ)引物進(jìn)行RT-PCR，以及其它類(lèi)型的擴(kuò)增檢測(cè)法，如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)?；蛘?，鑒定表達(dá)PSCA基因的細(xì)胞的試驗(yàn)包括檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞分泌的PSCA相關(guān)蛋白的存在情況。各種檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的，并被用來(lái)檢測(cè)PSCA相關(guān)蛋白和表達(dá)PSCA相關(guān)蛋白的細(xì)胞。PSCA表達(dá)分析也被用作鑒定和評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)PSCA基因表達(dá)的試劑的工具。例如，PSCA表達(dá)在前列腺癌中顯著上調(diào)，并在表I所列組織的癌癥中表達(dá)。鑒定抑制PSCA在癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或過(guò)度表達(dá)的分子或生物試劑具有治療價(jià)值。例如，可采用通過(guò)RT-PCR、核酸雜交或抗體結(jié)合來(lái)量化PSCA表達(dá)的篩選方法來(lái)鑒定這種試劑。VIII.)監(jiān)測(cè)PSCA-相關(guān)基因及其產(chǎn)物狀態(tài)的方法已知腫瘤形成是一個(gè)多步驟過(guò)程，其中，細(xì)胞生長(zhǎng)逐步失調(diào)同時(shí)細(xì)胞由正常生理狀態(tài)發(fā)展到癌前狀態(tài)然后到癌癥狀態(tài)(見(jiàn)例如Alers等，LabInvest.77(5)437-438(1997)和Isaacs等，CancerSurv.2319-32(1995))。文中，檢查生物樣品細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)的證據(jù)(如癌癥中的異常PSCA表達(dá))能夠在病理狀態(tài)(如癌癥)發(fā)展到治療選項(xiàng)更加有限或預(yù)后更加不良的階段之前早期察覺(jué)這種異常生理狀態(tài)。在這種實(shí)施方案中，可將感興趣的生物樣品內(nèi)PSCA的狀態(tài)與例如相應(yīng)的的正常樣品(如來(lái)自個(gè)體或未受病理影響的其它個(gè)體的樣品)內(nèi)PSCA的狀態(tài)進(jìn)行比較。生物樣品中PSCA狀態(tài)的改變(相比正常樣品)提供了細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)的證據(jù)。除使用未受病變影響的生物樣品作為正常樣品，我們也可使用預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)值，例如預(yù)定的正常mRNA表達(dá)水平(見(jiàn)例如Grever等，J.Comp.Neurol.1996-12-9；376(2)306-14以及美國(guó)專(zhuān)利5,837,501)與樣品的PSCA狀態(tài)進(jìn)行比較。文中，術(shù)語(yǔ)″狀態(tài)″具有本領(lǐng)域可接受的含義，是指基因及其產(chǎn)物的情況或狀態(tài)。通常，熟練的技術(shù)人員可使用許多參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)基因及其產(chǎn)物的情況或狀態(tài)。這些參數(shù)包括但不限于表達(dá)的基因產(chǎn)物的定位(包括PSCA表達(dá)細(xì)胞的定位)和水平、表達(dá)的基因產(chǎn)物(如PSCAmRNA、多核苷酸和多肽)的生物活性。通常，PSCA狀態(tài)的改變包括PSCA和/或PSCA表達(dá)細(xì)胞定位的變化，和/或PSCAmRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)增加。樣品的PSCA狀態(tài)可用許多本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)分析，包括但不限于免疫組織化學(xué)分析、原位雜交、在激光捕獲顯微切割樣品上進(jìn)行RT-PCR分析、Western印跡分析和組織陣列分析。評(píng)價(jià)PSCA基因和基因產(chǎn)物狀態(tài)的典型方法可在以下文獻(xiàn)中找到，例如Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，1995，第2(Northern印跡)、4(Southern印跡)、15(免疫印跡)和18(PCR分析)單元。因此，熟練的技術(shù)人員可用各種方法來(lái)評(píng)價(jià)生物樣品的PSCA狀態(tài)，其中包括但不限于基因組Southern分析(用來(lái)檢測(cè)例如PSCA基因內(nèi)的紊亂)、PSCAmRNA的Northern分析和/或PCR分析(用來(lái)檢測(cè)例如多核苷酸序列或PSCAmRNA表達(dá)水平的變化)、以及Western和/或免疫組織化學(xué)分析(用來(lái)檢測(cè)例如多肽序列的變化、多肽在樣品內(nèi)定位的變化、PSCA蛋白表達(dá)水平的變化和/或PSCA蛋白與多肽結(jié)合伴侶的結(jié)合)?？蓹z測(cè)的PSCA多核苷酸包括，例如，PSCA基因或其片段、PSCAmRNA、交替剪接變體、PSCAmRNA以及含有PSCA多核苷酸的重組DNA或RNA分子。PSCA的表達(dá)特征使其成為局限性和/或轉(zhuǎn)移疾病的診斷標(biāo)記，并為生物樣品的生長(zhǎng)或致癌潛能提供了信息。具體地說(shuō)，PSCA的狀態(tài)為預(yù)測(cè)對(duì)特定疾病階段的易感性、進(jìn)展和/或腫瘤侵襲性提供了有用信息。本發(fā)明提供了確定PSCA狀態(tài)和診斷表達(dá)PSCA的癌癥(如表I所列組織的癌癥)的方法和試驗(yàn)。例如，由于相比正常前列腺組織，PSCAmRNA在前列腺和其它癌癥中如此高度地表達(dá)，評(píng)價(jià)生物樣品內(nèi)PSCAmRNA轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)水平的試驗(yàn)可被用來(lái)診斷與PSCA失調(diào)有關(guān)的疾病，并可在確定合適的治療方法時(shí)提供有用的預(yù)測(cè)信息。PSCA的表達(dá)狀態(tài)提供的信息包括發(fā)育異常細(xì)胞、癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞的存在、狀態(tài)和定位；預(yù)測(cè)對(duì)各種疾病階段的易感性和/或測(cè)量腫瘤的侵襲性。此外，這種表達(dá)特征使其可用作轉(zhuǎn)移疾病的顯象劑。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及檢測(cè)生物樣品(如來(lái)自患有或疑有以細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)為特征的病變(如癌癥)的個(gè)體的樣品)中PSCA狀態(tài)的各種分子預(yù)測(cè)和診斷方法。如上所述，生物樣品的PSCA狀態(tài)可通過(guò)許多本領(lǐng)域熟知的方法檢測(cè)。例如，取自機(jī)體特定部位的生物樣品的PSCA狀態(tài)可通過(guò)評(píng)估樣品內(nèi)存在或不存在PSCA表達(dá)細(xì)胞(如表達(dá)PSCAmRNA或PSCA蛋白的細(xì)胞)加以檢測(cè)。例如，當(dāng)在正常情況下不含表達(dá)PSCA的細(xì)胞的生物樣品(如淋巴結(jié))內(nèi)發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞時(shí)，由于生物樣品中PSCA狀態(tài)的這種變化通常與細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)有關(guān)，因此這種檢測(cè)可提供細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)的證據(jù)。具體地說(shuō)，細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)的一個(gè)指標(biāo)是癌細(xì)胞從原來(lái)的器官(如前列腺)轉(zhuǎn)移到身體的其它區(qū)域(如淋巴結(jié))。文中，細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)的證據(jù)是重要是，這是由于，例如，可在一定比例的前列腺癌患者內(nèi)檢出隱性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且這種轉(zhuǎn)移與已知的疾病發(fā)展預(yù)測(cè)器有關(guān)(見(jiàn)例如Murphy等，Prostate42(4)315-317(2000)；Su等，Semin.Surg.Oncol.18(1)17-28(2000)和Freeman等，JUrol1995-8154(2Pt1)474-8)。一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)測(cè)PSCA基因產(chǎn)物的方法，該方法通過(guò)確定個(gè)體細(xì)胞表達(dá)的PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)，所述個(gè)體疑有與細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)有關(guān)的疾病(如增生或癌癥)，然后將如此確定的狀態(tài)與相應(yīng)的正常組織的PSCA基因產(chǎn)物的狀態(tài)進(jìn)行比較。相對(duì)正常組織，測(cè)試樣品內(nèi)存在異常PSCA基因產(chǎn)物說(shuō)明該個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)存在細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)。在另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)于確定個(gè)體內(nèi)存在癌癥有用的試驗(yàn)，該方法包括檢測(cè)測(cè)試細(xì)胞或組織樣品內(nèi)PSCAmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)相對(duì)于對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)水平顯著升高?？稍诶绲幌抻诒鞩所列的組織內(nèi)評(píng)價(jià)PSCAmRNA的存在。由于相應(yīng)的正常組織不表達(dá)PSCAmRNA或以較低水平表達(dá)，所以任何這些組織內(nèi)出現(xiàn)顯著的PSCA表達(dá)可用來(lái)說(shuō)明癌癥的再現(xiàn)、存在和/或嚴(yán)重性。在有關(guān)實(shí)施方案中，PSCA狀態(tài)是在蛋白質(zhì)水平而不是核酸水平確定的。例如，這種方法包括確定測(cè)試組織樣品的細(xì)胞表達(dá)的PSCA蛋白的水平，并將這樣確定的水平與相應(yīng)的正常樣品內(nèi)表達(dá)的PSCA水平進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如用免疫組織化學(xué)的方法評(píng)估了PSCA蛋白的存在。能夠檢測(cè)PSCA蛋白表達(dá)的PSCA抗體或結(jié)合伴侶被用于本領(lǐng)域熟知的用于此目的的各種測(cè)定模式。在另一實(shí)施方案中，我們可評(píng)價(jià)生物樣品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的狀態(tài)，以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂。這些紊亂可包括插入、缺失、取代等。這種評(píng)價(jià)是有用的，因?yàn)樵诖罅颗c生長(zhǎng)失調(diào)表型有關(guān)的蛋白質(zhì)中觀察到核苷酸和氨基酸序列的紊亂(見(jiàn)例如Marrogi等，1999，J.Cutan.Pathol.26(8)369-378)。例如，PSCA序列中的突變可說(shuō)明腫瘤的存在或促進(jìn)。因此，PSCA的突變表明潛在的功能損失或腫瘤生長(zhǎng)加快，這種測(cè)定具有診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值。許多觀察核苷酸和氨基酸序列內(nèi)紊亂的試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。例如，通過(guò)這里所述的Northern、Southern、Western、PCR和DNA測(cè)序法觀察PSCA基因產(chǎn)物核酸或氨基酸序列的大小和結(jié)構(gòu)。此外，觀察核苷酸和氨基酸序列內(nèi)紊亂的其它方法，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，是本領(lǐng)域熟知的(見(jiàn)例如1999年9月7日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利5,382,510，和1995年1月17日發(fā)表的5,952,170)。此外，我們可檢測(cè)生物樣品中PSCA基因的甲基化狀態(tài)。基因5’調(diào)節(jié)區(qū)CpG島的異常去甲基化和/或超甲基化經(jīng)常出現(xiàn)于不死細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且可導(dǎo)致不同基因的表達(dá)改變。例如，π-類(lèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(一種在正常前列腺中表達(dá)的蛋白質(zhì)，但在90％以上的前列腺癌中不表達(dá))的啟動(dòng)子超甲基化將永久沉默轉(zhuǎn)錄該基因，并且是前列腺癌中最經(jīng)常檢測(cè)到的基因組變化(DeMarzo等，Am.J.Pathol.155(6)1985-1992(1999))。此外，這種變化在至少70％的高級(jí)前列腺上皮內(nèi)瘤樣病變(PIN)中出現(xiàn)(Brooks等，CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.，1998，7531-536)。在另一實(shí)施例中，成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞中脫氧-氮雜胞苷誘導(dǎo)LAGE-I腫瘤特異性基因(該基因不在正常前列腺中表達(dá)，但在25-50％的前列腺癌中表達(dá))的表達(dá)，說(shuō)明腫瘤表達(dá)是由于去甲基化造成的(Lethe等，Int.J.Cancer76(6)903-908(1998))。許多檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)的試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。例如，我們可在Southern雜交方法中使用對(duì)甲基化敏感但不能切割含甲基化CpG位點(diǎn)的序列的限制性酶來(lái)了解CpG島的甲基化狀態(tài)。此外，MSP(甲基化特異性PCR)可迅速顯示所給基因CpG島中存在的所有CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。該過(guò)程包括先用亞硫酸氫鈉(它將把所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶)修飾DNA，然后用甲基化和非未甲基化DNA的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。關(guān)于甲基化紊亂的方法也可在例如FrederickM.Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》(1995)第12單元中找到?；驍U(kuò)增是另一種獲得PSCA狀態(tài)的方法。直接測(cè)定樣品的基因擴(kuò)增，例如通過(guò)常規(guī)的Southern印跡或Northern印跡來(lái)量化mRNA的轉(zhuǎn)錄(Thomas，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，7752015205)、斑點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交，使用根據(jù)這里提供的序列的合適標(biāo)記的探針?；蛘?，可使用識(shí)別特定雙鏈體的抗體，其中包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNARNA雜合體雙鏈體或DNA蛋白質(zhì)雙鏈體。然后抗體被標(biāo)記并進(jìn)行測(cè)定，其中雙鏈體結(jié)合到表面，從而在表面形成雙鏈體，因此可檢測(cè)是否存在結(jié)合到雙鏈體的抗體。通?？蓹z測(cè)活檢組織或外周血以了解癌細(xì)胞的存在，使用例如Northern印跡、斑點(diǎn)印跡或RT-PCR分析來(lái)檢測(cè)PSCA表達(dá)。存在RT-PCR可擴(kuò)增的PSCAmRNA表明了癌癥的存在。RT-PCR試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。目前評(píng)價(jià)了外周血腫瘤細(xì)胞的RT-PCR試驗(yàn)是否可用于診斷和處理多種人類(lèi)實(shí)體瘤。在前列腺癌領(lǐng)域，這些包括檢測(cè)表達(dá)PSA和PSM的細(xì)胞的RT-PCR試驗(yàn)(Verkaik等，1997，Urol.Res.25373-384；Ghossein等，1995，J.Clin.Oncol.131195-2000；Heston等，1995，Clin.Chem.411687-1688)。本發(fā)明的另一方面是評(píng)估個(gè)體對(duì)癌癥的易感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)對(duì)癌癥易感性的方法包括檢測(cè)組織樣品內(nèi)的PSCAmRNA或PSCA蛋白，其存在說(shuō)明對(duì)癌癥易感，其中PSCAmRNA的表達(dá)程度與易感性程度相對(duì)應(yīng)。在以具體實(shí)施方案中，檢測(cè)了前列腺或其它組織內(nèi)PSCA的存在情況，樣品內(nèi)存在PSCA說(shuō)明對(duì)前列腺癌易感(或出現(xiàn)或存在前列腺腫瘤)。類(lèi)似地，我們可評(píng)估生物樣品內(nèi)PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂，所述紊亂如插入、缺失、取代等。樣品PSCA基因產(chǎn)物內(nèi)存在一種或多種紊亂是癌癥易感性(或出現(xiàn)或存在腫瘤)的指標(biāo)。本發(fā)明還包括測(cè)定腫瘤侵襲性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定腫瘤侵襲性的方法包括確定腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平，將如此確定的水平與取自同一個(gè)體或正常組織參考樣品的相應(yīng)的正常組織內(nèi)表達(dá)的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平進(jìn)行比較，其中，相對(duì)正常樣品，腫瘤樣品中PSCAmRNA或PSCA蛋白的表達(dá)程度說(shuō)明了侵襲性程度。在一具體實(shí)施方案中，腫瘤的侵襲性是通過(guò)確定腫瘤細(xì)胞內(nèi)PSCA的表達(dá)程度來(lái)評(píng)價(jià)的，表達(dá)水平越高說(shuō)明越是侵襲性腫瘤。其它實(shí)施方案評(píng)價(jià)了生物樣品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性，以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂，所述紊亂如插入、缺失、取代等。存在一種或多種紊亂說(shuō)明是侵襲性更強(qiáng)的腫瘤。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及觀察一段時(shí)間內(nèi)惡性腫瘤在個(gè)體的發(fā)展的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，觀察一段時(shí)間內(nèi)惡性腫瘤在個(gè)體的發(fā)展的方法包括確定腫瘤樣品內(nèi)細(xì)胞表達(dá)的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平，將如此確定的水平與不同時(shí)間取自同一個(gè)體的相同組織樣品內(nèi)表達(dá)的PSCAmRNA或PSCA蛋白的水平進(jìn)行比較，其中，一段時(shí)間內(nèi)腫瘤樣品中表達(dá)的PSCAmRNA或PSCA蛋白的程度提供了癌癥發(fā)展的信息。在一具體實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的PSCA來(lái)評(píng)價(jià)癌癥的發(fā)展，一段時(shí)間內(nèi)表達(dá)升高表明癌癥發(fā)展。同時(shí)，我們可評(píng)價(jià)生物樣品中PSCA核苷酸和氨基酸序列的完整性，以鑒定這些分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的紊亂，所述紊亂如插入、缺失、取代等，存在一種或多種紊亂說(shuō)明了癌癥發(fā)展。上述診斷方法也可與本領(lǐng)域已知的多種預(yù)測(cè)和診斷方法中的任何一種聯(lián)合。例如，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及觀察PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的表達(dá)(或PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物中的紊亂)與惡性腫瘤相關(guān)因子相一致的方法，該方法被作為診斷和預(yù)測(cè)組織樣品狀態(tài)的手段?？刹捎枚喾N與惡性腫瘤有關(guān)的因子，如惡性腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)(例如前列腺癌的PSA、PSCA和PSM的表達(dá)，等等)以及總的細(xì)胞學(xué)觀察(見(jiàn)例如Bocking等，1984，Anal.Quant.Cytol.6(2)74-88；Epstein，1995，Hum.Pathol.26(2)223-9；Thorson等，1998，Mod.Pathol.11(6)543-51；Baisden等，1999，Am.J.Surg.Pathol.23(8)918-24)。例如，由于存在一組與疾病相一致的特定因子，這為診斷和預(yù)測(cè)組織樣品狀態(tài)提供了重要信息，因此觀察PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的表達(dá)(或?qū)SCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的紊亂)與其它惡性腫瘤相關(guān)因子相一致的方法是有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，觀察PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物的表達(dá)(或PSCA基因和PSCA基因產(chǎn)物中的紊亂)與其它惡性腫瘤相關(guān)因子相一致的方法必需檢測(cè)組織樣品內(nèi)PSCAmRNA或蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)，檢測(cè)組織樣品內(nèi)PSAmRNA或蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)(或者PSCA或PSM的表達(dá))，并觀察PSCAmRNA或蛋白質(zhì)與PSAmRNA或蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)(或者PSCA或PSM的表達(dá))的一致性。在一具體實(shí)施方案中，檢測(cè)了前列腺組織內(nèi)PSCA和PSAmRNA的表達(dá)，樣品內(nèi)PSCA和PSAmRNA的過(guò)度表達(dá)相一致說(shuō)明了前列腺癌的存在、對(duì)前列腺癌的易感性或前列腺腫瘤的復(fù)發(fā)或狀態(tài)。這里描述了檢測(cè)并量化PSCAmRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，標(biāo)準(zhǔn)核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)和量化技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。檢測(cè)和量化PSCAmRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法包括使用標(biāo)記的PSCA核糖核酸探針的原位雜交、使用PSCA多核苷酸探針的Northern印跡和相關(guān)技術(shù)、使用PSCA特異性引物的RT-PCR分析以及其它擴(kuò)增類(lèi)型的檢測(cè)方法，例如有分支DNA、SISBA、TMA等等。在一具體實(shí)施方案中，采用半定量RT-PCR來(lái)檢測(cè)和量化PSCAmRNA的表達(dá)。出于該目的可使用任何數(shù)量的能夠擴(kuò)增PSCA的引物，包括但不限于這里具體描述的各種引物組。在一具體實(shí)施方案中，在活檢組織的免疫組織化學(xué)測(cè)定中從使用與野生型PSCA蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的多克隆或單克隆抗體。IX.)與PSCA相互作用分子的鑒定通過(guò)本領(lǐng)域可接受的多種方法中的任何一種，熟練的技術(shù)人員可用這里揭示的PSCA蛋白和核酸序列來(lái)鑒定與PSCA相互作用的蛋白質(zhì)、小分子和其它試劑。例如，我們可利用一種所謂相互作用阱的系統(tǒng)(也成為“雙雜交試驗(yàn)”)。在該系統(tǒng)中，分子與指導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用并重建，從而可檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。其它系統(tǒng)通過(guò)真核轉(zhuǎn)錄激活蛋白的重建在體內(nèi)鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，見(jiàn)例如1999年9月21日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利5,955,280，1999年7月20日發(fā)表的5,925,523，1998年12月8日發(fā)表的5,846,722和1999年12月21日發(fā)表的6,004,746。本領(lǐng)域也存在基于基因組的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能的算法(見(jiàn)例如Marcotte等，Nature40241999年11月4日，83-86)。或者，我們可篩選肽文庫(kù)來(lái)鑒定與PSCA蛋白質(zhì)序列相互作用的分子。在該方法中，通過(guò)篩選文庫(kù)中編碼隨機(jī)或受控氨基酸集合來(lái)鑒定結(jié)合PSCA的肽。該文庫(kù)編碼的肽被作為噬菌體外被蛋白的融合蛋白表達(dá)，然后可選出抗PSCA蛋白的噬菌體顆粒。因此，無(wú)需之前對(duì)配體或受體分子的結(jié)構(gòu)有任何了解就鑒定出了具有多種用途的肽，例如治療、預(yù)測(cè)或診斷肽?？捎脕?lái)鑒定與PSCA蛋白質(zhì)序列相互作用的分子的典型肽文庫(kù)和篩選方法描述于，例如，1998年3月3日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利5,723,286和1998年3月31日發(fā)表的5,733,731?；蛘撸磉_(dá)PSCA的細(xì)胞系被用來(lái)鑒定PSCA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。這種相互作用可用免疫沉淀技術(shù)來(lái)檢測(cè)(見(jiàn)例如HamiltonB.J.等Biochem.Biophys.Res.Commun.1999，261646-51)?？捎每?PSCA抗體從表達(dá)PSCA的細(xì)胞系中免疫測(cè)定PSCA蛋白。或者，可在經(jīng)工程改造的表達(dá)PSCA和His-tag(上述載體)融合物的細(xì)胞系內(nèi)采用抗His-tag抗體。可通過(guò)以下方法檢測(cè)免疫沉淀的復(fù)合體的蛋白質(zhì)結(jié)合，例如Western印跡、35S-甲硫氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)微測(cè)序、銀染和雙向凝膠電泳?？赏ㄟ^(guò)與這種篩選測(cè)定有關(guān)實(shí)施方案來(lái)鑒定與PSCA相互作用的小分子和配體。例如，可鑒定紊亂蛋白質(zhì)功能的小分子，包括紊亂PSCA介導(dǎo)磷酸化和去磷酸化能力、與DNA或RNA分子相互作用的分子，作為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、第二信使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或腫瘤發(fā)生的指標(biāo)。類(lèi)似地，可鑒定調(diào)節(jié)PSCA-相關(guān)離子通道、蛋白質(zhì)泵或細(xì)胞通訊功能的小分子，并用來(lái)治療具有表達(dá)PSCA的癌癥的患者(見(jiàn)例如Hille，B.，《可興奮膜的離子通道》(IonicChannelsofExcitableMembranes)，第二版，SinauerAssoc.，Sunderland，MA，1992)。此外，調(diào)節(jié)PSCA功能的配體可基于其結(jié)合PSCA和活化受體構(gòu)建物的能力加以鑒定。典型的方法敘述于例如1999年7月27日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利5,928,868，并包括形成至少有一個(gè)配體是小分子的雜交配體的方法。在一示范性實(shí)施方案中，利用經(jīng)工程改造能表達(dá)PSCA和DNA-結(jié)合蛋白融合蛋白的細(xì)胞來(lái)共表達(dá)雜交配體/小分子的融合蛋白和cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)錄激活蛋白。該細(xì)胞還含有報(bào)告基因，報(bào)告基因的表達(dá)使第一和第二融合蛋白相互接近，相互接近只有當(dāng)雜交配體結(jié)合兩個(gè)雜交蛋白上的靶位點(diǎn)時(shí)才會(huì)發(fā)生。選擇表達(dá)報(bào)告基因的那些細(xì)胞，并鑒定未知小分子或未知配體。該方法可鑒定激活或抑制PSCA的調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案包括篩選與圖1所示PSCA氨基酸序列相互作用的方法，該方法包括使一群分子接觸PSCA氨基酸序列、使這群分子和PSCA氨基酸序列在易于相互作用的條件下相互作用、確定存在與PSCA氨基酸序列相互作用的分子、然后將不和PSCA氨基酸序列相互作用的分子與和PSCA氨基酸序列相互作用的分子分離的步驟。在一具體實(shí)施方案中，該方法還包括純化、特征分析和鑒定與PSCA氨基酸序列相互作用的分子。鑒定出的分子可用來(lái)調(diào)節(jié)PSCA的功能。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，PSCA氨基酸序列與肽文庫(kù)相連.X.)治療方法和組合物鑒定在有限的組織內(nèi)正常表達(dá)但也在表I所列的癌中表達(dá)的PSCA將開(kāi)創(chuàng)了許多治療此類(lèi)癌癥的方法。注意，即便當(dāng)靶蛋白在正常組織(甚至是正常的生命器官組織)內(nèi)表達(dá)時(shí)靶向抗腫瘤療法也是有效的。生命器官是維持生命必需的器官，如心臟或結(jié)腸。非生命器官是可切除但個(gè)體仍能存活的器官。非生命器官的例子有卵巢、乳腺和前列腺。例如，Herceptin是一種FDA批準(zhǔn)的藥物，它是由各種稱(chēng)為HER2、HER2/neu和erb-b-2的蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體組成的。它由Genentech銷(xiāo)售并且是一種獲得商業(yè)成功的抗腫瘤藥。2002年Herceptin的銷(xiāo)售額達(dá)到約4億美元。Herceptin用于治療HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。然而，HER2的表達(dá)不限于這種腫瘤。這種蛋白質(zhì)在許多正常組織內(nèi)表達(dá)。具體地說(shuō)，已知HER2/neu存在于正常的腎臟和心臟內(nèi)，而這些組織存在于所有接受Herceptin的人當(dāng)中。Latif，Z.等也證實(shí)正常腎臟內(nèi)存在HER2/neu(B.J.U.International(2002)895-9)。如該文獻(xiàn)所示(其評(píng)價(jià)了腎細(xì)胞癌是否應(yīng)成為抗-HER2抗體如Herceptin的優(yōu)選適應(yīng)證)，良性腎組織制造這種蛋白和mRNA。特別地，HER2/neu蛋白在良性腎組織內(nèi)強(qiáng)烈過(guò)度表達(dá)。盡管HER2/neu在心臟和腎臟等生命組織內(nèi)表達(dá)，但Herceptin是一種非常有效的、獲得FDA批準(zhǔn)并取得商業(yè)成功的藥物。Herceptin對(duì)心臟組織的影響，即“心臟毒性(cardiotoxicity)”僅是一種治療副作用。當(dāng)單獨(dú)用Herceptin治療患者時(shí)，僅在極少患者內(nèi)會(huì)發(fā)生顯著心臟毒性。為了使心臟毒性最小化，對(duì)于用HER2/neu進(jìn)行的治療具有更為嚴(yán)格的準(zhǔn)入要求。在能夠進(jìn)行治療之前，需評(píng)估例如遺傳缺陷對(duì)心臟條件影響的因素。特別值得注意的是，盡管腎組織顯示正常表達(dá)，甚至可能高于心臟組織的表達(dá)，但腎臟未出現(xiàn)任何可評(píng)價(jià)的Herceptin副作用。此外，在表達(dá)HER2的各種正常組織中，只有極少會(huì)發(fā)生副作用。只有心臟組織出現(xiàn)可評(píng)價(jià)的副作用。在HER2/neu表達(dá)尤其顯著的組織，如腎組織，未出現(xiàn)任何副作用。此外，發(fā)現(xiàn)以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)；Erbitux(ImClone)為靶點(diǎn)的抗腫瘤療法有良好的治療效果。EGFR也在許多正常組織內(nèi)表達(dá)。使用抗-EGFR療法之后正常組織內(nèi)的副作用非常有限。EGFR治療中常見(jiàn)的副作用是在接受治療的100％的患者中都觀察到嚴(yán)重的皮疹。因此，正常組織甚至正常生命組織內(nèi)靶蛋白的表達(dá)不會(huì)破壞以該蛋白質(zhì)為靶向的靶向制劑在對(duì)某些該蛋白也過(guò)表達(dá)的腫瘤中作為治療劑的作用。例如，生命器官中的表達(dá)本身并不是有害的。此外，可去除被認(rèn)為可給藥的器官(例如前列腺和卵巢)而不會(huì)導(dǎo)致死亡。最后，某些生命器官由于具有免疫特權(quán)(immuno-privilege)而不受正常器官表達(dá)的影響。具有免疫特權(quán)的器官是通過(guò)血液-器官屏障來(lái)免受血液影響并由此不易受免疫治療影響的器官。具有免疫特權(quán)的器官的例子是腦和睪丸。因此，抑制PSCA蛋白活性的治療方法可用于患有表達(dá)PSCA的癌癥的患者。這些治療方法通常分為3類(lèi)。第一類(lèi)是因PSCA與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)，通過(guò)調(diào)整PSCA功能使得腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制或生長(zhǎng)遲緩或者誘導(dǎo)對(duì)其的殺傷。第二類(lèi)包括各種抑制PSCA蛋白與其結(jié)合伴侶或其它蛋白質(zhì)結(jié)合或締合的方法。第三類(lèi)包括各種抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄或PSCAmRNA翻譯的方法。X.A.)抗癌疫苗本發(fā)明提供了含有PSCA相關(guān)蛋白或PSCA-相關(guān)核酸的癌癥疫苗。就PSCA的表達(dá)而言，癌癥疫苗可預(yù)防和/或治療表達(dá)PSCA的癌癥，而對(duì)非靶組織的影響很小或沒(méi)有影響。在疫苗中使用產(chǎn)生細(xì)胞-介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答的腫瘤抗原以進(jìn)行抗癌治療的方法是本領(lǐng)域熟知的，并被用于將人PSMA和嚙齒動(dòng)物PAP免疫原用于前列腺癌的治療(Hodge等，1995，Int.J.Cancer63231-237；Fong等，1997，J.Immunol.1593113-3117)。通過(guò)使用PSCA相關(guān)蛋白或編碼PSCA的核酸分子以及能夠表達(dá)和呈遞PSCA免疫原的重組載體(通常包含許多T細(xì)胞表位或抗體)不難實(shí)施這種方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本領(lǐng)域已知許多輸送免疫反應(yīng)性表位的疫苗系統(tǒng)(見(jiàn)例如Heryln等，AnnMed1999-231(1)66-78；Maruyama等，CancerImmunolImmunother2000-649(3)123-32)。簡(jiǎn)言之，這種在哺乳動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答(例如細(xì)胞-介導(dǎo)的和/或體液免疫應(yīng)答)的方法包括以下步驟使哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)接觸某免疫反應(yīng)性表位(例如圖1所示PSCA蛋白或其類(lèi)似物或同系物上的表位)從而使哺乳動(dòng)物產(chǎn)生該表位的特異性免疫應(yīng)答(例如產(chǎn)生特異性識(shí)別該表位的抗體)。完整的PSCA蛋白、其免疫原性區(qū)域或表位可加以組合通過(guò)各種方法輸送。這種疫苗組合物可包括，例如，脂肽(例如Vitiello，A.等，J.Clin.Invest.95341，1995)、包裹在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球體中的肽組合物(見(jiàn)例如Eldridge等，Molec.Immunol.28287-294，1991Alonso等，Vaccine12299-306，1994；Jones等，Vaccine13675-681，1995)、含在免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)內(nèi)的肽組合物(見(jiàn)例如Takahashi等，Nature344873-875，1990；Hu等，ClinExpImmunol.113235-243，1998)、多重抗原肽系統(tǒng)(MAP)(見(jiàn)例如Tam，J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855409-5413，1988；Tam，J.P.，J.Immunol.Methods19617-32，1996)、配制成多價(jià)肽的肽；用于彈道輸送系統(tǒng)的肽(通常是結(jié)晶的肽)和病毒輸送載體的肽(Perkus，M.E.等，引自Kaufmann，S.H.E.編的《疫苗發(fā)展概述》(Coneeptsinvaccinedevelopment)，第379頁(yè)，1996；Chakrabarti，S.等，Nature320535，1986；Hu，S.L.等，Nature320537，1986；Kieny，M.-P.等，AIDSBio/Technology4790，1986；Top，F(xiàn).H.等，J.Infect.Dis.124148，1971；Chanda，P.K.等，Virology175535，1990)、病毒或合成來(lái)源的顆粒(例如，Kofler，N.等，J.Immunol.Methods.19225，1996；Eldridge，J.H.等，Sem.Hematol.3016，1993；小Falo，L.D.等，NatureMed.7649，1995)、佐劑(Warren，H.S.，Vogel，F(xiàn).R.和Chedid，L.A.Annu.Rev.Immunol.4369，1986；Gupta，R.K.等，Vaccine11293，1993)、脂質(zhì)體(Reddy，R.等，J.Immunol.1481585，1992；Rock，K.L.，Immunol.Today17131，1996)，或者裸cDNA或顆粒吸收的cDNA(Ulmer，J.B.等，Science2591745，1993；Robinson，H.L.、Hunt，L.A.和Webster，R.G.，Vaccine11957，1993；Shiver，J.W.等，引自Kaufmann，S.H.E.編的《疫苗發(fā)展概述》(Conceptsinvaccinedevelopment)，第423頁(yè)，1996；Cease，K.B.和Berzofsky，J.A.，Annu.Rev.Immunol.12923，1994，以及Eldridge，J.H.等，Sem.Hematol.3016，1993)。也可使用靶向毒素的輸送技術(shù)，也成為受體介導(dǎo)的尋靶，如AvantImmunotherapeutics，Inc.(Needham，Massachusetts)的那些技術(shù)。在患有PSCA相關(guān)癌癥的患者中，本發(fā)明的疫苗組合物也可與其它治療癌癥的方法例如手術(shù)、化療、藥物治療、放療等結(jié)合，包括與IL-2、IL-12、GM-CSF等免疫佐劑聯(lián)合使用。細(xì)胞疫苗可用特定的算法鑒定PSCA蛋白內(nèi)結(jié)合相應(yīng)HLA等位基因的肽以確定CTL表位(見(jiàn)例如表IV；EpimerTM和EpimatrixTM，BrownUniversity(URLbrown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html)；以及BIMAS(URLbimas.dcrt.nih.gov/；SYFPEITHI，URLsyfpeithi.bmi-heidelberg.com/)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，PSCA免疫原含有一個(gè)或多個(gè)用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)鑒定的氨基酸序列，如表V-XVIII和XXII-LI所示的序列，或有8、9、10或11個(gè)HLAI類(lèi)基序/超基序(例如表IV(A)、表IV(D)或表IV(E))特有氨基酸的肽和/或至少有9個(gè)氨基酸的包含HLAII類(lèi)基序/超基序(例如表IV(B)或表IV(C))的肽。本領(lǐng)域已知，HLAI類(lèi)結(jié)合溝末端基本關(guān)閉，因此只有特定大小范圍的肽才能與溝相符合并與之結(jié)合，HLAI類(lèi)表位的長(zhǎng)度通常有8、9、10或11個(gè)氨基酸。相反，HLAII類(lèi)結(jié)合溝末端基本開(kāi)放；因此有約9個(gè)或更多氨基酸的肽可被HLAII類(lèi)分子結(jié)合。由于HLAI和II類(lèi)的結(jié)合溝不同，因此HLAI類(lèi)基序是長(zhǎng)度特異的，即I類(lèi)基序的位置2是肽氨基到羧基方向的第二個(gè)氨基酸。II類(lèi)基序的氨基酸位置只是相互之間相對(duì)的，而不是相對(duì)于整個(gè)肽，即帶有基序的序列的氨基和/或羧基末端可結(jié)合其它氨基酸。HLAII類(lèi)表位是長(zhǎng)度通常有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)氨基酸，或25個(gè)氨基酸以上。本領(lǐng)域已知許多在哺乳動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法(例如產(chǎn)生雜交瘤的第一個(gè)步驟)。在哺乳動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法包括使哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)暴露于蛋白質(zhì)的免疫原性表位(例如PSCA蛋白)以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。一個(gè)具體的實(shí)施方案包括在宿主內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)PSCA的免疫應(yīng)答的方法，該方法是使宿主接觸足量的至少一種PSCAB細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞表位或其類(lèi)似物；并在這之后至少一定實(shí)踐間隔使宿主再接觸PSCAB細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞表位或其類(lèi)似物。一個(gè)具體的實(shí)施方案包括產(chǎn)生抗PSCA相關(guān)蛋白或人造多表位肽的免疫應(yīng)答的方法給予人或其它哺乳動(dòng)物含在疫苗制品內(nèi)的PSCA免疫原(例如PSCA蛋白或其肽片段、PSCA融合蛋白或類(lèi)似物等)。通常，這種疫苗制品還含有合適的佐劑(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6,146,635)或通用輔助表位，如PADRETM肽(EpimmuneInc.，SanDiego，CA；見(jiàn)例如Alexander等，J.Immunol.2000164(3)；164(3)1625-1633；Alexander等，Immunity19941(9)751-761，和Alexander等，Immunol.Res.199818(2)79-92)。另一種方法包括在個(gè)體內(nèi)產(chǎn)生抗PSCA免疫原的免疫應(yīng)答，方法如下在哺乳動(dòng)物機(jī)體的肌肉或皮膚中體內(nèi)給予包含編碼PSCA免疫原的DNA序列的DNA分子，該DNA序列操作性連接于控制DNA序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列；其中所述DNA分子被細(xì)胞攝取，DNA序列在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并產(chǎn)生抗該免疫原的免疫應(yīng)答(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,962,428)。也可任選給予基因疫苗促效劑(facilitator)，如陰離子脂質(zhì)；皂苷；凝集素；雌激素類(lèi)化合物；羥基化低級(jí)烷基；二甲基亞砜；以及尿素。此外，可給予模擬PSCA的抗獨(dú)特型抗體以產(chǎn)生對(duì)于靶抗原的反應(yīng)。核酸疫苗本發(fā)明的疫苗組合物包括核酸-介導(dǎo)的形式?？山o予患者編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或RNA?？刹捎没蛎庖呓臃N法來(lái)產(chǎn)生抗表達(dá)PSCA的癌細(xì)胞的預(yù)防性或治療性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答?？蓪⒑芯幋aPSCA相關(guān)蛋白/免疫原的DNA和適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的構(gòu)建物直接注射到個(gè)體的肌肉或皮膚內(nèi)，從而肌肉或皮膚細(xì)胞攝取該構(gòu)建物并表達(dá)編碼的PSCA蛋白/免疫原。或者疫苗中包含PSCA相關(guān)蛋白。PSCA相關(guān)蛋白免疫原的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生抗帶有PSCA蛋白的T細(xì)胞的預(yù)防性或治療性體液和細(xì)胞免疫力?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種預(yù)防性和治療性基因免疫接種技術(shù)(參見(jiàn)例如互聯(lián)網(wǎng)地址genweb.com上公布的信息和參考資料)?；诤怂岬妮斔兔枋鲈冢?，Wolff等，Science2471465(1990)以及美國(guó)專(zhuān)利5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；WO98/04720。基于DNA的輸送技術(shù)的例子包括“裸DNA”、促效(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽-介導(dǎo)的)輸送、陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合體和顆粒-介導(dǎo)的輸送(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的輸送(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,922,687)。出于治療性或預(yù)防性免疫接種的目的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過(guò)病毒載體或細(xì)菌載體表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)踐的各種病毒性基因輸送系統(tǒng)包括但不限于牛痘、禽痘、金絲雀痘、腺病毒、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腺伴隨病毒、慢病毒和辛德畢斯病毒(見(jiàn)例如Restifo，1996，Curr.Opin.Immunol.8658-663；Tsang等J.Natl.CancerInst.87982-990(1995))。也可使用非病毒輸送系統(tǒng)，方法是在患者內(nèi)引入編碼PSCA相關(guān)蛋白的裸DNA(例如在肌肉內(nèi)或真皮內(nèi))以誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答反應(yīng)。例如，牛痘病毒可被用作載體以表達(dá)編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列。引入宿主之后，重組牛痘病毒表達(dá)蛋白質(zhì)免疫原性肽，因而引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。牛痘載體以及免疫接種用的方法描述在例如美國(guó)專(zhuān)利4,722,848中。另一種載體是BCG(BacilleCalmetteGuerin)。BCG載體描述在Stover等，Nature351456-460(1991)。通過(guò)這里的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員直到許多其它載體可用治療性給予或免疫接種本發(fā)明的肽，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphi)載體、解毒的炭疽毒素載體等。因此，基因輸送系統(tǒng)被用來(lái)運(yùn)送PSCA-相關(guān)核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中使用了全長(zhǎng)人PSCAcDNA。另一實(shí)施方案中使用了編碼特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)和/或抗體表位的PSCA核酸分子。離體疫苗也可用各種離體方法來(lái)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。一種方法包括使用抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突細(xì)胞(DC)，以將PSCA抗原呈遞到患者的免疫系統(tǒng)。樹(shù)突細(xì)胞表達(dá)MHCI和II類(lèi)分子、B7共刺激物和IL-12，因此是高度專(zhuān)一的抗原呈遞細(xì)胞。在前列腺癌中，前列腺特異性膜抗原(PSMA)脈沖的自體樹(shù)突細(xì)胞被用于I期臨床試驗(yàn)以刺激前列腺癌患者的免疫系統(tǒng)(Tjoa等，1996，Prostate2865-69；Murphy等，1996，Prostate29371-380)。因此，樹(shù)突細(xì)胞可用來(lái)將PSCA肽呈遞到T細(xì)胞的MHCI或II類(lèi)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，自體樹(shù)突細(xì)胞被能夠結(jié)合到MHCI類(lèi)和/或II類(lèi)分子的PSCA肽脈沖。另一實(shí)施方案中，樹(shù)突細(xì)胞被完整的PSCA蛋白脈沖。再一個(gè)實(shí)施方案包括用本領(lǐng)域已知的各種執(zhí)行載體使PSCA基因在樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)，所述載體例如腺病毒(Arthur等，1997，CancerGeneTher.417-25)、反轉(zhuǎn)錄病毒(Henderson等，1996，CancerRes.563763-3770)、慢病毒、腺伴隨病毒、DNA轉(zhuǎn)染(Ribas等，1997，CancerRes.572865-2869)或腫瘤衍生的RNA轉(zhuǎn)染(Ashley等，1997，J.Exp.Med.1861177-1182)。也可工程改造表達(dá)PSCA的細(xì)胞來(lái)表達(dá)免疫調(diào)節(jié)劑，如GM-CSF，并將其用作免疫劑。X.B.)將PSCA作為以抗體為基礎(chǔ)的治療的靶標(biāo)PSCA在基于抗體的治療策略中是很有吸引力的靶標(biāo)。本領(lǐng)域中已知許多種用于靶向胞外和胞內(nèi)分子的抗體策略(參見(jiàn)例如，complementandADCCmediatedkillingaswellastheuseofintrabodies)。由于PSCA較相應(yīng)的正常細(xì)胞而言由各種癌細(xì)胞系表達(dá)，制備了全身性給予的PSCA-免疫反應(yīng)性組合物，該組合物具有優(yōu)良的敏感性，且不會(huì)因該免疫反應(yīng)性組合物與非靶標(biāo)器官和組織的結(jié)合而產(chǎn)生毒性、非特異性和/或非靶向性作用。與PSCA結(jié)構(gòu)域發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體可用于全身性治療表達(dá)PSCA的癌癥，其可與毒素或治療劑聯(lián)用，或用作能抑制細(xì)胞增殖或功能的裸露抗體?？蓪SCA抗體導(dǎo)入患者，從而使得該抗體結(jié)合于PSCA并調(diào)整如下功能例如與結(jié)合對(duì)象的相互反應(yīng)以及其后介導(dǎo)的破壞腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。此類(lèi)抗體具有治療效果的機(jī)制可包括補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解、抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性、對(duì)PSCA生理功能的調(diào)節(jié)、對(duì)配體結(jié)合或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制、對(duì)腫瘤細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、對(duì)腫瘤血管生成因子分布的改變、和/或凋亡。舉例包括用于非霍奇金淋巴瘤的Rituxan、用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的Herceptin以及用于結(jié)腸直腸癌的Erbitux。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解抗體可用于特異性靶向和結(jié)合免疫原性分子，例如圖1所示的PSCA序列的免疫原性區(qū)域。此外，熟練的技術(shù)人員會(huì)理解將抗體與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)是很常規(guī)的(參見(jiàn)例如，Slevers等，Blood93113678-3684(1999年6月1日))。將細(xì)胞毒劑和/或治療劑通過(guò)例如將它們與該細(xì)胞表達(dá)的分子(例如PSCA)特異性結(jié)合的抗體偶聯(lián)的方法直接遞送給細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞毒劑將對(duì)那些細(xì)胞發(fā)揮其已知的生物效應(yīng)(即，細(xì)胞毒性)。本領(lǐng)域已知用于抗體-細(xì)胞毒劑偶聯(lián)物以殺傷細(xì)胞的許多組合物和方法。在癌癥方面，常用的方法包括給予帶有腫瘤的動(dòng)物生物學(xué)有效量的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含與靶向劑(例如抗PSCA抗體)結(jié)合的所選細(xì)胞毒劑和/或治療劑，易于結(jié)合或定位到細(xì)胞表面。一個(gè)典型的實(shí)施方式是將細(xì)胞毒劑和/或治療劑遞送給表達(dá)PSCA的細(xì)胞的方法，所述方法包括使細(xì)胞毒劑與免疫特異性結(jié)合于PSCA表位的抗體偶聯(lián)，然后使所述細(xì)胞與該抗體-藥物偶聯(lián)物接觸。另一示例性的實(shí)施方式是治療疑似患有轉(zhuǎn)移性癌癥的個(gè)體的方法，所述方法包括以下步驟非胃腸道給予所述個(gè)體包含治療有效量的與細(xì)胞毒劑和/或治療劑偶聯(lián)的抗體的藥物組合物?？砂凑找言谄渌?lèi)型癌癥的治療中成功應(yīng)用的各種途徑來(lái)進(jìn)行采用抗PSCA的癌癥免疫治療，所述其它類(lèi)型的癌癥包括但不限于結(jié)腸癌(Arlen等，1998，Crit.Rev.Immunol.18133-138)、多發(fā)性骨髓瘤(Ozaki等，1997，Blood903179-3186，Tsunenari等，1997，Blood902437-2444)、胃癌(Kasprzyk等，1992，CancerRes.522771-2776)、B細(xì)胞淋巴瘤(Funakoshi等，1996，J.Immunother.EmphasisTumorImmunol.1993-101)、白血病(Zhong等，1996，Leuk.Res.20581-589)、結(jié)腸直腸癌(Moun等，1994，CancerRes.546160-6166；Velders等，1995，CancerRes.554398-4403)以及乳腺癌(Shepard等，1991，J.Clin.Immunol.11117-127)。一些治療途徑涉及將裸露抗體與毒素或放射性同位素偶聯(lián)，例如分別將Y91或I131與抗CD20抗體(例如，ZevalinTM，IDECPharmaceuticaisCorp.或BexxarTM，CoulterPharmaceuticals)偶聯(lián)，而其它則涉及共同給予抗體和其它治療劑，例如共同給予HerceptinTM(曲妥單抗)和紫杉醇(Genentech，Inc.)?？蓪⑺隹贵w與治療劑偶聯(lián)。對(duì)于前列腺癌的治療，例如可同時(shí)給予PSCA抗體和放療、化療護(hù)激素去除。還可將抗體與以下物質(zhì)偶聯(lián)毒素(例如，MylotargTM，Wyeth-Ayerst，Madison，NJ，一種與抗腫瘤抗生素刺孢霉素偶聯(lián)的重組人化IgG4κ抗體)或美登醇(maytansinoid，例如基于紫杉烷的腫瘤活性前藥，TAP，platform，ImmunoGen，Cambridge，MA，也可參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5,416,064)或AuristatinE(NatBiotechnol.2003年7月；21(7)778-84。(SeattleGenetics))。雖然PSCA抗體治療可用于癌癥的所有階段，但抗體治療尤為適宜用于晚期或轉(zhuǎn)移癌中?？蔀橐呀邮芰艘换蚨噍喕煹幕颊咧付ㄟM(jìn)行本發(fā)明的抗體治療?；蛘撸瑢?duì)于未接受化療的患者，可將本發(fā)明的抗體治療與化療或放療方案結(jié)合進(jìn)行。此外，抗體治療能使得采用降低劑量的聯(lián)用化療劑成為可能，尤其是在對(duì)化療劑毒性的耐受性不是很好的患者中。Fan等(CancerRes.534637-4642，1993)、Prewett等(InternationalJ.ofOnco.9217-224，1996)和Hancock等(CancerRes.514575-4580，1991)中描述了多種抗體與化療劑的共同使用。雖然PSCA抗體治療可用于癌癥的所有階段，但抗體治療尤為適宜用于晚期或轉(zhuǎn)移癌中。可為已接受了一或多輪化療的患者指定進(jìn)行本發(fā)明的抗體治療?；蛘撸瑢?duì)于未接受化療的患者，可將本發(fā)明的抗體治療與化療或放療方案結(jié)合進(jìn)行。此外，抗體治療能使得采用降低劑量的聯(lián)用化療劑成為可能，尤其是在對(duì)化療劑毒性的耐受性不是很好的患者中?？稍u(píng)價(jià)癌癥患者的PSCA表達(dá)或水平，優(yōu)選采用腫瘤組織的免疫組織化學(xué)評(píng)定、定量PSCA成象或其它可靠指示PSCA表達(dá)的存在和程度的技術(shù)。腫瘤活檢或手術(shù)標(biāo)本的免疫組織化學(xué)分析優(yōu)選用于此目的。腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析法是本領(lǐng)域熟知的。治療前列腺癌和其它癌癥的抗-PSCA單克隆抗體包括那些能誘導(dǎo)抗腫瘤強(qiáng)效免疫應(yīng)答的抗體或直接導(dǎo)致細(xì)胞毒性的抗體。就這點(diǎn)而言，抗-PSCA單克隆抗體(MAb)可通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的或抗體依賴(lài)的細(xì)胞細(xì)胞毒性(ADCC)機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解，這兩種機(jī)制都要求免疫球蛋白分子的完整Fc部分與補(bǔ)體蛋白上的效應(yīng)細(xì)胞Fc受體位點(diǎn)相互作用。此外，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)揮直接生物效應(yīng)的抗-PSCAMAb可用于治療表達(dá)PSCA的癌癥。細(xì)胞毒MAb的直接作用機(jī)制包括抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)腫瘤血管形成因子的特性和誘導(dǎo)凋亡。用多種評(píng)價(jià)細(xì)胞死亡的體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)了特定抗-PSCAMAb發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制，這些試驗(yàn)通常是本領(lǐng)域已知的，如ADCC、ADMMC、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解等等。一些患者中，使用鼠類(lèi)或其它非人單克隆抗體或人/小鼠嵌合MAb可誘導(dǎo)中等至強(qiáng)的抗非人抗體的免疫應(yīng)答。這可導(dǎo)致從循環(huán)中清除抗體和降低功效。最嚴(yán)重時(shí)，這種免疫應(yīng)答可導(dǎo)致大量形成免疫復(fù)合體，這種復(fù)合體可能造成腎衰竭。因此，優(yōu)選的用于本發(fā)明治療方法的單克隆抗體是完全長(zhǎng)人的或人源化的，并以高親和力特異性結(jié)合靶PSCA抗原，但在患者內(nèi)有低抗原性或沒(méi)有抗原性。本發(fā)明的治療方法包括單獨(dú)給予的抗-PSCAMAb以及其它MAb的組合物或混合物。這種MAb混合物具有某些優(yōu)點(diǎn)，這是由于它們含有的MAb可靶向不同表位、采用不同的效應(yīng)機(jī)制或?qū)⒓?xì)胞毒MAb與依賴(lài)于免疫效應(yīng)功能的MAb直接組合。這種組合的MAb可發(fā)揮協(xié)同治療作用。此外，抗-PSCAMAb可與其它治療形式一起給予，包括但不限于各種化學(xué)治療劑、雄激素阻斷劑、免疫調(diào)節(jié)劑(例如IL-2、GM-CSF)、手術(shù)或放療?？?PSCAMAb以其“裸露”形式或非結(jié)合形式給予，或者可與治療劑結(jié)合?？?PSCA抗體制劑可通過(guò)任何能夠?qū)⒖贵w輸送到腫瘤細(xì)胞的途徑給予。給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、瘤內(nèi)、真皮內(nèi)等等。治療一般包括通過(guò)可接受的給藥途徑如靜脈注射(IV)重復(fù)給予抗-PSCA抗體制劑，其劑量范圍一般約為每千克體重0.1、.2、.3、.4、.5、.6、.7、.8、.9.、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25毫克。通常，每周10-1000mgMAb的劑量是有效的并且是可以耐受的?；谟肏erceptinTM治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床試驗(yàn)，一種可接受的劑量方案是，起始負(fù)荷劑量約為每千克患者體重靜脈注射4mg，然后以約2mg/kg的劑量每周靜脈注射一次抗-PSCAMAb制劑。優(yōu)選地，起始負(fù)荷劑量是以90分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間灌輸給予的。定期維持劑量以30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間的灌輸給予，只要起始劑量可良好耐受。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員都知道，在具體病理中，許多因素會(huì)影響理想的劑量方案。這些因素包括，例如，所用Ab或MAb的結(jié)合親和力和半衰期、PSCA在患者內(nèi)的表達(dá)程度、循環(huán)排除PSCA抗原的程度、所需穩(wěn)定狀態(tài)的抗體濃度水平、治療頻率、與本發(fā)明的治療方法聯(lián)合使用的化療劑或其它試劑的影響以及具體患者的健康狀況。任選地，可評(píng)價(jià)患者給定樣品內(nèi)PSCA的水平(例如循環(huán)PSCA抗原和/或PSCA表達(dá)細(xì)胞的水平)以幫助確定最有效的劑量方案等。這種評(píng)價(jià)也可用來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)治療的目的，并且可結(jié)合其它參數(shù)的評(píng)估(例如膀胱癌治療中的尿細(xì)胞學(xué)和/或免疫細(xì)胞化學(xué)水平，或通過(guò)類(lèi)推，前列腺癌治療中的血清PSA水平)來(lái)衡量治療效果?？?獨(dú)特型抗-PSCA抗體也可用作抗癌療法的疫苗素誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)PSCA相關(guān)蛋白的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。具體地說(shuō)，抗-獨(dú)特型抗體的產(chǎn)生是本領(lǐng)域熟知的；該方法適合產(chǎn)生模擬PSCA相關(guān)蛋白上的表位的抗-獨(dú)特型抗-PSCA抗體(見(jiàn)例如Wagner等，1997，Hybridoma1633-40；Foon等，1995，J.Clin.Invest.96334-342；Herlyn等，1996，CancerImmunol.Immunother.4365-76)。這種抗-獨(dú)特型抗體可用于癌癥疫苗方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供抑制或延緩表達(dá)PSCA的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的PSCA抗體。本發(fā)明的另一目的是提供在哺乳動(dòng)物中(優(yōu)選為人類(lèi))抑制血管生成和其它生物學(xué)功能從而減少腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法采用PSCA抗體、尤其是將這些PSCA抗體與放療或化療劑或這兩者聯(lián)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)聯(lián)用PSCA抗體和化療劑或放療劑或它們的組合治療包括人腫瘤在內(nèi)的腫瘤時(shí)，具有協(xié)同作用。換言之，PSCA抗體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用在聯(lián)用化療劑或放療或它們的組合時(shí)，比預(yù)想中提高得更多。協(xié)同作用可通過(guò)例如與單用PSCA抗體治療或用PSCA抗體和化療劑或放療的加合效果相比，聯(lián)合治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用比預(yù)想中更大來(lái)顯示。優(yōu)選，采用癌癥的減輕來(lái)證明協(xié)同作用，這一減輕相對(duì)于采用裸露PSCA抗體的治療或采用PSCA抗體和化療劑或放療的加合治療是意想不到的。采用PSCA抗體以及化療或放療的組合或同時(shí)采用兩者來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法包括在開(kāi)始化療或放療之前、期間或之后給予PSCA抗體，以及它們的任何組合(即，在開(kāi)始化療和/或放療之前和期間、之前和之后、或之前、期間和之后)。例如，通常在開(kāi)始放療和/或化療前1-60天之間，優(yōu)選3-40天之間，更優(yōu)選5-12天之間給予所述PSCA抗體。然而，可根據(jù)治療記錄和特殊患者的需要，以可提供最有效的治療和最終延長(zhǎng)患者生命的方式實(shí)施該方法?；焺┑慕o予可通過(guò)多種方式進(jìn)行，包括通過(guò)胃腸道外和途徑進(jìn)行全身性給藥。在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述PSCA抗體和化療劑作為分開(kāi)的分子給藥。在另一實(shí)施方式中，所述PSCA抗體是附著(例如，通過(guò)偶聯(lián))于化療劑的。(參見(jiàn)標(biāo)題為“通過(guò)體內(nèi)使用人抗PSCA抗體治療和診斷人癌的人臨床試驗(yàn)”的實(shí)施例)和(參見(jiàn)標(biāo)題為“將PSCA作為以抗體為基礎(chǔ)的治療的靶標(biāo)”的部分)?；焺┗蚧煹木唧w實(shí)例包括順鉑、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、放線菌素D、二氯甲二乙胺(氮芥)、鏈佐星、環(huán)磷酰胺，、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、柔紅霉素、丙卡巴肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、博來(lái)霉素、紫杉醇(泰素)、多西他賽(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉑、克拉屈濱、達(dá)卡巴嗪、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、干擾素α、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、光輝霉素、米托坦、培門(mén)冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、鏈佐星、它莫西芬、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥(niǎo)嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、長(zhǎng)春瑞濱、苯丁酸氮芥、紫杉醇或它們的組合。用于與PSCA抗體聯(lián)用的放射源可位于接受治療的患者的外部或內(nèi)部。當(dāng)所述放射源位于患者的外部，這種治療被稱(chēng)為外線束放射療法(EBRT)。當(dāng)所述放射源位于患者的內(nèi)部，這種治療被稱(chēng)為近距離放射療法(BT)。根據(jù)熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)采用為了該目的制造的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備(例如AECL放射治療機(jī)和Varian醫(yī)用直線加速器)來(lái)給予該放射。放射劑量取決于本領(lǐng)域已知的多種因素。這些因素包括接受治療的器官、在放射路徑中可能會(huì)受到不良影響的健康器官、患者對(duì)放療的耐受性以及需要進(jìn)行治療的身體區(qū)域。該劑量通常為1-100Gy，更具體為2-80Gy。已報(bào)道的一些劑量包括對(duì)脊髓施予35Gy，對(duì)腎臟施予15Gy，對(duì)肝臟施予20Gy以及對(duì)前列腺施予65-80Gy。然而應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是本發(fā)明并不限于任何具體的劑量?？捎芍委熱t(yī)生按照給定情況下的具體因素(包括上述的因素)來(lái)確定劑量。外部放射源與進(jìn)入患者的點(diǎn)之間的距離可為能使對(duì)靶T細(xì)胞的殺傷和使副作用最小化達(dá)到適宜平衡的任何距離。通常外部放射源與進(jìn)入患者的點(diǎn)之間的距離為70-100cm。近距離放射療法通常是通過(guò)將放射源置于患者中來(lái)進(jìn)行的。通常，將放射源放置在距離要治療的器官的約0-3cm處。已知的技術(shù)包括間質(zhì)、腔內(nèi)和表面近距離放射療法?？捎谰眯灾踩牖驎簳r(shí)性植入放射性粒源。一些已用于永久性植入的典型放射性原子包括碘-125和氡。一些已用于暫時(shí)性植入的典型放射性原子包括鐳、銫-137和銥-192。一些已用于近距離放射療法的其它放射性原子包括镅-241和金-198。用于近距離放射療法的輻射劑量可與上述的外線束放射治療的劑量相同。除了上述用于確定外線束放射治療劑量的因素以外，在確定近距離放射療法的劑量時(shí)還要考慮到所用放射性原子的性質(zhì)。X.C.)PSCA作為細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶標(biāo)疫苗和制備疫苗的方法是本發(fā)明的另一實(shí)施方案，所述疫苗含有免疫有效量的一種或多種這里所述HLA-結(jié)合肽。此外，本發(fā)明的疫苗包含一種或多種所述肽的組合物。肽可單獨(dú)存在于疫苗中?；蛘?，所述肽可作為含有同一肽多個(gè)拷貝的均聚物或作為不同肽的雜聚物存在。聚合物的優(yōu)點(diǎn)在于有增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且由于使用了不同的表位而使聚合物具有額外的誘導(dǎo)與免疫應(yīng)答尋靶的病原生物或腫瘤-相關(guān)肽的不同抗原決定子反應(yīng)的抗體和/或CTL的額外能力。所述組合物可以是天然產(chǎn)生的抗原區(qū)域或這可以通過(guò)例如重組或化學(xué)合成方法制備。可與本發(fā)明的疫苗一起使用的載體是本領(lǐng)域熟知的，其中包括，例如甲狀腺球蛋白，白蛋白如人血清白蛋白，破傷風(fēng)類(lèi)毒素，聚氨基酸如聚L-賴(lài)氨酸、聚L-谷氨酸，流感病毒、乙肝病毒核蛋白等等。疫苗可含有生理上可耐(即可接受的)稀釋劑，如水或鹽水，優(yōu)選磷酸緩沖鹽水。疫苗中通常還可含有佐劑。不完全弗氏佐劑、硫酸鋁、氫氧化鋁或明礬等佐劑都是本領(lǐng)域熟知的材料的例子。此外，如本文所述，將本發(fā)明的肽與脂質(zhì)如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酸-絲氨酸(P3CSS)結(jié)合可引發(fā)CTL應(yīng)答。此外，發(fā)現(xiàn)佐劑，如含有合成胞嘧啶-硫代磷酸化-鳥(niǎo)嘌呤(CpG)的合成寡核苷酸可使CTL應(yīng)答提高10-100倍(見(jiàn)例如Davila和Celis，J.Immunol.165539-547(2000))。通過(guò)注射、氣溶膠、口服、透皮、透粘膜、胸膜內(nèi)、鞘內(nèi)或其它合適途徑用本發(fā)明的肽組合物免疫之后，宿主的免疫系統(tǒng)可通過(guò)產(chǎn)生大量所需抗原特異性的CTL和/或HTL對(duì)疫苗產(chǎn)生反應(yīng)。之后，宿主對(duì)隨后產(chǎn)生的表達(dá)或過(guò)度表達(dá)PSCA的細(xì)胞至少有部分免疫力，或者對(duì)該抗原相關(guān)的腫瘤至少能產(chǎn)生一些治療作用。在一些實(shí)施方案中，宜將I類(lèi)肽組分與誘導(dǎo)或促進(jìn)產(chǎn)生對(duì)該靶抗原的中和抗體和或輔助T細(xì)胞應(yīng)答的組分組合。這種組合物的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包含本發(fā)明的I類(lèi)和II類(lèi)表位。這種組合物的另一個(gè)實(shí)施方案包含本發(fā)明的I類(lèi)和/或II類(lèi)表位以及交叉反應(yīng)性HTL表位，如PADRE(Epimmune，SanDiego，CA)分子(描述在例如美國(guó)專(zhuān)利5,736,142中)。本發(fā)明的疫苗還可包含抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹(shù)突細(xì)胞(DC)，作為呈遞本發(fā)明的肽的載體。可在體外產(chǎn)生疫苗組合物，然后活動(dòng)并收獲樹(shù)突細(xì)胞，從而在體外加載樹(shù)突細(xì)胞。例如，樹(shù)突細(xì)胞可用例如本發(fā)明的小基因轉(zhuǎn)染或用肽脈沖。然后將該樹(shù)突細(xì)胞給予患者并在體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答。基于DNA或肽的疫苗組合物也可體內(nèi)施用，同時(shí)活動(dòng)樹(shù)突細(xì)胞，從而在體內(nèi)加載樹(shù)突細(xì)胞。在選擇多表位組合物的表位陣列時(shí)優(yōu)選采用以下原則，所述多表位組合物被用于疫苗或者用來(lái)選擇疫苗中所包含的和/或由核酸(如小基因)編碼的不連續(xù)表位。為進(jìn)行此種選擇宜平衡以下原則。加入給定疫苗組合物內(nèi)的多個(gè)表位可以是但不需要是產(chǎn)生該表位的天然抗原序列中毗連的表位。1.)選擇在施用后模擬與清除腫瘤有關(guān)的免疫應(yīng)答的表位。對(duì)于HLAI類(lèi)而言，包括來(lái)自至少一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的3-4個(gè)表位。對(duì)于HLAII類(lèi)采用了類(lèi)似的原理；又從至少一個(gè)TAA中選擇了3-4個(gè)表位(見(jiàn)例如Rosenberg等，Science2781447-1450)。來(lái)自一個(gè)TAA的表位可與來(lái)自一個(gè)或多個(gè)其它TAA的表位組合以產(chǎn)生能靶向腫瘤并改變常見(jiàn)的TAA表達(dá)模式的疫苗。2.)選擇具有與免疫原性有關(guān)的必需結(jié)合親和力的表位對(duì)HLAI類(lèi)分子，IC50為500nM或更低，通常為200nM或更低；對(duì)II類(lèi)分子，IC50為1000nM或更低。3.)選擇具有足夠超基序的肽，或具有足夠等位基因特異性基序的肽陣列，以得到較寬的群體覆蓋率。例如優(yōu)選有至少80％的群體覆蓋率?？捎帽绢I(lǐng)域已知的統(tǒng)計(jì)計(jì)算法—MonteCarlo分析來(lái)評(píng)價(jià)群體覆蓋的寬度或冗余。4.)當(dāng)選擇癌癥相關(guān)抗原表位時(shí)經(jīng)常選擇類(lèi)似物，這是由于患者可能已經(jīng)建立了對(duì)天然表位的耐受。5.)特別適合的表位稱(chēng)為“嵌套表位(nestedepitope)”。嵌套表位見(jiàn)于某一給定肽序列的至少兩個(gè)表位重疊處。嵌套的肽序列可包括B細(xì)胞、HLAI類(lèi)和/或HLAII類(lèi)表位。當(dāng)提供嵌套表位時(shí)，一般的目的是提供每個(gè)序列的最大表位數(shù)。因此，一方面是避免提供比肽氨基末端表位的氨基末端長(zhǎng)或比肽羧基末端表位的羧基末端長(zhǎng)的肽。當(dāng)提供多表位序列時(shí)，例如含有嵌套表位的序列時(shí)，為確保不具有致病或其它有害生物學(xué)性能，篩選序列通常是重要的。6.)如果產(chǎn)生了多表位蛋白質(zhì)或在產(chǎn)生小基因時(shí)，一個(gè)目的是產(chǎn)生包括感興趣表位的最小的肽。該原則與選擇包含嵌套表位的肽的原則相同或類(lèi)似。然而，若是人造多表位肽，長(zhǎng)度最小化的目的是使整合在該多表位蛋白質(zhì)中各表位之間的間隔序列相平衡。例如，可引入間隔氨基酸殘基以避免相連表位(可被免疫系統(tǒng)識(shí)別但靶抗原中不存在并且只能通過(guò)人為并列表位而產(chǎn)生的表位)相連，或便于在各表位之間切斷從而增強(qiáng)表位呈遞。由于受體可產(chǎn)生針對(duì)非天然表位的免疫應(yīng)答，所以通常需要避免表位相連。當(dāng)相連表位是“優(yōu)勢(shì)表位”時(shí)需要特別注意。優(yōu)勢(shì)表位可導(dǎo)致對(duì)其它被削弱或被抑制表位的零應(yīng)答。7.)當(dāng)存在同一靶蛋白多個(gè)變體的序列時(shí)，也可根據(jù)它們的保密性選擇可能的肽表位。例如，保密性的標(biāo)準(zhǔn)可規(guī)定，HLAI類(lèi)結(jié)合肽的整個(gè)序列或II類(lèi)結(jié)合肽的整個(gè)9-肽核心對(duì)某具體蛋白質(zhì)抗原所指定的序列評(píng)價(jià)其百分率是保守的。X.C.1.小基因疫苗有許多不同的能夠同時(shí)輸送多個(gè)表位的方法。編碼本發(fā)明的肽的核酸是本發(fā)明的一個(gè)特別有用的實(shí)例。根據(jù)以上章節(jié)設(shè)定的指南，優(yōu)選包含在小基因中的表位。一個(gè)優(yōu)選的給予編碼本發(fā)明肽的核酸的方法使用編碼含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表位的肽的小基因構(gòu)建物。下文和以下文獻(xiàn)描述了多表位小基因的應(yīng)用Ishioka等，J.Immunol.1623915-3925，1999；An，L.和Whitton，J.L.，J.Virol.712292，1997；Thomson，S.A.等，J.Immunol.157822，1996；Whitton，J.L.等，J.Virol.67348，1993；Hanke，R.等，Vaccine16426，1998。例如，可經(jīng)工程改造產(chǎn)生一種多表位DNA質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼帶有超基序和/或基序的PSCA衍生表位、PADREò通用輔助T細(xì)胞表位或PSCA的多個(gè)HTL表位(見(jiàn)例如表V-XVIII和XXII-LI)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列。疫苗也可包含衍生自其它TAA的表位。可在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)驗(yàn)證多表位小基因的免疫原性以評(píng)估針對(duì)測(cè)試表位誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答反應(yīng)的數(shù)量級(jí)。此外，DNA編碼表位的體內(nèi)免疫原性可與特定CTL品系針對(duì)被該DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞的體外應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。因此，這些實(shí)驗(yàn)可顯示這種小基因的兩種作用1.)產(chǎn)生CTL應(yīng)答，和2.)誘導(dǎo)CTL識(shí)別的細(xì)胞表達(dá)編碼的表位。例如，為產(chǎn)生編碼所選表位(小基因)的DNA序列以在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)，可反翻譯該表位的氨基酸序列?？捎萌嗣艽a子表來(lái)選擇各個(gè)氨基酸的密碼子。這些編碼表位的DNA序列可直接毗鄰，因此當(dāng)翻譯時(shí)可產(chǎn)生連續(xù)的多肽序列。為使表達(dá)和/或免疫原性最優(yōu)，可在設(shè)計(jì)小基因時(shí)加入其它元件?？杀环捶g的小基因序列內(nèi)的氨基酸序列的例子包括HLAI類(lèi)表位、HLAII類(lèi)表位、抗體表位、遍在蛋白化信號(hào)序列和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)。此外，可通過(guò)加入合成的(例如聚丙氨酸)或天然產(chǎn)生的毗鄰CTL或HTL表位的側(cè)接序列來(lái)改進(jìn)CTL和HTL表位的HLA呈遞；這些較大的肽包括的表位屬于本發(fā)明范圍?？赏ㄟ^(guò)組裝編碼小基因正鏈和負(fù)鏈的寡核苷酸將小基因序列轉(zhuǎn)化成DNA?？捎檬熘募夹g(shù)在適當(dāng)條件下合成、磷酸化、純化和退火重疊寡核苷酸(長(zhǎng)30-100個(gè)堿基)。可用例如T4DNA連接酶連接寡核苷酸的末端。然后將這種合成的編碼表位多肽的小基因克隆入所需表達(dá)載體。載體中優(yōu)選包含精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)序列以確保在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。需要一些載體元件帶有下游克隆位點(diǎn)以插入小基因的啟動(dòng)子；有效終止轉(zhuǎn)錄的聚腺苷化信號(hào)；用來(lái)復(fù)制的大腸桿菌起點(diǎn)；和大腸桿菌可選擇標(biāo)記(例如氨芐青霉素或卡那霉素抗性)。許多啟動(dòng)子可用于該目的，例如人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動(dòng)子。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,580,859和5,589,466以了解其它合適的啟動(dòng)子序列?？杉尤肫渌d體修飾以?xún)?yōu)化小基因的表達(dá)和免疫原性。一些情況下，需要內(nèi)含子以進(jìn)行有效的基因表達(dá)，可在小基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)摻入一個(gè)或多個(gè)合成的或天然產(chǎn)生的內(nèi)含子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)加入mRNA穩(wěn)定序列以及復(fù)制的序列也可提高小基因的表達(dá)。一旦選擇了表達(dá)載體，可將小基因克隆到啟動(dòng)子下游的多接頭區(qū)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌菌株并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備DNA。通過(guò)限制性酶切繪圖和DNA序列分析驗(yàn)證小基因的取向以及DNA序列以及載體內(nèi)的所有其它元件。包含正確質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞可保存作為主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)。此外，免疫刺激序列(ISS或CpG)似乎在DNA疫苗的免疫原性中發(fā)揮作用。如果需要增強(qiáng)免疫原性，可在載體的小基因編碼序列之外包含這些序列。一些實(shí)施方案中，可使用能夠制造小基因編碼表位和第二蛋白質(zhì)(可增強(qiáng)或降低免疫原性)的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體。共同表達(dá)時(shí)可有利地增強(qiáng)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或多肽的例子包括細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子(例如LeIF)、共刺激分子，或者對(duì)于HTL應(yīng)答有pan-DR結(jié)合蛋白(PADRE，Epimmune，SanDiego，CA)。輔助(HTL)表位可結(jié)合到胞內(nèi)尋靶信號(hào)并與CTL表位獨(dú)立表達(dá)；這可將HTL表位導(dǎo)向不同于CTL表位的細(xì)胞區(qū)室。需要的話，這可使HTL表位更有效地進(jìn)入HLAII類(lèi)途徑，從而促進(jìn)HTL誘導(dǎo)。與HTL或CTL誘導(dǎo)相反，通過(guò)共表達(dá)免疫抑制分子(例如TGF-b)特異性降低免疫應(yīng)答對(duì)于某些疾病有益?？赏ㄟ^(guò)例如在大腸桿菌內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)然后再純化來(lái)生產(chǎn)治療量的質(zhì)粒DNA。按照熟知的技術(shù)，將等量的工作細(xì)胞庫(kù)接種到生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在搖瓶或生物反應(yīng)器內(nèi)生長(zhǎng)至飽和。質(zhì)粒DNA可用標(biāo)準(zhǔn)生物分離技術(shù)純化，例如QIAGEN，Inc.(Valencia，California)提供的固相陰離子交換樹(shù)脂。需要的話可用凝膠電泳或其它方法將開(kāi)環(huán)形式和線型形式中的DNA與超螺旋DNA相分離?？芍苽浼兓馁|(zhì)粒DNA以便用各種制劑進(jìn)行注射。最簡(jiǎn)單的方法是用無(wú)菌磷酸緩沖鹽水(PBS)重建凍干的DNA。這種稱(chēng)為“裸DNA”的方法目前在臨床試驗(yàn)中被用于肌肉內(nèi)(IM)給藥。為盡可能提高基因DNA疫苗的免疫治療作用，可以采用其它配制純化的質(zhì)粒DNA的方法。已經(jīng)描述過(guò)許多方法，并且也可使用新技術(shù)。該試劑可采用陽(yáng)離子脂質(zhì)、糖脂和促融脂質(zhì)體(見(jiàn)例如以下文獻(xiàn)所述WO93/24640；Mannino&Gould-Fogerite，BioTechniques6(7)682(1988)；美國(guó)專(zhuān)利5,279,833；WO91/06309；以及Felgner等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA847413(1987)。此外，肽以及統(tǒng)稱(chēng)為保護(hù)性、交互反應(yīng)性、非凝聚化合物(PINC，protective，interactive，non-condensingcompound)的化合物也可與純化的質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物，以改變例如穩(wěn)定性、肌肉內(nèi)分散性或?qū)μ囟ㄆ鞴倩蚣?xì)胞類(lèi)型的運(yùn)輸?shù)茸兞?。靶?xì)胞致敏可被用作小基因編碼的CTL表位的表達(dá)和HLAI類(lèi)呈遞的功能測(cè)定。例如，質(zhì)粒DNA被引入適合作為標(biāo)準(zhǔn)CTL鉻釋放測(cè)試的靶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。所用轉(zhuǎn)染方法將千里眼最終的制劑。電穿孔可用于″裸″DNA，而陽(yáng)離子脂質(zhì)可用于直接體外轉(zhuǎn)染。表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)?？杀还厕D(zhuǎn)染以便通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些細(xì)胞然后用鉻-51(51Cr)標(biāo)記并被用作表位特異性CTL系的靶細(xì)胞；通過(guò)51Cr釋放檢測(cè)細(xì)胞溶解，它表明了小基因編碼的CTL表位的產(chǎn)生以及HLA呈遞?？捎妙?lèi)似的試驗(yàn)評(píng)價(jià)HLA表位的表達(dá)以便評(píng)估HLA活性。體內(nèi)免疫原性是檢測(cè)小基因DNA制劑功能的第二種方法。用DNA產(chǎn)物免疫接種表達(dá)合適人HLA蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。給藥劑量和途徑取決于所用的制劑(例如，對(duì)用PBS配的DNA采用IM途徑，對(duì)脂質(zhì)復(fù)合的DNA采用腹膜內(nèi)(i.p.)途徑)。免疫21天后收獲脾細(xì)胞并在存在編碼各個(gè)測(cè)試表位的肽時(shí)再刺激一周。然后可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)CTL效應(yīng)細(xì)胞溶解中帶有肽的51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞試驗(yàn)。被帶有與小基因編碼表位相對(duì)應(yīng)的肽表位的HLA致敏的靶細(xì)胞溶解證實(shí)了DNA疫苗制劑體內(nèi)誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。用類(lèi)似的方法證實(shí)HTL表位在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的免疫原性。或者，可用例如美國(guó)專(zhuān)利5,204,253中所述的彈道輸送法施用核酸。采用這種技術(shù)時(shí)，給予僅含有DNA的顆粒。在再一個(gè)實(shí)施方案中，可使DNA附著到顆粒例如金顆粒上。也可用本領(lǐng)域樹(shù)脂的細(xì)菌或病毒輸送系統(tǒng)來(lái)輸送小基因，例如可將編碼本發(fā)明表位的表達(dá)構(gòu)建物摻入牛痘等病毒載體。X.C.2.CTL肽和輔助肽的組合含有本發(fā)明的肽的疫苗組合物可被修飾，例如被類(lèi)似化，以提供所需特性，如血清半衰期改進(jìn)、群體覆蓋率變寬或免疫原性增強(qiáng)。例如，可使肽連接到含有至少一個(gè)能夠誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞應(yīng)答的表位的序列來(lái)增強(qiáng)肽誘導(dǎo)CTL活性的能力。盡管CTL肽可直接連接到T輔助肽，但通常通過(guò)間隔分子使CTL表位/HTL表位結(jié)合。這種間隔分子通常含有相對(duì)較小的中性分子，如在生理?xiàng)l件下基本上不帶電荷的氨基酸或氨基酸模擬物。間隔分子通常可選自，例如Ala、Gly或其它非極性氨基酸或中性極性氨基酸的中性間隔分子?？梢岳斫?，任選存在的間隔分子不一定要含有相同的殘基，因此可以是雜-或同-寡聚物。當(dāng)存在間隔分子時(shí)，間隔分子通常有至少一個(gè)或兩個(gè)殘基，更通常有3-6個(gè)殘基，有時(shí)甚至有10個(gè)或更多殘基?？蓪TL肽表位可直接或通過(guò)CTL肽氨基或羧基末端的間隔連接到T輔助肽表位。免疫原性肽或T輔助肽的氨基末端可被?；?。HTL肽表位也可被修飾以改變其生物特性。例如，它們可被修飾以包含D-氨基酸從而增強(qiáng)它們對(duì)蛋白酶的抗性并因此延長(zhǎng)它們的血清半衰期，或者它們可與其它分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等)結(jié)合以增強(qiáng)其生物活性。例如，T輔助肽可在氨基或羧基末端結(jié)合一條或多條棕櫚酸鏈。X.C.3.CTL肽和T細(xì)胞引發(fā)(priming)劑的組合一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中可包含至少一種能引發(fā)B淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞的組分。已鑒定脂質(zhì)能在體內(nèi)引發(fā)CTL。例如可將棕櫚酸殘基附加到賴(lài)氨酸殘基的e-和a-氨基上然后再通過(guò)一個(gè)或多個(gè)連接基(如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等)連接到免疫原性肽。脂質(zhì)化的肽然后可作為摻入脂質(zhì)體的微團(tuán)或顆粒直接施用，或用乳劑(如不完全弗氏佐劑)乳化后施用。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，特別有效的免疫原性組合物包含附加到Lys的e-和a-氨基上的棕櫚酸，然后通過(guò)接頭(如Ser-Ser)使其結(jié)合于免疫原性肽的氨基末端。引發(fā)CTL應(yīng)答的脂質(zhì)的另一個(gè)例子是大腸桿菌脂蛋白，如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)當(dāng)共價(jià)結(jié)合到合適的肽時(shí)可被用來(lái)引發(fā)病毒特異性CTL(見(jiàn)例如Deres等，Nature342561，1989)。本發(fā)明的肽可與例如P3CSS偶聯(lián)，并將脂肽施用給個(gè)體以引發(fā)針對(duì)靶抗原的特異性免疫應(yīng)答。此外，由于用P3CSS-綴合的表位引發(fā)也可誘生中和抗體，因此可將這樣的兩種組合物結(jié)合以更有效地引發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脈沖的DC的疫苗組合物本發(fā)明所述疫苗組合物的一個(gè)實(shí)施方案包括離體給予來(lái)自患者血液的PBMC或從中分離的DC帶有表位的肽的混合物。可使用有利于收獲DC的藥物，如ProgenipoietinTM(Pharmacia-Monsanto，St.Louis，MO)或GM-CSF/IL-4。用肽脈沖DC并在再輸注到患者之前洗滌DC以除去未結(jié)合的肽。該實(shí)施方案中，疫苗包含肽脈沖的DC，其表面存在脈沖肽表位與HlA分子形成的復(fù)合物。可用肽的混合物離體脈沖DC，混合物中有一些肽刺激針對(duì)PSCA的CTL應(yīng)答。可任選地含有輔助T細(xì)胞(HTL)肽，如天然或人造的疏松限制的HLAII類(lèi)肽，以促進(jìn)CTL應(yīng)答。因此，本發(fā)明的疫苗被用來(lái)治療表達(dá)或過(guò)度表達(dá)PSCA的癌癥。X.D.)過(guò)繼免疫治療抗原性PSCA-相關(guān)肽也被用來(lái)離體誘導(dǎo)CTL和/或HTL應(yīng)答。所得CTL或HTL細(xì)胞可被用來(lái)治療患者體內(nèi)的腫瘤，所述患者對(duì)其它傳統(tǒng)治療模式無(wú)反應(yīng)或?qū)?duì)本發(fā)明的治療性疫苗肽或核酸無(wú)反應(yīng)。通過(guò)在組織培養(yǎng)液內(nèi)一起培養(yǎng)患者的或遺傳相容的CTL或HTL前體細(xì)胞以及抗原呈遞細(xì)胞(APC)如樹(shù)突細(xì)胞和合適的免疫原性肽，離體誘導(dǎo)對(duì)特定抗原的CTL或HTL應(yīng)答。培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(通常約7-28天)之后，這期間前體細(xì)胞被激活并擴(kuò)增成為效應(yīng)細(xì)胞，將其灌輸回患者，它們將在這里破壞(CTL)或幫助破壞(HTL)它們的特異性靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染的樹(shù)突細(xì)胞也可被用作抗原呈遞細(xì)胞。X.E.)出于治療或預(yù)防目的施用疫苗本發(fā)明的藥物組合物和疫苗組合物通常可用來(lái)治療和/或預(yù)防表達(dá)或過(guò)表達(dá)PSCA的癌癥。在治療應(yīng)用中，可給予患者一定量的肽和/或核酸組合物，所述量足以引發(fā)有效的針對(duì)抗原的B細(xì)胞、CTL和/或HTL應(yīng)答，或者可治愈或至少部分阻止或減緩癥狀和/或并發(fā)癥。適合實(shí)現(xiàn)該目的的量被稱(chēng)為″治療有效劑量″。對(duì)該用途有效量將取決于，例如，所施用的具體組合物、給藥方式、被治療疾病的階段和嚴(yán)重性、患者的體重和健康狀況以及主治醫(yī)師的判斷。本發(fā)明的藥物組合物、免疫原性肽或編碼它們的DNA給予已經(jīng)帶有表達(dá)PSCA的腫瘤的個(gè)體。所述肽或其編碼DNA可單獨(dú)給予或以一個(gè)或多個(gè)肽序列的融合序列的形式給予。患者可用所述免疫原性肽單獨(dú)治療，或者適當(dāng)?shù)脑捯部膳c其它治療方法(如手術(shù))聯(lián)合治療。在治療應(yīng)用中，給藥通常開(kāi)始于首次被診斷出PSCA相關(guān)癌癥時(shí)。然后增加劑量直到至少癥狀基本緩解并再持續(xù)一段時(shí)間。輸送到患者的疫苗組合物(即包括但不限于例如肽混合物、多表位多肽、小基因或TAA特異性CTL或脈沖的樹(shù)突細(xì)胞)可根據(jù)疾病階段或患者的健康狀況而改變。例如，在患有表達(dá)PSCA的腫瘤的患者中，相比其它實(shí)例，含有PSCA特異性CTL的疫苗對(duì)于殺死晚期癌癥患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞更有效。通過(guò)一種給藥方式輸送足以有效刺激細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答量的肽表位通常是重要的；也可按照本發(fā)明的實(shí)施方案給予刺激輔助T細(xì)胞應(yīng)答的組合物。用于最初治療免疫的劑量通常以單位劑量出現(xiàn)，其范圍下限約為1、5、50、500或1,000μg，上限約為10,000、20,000、30,000或50,000μg。用于人的劑量值范圍通常為每70千克體重患者約500μg至約50,000μg。之后的數(shù)周至數(shù)月內(nèi)可提高劑量，增加劑量在約1.0mg和約50,000mg肽之間，這取決于通過(guò)測(cè)量獲自患者血液的CTL和HTL的比活確定的患者的反應(yīng)和狀況。可連續(xù)給藥直到臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室試驗(yàn)表明腫瘤已被排除或減少，并再持續(xù)一段時(shí)間。劑量、給藥途徑以及給藥方案將根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)判斷。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽和組合物可用于嚴(yán)重的疾病狀態(tài)，即威脅生命或有可能威脅生命的狀態(tài)。此時(shí)，基于外部物質(zhì)的最小量和優(yōu)選的本發(fā)明組合物中的肽的相對(duì)無(wú)毒特性，可以并且有必要給予患者相對(duì)所述劑量過(guò)量的肽組合物來(lái)進(jìn)行治療。本發(fā)明的疫苗組合物也可僅作為預(yù)防劑。最初的預(yù)防免疫接種劑量通常以單位劑量出現(xiàn)，其范圍下限為約1、5、50、500或1000μg，上限為約10,000、20,000、30,000或50,000μg。用于人的劑量值范圍通常為每70千克患者約500μg至約50,000μg。在初次接種疫苗之后以約4周至6個(gè)月的預(yù)定間隔給予強(qiáng)化劑量，強(qiáng)化劑量在約1.0mg和約50,000mg肽之間。疫苗的免疫原性可通過(guò)測(cè)量獲自患者血液樣品的CTL和HTL的特異性活性來(lái)評(píng)估。治療用的藥物組合物可通過(guò)腸胃外、外用、口、鼻、鞘內(nèi)或在局部(例如作為乳膏或外用軟膏)施用。優(yōu)選通過(guò)腸胃外施用藥物組合物，例如靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了供腸胃外用藥的組合物，其中包含溶于或懸浮在可接受載體，優(yōu)選含水載體內(nèi)的免疫原性肽的溶液?？墒褂酶鞣N含水載體，例如水、緩沖的水、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可用熟知的常規(guī)滅菌技術(shù)來(lái)滅菌，或者可被無(wú)菌過(guò)濾。所得水溶液可被包裝成直接使用的制劑，或被凍干，凍干的制品在給藥之前需要用無(wú)菌溶液重溶。所述組合物可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以滿足生理?xiàng)l件的需要，如pH-調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑等，具體例如有乙酸鈉、乳酸納、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。藥物制劑中本發(fā)明的肽的濃度是可變的，即其重量比例可從小于約0.1％(通常為或至少約2％)至20％-50％或更高，并將根據(jù)所選特定給藥模式主要通過(guò)液體體積、粘度等來(lái)選擇。藥物組合物中通常含有人單位劑量單位的組合物，所述藥物組合物包含人單位劑量的可接受的載體，在一個(gè)實(shí)施方案中是含水載體，并以精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的用來(lái)將這種組合物給予人類(lèi)的體積/質(zhì)量比進(jìn)行給藥(見(jiàn)例如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’sPharmaceuticalSciences)第17版，A.Gennaro編，MackPublishingCo.，Easton，Pennsylvania，1985)。例如，70kg體重患者的初次免疫肽劑量可從約1到約50,000mg，通常為100-5,000mg。例如，對(duì)核酸而言，初次免疫可用以0.5-5mg的量在多個(gè)部位通過(guò)IM(或SC或ID)給予的裸核酸形式的表達(dá)載體進(jìn)行。核酸(0.1-1000mg)也可用基因槍給予。3-4周后給予強(qiáng)化劑量。強(qiáng)化劑可以是以5-107至5x109pfu的劑量施用的重組禽痘病毒。對(duì)抗體而言，治療通常包括通過(guò)可接受的給予途徑，如靜脈注射(IV)，重復(fù)給予抗-PSCA抗體制品，其劑量通常為每千克體重約0.1-10mg。通常，每周10-500mgMAb的劑量是有效并能良好耐受的。此外，一種可以接受的抗-PSCAMAb制品的劑量方案是，每千克體重患者通過(guò)IV給予約4mg起始負(fù)荷劑量，然后每周通過(guò)IV給予約2mg/kg的劑量。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，在具體病例中，有許多因素會(huì)影響理想劑量。這些因素包括，例如，組合物的半衰期、Ab的結(jié)合親和力、物質(zhì)的免疫原性、PSCA在患者內(nèi)的表達(dá)程度、PSCA抗原的循環(huán)排除程度、所需穩(wěn)定狀態(tài)的濃度水平、治療頻率、與本發(fā)明的治療方法聯(lián)合使用的化療劑或其它試劑的影響以及特定患者的健康狀況。非限制性的優(yōu)選的人單位劑量是，例如，500μg-1mg、1mg-50mg、50mg-100mg、100mg-200mg、200mg-300mg、400mg-500mg、500mg-600mg、600mg-700mg、700mg-800mg、800mg-900mg、900mg-1g或1mg-700mg。在某些實(shí)施方案中，劑量范圍是每千克體重2-5mg，例如，然后每周給予1-3mg/kg；例如，然后是0.5mg、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/kg體重，每周給予，為期2、3或4周；例如，然后是0.5-10mg/kg體重，每周給予，為期2、3或4周；每周225、250、275、300、325、350、375、400mg/m2體表面積；每周1-600mg/m2體表面積；每周225-400mg/m2體表面積；這些劑量可每周給予，為期2、3、4、5、6、7、8、9、19、11、12或更多周。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸的人單位劑型包括合適的劑量范圍或提供任何治療效果的有效量。如本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所了解的，治療效果取決于許多因素，其中包括多核苷酸的序列、多核苷酸的分子量和給藥途徑。劑量通常由醫(yī)生或其它健康護(hù)理專(zhuān)家根據(jù)各種本領(lǐng)域已知的參數(shù)(例如癥狀的嚴(yán)重性、病史等)來(lái)選擇。通常，對(duì)于約20個(gè)堿基的多核苷酸而言，劑量范圍可選自，例如，獨(dú)立選擇的下限，如約0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500mg/kg，至獨(dú)立選擇的大于下限的上限，如約60、80、100、200、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000mg/kg。例如，劑量可以是以下任何一種0.1-100mg/kg、0.1-50mg/kg、0.1-25mg/kg、0.1-10mg/kg、1-500mg/kg、100-400mg/kg、200-300mg/kg、1-100mg/kg、100-200mg/kg、300-400mg/kg、400-500mg/kg、500-1000mg/kg、500-5000mg/kg或500-10,000mg/kg。通常，相比將核苷酸更直接地施加到疾病組織，腸胃外給藥途徑需要較高劑量的多核苷酸，當(dāng)多核苷酸長(zhǎng)度增加時(shí)劑量也需增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，T細(xì)胞的人單位劑型包括合適的劑量范圍或提供任何治療效果的有效量。如本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所了解的，治療效果取決于許多因素。劑量通常由醫(yī)生或其它健康護(hù)理專(zhuān)家根據(jù)各種本領(lǐng)域已知的各種參數(shù)(例如癥狀的嚴(yán)重性、病史等)來(lái)選擇。劑量可以是約104-106細(xì)胞、約106-108細(xì)胞、約108-1011細(xì)胞或約108-5×1010細(xì)胞。劑量還可以是約106細(xì)胞/m2至約1010細(xì)胞/m2，或約106細(xì)胞/m2至約108細(xì)胞/m2。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)的編碼核酸也可通過(guò)脂質(zhì)體給予，脂質(zhì)體具有以下作用1)使蛋白質(zhì)靶向特定組織如淋巴組織；2)選擇性尋靶疾病細(xì)胞；或3)延長(zhǎng)肽組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、微團(tuán)、不溶單層、液晶、磷脂分散體、多層等等。在這些制品中，將被輸送的肽被作為脂質(zhì)體的一部分單獨(dú)摻入或與結(jié)合淋巴細(xì)胞普遍受體的分子(如結(jié)合CD45抗原的單克隆抗體)或其它治療性或免疫原性成分一起摻入。因此，裝有所需的本發(fā)明的肽的脂質(zhì)體或用這種肽裝飾的脂質(zhì)體可被導(dǎo)向到淋巴細(xì)胞部位，然后脂質(zhì)體將在這里輸送所述肽組合物?？捎脴?biāo)準(zhǔn)載體形成脂質(zhì)來(lái)形成用于本發(fā)明的脂質(zhì)體，其中一般包括電中性和負(fù)電荷的磷脂和類(lèi)固醇(如膽固醇)。選擇脂質(zhì)時(shí)通常要考慮以下因素，例如脂質(zhì)體的大小、酸不穩(wěn)定性和脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性。有許多制備脂質(zhì)體的方法，例如以下文獻(xiàn)中所描述的方法Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)以及美國(guó)專(zhuān)利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369。為使細(xì)胞靶向免疫系統(tǒng)，被摻入脂質(zhì)體的配體例如可包括所需免疫系統(tǒng)的細(xì)胞表面決定簇的特異性抗體或其片段。含有肽的脂質(zhì)體懸液可通過(guò)靜脈內(nèi)、局部等途徑給予，其劑量可根據(jù)給藥方式、被輸送的肽以及被治療擊疾病的階段等因素而改變。對(duì)于固體組合物可使用常規(guī)的無(wú)毒固體載體，其中包括，例如，藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石。纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。為口服給藥，可通過(guò)摻入任何通常使用的賦形劑(如上面列出的那些載體)來(lái)形成藥學(xué)上可接受的無(wú)毒組合物，這種組合物中通常含有10-95％活性成分，即一種或多種本發(fā)明的肽，且更優(yōu)選的濃度為25％-75％。對(duì)于氣溶膠給藥，免疫原性肽優(yōu)選以細(xì)分的形式和表面活性劑及推進(jìn)劑一起提供。肽的重量比例通常為約0.01％-20％，優(yōu)選約1％-10％。當(dāng)然，表面活性劑必需是無(wú)毒的，并且優(yōu)選溶于推進(jìn)劑。代表性的這種試劑是含有6-22個(gè)碳原子的脂肪酸(如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油基硬脂酸(olestericacid)和油酸)與脂族多羥基醇或其環(huán)酐的酯或偏酯?？墒褂没旌系孽?，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性劑占組合物重量的約0.1％-20％，優(yōu)選約0.25-5％。用常規(guī)推進(jìn)劑平衡組合物。需要的話也可含有載體，例如鼻內(nèi)輸送時(shí)可含有卵磷脂。XI.)PSCA的診斷和預(yù)后實(shí)施方式如本文所述，PSCA多核苷酸、多肽、反應(yīng)性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)、反應(yīng)性輔助T細(xì)胞(HTL)和抗-多肽抗體被用于熟知的診斷、預(yù)測(cè)和治療試驗(yàn)，這用來(lái)檢測(cè)與細(xì)胞生長(zhǎng)失調(diào)有關(guān)的疾病，如癌癥，尤其是表I列出的癌癥(參見(jiàn)，例如，其特定組織表達(dá)模式及其在某些癌癥中的過(guò)度表達(dá)，如題為“正常組織和患者標(biāo)本內(nèi)PSCA的表達(dá)分析”的實(shí)施例所述)。由此可知，PSCA是一種前列腺相關(guān)抗原PSA，醫(yī)療工作者用這種原型標(biāo)記來(lái)鑒定和監(jiān)測(cè)前列腺癌的發(fā)生已有多年(見(jiàn)例如Merrill等，J.Urol.163(2)503-5120(2000)；Polascik等，J.Urol.Aug；162(2)293-306(1999)和Fortier等，J.Nat.CancerInst.91(19)1635-1640(1999))。也可使用許多其它的診斷標(biāo)記，其中包括p53和K-ras(見(jiàn)例如Tulchinsky等，IntJMolMed1999-7-4(1)99-102和Minimoto等，CancerDetectPrev2000；24(1)1-12)。因此，公開(kāi)PSCA多核苷酸和多肽(以及用來(lái)鑒定這些分子存在情況的PSCA多核苷酸探針和抗-PSCA抗體)以及它們的特征使得熟練的技術(shù)人員能夠?qū)⑦@些分子用于類(lèi)似的方法，例如許多涉及癌癥相關(guān)癥狀的診斷試驗(yàn)。使用PSCA多核苷酸、多肽、反應(yīng)性T細(xì)胞和抗體的診斷方法的典型實(shí)施方案類(lèi)似于已經(jīng)良好建立的使用例如PSA多核苷酸、多肽、反應(yīng)性T細(xì)胞和抗體的診斷試驗(yàn)。例如，就像在監(jiān)測(cè)PSA過(guò)度表達(dá)或前列腺癌轉(zhuǎn)移的方法中使用PSA多核苷酸作為探針(例如Northern分析，見(jiàn)例如Sharief等，Biochem.Mol.Biol.Int.33(3)567-74(1994))和引物(例如PCR分析，見(jiàn)例如Okegawa等，J.Urol.163(4)1189-1190(2000))以觀察PSAmRNA的存在和/或水平一樣，可用同樣的方法用這里所述的PSCA多核苷酸來(lái)監(jiān)測(cè)PSCA的過(guò)表達(dá)或前列腺癌和其它表達(dá)這種基因的癌癥的轉(zhuǎn)移?；蛘撸拖裨诒O(jiān)測(cè)PSA蛋白過(guò)表達(dá)(見(jiàn)例如Stephan等，Urology55(4)560-3(2000))或前列腺細(xì)胞轉(zhuǎn)移(見(jiàn)例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3)233-7(1996))的方法中用PSA多肽來(lái)產(chǎn)生PSA特異性的抗體用來(lái)觀察PSA蛋白的存在和/或水平一樣，可用這里所述的PSCA多肽來(lái)產(chǎn)生用來(lái)監(jiān)測(cè)PSCA的過(guò)表達(dá)和/或前列腺細(xì)胞以及表達(dá)這種基因的其它癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。具體地說(shuō)，由于轉(zhuǎn)移涉及癌細(xì)胞從一種來(lái)源的器官(如肺或前列腺等)移動(dòng)到身體其它區(qū)域(如淋巴結(jié))，所以可采用檢測(cè)生物樣品是否存在表達(dá)PSCA多核苷酸和/或多肽的細(xì)胞的試驗(yàn)來(lái)提供轉(zhuǎn)移的證據(jù)。例如，當(dāng)發(fā)現(xiàn)來(lái)自通常不含表達(dá)PSCA的細(xì)胞的組織(淋巴結(jié))的生物樣品中含有表達(dá)PSCA的細(xì)胞時(shí)，例如在分離自淋巴結(jié)和骨轉(zhuǎn)移的異種移植物L(fēng)APC4和LAPC9中觀察到PSCA表達(dá)，該發(fā)現(xiàn)預(yù)示著轉(zhuǎn)移。或者，可用PSCA多核苷酸和/或多肽來(lái)提供癌癥的證據(jù)，例如當(dāng)發(fā)現(xiàn)通常不表達(dá)PSCA或以不同水平表達(dá)PSCA的生物樣品內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)PSCA或PSCA表達(dá)升高時(shí)(見(jiàn)例如表I所列癌癥中的PSCA表達(dá)以及相應(yīng)的圖中所示的患者樣品等中的PSCA表達(dá))。在這種測(cè)定中，技術(shù)人員還希望通過(guò)檢測(cè)生物樣品中是否存在除PSCA之外的第二組織限制性標(biāo)記，如PSA、PSCA等，來(lái)產(chǎn)生關(guān)于轉(zhuǎn)移的補(bǔ)充證據(jù)(見(jiàn)例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3)233-237(1996))。使用免疫組織化學(xué)法鑒定組織切片內(nèi)存在PSCA多肽可說(shuō)明該組織內(nèi)某些細(xì)胞的狀態(tài)被改變。如本領(lǐng)域所熟知的，抗體定位到癌細(xì)胞表達(dá)的多肽的能力是一種診斷疾病存在、疾病所處階段、發(fā)展和/或腫瘤侵襲性的方法。相比相應(yīng)的非惡性腫瘤組織，這種抗體也可檢測(cè)癌細(xì)胞內(nèi)該多肽分布的改變。PSCA多肽和免疫原性組合物也可用于了解疾病狀態(tài)中亞細(xì)胞蛋白定位的改變。細(xì)胞從正常狀態(tài)改變成疾病狀態(tài)會(huì)使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化并通常與亞細(xì)胞單位定位/分布的變化有關(guān)。例如，以極化方式在正常細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)在疾病中會(huì)改變，這導(dǎo)致蛋白質(zhì)以非極性方式分布在整個(gè)細(xì)胞表面。已通過(guò)免疫組織化學(xué)方法用MUC1和Her2蛋白表達(dá)證實(shí)了疾病狀態(tài)中亞細(xì)胞蛋白定位改變的現(xiàn)象。正常的上皮細(xì)胞具有典型的MUC1的頂端分布，除此之外還有糖蛋白的核上定位，而在惡性腫瘤病病灶通常呈現(xiàn)非極性染色模式(Diaz等，TheBreastJournal，7；40-45(2001)；Zhang等，ClinicalCancerResearch，4；2669-2676(1998)Cao等，TheJournalofHistochemistryandCytochemistry，451547-1557(1997))。此外，正常的乳腺上皮是Her2蛋白陰性的或僅顯示基底外側(cè)分布，而惡性T細(xì)胞可在整個(gè)細(xì)胞表面表達(dá)蛋白質(zhì)(DePotter等，International.JournalofCancer，44；969-974(1989)McCormick等，117；935-943(2002))?；蛘?，在疾病狀態(tài)中，蛋白質(zhì)的分布可從僅定位于表面變?yōu)榉稚⒌桨|(zhì)中。對(duì)MUC1可觀察到這樣的例子(Diaz等，TheBreastJournal，740-45(2001))。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位/分布的變化也為某些治療方法的可行性提供了重要信息。這最后一點(diǎn)可通過(guò)在正常組織中位于胞內(nèi)但在惡性細(xì)胞中出現(xiàn)在細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的情況來(lái)說(shuō)明；細(xì)胞表面定位使得細(xì)胞可順利地用于基于抗體的診斷和治療方法。當(dāng)PSCA發(fā)生蛋白質(zhì)定位改變時(shí)，PSCA蛋白和與其有關(guān)的免疫應(yīng)答是非常有用的。因此，確定24P4C12亞細(xì)胞蛋白定位是否發(fā)生變化的能力使PSCA蛋白和與其有關(guān)的免疫應(yīng)答非常有用。使用PSCA組合物使得精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠做出重要的診斷和治療決定。當(dāng)PSCA多肽出現(xiàn)在正常情況下不產(chǎn)生PSCA的組織中時(shí)，特異于PSCA的免疫組織化學(xué)試劑對(duì)于檢測(cè)表達(dá)PSCA的腫瘤的轉(zhuǎn)移也是有用的。因此，PSCA多肽及其免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體可用于許多重要的方面，如精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的診斷、預(yù)后、預(yù)防和/或治療目的。就像熟練的技術(shù)人員將PSA多核苷酸片段和多核苷酸變體用于監(jiān)測(cè)PSA的方法一樣，PSCA多核苷酸片段和多核苷酸變體也可以類(lèi)似方式使用。具體地說(shuō)，用于監(jiān)測(cè)PSA方法的典型PSA多核苷酸是由PSAcDNA序列片段構(gòu)成的探針或引物。舉例來(lái)說(shuō)，用來(lái)PCR擴(kuò)增PSA多核苷酸的引物必需包含不完整的PSA序列以在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中發(fā)揮作用。在這種PCR反應(yīng)中，熟練的技術(shù)人員通常產(chǎn)生許多不同的多核苷酸片段，這些片段可被用作引物以擴(kuò)增感興趣的多核苷酸的不同部分或使擴(kuò)增反應(yīng)最優(yōu)(見(jiàn)例如Caetano-Anolles，G.Biotechniques25(3)472-476，478-480(1998)；Robertson等，MethodsMol.Biol.98121-154(1998))。使用這種片段的另一個(gè)例子提供在題為“正常組織和患者標(biāo)本內(nèi)PSCA的表達(dá)分析”的實(shí)施例中，其中將PSCA多核苷酸片段用作探針以顯示PSCARNA在癌細(xì)胞中的表達(dá)。此外，變體多核苷酸序列在PCR和Northern分析中通常被用作相應(yīng)mRNA的引物和探針(見(jiàn)例如Sawai等，F(xiàn)etalDiagn.Ther.199611-1211(6)407-13和FrederickM.Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，1995))。多核苷酸片段和變體在這里是有用的，它們?cè)诟叨葒?yán)謹(jǐn)條件下能夠結(jié)合靶多核苷酸序列(例如圖1所示的PSCA多核苷酸或其變體)。此外，含有可被抗體或T細(xì)胞識(shí)別的表位的PSA多肽被用于監(jiān)測(cè)PSA的方法，其中所述抗體或T細(xì)胞特異性結(jié)合該表位。PSCA多肽片段和多肽類(lèi)似物或變體也可以類(lèi)似方式使用。這種用多肽片段或多肽變體產(chǎn)生抗體(如抗-PSA抗體或T細(xì)胞)在本領(lǐng)域的許多系統(tǒng)中是常見(jiàn)的，如技術(shù)人員使用的融合蛋白系統(tǒng)(見(jiàn)例如FrederickM.Ausubel等編的《分子生物學(xué)最新方法》，1995，第2卷第16單元)。文中，每個(gè)表位的功能是提供抗體或T細(xì)胞的反應(yīng)性結(jié)構(gòu)。通常，熟練的技術(shù)人員創(chuàng)建許多不同的多肽片段，這些片段可用來(lái)產(chǎn)生特異于感興趣多肽不同部分的免疫應(yīng)答(見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,840,501和美國(guó)專(zhuān)利5,939,533)。例如，可優(yōu)選使用含有這里所述的一種PSCA生物基序或帶有基序的子序列的多肽，這種子序列是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本領(lǐng)域已知序列容易鑒定的。多肽片段、變體或類(lèi)似物在這里通常是有用的，只要它們含有能夠產(chǎn)生靶多肽序列(例如圖3所示的PSCA多肽)特異性抗體或T細(xì)胞的表位。如本文所示，PSCA多核苷酸和多肽(以及用來(lái)鑒定存在這些分子的PSCA多核苷酸探針和抗-PSCA抗體或T細(xì)胞)具有特殊的性質(zhì)，這種特性使它們可用于診斷癌癥，如表I所列的癌癥。測(cè)量存在PSCA基因產(chǎn)物以評(píng)價(jià)這里所述疾病狀況(如前列腺癌)的出現(xiàn)或發(fā)生的診斷方法被用于鑒定患者以進(jìn)行預(yù)防性檢測(cè)或進(jìn)一步的監(jiān)測(cè)，就像已經(jīng)獲得成功的PSA那樣。此外，這些物質(zhì)滿足了本領(lǐng)域在一些情況下對(duì)具有與PSA類(lèi)似或互補(bǔ)特性的小分子的需要，所述情況例如，僅根據(jù)PSA的測(cè)試不能明確診斷前列腺來(lái)源的轉(zhuǎn)移(見(jiàn)例如Alanen等，Pathol.Res.Pract.192(3)233-237(1996))，因此需要用PSCA多核苷酸和多肽(以及用來(lái)鑒定存在這些分子的PSCA多核苷酸探針和抗-PSCA抗體)等物質(zhì)來(lái)證實(shí)前列腺來(lái)源的轉(zhuǎn)移。最后，除了它們?cè)谠\斷檢測(cè)中的用途，這里所述的PSCA多核苷酸有許多其它用途，例如它們可用來(lái)鑒定PSCA基因染色體區(qū)域內(nèi)與致癌有關(guān)的染色體異常(見(jiàn)下文題為“PSCA的染色體繪圖”的實(shí)施例)。此外，除了用于診斷試驗(yàn)外，這里所述的PSCA相關(guān)蛋白和多核苷酸有許多其它用途，，例如它們可用于法醫(yī)分析未知來(lái)源的組織(見(jiàn)例如TakahamaKForensicSciInt1996-6-28；80(1-2)63-9)。此外，本發(fā)明的PSCA相關(guān)蛋白或多核苷酸可用來(lái)治療以PSCA過(guò)度表達(dá)為特征的病理狀況。例如，圖1的氨基酸或核酸序列，或其片段，可用來(lái)產(chǎn)生針對(duì)PSCA抗原的免疫應(yīng)答?？捎门cPSCA反應(yīng)的抗體或其它分子來(lái)調(diào)節(jié)這種分子的功能，從而可提供治療益處。XII.)PSCA蛋白功能的抑制本發(fā)明包括各種抑制PSCA結(jié)合其結(jié)合伴侶或與其它蛋白質(zhì)相互關(guān)聯(lián)的方法和組合物，以及抑制PSCA功能的方法。XII.A.)用胞內(nèi)抗體對(duì)PSCA進(jìn)行的抑制一種方法中，編碼特異性結(jié)合PSCA的單鏈抗體的重組載體被通過(guò)基因傳遞技術(shù)引入PSCA表達(dá)細(xì)胞。因此，編碼的單鏈抗-PSCA抗體在胞內(nèi)表達(dá)，結(jié)合PSCA蛋白，并因此抑制其功能。工程改造這種胞內(nèi)單鏈抗體的方法是熟知的。這種胞內(nèi)抗體也稱(chēng)為“胞內(nèi)抗體”，能特異性靶向細(xì)胞內(nèi)的特定區(qū)室，使治療的抑制作用基重在該區(qū)室。這種技術(shù)已成功用于本領(lǐng)域(參見(jiàn)例如Richardson和Marasco，1995，TIBTECH第13卷)。胞內(nèi)抗體事實(shí)上可消除高豐度細(xì)胞表面受體的表達(dá)(見(jiàn)例如Richardson等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA923137-3141；Beerli等，1994，J.Biol.Chem.28923931-23936；Deshane等，1994，GeneTher.1332-337)。單鏈抗體包含通過(guò)可彎曲的接頭多肽連接的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，并作為單個(gè)多肽表達(dá)。任選地，單鏈抗體被作為與輕鏈恒定區(qū)結(jié)合的單鏈可變區(qū)片段表達(dá)。將熟知的胞內(nèi)運(yùn)輸信號(hào)經(jīng)工程改造成編碼這種單鏈抗體的重組多核苷酸載體以使該胞內(nèi)抗體精確靶向所需胞內(nèi)區(qū)室。例如，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的胞內(nèi)抗體經(jīng)改造而加入前導(dǎo)肽和任選的C-末端ER保留信號(hào)肽(如KDEL氨基酸基序)。工程改造使其含有核定位信號(hào)因而使胞內(nèi)抗體在細(xì)胞核內(nèi)具有活性。使脂質(zhì)部分與胞內(nèi)抗體結(jié)合以將胞內(nèi)受體限制在質(zhì)膜的胞質(zhì)側(cè)。胞內(nèi)抗體經(jīng)靶向也在胞質(zhì)溶膠中發(fā)揮作用。例如，使胞質(zhì)內(nèi)的胞內(nèi)抗體與胞質(zhì)溶膠內(nèi)的因子螯合，這樣可防止它們進(jìn)入它們的天然細(xì)胞目標(biāo)地點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，胞內(nèi)抗體被用來(lái)捕獲細(xì)胞核內(nèi)的PSCA，從而防止它在細(xì)胞核內(nèi)的活性。在這種PSCA胞內(nèi)抗體中加入核靶向信號(hào)以實(shí)現(xiàn)所需尋靶。可設(shè)計(jì)這種PSCA胞內(nèi)抗體來(lái)特異性結(jié)合特定的PSCA結(jié)構(gòu)域。另一實(shí)施方案中，特異性結(jié)合PSCA蛋白的胞質(zhì)胞內(nèi)抗體被用來(lái)防止PSCA與細(xì)胞核接觸，從而可防止它們?cè)诩?xì)胞核內(nèi)發(fā)揮任何生物活性(例如防止PSCA與其它因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體)。為具體指導(dǎo)這種胞內(nèi)受體在特定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使胞內(nèi)受體在合適的腫瘤特異性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的調(diào)控之下轉(zhuǎn)錄。為使胞內(nèi)受體在前列腺中特異性表達(dá)，可使用例如PSA啟動(dòng)子和/或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(見(jiàn)例如1999年7月6日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利5,919,652)。XII.B.)用重組蛋白對(duì)PSCA進(jìn)行抑制另一種方法中，重組分子結(jié)合PSCA并因此抑制PSCA的功能。例如，這些重組分子可防止或抑制PSCA接觸/結(jié)合其結(jié)合伴侶或與其它蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)。例如，這種重組分子可以含有PSCA特異性抗體分子的反應(yīng)性部分。在一具體實(shí)施方案中，PSCA結(jié)合伴侶的PSCA結(jié)合域經(jīng)工程改造到二聚融合蛋白中，因此該融合蛋白含有兩個(gè)與人IgG(如人IgG1)的Fc部分結(jié)合的PSCA配體結(jié)合域。這種IgG部分可含有，例如，CH2和CH3區(qū)域以及絞鏈區(qū)，但不含CH1區(qū)域。這種二聚融合蛋白可以可溶形式給予患有與PSCA表達(dá)有關(guān)的癌癥的患者，從而該二聚融合蛋白特異性結(jié)合PSCA并阻斷PSCA與結(jié)合伴侶相互作用。還可用已知的抗體結(jié)合技術(shù)使這種二聚融合蛋白組合成多聚蛋白。XII.C.)對(duì)PSCA轉(zhuǎn)錄或翻譯的抑制本發(fā)明還包括各種抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄的方法和組合物。類(lèi)似地，本發(fā)明還提供了抑制PSCAmRNA翻譯成蛋白質(zhì)的方法和組合物。一種方法中，抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄的方法包括使PSCA基因接觸PSCA反義多核苷酸。另一種方法中，抑制PSCAmRNA翻譯的方法包括使PSCAmRNA接觸反義多核苷酸。另一個(gè)方法中，用PSCA特異性核酶來(lái)切割PSCA信使從而抑制翻譯。這種基于反義和核酶的方法也可針對(duì)PSCA基因的調(diào)節(jié)區(qū)域，如PSCA啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子元件。類(lèi)似地，能夠抑制PSCA基因轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)被用來(lái)抑制PSCAmRNA轉(zhuǎn)錄。在上述方法中有用的各種多核苷酸和組合物已經(jīng)在上文中描述。使用反義和核酶分子抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯的方法是本領(lǐng)域熟知的。通過(guò)紊亂PSCA轉(zhuǎn)錄活性抑制PSCA轉(zhuǎn)錄的其它因子也可用來(lái)治療表達(dá)PSCA的癌癥。類(lèi)似地，紊亂PSCA加工的因子也可用來(lái)治療表達(dá)PSCA的癌癥。使用這類(lèi)因子的癌癥治療方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。XII.D.)治療方法的一般過(guò)程可用基因轉(zhuǎn)移和基因治療技術(shù)來(lái)輸送治療性多核苷酸分子到合成PSCA的腫瘤細(xì)胞(即反義、核酶、編碼胞內(nèi)抗體的多核苷酸和其它PSCA抑制分子)。本領(lǐng)域已知許多基因治療方法。也可用這種基因治療方法將編碼PSCA反義多核苷酸的重組載體、核酶、能夠紊亂PSCA轉(zhuǎn)錄的因子等輸送到靶腫瘤細(xì)胞。上述治療方法可與廣泛使用的手術(shù)、化療或放療方法聯(lián)合。本發(fā)明的治療方法能夠降低化療(或其它療法)的劑量和/或施用頻率，這對(duì)患者是有利的，尤其是對(duì)于那些無(wú)法良好耐受化學(xué)治療劑毒性的患者。特定組合物(例如反義、核酶、胞內(nèi)受體)或這些物質(zhì)組合的抗腫瘤活性可用各種體外和體內(nèi)測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)治療活性的體外測(cè)定包括細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定、軟瓊脂測(cè)定和其它指示腫瘤生長(zhǎng)活性的試驗(yàn)，結(jié)合測(cè)定能夠確定治療化合物將抑制PSCA與結(jié)合伴侶等結(jié)合的程度的結(jié)合試驗(yàn)等?？稍诤线m的動(dòng)物模型內(nèi)評(píng)價(jià)PSCA治療組合物的體內(nèi)效果。例如可使用異種前列腺癌模型，此模型中，人前列腺癌外植體或傳代的異種移植物組織被引入免疫能力低下的動(dòng)物，如裸鼠或SCID小鼠(Klein等，1997，NatureMedicine3402-408)。例如，PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/16628和美國(guó)專(zhuān)利6,107,540描述了人前列腺癌的各種異種移植物模型，這些模型能夠說(shuō)明原發(fā)性腫瘤的發(fā)展、微轉(zhuǎn)移和作為晚期疾病特征的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移。可利用測(cè)定抑制腫瘤形成、腫瘤消退或轉(zhuǎn)移等預(yù)測(cè)其功效。評(píng)價(jià)促進(jìn)凋亡的體內(nèi)試驗(yàn)也可用來(lái)評(píng)價(jià)治療組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)用治療組合物處理的帶有腫瘤異種移植物的小鼠以了解相比未處理的帶有對(duì)照異種移植物的小鼠是否存在凋亡病灶。在經(jīng)過(guò)治療的小鼠的腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)的凋亡病灶說(shuō)明了組合物的治療功效。用于上述方法的治療組合物可被配制成藥物組合物，該藥物組合物中含有適合所述輸送方法的載體。合適的載體包括當(dāng)與治療組合物混合時(shí)保留治療組合物的抗腫瘤功能且通常不與患者的免疫原性發(fā)生反應(yīng)的任何物質(zhì)。其例子包括但不限于任何一種標(biāo)準(zhǔn)藥用載體，如無(wú)菌磷酸緩沖鹽水溶液、抑菌水等(通?？梢?jiàn)《Remington’sPharmaceuticalSciences》第16版，A.Osal.編，1980)。治療制劑可被溶解并通過(guò)任何能夠?qū)⒅委熃M合物輸送到腫瘤部位的途徑給藥。比較有效的給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、瘤內(nèi)、真皮內(nèi)、器官內(nèi)、正位等。優(yōu)選的靜脈注射制劑所含的該治療組合物可與防腐抑菌水、無(wú)菌非防腐水配成溶液或稀釋在注射用含有0.9％無(wú)菌氯化鈉的聚氯乙烯或聚乙烯袋中。治療性蛋白質(zhì)制品可被凍干并作為無(wú)菌粉末保存，優(yōu)選在真空下凍干，然后在注射之前用抑菌水(含有例如苯甲醇防腐劑)或無(wú)菌水重配。用上述方法治療癌癥的劑量和給藥方法可根據(jù)方法和靶癌癥不同而改變，且通常將取決于許多本領(lǐng)域已知的其它因素。XIII.)PSCA調(diào)節(jié)劑的鑒定、特征分析和用途鑒定和使用調(diào)節(jié)劑的方法在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行篩選以鑒定調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)或抑制特定表達(dá)模式、抑制或誘導(dǎo)特定途徑，優(yōu)選因此產(chǎn)生相關(guān)表型。另一實(shí)施方案中，已經(jīng)鑒定了對(duì)于具體情況重要的差別表達(dá)的基因；進(jìn)行篩選以鑒定改變(提高或降低)個(gè)體基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。另一實(shí)施方案中，進(jìn)行篩選以鑒定改變差別表達(dá)基因表達(dá)產(chǎn)物的生物功能的調(diào)節(jié)劑。再者，已經(jīng)鑒定了基因在特定狀態(tài)中的重要性，進(jìn)行篩選以鑒定結(jié)合和/或調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物生物活性的試劑。此外，篩選在對(duì)候選試劑應(yīng)答反應(yīng)中受誘導(dǎo)的基因。鑒定調(diào)節(jié)劑(抑制癌癥表達(dá)模式而產(chǎn)生正常表達(dá)模式的試劑，或能調(diào)節(jié)癌基因?qū)е略摶蛟谡＝M織中表達(dá)的調(diào)節(jié)劑)，然后進(jìn)行篩選以鑒定在對(duì)該試劑的應(yīng)答反應(yīng)中受到特異性調(diào)節(jié)的基因。比較正常組織和用試劑處理的癌組織的表達(dá)模式可顯示在正常組織或癌組織內(nèi)不表達(dá)但在經(jīng)過(guò)試劑處理的組織內(nèi)表達(dá)的基因，或者反之亦然。用這里所述的用于癌癥基因或蛋白質(zhì)的方法鑒定和使用這些試劑特異性序列。具體地說(shuō)，這些序列和它們編碼的蛋白質(zhì)被用來(lái)標(biāo)記或鑒定試劑處理的細(xì)胞。此外，產(chǎn)生了抗試劑誘導(dǎo)型蛋白質(zhì)的抗體并被用來(lái)使新的治療劑靶向被治療的癌癥組織樣品。與調(diào)節(jié)劑有關(guān)的鑒定和篩選試驗(yàn)與基因表達(dá)有關(guān)的試驗(yàn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、核酸和抗體被用于篩選試驗(yàn)。與癌癥有關(guān)的蛋白質(zhì)、抗體、核酸、修飾的蛋白質(zhì)以及含有這些序列的細(xì)胞被用于篩選測(cè)定，例如評(píng)價(jià)藥物候選物對(duì)″基因表達(dá)模式”、多肽表達(dá)模式或改變生物功能的作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用表達(dá)模式(優(yōu)選與高通量篩選技術(shù)結(jié)合)以在用候選試劑處理之后監(jiān)測(cè)基因表達(dá)模式(例如Davis，GF等，JBiolScreen769(2002)；Zlokarnik等，Science27984-8(1998)；Heid，GenomeRes6986-94，1996)。癌蛋白、抗體、核酸、修飾的蛋白質(zhì)和含有天然或修飾癌蛋白或基因的細(xì)胞被用于篩選測(cè)定。即，本發(fā)明包括篩選調(diào)節(jié)癌癥表型或本發(fā)明的癌蛋白生理功能的方法。這可基因上完成或通過(guò)評(píng)價(jià)藥物候選物的“基因表達(dá)模式”或生物學(xué)功能而完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用表達(dá)模式(優(yōu)選與高通量篩選技術(shù)結(jié)合)以在用候選試劑處理之后進(jìn)行監(jiān)測(cè)，見(jiàn)Zlokamik，同上。進(jìn)行了各種涉及本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)的試驗(yàn)。測(cè)定可在個(gè)體核酸或蛋白質(zhì)水平進(jìn)行。即，鑒定在癌癥中上調(diào)的特定基因之后可篩選測(cè)試化合物以了解調(diào)節(jié)基因表達(dá)或結(jié)合本發(fā)明的癌蛋白的能力?！逭{(diào)節(jié)″在這里包括提高或降低基因表達(dá)。優(yōu)選的調(diào)節(jié)量將取決于正常組織與癌組織中基因表達(dá)的最初變化，其變化至少為10％，優(yōu)選50％，更優(yōu)選100-300％，且在一些實(shí)施方案中為300-1000％或更高。因此，如果正常組織相比某基因在癌組織中表達(dá)增加4倍，常需要降低約4倍；類(lèi)似地，與正常組織相比在癌組織內(nèi)降低10倍，常需要測(cè)試化合物使其表達(dá)提高10倍。也可采用能惡化癌癥中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑，例如，在進(jìn)一步分析上調(diào)靶基因表達(dá)。用核酸探針和定量測(cè)定來(lái)監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的量及基因表達(dá)水平，或者可監(jiān)測(cè)基因產(chǎn)物本身，例如通過(guò)使用癌蛋白的抗體和標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗(yàn)。也可用蛋白組學(xué)和分離技術(shù)來(lái)定量測(cè)定表達(dá)。通過(guò)監(jiān)測(cè)表達(dá)來(lái)鑒定修飾基因表達(dá)的化合物在一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)對(duì)許多實(shí)體進(jìn)行基因表達(dá)監(jiān)測(cè)，即監(jiān)測(cè)表達(dá)圖譜。這種圖譜通常包括一個(gè)或多個(gè)圖1所示的基因。該實(shí)施方案中，例如，使癌癥核酸探針結(jié)合到生物芯片上以檢測(cè)并量化特定細(xì)胞內(nèi)的癌癥序列。或者可采用PCR。因此可使用微量滴定板，其所需孔內(nèi)分散有引物。然后可進(jìn)行PCR反應(yīng)并對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行分析。進(jìn)行表達(dá)監(jiān)測(cè)以鑒定修飾一種或多種癌癥相關(guān)序列(如圖1所列的多核苷酸序列)的表達(dá)的化合物。通常在分析之前在細(xì)胞中加入測(cè)試調(diào)節(jié)劑。此外，還進(jìn)行篩選以鑒定調(diào)節(jié)癌癥、調(diào)節(jié)本發(fā)明的癌蛋白、結(jié)合本發(fā)明的癌蛋白或紊亂本發(fā)明的癌蛋白與抗體或其結(jié)合伴侶結(jié)合的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，高通量篩選方法包括提供包含大量潛在治療化合物(候選化合物)的庫(kù)。然后在一個(gè)或多個(gè)測(cè)定中篩選這種″組合化學(xué)庫(kù)″以鑒定那些具有所需化學(xué)活性的庫(kù)成員(尤其是化學(xué)種類(lèi)或亞類(lèi))。鑒定出的化合物可作為常規(guī)的″先導(dǎo)化合物″，如篩選用化合物，或作為治療劑。在某些實(shí)施方案中，篩選潛在調(diào)節(jié)劑組合文庫(kù)結(jié)合癌多肽的能力或調(diào)節(jié)活性。通常，通過(guò)鑒定具有一些所需特性或活性(例如抑制活性)的化合物(稱(chēng)作“先導(dǎo)化合物”)、產(chǎn)生所述先導(dǎo)化合物的變體并評(píng)價(jià)這些變體化合物的特性和活性，可產(chǎn)生具有有用特性的新的化學(xué)實(shí)體。通常，高通量篩選(HTS)法被用于這種分析。如上所述，基因表達(dá)監(jiān)測(cè)通常被用來(lái)檢測(cè)候選調(diào)節(jié)劑(例如蛋白質(zhì)、核酸或小分子)。加入候選試劑并將細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間之后，含有待分析靶序列的樣品例如被加到生物芯片上。需要的話可用已知技術(shù)來(lái)制備靶序列。例如，用已知的裂解緩沖液、電穿孔等方法處理樣品以使細(xì)胞裂解，并純化和/或擴(kuò)增，例如通過(guò)PCR。例如可用共價(jià)結(jié)合到核苷酸的標(biāo)記物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。核酸通常用生物素-FITC或PE或用cy3或cy5標(biāo)記。靶序列可用熒光信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)、化學(xué)信號(hào)或放射性信號(hào)標(biāo)記以便檢測(cè)與探針特異性結(jié)合的靶序列。標(biāo)記也可以是酶，如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，當(dāng)提供合適底物時(shí)可檢測(cè)這些酶產(chǎn)生的產(chǎn)物?；蛘?，標(biāo)記是被標(biāo)記的化合物或小分子，如酶抑制劑，它們與酶結(jié)合但不被酶催化或改變。標(biāo)記也可以是例如表位標(biāo)記或特異性結(jié)合鏈霉親和素的生物素。以生物素為例，如上所述標(biāo)記鏈霉親和素，從而為結(jié)合的靶序列提供了可檢測(cè)的信號(hào)。未結(jié)合的標(biāo)記鏈霉親和素通常在分析之前被除去。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，這些試驗(yàn)可以是直接雜交測(cè)定或者是使用多個(gè)探針的“夾心試驗(yàn)”，這種方法通常描述在美國(guó)專(zhuān)利5,681,702；5,597,909；5,545,730；5,594,117；5,591,584；5,571,670；5,580,731；5,571,670；5,591,584；5,624,802；5,635,352；5,594,118；5,359,100；5,124,246和5,681,697。該實(shí)施方案中，通常按上述方法制備靶核酸，然后在能夠形成雜交復(fù)合體的條件下將其加到含有許多核酸探針的生物芯片上。本發(fā)明采用了多種雜交條件，其中包括上述高、中和低嚴(yán)謹(jǐn)條件。通常在僅在靶存在時(shí)才能形成標(biāo)記探針雜交復(fù)合體的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行測(cè)定?？赏ㄟ^(guò)改變熱力學(xué)可變的步驟參數(shù)來(lái)控制嚴(yán)謹(jǐn)性，其中包括但不限于溫度、甲酰胺濃度、鹽濃度、離液鹽濃度、pH、有機(jī)溶劑濃度等。也可用這些參數(shù)來(lái)控制非特異性結(jié)合，例如美國(guó)專(zhuān)利5,681,697所述。因此，在比較高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行某些步驟以減少非特異性結(jié)合較為理想。可用各種方法實(shí)現(xiàn)這里列出的反應(yīng)。反應(yīng)組分可同時(shí)或以不同順序依次加入，其優(yōu)選實(shí)施方案如下。此外，可在反應(yīng)物中加入許多其它試劑。這些試劑包括鹽、緩沖液、中性蛋白質(zhì)(如白蛋白)、去污劑等，它們將有利于優(yōu)化雜交和檢測(cè)，和/或減少非特異性或背景相互作用。需要的話也可使用能夠提高測(cè)定效率的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酶抑制劑、抗微生物劑等，這取決于樣品制備方法和靶的純度。分析檢測(cè)數(shù)據(jù)以確定各個(gè)基因的表達(dá)水平以及各種狀態(tài)之間表達(dá)水平的變化，從而形成基因表達(dá)圖譜。與生物活性有關(guān)的測(cè)定本發(fā)明提供了鑒定或篩選調(diào)節(jié)本發(fā)明的癌癥相關(guān)基因或蛋白質(zhì)的活性的化合物。該方法包括在含有本發(fā)明癌蛋白的細(xì)胞中加入上文定義的檢測(cè)化合物。所述細(xì)胞含有編碼本發(fā)明癌蛋白的重組核酸。另一實(shí)施方案中，在許多細(xì)胞上檢測(cè)候選試劑的庫(kù)。一方面，在存在或不存在生理信號(hào)，或者之前或之后暴露于生理信號(hào)的情況下進(jìn)行測(cè)定，所述生理信號(hào)例如有激素、抗體、肽、抗原、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、動(dòng)作電位、藥劑(包括化療劑)、輻射、致癌物或其它細(xì)胞(即細(xì)胞-細(xì)胞接觸)。另一實(shí)施例中，在細(xì)胞周期的不同階段進(jìn)行測(cè)定。用這種方法鑒定了調(diào)節(jié)本發(fā)明的基因或蛋白質(zhì)的化合物。具有藥理活性的化合物能夠增強(qiáng)或紊亂本發(fā)明的癌蛋白的活性。一旦被鑒定，可評(píng)估類(lèi)似的結(jié)構(gòu)以便鑒定化合物的決定性結(jié)構(gòu)特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)(例如抑制)癌細(xì)胞分裂的方法；該方法包括給予一種癌癥調(diào)節(jié)劑。另一實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)(例如抑制)癌癥的方法；該方法包括給予一種癌癥調(diào)節(jié)劑。再在其它實(shí)施方案中，提供了處理癌細(xì)胞或患有癌癥的個(gè)體的方法；該方法包括給予一種癌癥調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)表達(dá)本發(fā)明基因的細(xì)胞的狀態(tài)的方法。這里所述的狀態(tài)包括本領(lǐng)域接受的參數(shù)，如細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活力、功能、凋亡、老化、定位、酶活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥抑制劑是上述抗體。另一實(shí)施方案中，癌癥抑制劑是反義分子。如本文所述，各種測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的方法是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。通過(guò)高通量篩選鑒定調(diào)節(jié)劑鑒定合適調(diào)節(jié)劑的試驗(yàn)包括高通量篩選。優(yōu)選的試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)癌基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)或抑制、多肽表達(dá)的增強(qiáng)或抑制、以及多肽活性的抑制或增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，高通量篩選法鑒定的調(diào)節(jié)劑是蛋白質(zhì)，通常是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的片段。因此，例如可使用含有蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物或蛋白質(zhì)性細(xì)胞提取物的隨機(jī)或定向消化物。通過(guò)這種方法制得了在本發(fā)明方法中用來(lái)進(jìn)行篩選的蛋白質(zhì)文庫(kù)。在該實(shí)施方案中，特別優(yōu)選的是細(xì)菌、真菌、病毒和哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)文庫(kù)，優(yōu)選哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)文庫(kù)，尤其是人蛋白質(zhì)文庫(kù)。特別有用的測(cè)試化合物將被定向到靶所屬蛋白質(zhì)種類(lèi)，例如酶和底物，或者配體和受體。使用軟瓊脂生長(zhǎng)和集落形成來(lái)鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑正常細(xì)胞需要固體基質(zhì)以附著和生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化后便喪失了這種表型并可離開(kāi)基質(zhì)生長(zhǎng)。例如，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可生長(zhǎng)在攪拌的懸浮培養(yǎng)物中或懸浮在半固體培養(yǎng)基(例如半固體瓊脂或軟瓊脂)中。當(dāng)用腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化的細(xì)胞時(shí)，它們可恢復(fù)正常表型并又需要固體基質(zhì)以便附著和生長(zhǎng)。在檢測(cè)中用軟瓊脂生長(zhǎng)或集落形成來(lái)鑒定癌癥序列的調(diào)節(jié)劑，當(dāng)該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)可抑制異常細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。調(diào)節(jié)劑可降低或消除宿主細(xì)胞在固體或半固體培養(yǎng)基(如瓊脂)中懸浮生長(zhǎng)的能力。懸浮測(cè)定中的軟瓊脂生長(zhǎng)或集落形成技術(shù)描述在Freshney的《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)》(CultureofAnimalCellsaManualofBasicTechnique)(第三版，1994)。也可參見(jiàn)Garkavtsev等(1996，同上)一書(shū)的方法部分。評(píng)定接觸抑制和生長(zhǎng)密度限制以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑正常細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中通常以平鋪且有組織的模式生長(zhǎng)，直到它們接觸其它細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞接觸其它細(xì)胞時(shí)它們會(huì)接觸抑制并停止生長(zhǎng)。然而，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不會(huì)接觸抑制并在紊亂的病灶內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)至高密度。因此，相比正常細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)至較高的飽和密度。這可通過(guò)在病灶中形成無(wú)序的細(xì)胞單層細(xì)胞從形態(tài)上加以鑒定?；蛘呖捎蔑柡兔芏葧r(shí)(3H)-胸腺嘧啶的標(biāo)記指數(shù)來(lái)測(cè)定生長(zhǎng)密度限制，類(lèi)似地，MTT或Alamar藍(lán)檢測(cè)將顯示細(xì)胞的增殖能力以及調(diào)節(jié)劑影響增殖的能力。見(jiàn)Freshney，(1994)，同上。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞當(dāng)被腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)染時(shí)可恢復(fù)正常表型，受到接觸抑制并生長(zhǎng)至較低密度。該檢測(cè)中，飽和密度時(shí)(3H)-胸腺嘧啶的標(biāo)記指數(shù)是優(yōu)選的測(cè)量生長(zhǎng)密度限制的方法。用癌癥相關(guān)序列轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并使其在非限制培養(yǎng)條件下在飽和密度生長(zhǎng)24小時(shí)。通過(guò)每分鐘摻入的數(shù)量來(lái)確定(3H)-胸腺嘧啶標(biāo)記的細(xì)胞的百分比。用接觸不限制的生長(zhǎng)來(lái)鑒定癌癥序列的調(diào)節(jié)劑，所述序列以及導(dǎo)致異常細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。調(diào)節(jié)劑可降低或消除接觸不限制的生長(zhǎng)并使細(xì)胞回到正常表型。評(píng)價(jià)生長(zhǎng)因子或血清依賴(lài)性以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相比相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞具有較低的血清依賴(lài)性(見(jiàn)例如Temin，J.Natl.CancerInst.37167-175(1966)；Eagle等，J.Exp.Med131836-879(1970))；Freshney，同上。這部分是由于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會(huì)釋放各種生長(zhǎng)因子?？蓪⑥D(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)因子或血清依賴(lài)性程度與對(duì)照細(xì)胞相比較。例如，在方法中監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)因子或血清依賴(lài)性以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)本發(fā)明癌癥相關(guān)序列的化合物。使用腫瘤特異性標(biāo)記的水平來(lái)鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑腫瘤細(xì)胞釋放的某些因子(以后稱(chēng)為“腫瘤特異性標(biāo)記”)的量高于相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞。例如，人膠質(zhì)瘤以高于正常腦細(xì)胞的水平釋放纖溶酶原激活劑(PA)(見(jiàn)例如Gullino，“血管生成、腫瘤血管形成和腫瘤生長(zhǎng)的潛在紊亂”(Angiogenesis，TumorVascularization，andPotentialInterferencewithTumorGrowth)，引自《癌癥中的生物應(yīng)答》(BiologialResponsesinCancer)一書(shū)第178-184頁(yè)(Mihich編，1985))。類(lèi)似地，腫瘤細(xì)胞也以高于相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞的水平釋放腫瘤血管形成因子(TAF)。見(jiàn)例如Folkman，《血管生成和癌癥》(AngiogenesisandCancer)，SemCancerBiol.(1992))，而內(nèi)皮瘤釋放bFGF(Ensoli，B等)。測(cè)量這些因子的釋放的各種技術(shù)描述在Freshney(1994)，同上。也可參見(jiàn)Unkless等，J.Biol.Chem.2494295-4305(1974)；Strickland&Beers，J.Biol.Chem.2515694-5702(1976)；Whur等，Br.J.Cancer42305312(1980)；Gullino，“血管生成、腫瘤血管形成和腫瘤生長(zhǎng)的潛在紊亂”，引自《癌癥中的生物應(yīng)答》一書(shū)第178-184頁(yè)(Mihich編，1985)；Freshney，AnticancerRes.5111-130(1985)。例如，可在方法中監(jiān)測(cè)腫瘤特異性標(biāo)記的水平以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)本發(fā)明癌癥相關(guān)序列的化合物。通過(guò)對(duì)基質(zhì)膠的侵襲來(lái)鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑可將侵入基質(zhì)膠的程度或胞外基質(zhì)成分用于鑒定和特征分析能調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)序列的化合物的試驗(yàn)。腫瘤細(xì)胞在惡變和侵入基質(zhì)膠或其它胞外基質(zhì)成分之間顯示為正相關(guān)。在該測(cè)定中通常將腫瘤發(fā)生細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。腫瘤抑制基因在這些宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)將降低對(duì)宿主細(xì)胞的侵入性?？墒褂靡韵挛墨I(xiàn)中描述的技術(shù)CancerRes.1999；596010；Freshney(1994)，同上。簡(jiǎn)言之，可用涂有基質(zhì)膠或其它胞外基質(zhì)成分的濾器來(lái)測(cè)量對(duì)宿主細(xì)胞的侵入水平。侵入凝膠或穿過(guò)濾器的遠(yuǎn)側(cè)被評(píng)定為侵襲力，并通過(guò)細(xì)胞數(shù)和移動(dòng)距離或通過(guò)用125I預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞然后對(duì)濾器的遠(yuǎn)側(cè)或平皿底部進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)來(lái)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。見(jiàn)例如Freshney(1984)，同上。評(píng)定體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑在轉(zhuǎn)基因生物或免疫抑制生物內(nèi)檢測(cè)癌癥相關(guān)序列對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。轉(zhuǎn)基因生物用各種本領(lǐng)域可接受的方法制備。例如可制造敲除轉(zhuǎn)基因生物，例如小鼠等哺乳動(dòng)物，其中的癌基因被破壞或在其中插入癌基因。通過(guò)同源重組在小鼠基因組的內(nèi)源癌癥基因位點(diǎn)插入標(biāo)記基因或其它異源基因從而制造出敲除轉(zhuǎn)基因小鼠。也可用突變的癌基因取代內(nèi)源癌基因，或使內(nèi)源癌基因突變(例如通過(guò)本領(lǐng)域致癌物)來(lái)制造這種小鼠。為制造轉(zhuǎn)基因嵌合動(dòng)物(如小鼠)，可將DNA構(gòu)建物引入胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核。具有新構(gòu)建的遺傳缺陷的細(xì)胞被注射入宿主小鼠胚胎，并將該胚胎重新植入雌性受體。其中一些胚胎發(fā)展成嵌合小鼠，這些小鼠的一些生殖細(xì)胞源自突變細(xì)胞系。因此，通過(guò)飼養(yǎng)這種嵌合小鼠能夠獲得含有引入的遺傳缺陷的新小鼠品系(見(jiàn)例如Capecchi等，Science2441288(1989))?？捎靡韵路椒ǐ@得嵌合小鼠2002年4月2日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利6,365,797；2000年8月22日發(fā)表的美國(guó)專(zhuān)利6,107,540；Hogan等，《小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(ManipulatingtheMouseEmbryoAlaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratory(1988)以及Robertson編寫(xiě)的《畸胎癌和胚胎干細(xì)胞實(shí)際進(jìn)展》，IRLPress，Washington，D.C.，(1987)。或者可使用各種免疫抑制或免疫缺陷宿主動(dòng)物。例如，通過(guò)基因方法獲得的無(wú)胸腺“裸”鼠(見(jiàn)例如Giovanella等，J.Natl.CancerInst.52921(1974))、SCID小鼠、胸腺切除小鼠或照射小鼠(見(jiàn)例如Bradley等，Br.J.Cancer38263(1978)；Selby等，Br.J.Cancer4152(1980))可被用作宿主。注射入同基因宿主的可移植的腫瘤細(xì)胞(通常約106細(xì)胞)以高比例產(chǎn)生侵入性腫瘤，而類(lèi)似來(lái)源的正常細(xì)胞則不會(huì)這樣。在發(fā)展了侵入性腫瘤的宿主中皮下或正位注射表達(dá)腫瘤相關(guān)序列的細(xì)胞。然后將小鼠分成對(duì)照組和治療實(shí)驗(yàn)組(例如用調(diào)節(jié)劑治療)。合適時(shí)間后，優(yōu)選4-8周，測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)(例如通過(guò)體積或通過(guò)其兩個(gè)最大尺寸，或重量)并與對(duì)照進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少的腫瘤(采用例如斯氏T檢驗(yàn))被認(rèn)為生長(zhǎng)受到抑制。鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑的體外檢測(cè)可在體外進(jìn)行檢測(cè)以鑒定具有調(diào)節(jié)活性的化合物。例如，使癌癥多肽首先接觸潛在的調(diào)節(jié)劑，然后培養(yǎng)合適的時(shí)間，例如0.5-48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)或mRNA水平在體外確定癌癥多肽水平。蛋白質(zhì)水平采用免疫測(cè)定(例如Western印跡、ELISA等)用選擇性結(jié)合癌癥多肽或其片段的抗體來(lái)測(cè)量。為測(cè)量mRNA，優(yōu)選用擴(kuò)增檢測(cè)(例如用PCR、LCR)或雜交檢測(cè)(例如Northern雜交、RNA酶保護(hù)、斑點(diǎn)印跡)。用直接或剪接標(biāo)記的檢測(cè)試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)或mRNA的水平，所述檢測(cè)試劑如上所述例如熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記的核酸、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記的抗體等?；蛘?，可用操作性連接于螢光素酶、綠色熒光蛋白、CAT或P-gal等報(bào)告基因的癌蛋白啟動(dòng)子來(lái)設(shè)計(jì)報(bào)告基因系統(tǒng)。報(bào)告基因構(gòu)建物通常被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。用潛在的調(diào)節(jié)劑處理之后，用精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)量報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或活性量(DavisGF，同上；Gonzalez，J.&Negulescu，P.Curr.Opin.Biotechnol.19989624)。如上所述，對(duì)各個(gè)基因和基因產(chǎn)物進(jìn)行體外篩選。這就是說(shuō)，在鑒定出在特定狀態(tài)重要的差異性表達(dá)的特定基因之后對(duì)表達(dá)該基因或其基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)劑進(jìn)行篩選。在一個(gè)實(shí)施方案中，篩選表達(dá)特定基因的調(diào)節(jié)劑。通常只評(píng)價(jià)一個(gè)或幾個(gè)基因的表達(dá)。另一實(shí)施方案中，篩選被設(shè)計(jì)成首先尋找結(jié)合差別表達(dá)的蛋白質(zhì)的化合物。然后評(píng)價(jià)這些化合物調(diào)節(jié)差異性表達(dá)活性的能力。此外，一旦鑒定了最初的候選化合物，可進(jìn)一步篩選其變體以更好地評(píng)價(jià)結(jié)構(gòu)活性關(guān)系。鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑的結(jié)合檢測(cè)在本發(fā)明的結(jié)合檢測(cè)中通常使用純化或分離的本發(fā)明的基因產(chǎn)物。例如，產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體，進(jìn)行免疫測(cè)定以確定該蛋白質(zhì)的量和/或定位?；蛘?，含有癌蛋白的細(xì)胞可用于該測(cè)定。因此，所述方法包括使本發(fā)明的癌蛋白結(jié)合候選化合物(如配體)，并確定該化合物與本發(fā)明的癌蛋白的結(jié)合。優(yōu)選的實(shí)施方案使用人癌蛋白；也可建立并使用人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型。同時(shí)，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可使用其它類(lèi)似的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。此外，一些實(shí)施方案使用了變體或衍生的癌蛋白。通常，本發(fā)明的癌蛋白或配體非擴(kuò)散性地結(jié)合不溶性支持物。例如，所述支持物可以含有獨(dú)立的樣品接受區(qū)(微量滴定板、陣列等)。不溶性支持物可用任何組合物制成，它可結(jié)合所述組合物，易于從可溶性物質(zhì)中分離，或者與整個(gè)篩選方法相容。這種支持物的表面可以是固體或是多孔的，并具有任何方便操作的形狀。合適的不溶性支持物的例子包括微量滴定板、陣列、膜和珠。它們通常由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖、尼龍、硝酸纖維素或TeflonTM等制成。微量滴定板和陣列尤其方便，因?yàn)榭捎眯×吭噭┖蜆悠吠瑫r(shí)進(jìn)行大量測(cè)定。對(duì)組合物和支持物的具體結(jié)合方法沒(méi)有規(guī)定，只要它與本發(fā)明的試劑和方法相容、保持組合物的活性且不可擴(kuò)散即可。優(yōu)選的結(jié)合方法包括使用抗體，當(dāng)該抗體將蛋白質(zhì)結(jié)合到支持物時(shí)對(duì)配體結(jié)合位點(diǎn)或活化序列都不造成空間阻遏；直接結(jié)合到“粘性”或離子支持物；化學(xué)交聯(lián)；在表面合成蛋白質(zhì)或試劑等。蛋白質(zhì)或配體/結(jié)合劑與支持物結(jié)合之后通過(guò)洗滌除去過(guò)量的未結(jié)合的物質(zhì)。然后與牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)或其它化學(xué)分子一起培育以封閉樣品接受區(qū)。一旦本發(fā)明的癌蛋白與支持物結(jié)合，便可加入檢測(cè)化合物進(jìn)行測(cè)定?；蛘呤购蜻x結(jié)合劑結(jié)合支持物然后加入本發(fā)明的癌蛋白。結(jié)合劑包括特異性抗體、通過(guò)篩選化學(xué)文庫(kù)鑒定的非天然結(jié)合劑、肽類(lèi)似物等。特別感興趣的是鑒定對(duì)人類(lèi)細(xì)胞具有低毒性的試劑。出于該目的可使用許多檢測(cè)方法，其中包括增殖分析、cAMP分析、標(biāo)記的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合體外檢測(cè)、電泳遷移率變動(dòng)分析、蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫測(cè)定、功能分析(磷酸化作用分析等)，等等?？捎迷S多方法來(lái)測(cè)定檢測(cè)化合物(配體、結(jié)合劑、調(diào)節(jié)劑等)與本發(fā)明的癌蛋白的結(jié)合。檢測(cè)化合物可被標(biāo)記，并可直接確定結(jié)合作用，例如將全部或部分本發(fā)明的癌蛋白加到固體支持物、加入標(biāo)記的候選化合物(例如熒光素標(biāo)記)、洗去過(guò)量試劑并確定固體支持物上是否存在標(biāo)記。需要的話可使用不同的封閉和洗滌步驟。在某些實(shí)施方案中，只有一種組分被標(biāo)記，例如標(biāo)記本發(fā)明的蛋白質(zhì)或配體。或者用不同的標(biāo)記物標(biāo)記多個(gè)組分，例如用I125標(biāo)記蛋白質(zhì)并用熒光團(tuán)標(biāo)記化合物。鄰近試劑(proximityreagent)，例如淬滅劑或能量轉(zhuǎn)移劑，也是有用的。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合以鑒定和特征分析調(diào)節(jié)劑在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)與“競(jìng)爭(zhēng)物”的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)確定“檢測(cè)化合物”的結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)物是結(jié)合靶分子(例如本發(fā)明的癌蛋白)的結(jié)合部分。競(jìng)爭(zhēng)物包括抗體、肽、結(jié)合伴侶、配體等之類(lèi)的化合物。某些情況下，競(jìng)爭(zhēng)物代替檢測(cè)化合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)化合物被標(biāo)記。可在蛋白質(zhì)中加入檢測(cè)化合物或競(jìng)爭(zhēng)物或這兩者，并放置足夠進(jìn)行結(jié)合的時(shí)間。在使活性最強(qiáng)的溫度(通常在4-40℃之間)下進(jìn)行培育。培育時(shí)間通常被最優(yōu)化，例如以有利于迅速高通量篩選；通常0-1小時(shí)就足夠了。過(guò)量的試劑通常被除去或洗去。然后加入第二組分，之后加入或不加入指示結(jié)合的標(biāo)記的組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，先加入競(jìng)爭(zhēng)物，然后再加入檢測(cè)化合物。競(jìng)爭(zhēng)物被置換說(shuō)明檢測(cè)化合物結(jié)合癌蛋白，因此能夠結(jié)合并有可能調(diào)節(jié)癌蛋白的活性。該實(shí)施方案中，任一組分可被標(biāo)記。因此，例如，如果競(jìng)爭(zhēng)物被標(biāo)記，檢測(cè)后化合物的洗滌液中存在標(biāo)記說(shuō)明競(jìng)爭(zhēng)物被檢測(cè)化合物置換?；蛘?，如果檢測(cè)化合物被標(biāo)記，則支持物上存在標(biāo)記說(shuō)明被置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，首先加入檢測(cè)化合物，培育并洗滌，然后加入競(jìng)爭(zhēng)物。競(jìng)爭(zhēng)物未結(jié)合說(shuō)明該檢測(cè)化合物結(jié)合癌蛋白的親和力高于競(jìng)爭(zhēng)物。因此，如果檢測(cè)化合物被標(biāo)記，則支持物上存在標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物未能結(jié)合說(shuō)明檢測(cè)化合物能結(jié)合本發(fā)明的癌蛋白從而可能調(diào)節(jié)癌蛋白。因此，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合法包括差異性篩選以鑒定能夠調(diào)節(jié)本發(fā)明癌蛋白活性的試劑。在該實(shí)施方案中，所述方法包括使癌蛋白與第一樣品內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)物結(jié)合。第二樣品含有檢測(cè)化合物、癌蛋白和競(jìng)爭(zhēng)物。確定兩個(gè)樣品競(jìng)爭(zhēng)物的結(jié)合，兩個(gè)樣品之間結(jié)合情況的改變或不同說(shuō)明存在能夠結(jié)合癌蛋白并有可能調(diào)節(jié)其活性的試劑。這就是說(shuō)，如果第二樣品內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)物的結(jié)合不同于第一樣品，則該試劑能夠結(jié)合癌蛋白?；蛘?，用差異性篩選來(lái)鑒定結(jié)合天然癌蛋白但不能結(jié)合修飾的癌蛋白的藥物候選物。例如，確定癌蛋白的結(jié)構(gòu)并將其用于合理的藥物設(shè)計(jì)，從而合成與該位點(diǎn)相互作用的試劑以及通常不結(jié)合位點(diǎn)修飾的蛋白質(zhì)的試劑。此外，還通過(guò)篩選藥物增強(qiáng)或降低這種蛋白質(zhì)活性的能力而鑒定了影響天然癌蛋白活性的藥物候選物。分析中也可使用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。對(duì)照樣品和測(cè)試樣品宜進(jìn)行至少三次以獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的結(jié)果。將所有樣品培育足以使試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合的時(shí)間。培育之后洗滌樣品以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)并確定結(jié)合的且通常是標(biāo)記的試劑的量。例如，當(dāng)使用放射性標(biāo)記時(shí)，樣品可在閃爍計(jì)數(shù)器內(nèi)計(jì)數(shù)以確定結(jié)合的化合物的量。篩選分析中也可使用其它試劑。這些試劑包括鹽、中性蛋白質(zhì)(例如白蛋白)、去污劑等，使用它們將有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)最佳結(jié)合和/或減少非特異性或背景相互作用。也可使用能夠提高測(cè)定效率的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酶抑制劑、抗微生物劑等。以一定順序加入各組分的混合物以提供需要的結(jié)合。使用多核苷酸來(lái)下調(diào)或抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)如WO91/04753所述，通過(guò)形成與配體結(jié)合分子的綴合物可將癌癥的多核苷酸調(diào)節(jié)劑引入含有靶核苷酸序列的細(xì)胞。合適的配體結(jié)合分子包括但不限于細(xì)胞表面受體、生長(zhǎng)因子、其它細(xì)胞因子或結(jié)合細(xì)胞表面受體的其它配體。優(yōu)選配體結(jié)合分子的結(jié)合基本上不會(huì)影響配體結(jié)合分子結(jié)合其相應(yīng)分子或受體、或者阻止正義或反義寡核苷酸或其結(jié)合形式進(jìn)入細(xì)胞的能力?；蛘?，癌癥的多核苷酸調(diào)節(jié)劑可被引入含有靶核酸序列的細(xì)胞，例如通過(guò)形成多核苷酸-脂質(zhì)復(fù)合體，如WO90/10448所述。除治療方法外，在上述篩選方法中也可使用反義分子或敲除及敲入模型。抑制性和反義核苷酸在某些實(shí)施方案中，通過(guò)使用反義多核苷酸或抑制性核內(nèi)小RNA(snRNA)，即與mRNA編碼核酸序列(例如本發(fā)明的癌蛋白)、mRNA或其子序列互補(bǔ)并且可較佳地與它們特異性雜交的核酸，下調(diào)或完全抑制癌癥相關(guān)蛋白的活性。反義多核苷酸與mRNA結(jié)合降低了mRNA翻譯和/或穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，反義多核苷酸可包括天然產(chǎn)生的核苷酸或由天然產(chǎn)生的亞單位或其密切同系物形成的合成種類(lèi)。反義多核苷酸也可含有改變的糖部分或糖內(nèi)連接。其例子有硫代磷酸酯以及其它含有硫的種類(lèi)，已知它們都可用于本領(lǐng)域。只要類(lèi)似物可與本發(fā)明的核苷酸有效雜交即包含在本發(fā)明之內(nèi)。見(jiàn)例如IsisPharmaceuticals，Carlsbad，CA；Sequitor，Inc.，Natick，MA。這種反義多核苷酸可以用重組方法方便地合成，或者可以在體外合成。一些廠商出售這種合成設(shè)備，其中包括AppliedBiosystems。制備其它寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物的方法也是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這里使用的反義分子包括包括反義或正義寡核苷酸。例如，可用正義寡核苷酸與反義鏈的結(jié)合而阻斷轉(zhuǎn)錄。反義和正義寡核苷酸包括能夠結(jié)合癌癥分子靶mRNA(正義)或DNA(反義)序列的單鏈核酸序列(RNA或DNA)。本發(fā)明所述的反義或正義寡核苷酸包括通常含有至少約12個(gè)核苷酸，優(yōu)選含有約12-30個(gè)核苷酸的片段。從編碼指定蛋白質(zhì)的cDNA序列產(chǎn)生反義或正義寡核苷酸的能力描述在，例如，Stein&Cohen(CancerRes.4826591988)和vanderKrol等(BioTechniques6958(1988))。核酶除反義多核苷酸，可用核酶來(lái)尋靶和抑制癌癥相關(guān)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。核酶是能催化性切斷其它RNA分子的RNA分子。已經(jīng)描述過(guò)不同種類(lèi)的核酶，其中包括I組核酶、錘頭狀核酶、發(fā)夾狀核酶、核糖核酸酶P和斧頭狀核酶(可參見(jiàn)例如Castanotto等，Adv.inPharmacology25289-317(1994)以對(duì)不同核酶的特性有大致了解)。發(fā)夾核酶的一般特性描述在，例如，Hampel等，Nucl.AcidsRes.18299-304(1990)；歐洲專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)0360257；美國(guó)專(zhuān)利5,254,678。其制備方法是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的(見(jiàn)例如WO94/26877；Ojwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906340-6344(1993)；Yamada等，HumanGeneTherapy139-45(1994)；Leavitt等，Proc.Natl.AcadSci.USA92699-703(1995)；Leavitt等，HumanGeneTherapy51151-120(1994)；以及Yamada等，Virology205121-126(1994))。在表型篩選中使用調(diào)節(jié)劑在一個(gè)實(shí)施方案中，給予具有癌癥相關(guān)表達(dá)特征的癌細(xì)胞群檢測(cè)化合物?！褰o予″或″接觸″在這里是指將調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞中，調(diào)節(jié)劑對(duì)該細(xì)胞的作用方式是通過(guò)攝入和在胞內(nèi)發(fā)揮作用或在細(xì)胞表面發(fā)揮作用。一些實(shí)施方案中，編碼蛋白質(zhì)樣試劑(即肽)的核酸被加入病毒構(gòu)建物，例如腺病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建物，并加入細(xì)胞，這樣可實(shí)現(xiàn)肽試劑的表達(dá)，例如PCTUS97/01019。也可用可調(diào)基因治療系統(tǒng)。一旦給予細(xì)胞調(diào)節(jié)劑，需要的話洗滌細(xì)胞并優(yōu)選在生理?xiàng)l件下將細(xì)胞培育一段時(shí)間。然后收獲細(xì)胞并生成新的基因表達(dá)圖譜。篩檢該試劑所調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)或抑制)的癌組織表型變化。至少一個(gè)(優(yōu)選有多個(gè))基因表達(dá)圖譜的變化說(shuō)明該試劑對(duì)癌癥活性有作用。類(lèi)似地，生物功能或信號(hào)通路的改變也指示了調(diào)節(jié)劑的活性。通過(guò)定義這種癌癥表型特征可以篩選出改變這種表型的新藥。用這種方法不需要知道藥靶，并且不需要在傳統(tǒng)的基因/蛋白質(zhì)表達(dá)平臺(tái)上展示，且不需要改變靶蛋白的轉(zhuǎn)錄物水平。調(diào)節(jié)劑的抑制功能將被作為替代標(biāo)記。如上所述，對(duì)基因或基因產(chǎn)物進(jìn)行了篩選。這就是說(shuō)，在鑒定出對(duì)于特定狀態(tài)重要的具體差異表達(dá)的基因之后，對(duì)表達(dá)該基因或其基因產(chǎn)物本身的調(diào)節(jié)劑進(jìn)行篩選。使用調(diào)節(jié)劑來(lái)影響本發(fā)明的肽用各種試驗(yàn)測(cè)量癌癥多肽的活性或癌癥表型。例如通過(guò)檢測(cè)上述參數(shù)測(cè)量調(diào)節(jié)劑對(duì)癌癥多肽的作用。用影響活性的生理變化來(lái)評(píng)估檢測(cè)化合物對(duì)本發(fā)明多肽的影響。當(dāng)用完整的細(xì)胞或動(dòng)物確定功能結(jié)果之后可評(píng)估各種效應(yīng)，例如，在與實(shí)體瘤有關(guān)的癌癥病例中，這些效應(yīng)包括腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤轉(zhuǎn)移、新血管形成、激素釋放、已知和未知遺傳標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄變化(例如通過(guò)Northern印跡)、細(xì)胞代謝的變化如細(xì)胞生長(zhǎng)或pH的改變以及胞內(nèi)第二信使如cGNIP的變化。鑒定定性癌癥相關(guān)序列的方法各種基因序列的表達(dá)與癌癥相關(guān)。因此可確定基于突變體或變體癌癥基因的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定含有變體癌癥基因的細(xì)胞的方法，例如確定細(xì)胞內(nèi)存在(全部或部分)至少一種內(nèi)源癌癥基因的序列。這可通過(guò)多種測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明包括鑒定個(gè)體癌癥基因型的方法，例如確定個(gè)體內(nèi)至少一種本發(fā)明基因的全部或部分序列。這通常在至少一種個(gè)體組織內(nèi)進(jìn)行，例如表I所列的組織，并且可包括評(píng)價(jià)許多組織或相同組織的不同樣品。該方法可包括測(cè)序基因的序列與已知癌癥基因(即野生型基因)進(jìn)行比較以確定存在家族成員、同系物、突變體或變體。然后可將該基因的全部或部分序列與已知癌癥基因的序列進(jìn)行比較以確定是否存在任何區(qū)別。這可通過(guò)多種已知的同源性程序進(jìn)行，如BLAST、Bestfit等。如這里所述，患者的癌癥基因序列和已知癌癥基因序列之間存在差別與患病或可能患病相關(guān)聯(lián)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥基因被用作探針以確定基因組內(nèi)癌癥基因的拷貝數(shù)。癌癥基因被用作探針以確定癌癥基因的染色體定位。染色體定位等信息可用于診斷或預(yù)測(cè)，尤其是在癌癥基因基因座內(nèi)鑒定出染色體異常如易位時(shí)。XIV.)RNAi和采用小干擾RNA(siRNA)的治療本發(fā)明還涉及siRNA寡核苷酸，具體是包含PSCA編碼區(qū)或5”UTR區(qū)的至少一個(gè)片段的雙鏈RNA、或任何對(duì)PSCA序列具有特異性的互補(bǔ)鏈或反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，此類(lèi)寡核苷酸用于闡明PSCA的功能，或用于篩選或評(píng)估PSCA功能或表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)使用siRNA轉(zhuǎn)染來(lái)降低PSCA的基因表達(dá)，并使得內(nèi)源性表達(dá)該抗原的轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低；通過(guò)對(duì)例如與降低的增殖能力相關(guān)的細(xì)胞存活力代謝讀數(shù)的測(cè)定，用特異性PSCAsiRNA處理的細(xì)胞顯示存活率降低。因此，PSCAsiRNA組合物包含siRNA(雙鏈RNA)，它對(duì)應(yīng)于PSCA蛋白的核酸ORF序列或其子序列；這些子序列的長(zhǎng)度通常為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，31、32、33、34、35或大于35個(gè)連續(xù)RNA核苷酸，且含有與mRNA編碼序列的至少一部分互補(bǔ)和非互補(bǔ)的序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述子序列的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸，最優(yōu)選長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸。RNA干擾是在體外和體內(nèi)使基因沉默的一種新方法，因此小雙鏈RNA(siRNAs)是很有價(jià)值的治療劑。siRNA使得特異的基因活性沉默的能力現(xiàn)在已被用于疾病動(dòng)物模型中，并且也已用于人類(lèi)。例如，已證實(shí)將含抗具體靶標(biāo)的siRNA的siRNA溶液通過(guò)流體輸液給予小鼠是治療有效的。Song等的開(kāi)拓性研究顯示可將一類(lèi)完全天然的核酸——小干擾RNA(siRNA)用作治療劑，甚至無(wú)需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)修飾(Song，E.，等，“RNAinterferencetargetingFasprotectsmicefromfulminanthepatitis”Nat.Med.9(3)347-51(2003))。該研究提供了將siRNA輸液入動(dòng)物可減輕疾病的第一個(gè)體內(nèi)證據(jù)。在該案例中，作者們給小鼠注射了設(shè)計(jì)用于沉默F(xiàn)AS蛋白(一種細(xì)胞死亡受體，其當(dāng)在炎癥反應(yīng)中過(guò)度活化時(shí)會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞和其它細(xì)胞死亡))的siRNA。次日，給予動(dòng)物Fas特異性抗體。對(duì)照小鼠在數(shù)日內(nèi)因急性肝衰竭而死亡，而超過(guò)80％的用siRNA治療的小鼠保持不發(fā)生嚴(yán)重疾病并存活。它們肝細(xì)胞的約80％-90％摻入了裸露siRNA寡核苷酸。此外，在3周后喪失效力之前，該RNA分子持續(xù)發(fā)揮作用達(dá)10天。在用于人類(lèi)治療中時(shí)，通過(guò)可誘導(dǎo)長(zhǎng)效RNAi活性的有效系統(tǒng)遞送siRNA。臨床應(yīng)用中的主要告誡(caveat)在于將siRNA遞送到適宜的細(xì)胞中。肝細(xì)胞似乎尤其易于接受外源的RNA。目前，位于肝臟的靶標(biāo)是很具有吸引力的，這是由于該器官十分易于被核酸分子和病毒載體所靶向。然而，其它器官和組織靶標(biāo)也是優(yōu)選的。使用含有促進(jìn)透過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)幕衔锏膕iRNA制劑以在治療中改善siRNA的給藥。另一實(shí)施方式是對(duì)核酸酶具有抗性、具有血清穩(wěn)定性并由此使得RNAi作用的持續(xù)時(shí)間增加的經(jīng)化學(xué)修飾的合成siRNA。因此，siRNA技術(shù)是一種通過(guò)將針對(duì)PSCA的siRNA分子遞送給患有癌癥(例如表1中所列的癌癥)的個(gè)體以治療人類(lèi)惡性腫瘤的療法。這種給予siRNA可減少表達(dá)PSCA的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、提供一種抗腫瘤療法、降低與惡性腫瘤相關(guān)的發(fā)病率和/或死亡率。當(dāng)在體外或體內(nèi)測(cè)定時(shí)，這種模式的基因產(chǎn)物敲除的效果是十分顯著的。當(dāng)采用體外方法來(lái)檢測(cè)PSCA蛋白表達(dá)的降低時(shí)，很容易通過(guò)將siRNA施用于培養(yǎng)細(xì)胞(如前所述)或等量的癌癥患者或組織來(lái)證實(shí)其體外效果。XV.)試劑盒/產(chǎn)品的制造為用于這里所述的實(shí)驗(yàn)室、預(yù)后、預(yù)防、診斷和治療用途，本發(fā)明包括試劑盒。這種試劑盒可包含載體、包裝或被劃分以容納一種或多種內(nèi)容物如小瓶、試管等的容器，每個(gè)容器內(nèi)中包含一個(gè)單獨(dú)用于該方法的獨(dú)立元件，以及包括使用說(shuō)明書(shū)。例如，容器內(nèi)可包含被或可被可檢測(cè)標(biāo)記的探針。這種探針可以是分別特異于本發(fā)明的蛋白質(zhì)或基因或信使的抗體或多核苷酸。當(dāng)所述方法利用核酸雜交來(lái)檢測(cè)靶核酸時(shí)，試劑盒的容器中還可含有用來(lái)擴(kuò)增靶核酸序列的核苷酸。試劑盒的容器中含有受體，如結(jié)合生物素的蛋白質(zhì)，例如親和素或鏈霉親和素，它們結(jié)合到酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記等報(bào)告分子；這種報(bào)告分子可與例如核酸或抗體一起使用。所述試劑盒在可含有圖1的全部或部分氨基酸序列或其類(lèi)似物，或編碼這種氨基酸序列的核酸分子。本發(fā)明的試劑盒通常包含上述容器以及一個(gè)或多個(gè)與其有關(guān)的其它容器，這些容器中含有出于商業(yè)和用戶(hù)立場(chǎng)而需要的物質(zhì)，包括緩沖液、稀釋劑、填料、針頭、針管；載體、包裝、標(biāo)識(shí)成分和/或使用說(shuō)明的小瓶和/或試管上的標(biāo)簽、以及使用說(shuō)明書(shū)。標(biāo)簽可出現(xiàn)在容器上或與容器一起出現(xiàn)，以指導(dǎo)如何將該組合物用于特定的治療或非治療用途，例如預(yù)后、預(yù)防、診斷或?qū)嶒?yàn)室用途，并且可以指導(dǎo)如何在體內(nèi)和體外使用，如這里所述的那些。說(shuō)明或其它信息也可出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)或標(biāo)簽上，所述說(shuō)明書(shū)或標(biāo)簽與試劑盒一起提供或提供在試劑盒上。標(biāo)簽可出現(xiàn)在容器上或與容器一起提供。當(dāng)構(gòu)成標(biāo)簽的字母、數(shù)字或其它特征是模壓到或嵌入容器本身上時(shí)標(biāo)簽可出現(xiàn)在容器上；當(dāng)標(biāo)簽出現(xiàn)在裝有該容器的盒子或載體內(nèi)時(shí)標(biāo)簽可與容器一起提供。標(biāo)簽可指示如何將組合物用于診斷、治療、預(yù)防或預(yù)測(cè)癥狀，所述癥狀例如表I所列組織的腫瘤形成。術(shù)語(yǔ)“試劑盒”和“制造物品”可互換使用。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，制造物品中包含組合物，如氨基酸序列、小分子、核酸序列和/或抗體，例如用于診斷、預(yù)后、預(yù)防和/或治療組織(如表I中列出的那些組織)腫瘤形成的物品。制造物品中通常含有至少一個(gè)容器和至少一份標(biāo)簽。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、針筒和試管。所述容器可由多種材料制成，如玻璃、金屬或塑料。容器中可含有氨基酸序列、小分子、核酸序列、細(xì)胞群和/或抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，容器中含有用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)圖譜的多核苷酸以及用于此目的的試劑。另一實(shí)施方案中，容器中含有抗體、其結(jié)合片段或特異性結(jié)合蛋白，以評(píng)價(jià)細(xì)胞和組織內(nèi)PSCA的蛋白質(zhì)表達(dá)，或用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)室、預(yù)后、診斷、預(yù)防和治療目的；這種容器上或與其一起出現(xiàn)的還有這種用途的指導(dǎo)和/或說(shuō)明書(shū)，并且可含有用于這些目的的試劑和其它組合物或工具。另一實(shí)施方案中，容器中含有用來(lái)引發(fā)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的物質(zhì)，以及有關(guān)指導(dǎo)和/或說(shuō)明書(shū)。另一實(shí)施方案中，容器中含有用于過(guò)繼免疫治療的物質(zhì)，如如細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)或輔助T細(xì)胞(HTL)，以及有關(guān)指導(dǎo)和/或說(shuō)明書(shū)；也可含有用于該目的的試劑和其它組合物或工具。容器中也可含有能夠有效治療、診斷、預(yù)測(cè)或預(yù)防某種癥狀的組合物并且可含有無(wú)菌接口(例如，所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液包或小瓶，其上有可用皮下注射針頭刺穿的塞子)。組合物內(nèi)的活性劑可以是能夠特異性結(jié)合PSCA并調(diào)節(jié)PSCA功能的抗體。所述制造物品還可含有第二個(gè)容器，其中含有藥學(xué)上可接受的緩沖液，如磷酸緩沖鹽水、林格溶液和/或葡萄糖溶液。它還可含有其它出于商業(yè)和用戶(hù)立場(chǎng)而需要的物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋劑、填料、攪拌器、針頭、針管和/或使用說(shuō)明書(shū)和/或用法指導(dǎo)。實(shí)施例通過(guò)下面的幾個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面做進(jìn)一步的描述和說(shuō)明，這些實(shí)施例都不意味著對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1PSCA變體在正常組織及患者標(biāo)本內(nèi)的表達(dá)分析PSCA在本文中被稱(chēng)為PSCAv.1，以前的研究已經(jīng)證實(shí)PSCA在前列腺癌中是作為抗原來(lái)表達(dá)的。在超過(guò)80％的原發(fā)前列腺癌和大多數(shù)前列腺轉(zhuǎn)移癌中都有PSCA的表達(dá)。PSCA還表達(dá)于膽囊癌、卵巢癌和胰腺癌中；這種類(lèi)型的腫瘤都列于表I中。通過(guò)免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)尿道移行細(xì)胞癌、60％的原發(fā)胰腺腺癌的細(xì)胞表面都有PSCA的過(guò)量表達(dá)。在許多專(zhuān)利文獻(xiàn)(PCT/US98/04664、PCT/US/28883、PCT/US00/19967)和同行評(píng)議的文章(Saffran等，ProcNatlAcadSciUSA.2001-2-27；98(5)2658-2663；Amara等，CancerRes.2001-6-15；61(12)4660-65；Reiter等，ProcNatlAcadSciUSA.1998-2-17；95(4)1735-40；Argani等，CancerRes.2001-6-1；61(11)4320-24)中都報(bào)道了有關(guān)PSCA表達(dá)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明研究了不同PSCA變體在正常組織和癌癥患者標(biāo)本內(nèi)的特異性表達(dá)情況。所設(shè)計(jì)的引物可以區(qū)分PSCAv.1/v.2/v.4、PSCAv.3和PSCAv.5之間的區(qū)別，PSCAv.1/v.2/v.4的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為425bp，PSCAv.3的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為300bp，而PSCAv.5的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為910bp(圖1I(a))。從正常膽囊、腦、心臟、腎、肝臟、肺、前列腺、脾、骨骼肌、睪丸、胰腺、結(jié)腸、胃組織以及一組前列腺癌、膽囊癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌組織中制備cDNA第一條鏈(圖1I(b))。用肌動(dòng)蛋白的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物為對(duì)照。利用不同變體特異性的引物進(jìn)行半定量PCR，擴(kuò)增進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示PSCAv.5主要表達(dá)于乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌內(nèi)，在結(jié)腸癌和肺癌內(nèi)也有低水平表達(dá)。在前列腺癌、膽囊癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移癌和胰腺癌內(nèi)檢測(cè)到了PSCAv.1/v.2/v.4的PCR產(chǎn)物。在正常組織內(nèi)，只在前列腺、胃組織內(nèi)檢測(cè)到了PSCAv.1/v.2/v.4的PCR產(chǎn)物，在腎和肺組織內(nèi)也檢測(cè)到了低水平表達(dá)的PSCAv.1/v.2/v.4，而在所有正常組織內(nèi)都沒(méi)有檢測(cè)到PSCAv.5。在所檢測(cè)的所有樣品內(nèi)都沒(méi)有檢測(cè)到PSCAv.3的PCR產(chǎn)物。設(shè)計(jì)出可以區(qū)分PSCAv.4和PSCAv.5的引物(圖1J(a))。PSCAv.4的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為460bp，而PSCAv.5的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為945bp。從正常膽囊、腦、心臟、腎、肝臟、肺、前列腺、脾、骨骼肌、睪丸、胰腺、結(jié)腸、胃組織和一組前列腺癌、膽囊癌以及多種異種移植物混合物(前列腺癌、腎癌和膽囊癌異種移植物)組織內(nèi)制備cDNA第一條鏈(圖1J(b))。用肌動(dòng)蛋白的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物為對(duì)照。利用不同變體特異性的引物進(jìn)行半定量PCR，擴(kuò)增進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示在前列腺癌、膽囊癌、多種異種移植物混合物、正常腎和前列腺組織內(nèi)有PSCAv.4的表達(dá)。只在正常前列腺組織和膽囊癌組織內(nèi)檢測(cè)到了PSCAv.5的表達(dá)。PSCA變體在正常組織內(nèi)的表達(dá)是受限的，而在癌癥患者的標(biāo)本內(nèi)可以檢測(cè)到PSCA變體的表達(dá)，這說(shuō)明PSCA變體可以作為人類(lèi)腫瘤的治療性、預(yù)后性、實(shí)驗(yàn)性、預(yù)防性和診斷靶位。實(shí)施例2PSCA的剪切變體本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體”包括轉(zhuǎn)錄物變體和單核苷酸多態(tài)性(SNP)。轉(zhuǎn)錄物變體是同一基因的成熟mRNA的變體，是由于選擇性轉(zhuǎn)錄或選擇性剪接而形成的。選擇性轉(zhuǎn)錄物是指來(lái)自同一個(gè)基因但是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不同的轉(zhuǎn)錄物。剪接變體是指同一個(gè)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)不同剪接而形成的mRNA變體。在真核生物中，當(dāng)多外顯子基因從基因組DNA中轉(zhuǎn)錄出來(lái)后，所產(chǎn)生的RNA前體需要經(jīng)過(guò)剪接才能形成功能性的mRNA，這種mRNA只有一個(gè)外顯子，用于翻譯成氨基酸序列。相應(yīng)的，一個(gè)給定的基因可能有0到多個(gè)不同的選擇性轉(zhuǎn)錄物，每個(gè)轉(zhuǎn)錄物都可能有0到多個(gè)剪接變體。每個(gè)轉(zhuǎn)錄物變體都由其獨(dú)特的外顯子組成，包含轉(zhuǎn)錄物前體來(lái)源的不同編碼和/或非編碼(5’或3’末端)部分。轉(zhuǎn)錄物變體可以編碼相同的、相似的或不同的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)可以有相同的或相似的功能，也可以有不同的功能。突變蛋白質(zhì)可能在相同的時(shí)間、相同的組織內(nèi)表達(dá)，也可能在相同的時(shí)間、不同的組織內(nèi)表達(dá)，或者在不同的時(shí)間、相同的組織內(nèi)表達(dá)，或者在不同的時(shí)間、不同的組織內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)錄變體編碼的蛋白質(zhì)可能具有相似的或不同的亞細(xì)胞或細(xì)胞外定位(如分泌型和胞內(nèi)型)。本領(lǐng)域的許多方法都可用于鑒定轉(zhuǎn)錄物變體。例如，選擇性轉(zhuǎn)錄物和剪接變體可通過(guò)全長(zhǎng)克隆或使用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物和EST序列來(lái)鑒定。首先將所有的人源EST分成不同的簇，這些簇彼此之間具有直接的或間接的相同性。第二，將同一簇內(nèi)的EST分成不同的亞簇，組合成一個(gè)共有序列。基因的原始序列與共有序列或其他的全長(zhǎng)序列比較。每個(gè)共有序列都是該基因的一個(gè)潛在剪接變體。有幾個(gè)確證方法是本領(lǐng)域所熟知的，如通過(guò)RNA印跡、全長(zhǎng)克隆或使用探針文庫(kù)等來(lái)鑒定變體。即使所鑒定出的變體不是全長(zhǎng)克隆，這個(gè)變體片段也可用作研究工具，例如通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)用于抗原制備，或者用于進(jìn)一步克隆全長(zhǎng)剪接變體。另外，本領(lǐng)域現(xiàn)有一些計(jì)算機(jī)程序，這些程序可根據(jù)基因組序列來(lái)鑒定轉(zhuǎn)錄物變體?；诨蚪M序列的轉(zhuǎn)錄物變體鑒定程序包括FgenesH(A.Salamov和V.Solovyev，″AbinitiogenefindinginDrosophilagenomicDNA，″GenomeResearch.2000-4；10(4)516-22)；Grail(URLcompbio.ornl.gov/Grail-bin/EmptyGrailForm)和GenScan(URLgenes.mit.edu/GENSCAN.html)。有關(guān)剪接變體鑒定工具的討論見(jiàn)Southan，C.，Agenomicperspectiveonhumanproteases，F(xiàn)EBSLett.2001-6-8；498(2-3)214-8；deSouza，S.J.等，Identificationofhumanchromosome22transcribedsequenceswithORFexpressedsequencetags，Proc.NatlAcadSciUSA.2000-11-7；97(23)12690-3。本領(lǐng)域現(xiàn)有多種技術(shù)可用于進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄物變體的參數(shù)，如全長(zhǎng)克隆、蛋白質(zhì)組驗(yàn)證、以PCR為基礎(chǔ)的驗(yàn)證和5’RACE驗(yàn)證等(見(jiàn)蛋白質(zhì)組驗(yàn)證Brennan，S.O.等，Albuminbankspeninsulaanewterminationvariantcharacterizedbyelectrospraymassspectrometry，BiochemBiophysActa.1999-8-17；1433(1-2)321-6；FerrantiP等，Differentialsplicingofpre-messengerRNAproducesmultipleformsofmaturecaprinealpha(s1)-casein，EurJBiochem.1997-10-1；249(1)1-7。以PCR為基礎(chǔ)的驗(yàn)證WellmannS等，Specificreversetranscription-PCRquantificationofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)splicevariantsbyLightCyclertechnology，ClinChem.2001-4；47(4)654-60；Jia，H.P.等，Discoveryofnewhumanbeta-defensinsusingagenomics-basedapproach，Gene.2001-1-24；263(1-2)211-8。以PCR為基礎(chǔ)的驗(yàn)證和5’RACE驗(yàn)證Brigle，K.E.等，Organizationofthemurinereducedfolatecarriergeneandidentificationofvariantspliceforms，BiochemBiophysActa.1997-8-7；1353(2)191-8)。正如本領(lǐng)域所熟知的，腫瘤的基因組區(qū)是有變化的。當(dāng)一個(gè)特定腫瘤的基因組區(qū)的基因繪圖發(fā)生變化時(shí)，該基因的選擇性轉(zhuǎn)錄物或剪接變體也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。本文所描述的就是與腫瘤相關(guān)的PSCA的一個(gè)特殊表達(dá)模式(見(jiàn)表1)。腫瘤內(nèi)也包含PSCA的選擇性轉(zhuǎn)錄物和剪接變體，如這些組織中的一種或多種組織以及某些其他組織來(lái)源的腫瘤。因此這些變體也可以被看成是腫瘤相關(guān)標(biāo)記/抗原。利用全長(zhǎng)PSCA基因和EST序列鑒定出了另外的四個(gè)轉(zhuǎn)錄物變體，分別被命名為PSCAv.2、v.3、v.4和v.5。原始轉(zhuǎn)錄物PSCAv.1的外顯子邊界顯示在表VI內(nèi)。PSCA和PSCA變體的序列示于圖1中。實(shí)施例3PSCA的單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指核苷酸序列在特定位點(diǎn)上的單個(gè)堿基對(duì)的變化。在基因組的任意給定位點(diǎn)上都存在四個(gè)可能的核苷酸堿基對(duì)A/T、C/G、G/C和T/A。如本文所描述，等位基因是指一個(gè)給定基因的一系列不同形式中的一個(gè)，不同等位基因之間的差異在于其DNA序列，并且可影響其產(chǎn)物(RNA和/或蛋白質(zhì))。cDNA上發(fā)生的SNP被稱(chēng)為cSNP。這種cSNP可導(dǎo)致基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生氨基酸序列的變化，因而蛋白質(zhì)的功能也可能發(fā)生變化。某些SNP可導(dǎo)致遺傳性疾??；另外的一些SNP與表型量變及不同人對(duì)環(huán)境因素如食物和藥物的反應(yīng)的量變有關(guān)。因此，SNP和/或等位基因組合(被稱(chēng)為單元型)的存在有許多用途，如遺傳性疾病的診斷、藥物反應(yīng)和劑量的確定、疾病相關(guān)基因的鑒定以及個(gè)體之間遺傳相關(guān)性的分析(P.Nowotny，J.M.Kwon和A.M.Goate，“SNPanalysistodissecthumantraits，”Curr.Opin.Neurobiol.2001-10；11(5)637-641；M.Pirmohamed和B.K.Park，“Geneticsusceptibilitytoadversedrugreactions，”TrendsPharmacol.Sci.2001-6；22(6)298-305；J.H.Riley，C.J.Allan，E.Lai和A.Roses，“Theuseofsinglenucleotidepolymorphismsintheisolationofcommondiseasegenes”，Pharmacogenomics.2000-2；1(1)39-47；R.Judson，J.C.Stephens和A.Windemuth，“Thepredictivepowerofhaplotypesinclinicalresponse.”P(pán)harmacogenomics.2000-2；1(1)15-26)。SNP可用本領(lǐng)域已有的多種方法加以鑒定(P.Bean，“ThepromisingvoyageofSNPtargetdiscovery，”Am.Clin.Lab.2001年10-11月；20(9)18-20；K.M.Weiss，“Insearchofhumanvariation，”GenomeRes.1998-7；8(7)691-697；M.M.She，“Enablinglarge-scalepharmacogeneticstudiesbyhigh-throughputmutationdetectionandgenotypingtechnologies，”Clin.Chem.2001-2；47(2)164-172)。例如，經(jīng)過(guò)凝膠方法如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)具有多態(tài)性的DNA片段可通過(guò)測(cè)序來(lái)鑒定其SNP。另外也可以通過(guò)直接測(cè)定不同個(gè)體的DNA樣品的序列或通過(guò)比較不同DNA樣品的序列來(lái)揭示SNP。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)和私人數(shù)據(jù)庫(kù)中快速積累起來(lái)的序列數(shù)據(jù)，人們也可以利用計(jì)算機(jī)程序通過(guò)序列比較來(lái)發(fā)現(xiàn)SNP(Z.Gu，L.Hillier和P.Y.Kwok，“Singlenucleotidepolymorphismhuntingincyberspace，”Hum.Mutat.1998；12(4)221-225)。許多方法都可用于驗(yàn)證SNP，確定不同個(gè)體的基因型和單元型，其中包括直接測(cè)序和高通量芯片方法(P.Y.Kwok，“Methodsforgenotypingsinglenucleotidepolymorphisms，”Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2001；2235-258；M.Kokoris，K.Dix，K.Moynihan，J.Mathis，B.Erwin，P.Grass，B.Hines和A.Duesterhoeft，“High-throughputSNPgenotypingwiththeMasscodesystem，”Mol.Diagn.2000-12；5(4)329-340)。利用上面所描述的方法找出了PSCAv.2轉(zhuǎn)錄物的13個(gè)SNP。我們使用了變體2而不是變體1，這是因?yàn)樽凅w2的不明確堿基少于變體1。相應(yīng)的，PSCAv.2的SNP被確定位于位點(diǎn)57(t/c)、367(c/t)、424(a/c)、495(c/g)、499(c/t)、563(c/t)、567(g/a)、627(g/a)、634(t/g)、835(g/a)、847(g/a)、878(g/a)和978(c/g)上。選擇性等位基因的轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)被命名為變體PSCAv.6到v.18，如圖1B和圖1G所示。v.6上的核苷酸變化改變了v.1的起始密碼子，因此其翻譯直到遇到下一個(gè)ATG(mRNA上為AUG)才開(kāi)始，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)比v.1蛋白少9個(gè)氨基酸。v.7和v.8上的核苷酸改變反映在蛋白質(zhì)水平上是沉默的。這13個(gè)SNP中的12個(gè)也存在于變體4上。PSCAv.4相關(guān)的12個(gè)SNP分別被命名為PSCAv.19到v.30。變體19到27編碼不同的氨基酸如圖1H所示。實(shí)施例4在原核系統(tǒng)中制備重組PSCA為了在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組的PSCA和PSCA變體，將全長(zhǎng)PSCA和PSCA變體cDNA序列或其片段克隆到本領(lǐng)域熟知的任何一種表達(dá)載體內(nèi)。表達(dá)PSCA變體的下列一個(gè)或多個(gè)片段圖1所示的全長(zhǎng)序列，或者含有PSCA、PSCA變體或其類(lèi)似物的任意8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。A.體外轉(zhuǎn)錄和翻譯構(gòu)建物pCRII為了制備用于RNA原位檢測(cè)的PSCA正義和反義RNA探針，制備編碼全長(zhǎng)PSCAcDNA或其片段的pCRII構(gòu)建物(Invitrogen，CarlsbadCA)。在pCRII載體內(nèi)含有Sp6和T7啟動(dòng)子，分別位于插入片段的兩側(cè)，這兩個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)PSCARNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出的RNA可作為探針用于RNA原位雜交試驗(yàn)中。這些探針可用于在RNA水平上分析PSCA在細(xì)胞和組織內(nèi)的表達(dá)。代表PSCA基因cDNA氨基酸編碼區(qū)的PSCARNA轉(zhuǎn)錄物可用于體外翻譯系統(tǒng)如TnTTMCoupledReticulolysateSystem(Promega，Corp.，Madison，WI)中來(lái)合成PSCA蛋白。B.細(xì)菌構(gòu)建物pGEX構(gòu)建物為了在細(xì)菌中制備融合有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白的重組PSCA蛋白，將全長(zhǎng)或部分PSCAcDNA蛋白編碼序列克隆到GST融合載體的pGEX質(zhì)粒家族(AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)中。這些構(gòu)建物能夠可控地表達(dá)氨基端融合GST、羧基端為6×組氨酸表位(6×His)的重組PSCA蛋白。GST和6×His標(biāo)記的存在主要是為了用適當(dāng)?shù)挠H和基質(zhì)從誘導(dǎo)的細(xì)菌中純化重組融合蛋白，抗GST抗體和抗His抗體可識(shí)別這種融合蛋白。通過(guò)在開(kāi)放閱讀框架(ORF)的3’端克隆引物上加上6個(gè)組氨酸密碼子就可以使蛋白添加上6×His標(biāo)記。通過(guò)引入蛋白酶裂解位點(diǎn)，如在pGEX-6P-1上引入PreScissionTM識(shí)別位點(diǎn)，可將GST標(biāo)記從PSCA相關(guān)蛋白上裂解下來(lái)。氨芐青霉素耐藥基因和pBR322復(fù)制起點(diǎn)用于pGEX質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的篩選和復(fù)制。pMAL構(gòu)建物為了在細(xì)菌內(nèi)制備融合有甘露聚糖結(jié)合蛋白(MBP)的重組PSCA蛋白，將全長(zhǎng)或部分PSCAcDNA蛋白編碼序列克隆到pMAL-c2X和pMAL-p2X載體(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)內(nèi)使之與MBP基因融合。這些構(gòu)建物能夠可控地表達(dá)氨基端融合MBP、羧基端為6×組氨酸表位標(biāo)記的重組PSCA蛋白。MBP和6×His標(biāo)記的存在主要是為了用適當(dāng)?shù)挠H和基質(zhì)從誘導(dǎo)的細(xì)菌中純化重組融合蛋白，抗MBP抗體和抗His抗體可識(shí)別這種融合蛋白。通過(guò)在3’端克隆引物上加上6個(gè)組氨酸密碼子就可以使蛋白添加上6×His標(biāo)記。添加因子X(jué)a識(shí)別位點(diǎn)是為了將pMAL標(biāo)記從PSCA上裂解下來(lái)。pMAL-c2X和pMAL-p2X載體分別用于重組蛋白的胞質(zhì)和周質(zhì)表達(dá)。周質(zhì)表達(dá)有利于蛋白利用二硫鍵進(jìn)行折疊。pET構(gòu)建物為了在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)PSCA，將全長(zhǎng)或部分PSCAcDNA蛋白編碼序列克隆到pET家族的載體(Novagen，Madison，WI)內(nèi)。這些載體能夠在細(xì)菌內(nèi)可控地表達(dá)融合有增加可溶性的蛋白質(zhì)和表位標(biāo)記或不含融合蛋白的重組PSCA蛋白，增加可溶性的蛋白質(zhì)包括NusA和硫氧還原蛋白(Trx)，表位標(biāo)記包括6×His和S-TagTM，這些標(biāo)記可用于重組蛋白的純化和檢測(cè)。例如，利用pETNusA融合系統(tǒng)43.1構(gòu)建表達(dá)載體可使表達(dá)出的PSCA蛋白在氨基端融合上NusA。C.酵母構(gòu)建物pESC構(gòu)建物為了在釀酒酵母內(nèi)表達(dá)PSCA以制備重組蛋白并進(jìn)行功能性研究，將全長(zhǎng)或部分PSCAcDNA蛋白編碼序列克隆到pESC家族的載體內(nèi)，這些載體分別含有以下四種篩選標(biāo)記中的一種HIS3、TRP1、LEU2和URA3(Stratagene，LaJolla，CA)。這些載體使我們能夠在同一種酵母細(xì)胞內(nèi)從2個(gè)不同基因或克隆序列的同一個(gè)質(zhì)粒中可控地表達(dá)不同的蛋白，這兩個(gè)基因或克隆序列分別含有FlagTM和Myc表位標(biāo)記。這個(gè)系統(tǒng)可用于確定PSCA的蛋白-蛋白相互作用。另外，在酵母內(nèi)表達(dá)可產(chǎn)生與真核細(xì)胞表達(dá)相似的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化。pESP構(gòu)建物為了在粟酒酵母(Saccharomycespombe)內(nèi)表達(dá)PSCA，將全長(zhǎng)或部分PSCAcDNA蛋白編碼序列克隆到pESP家族的載體內(nèi)。這些載體能夠可控地高水平表達(dá)在氨基端或羧基端融合有GST的PSCA蛋白序列，GST有助于重組蛋白的純化。FlagTM表位的存在使我們能夠用抗FlagTM抗體來(lái)檢測(cè)重組蛋白。實(shí)施例5在高等真核生物中的生產(chǎn)重組PSCAA.哺乳動(dòng)物構(gòu)建物為了在真核細(xì)胞中表達(dá)重組PSCA，可將全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度的PSCAcDNA序列或其變體克隆入本領(lǐng)域已知的多種表達(dá)載體中的任何一個(gè)。在這些構(gòu)建物中表達(dá)PSCA的一個(gè)或多個(gè)以下的區(qū)域PSCAv.1、PSCA變體或它們的類(lèi)似物中的氨基酸1-123或其中的任何8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個(gè)連續(xù)氨基酸?？蓪⒃摌?gòu)建物轉(zhuǎn)染入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如293T細(xì)胞)中的任何一種?？捎帽疚乃龅目筆SCA多克隆血清對(duì)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行探針標(biāo)記。pcDNA4/HisMax構(gòu)建物為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)PSCA，將PSCA的PSCAORF或其部分克隆入pcDNA4/HisMaxVersionA(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和SP16轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。該重組蛋白具有與氨基端融合的6個(gè)組氨酸(6×His)表位和XpressTM。所述pcDNA4/HisMax載體還包含牛生長(zhǎng)激素(BGH)多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列以提高mRNA的穩(wěn)定性，以及用于游離體復(fù)制的SV40起點(diǎn)和在表達(dá)大T抗原的細(xì)胞系中可獲得拯救的簡(jiǎn)單載體。憑借澤渥星(Zeocin)抗性基因篩選表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而憑借氨芐西林抗性基因和ColE1起點(diǎn)篩選和保留大腸桿菌中的質(zhì)粒。pcDNA3.1/MycHis構(gòu)建物為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)PSCA，將PSCA的PSCAORF或其部分與共有Kozak翻譯起始位點(diǎn)一起克隆入pcDNA3.1/MycHisVersionA(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。該重組蛋白具有與羧基端融合的6個(gè)組氨酸(6×His)表位和myc表位。所述pcDNA3.1/MycHis載體還包含牛生長(zhǎng)激素(BGH)多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列以提高mRNA的穩(wěn)定性，以及用于游離體復(fù)制的SV40起點(diǎn)和在表達(dá)大T抗原的細(xì)胞系中可獲得拯救的單一載體?？刹捎眯旅顾乜剐曰蚝Y選表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而憑借氨芐西林抗性基因和ColE1起點(diǎn)篩選和保留大腸桿菌中的質(zhì)粒。pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO構(gòu)建物為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)PSCA并可使用熒光來(lái)檢測(cè)重組蛋白，將PSCAORF或其部分與共有Kozak翻譯起始位點(diǎn)一起克隆入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO(Invitrogen，CA)。用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。該重組蛋白具有與羧基端融合的綠色熒光蛋白(GFP)，使得非侵入、體內(nèi)檢測(cè)和細(xì)胞生物學(xué)研究更為簡(jiǎn)便。所述pcDNA3.1CT-GFP-TOPO載體還包含牛生長(zhǎng)激素(BGH)多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列以提高mRNA的穩(wěn)定性，以及用于游離體復(fù)制的SV40起點(diǎn)和在表達(dá)大T抗原的細(xì)胞系中可獲得拯救的單一載體。憑借新霉素抗性基因篩選表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而憑借氨芐西林抗性基因和ColE1起點(diǎn)篩選和保留大腸桿菌中的質(zhì)粒。在pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO中制備在氨基端具有GFP融合的其它構(gòu)建物以跨越PSCA蛋白的全長(zhǎng)。PAPtag將PSCAORF或其部分克隆入pAPtag-5(GenHunterCorp.Nashville，TN)。該構(gòu)建物產(chǎn)生了PSCA蛋白羧基端的堿性磷酸酶融合物，而在氨基端則融合了IgGκ信號(hào)序列。還構(gòu)建了堿性磷酸酶和IgGκ信號(hào)序列氨基端融合于PSCA蛋白氨基端的構(gòu)建物。優(yōu)化所得重組PSCA蛋白以使其分泌入經(jīng)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的介質(zhì)中，并可用于鑒別與PSCA蛋白相互作用的蛋白質(zhì)(例如配體或受體)。用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)，該重組蛋白還包含在羧基端融合的6×His表位和myc，以使檢測(cè)和純化更簡(jiǎn)便。憑借載體中的澤渥星抗性基因篩選表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而憑借氨芐西林抗性基因篩選大腸桿菌中的質(zhì)粒。ptag5將PSCAORF或其部分克隆入pTag-5。該載體類(lèi)似于pAPtag，當(dāng)沒(méi)有堿性磷酸酶融合。由該構(gòu)建物產(chǎn)生的PSCA蛋白具有氨基端的IgGκ信號(hào)序列和位于羧基端的6×His表位tag和myc，從而使得檢測(cè)和親和純化更為簡(jiǎn)便。優(yōu)化所得重組PSCA蛋白以使其分泌入經(jīng)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的介質(zhì)中，并用作免疫原或配體來(lái)鑒別與PSCA蛋白相互作用的蛋白質(zhì)(例如配體或受體)。用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。憑借載體中的澤渥星抗性基因篩選表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而憑借氨芐西林抗性基因篩選大腸桿菌中的質(zhì)粒。PsecFc將PSCAORF或其部分克隆入psecFc。psecFc載體是通過(guò)將人免疫球蛋白G1(IgG)Fc(鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)、CH2區(qū))克隆入pSecTag2(Invitrogen，California)而組裝起來(lái)的。該構(gòu)建物產(chǎn)生了PSCA蛋白羧基端的IgG1Fc融合物，而在N端則融合了IgGK信號(hào)序列。還使用了采用了小鼠IgG1Fc區(qū)的PSCA融合物。優(yōu)化所得重組PSCA蛋白以使其分泌入經(jīng)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的介質(zhì)中，并可用作免疫原或鑒別與PSCA蛋白相互作用的蛋白質(zhì)(例如配體或受體)。用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。憑借載體中的潮霉素抗性基因篩選表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而憑借氨芐西林抗性基因篩選大腸桿菌中的質(zhì)粒。圖8所示為293T細(xì)胞中PSCA.psecFc蛋白的表達(dá)和純化。pSRα構(gòu)建物為了產(chǎn)生組成型表達(dá)PSCA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，將PSCA的PSCAORF或其部分克隆入pSRα構(gòu)建物。通過(guò)將pSRα構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入293T-10A1包裝品系或?qū)SRα和輔助質(zhì)粒(含有缺失的包裝序列)共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，分別產(chǎn)生兩性和嗜同反轉(zhuǎn)錄病毒。使用該反轉(zhuǎn)錄病毒感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，使得克隆基因PSCA整合入宿主細(xì)胞系。用長(zhǎng)末端基因重復(fù)(LTR)驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。憑借載體中的新霉素抗性基因篩選表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而憑借氨芐西林抗性基因和ColE1起始篩選和保留大腸桿菌中的質(zhì)粒。其后可將該反轉(zhuǎn)錄載體用于感染和采用例如PC3、NIH3T3、TsuPr1、293或rat-1細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生各種細(xì)胞系。圖6所示為采用PSCA.pSRα構(gòu)建物在重組小鼠、大鼠和人細(xì)胞系中的PSCA表達(dá)。以帶有人PSCAcDNA和新霉素抗性基因或僅含新霉素抗性基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染指定的小鼠、大鼠和人細(xì)胞系。通過(guò)G418藥物篩選獲得穩(wěn)定的重組細(xì)胞系。以用1G8抗PSCAMAb(5μg/ml)染色的FACS來(lái)測(cè)定PSCA表達(dá)。所示為各細(xì)胞系的FACS分布圖，顯示了熒光漂移僅在PSCA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中發(fā)生，指示了細(xì)胞表面的PSCA表達(dá)。這些細(xì)胞系可在Mab開(kāi)發(fā)中用作免疫原、MAb篩選試劑以及用于功能分析。通過(guò)使抗原表位tag(例如FLAGTMtag)融合于PSCA序列的羧基端制備其它pSRα構(gòu)建物，以使用抗Flag抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。例如，將FLAGTM序列5’gattacaaggatgacgacgataag3’(SEQIDNO76)加到ORF3’端的克隆引物。制備其它pSRα構(gòu)建物以產(chǎn)生全長(zhǎng)PSCA蛋白的氨基端和羧基端GFP和myc/6XHis融合蛋白。其它病毒載體制備用于PSCA的病毒介導(dǎo)的遞送和表達(dá)的其它構(gòu)建物。在病毒遞送系統(tǒng)(例如腺病毒病毒和皰疹擴(kuò)增子載體)中獲得導(dǎo)致PSCA高水平表達(dá)的高病毒滴度。通過(guò)PCR擴(kuò)增PSCA編碼序列或其片段，并將其亞克隆入AdEasy穿梭載體(Stratagene)。根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組和病毒包裝以產(chǎn)生腺病毒載體?；蛘?，將PSCA編碼序列或其片段克隆入HSV-1載體(Imgenex)以產(chǎn)生皰疹病毒載體。然后將該病毒載體用于感染各種細(xì)胞系，例如PC3、NIH3T3、293或rat-1細(xì)胞。調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)為了控制PSCA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，將PSCA編碼序列或其部分克隆入哺乳動(dòng)物的調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，例如T-Rex系統(tǒng)(Invitrogen)、GeneSwitch系統(tǒng)(Invitrogen)和緊密調(diào)節(jié)蛻皮素系統(tǒng)(tightly-regulatedEcdysoneSystem，Stratagene)。這些系統(tǒng)用于研究重組PSCA的時(shí)間和濃度依賴(lài)性作用。然后將這些載體用于控制PSCA在各種細(xì)胞系(例如PC3、NIH3T3、293或rat-1細(xì)胞)中的表達(dá)。B.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為了在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生重組PSCA蛋白，將PSCAORF或其部分克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體pBlueBac4.5(Invitrogen)，該載體在N端提供His-tag。具體而言，將pBlueBac-PSCA與輔助質(zhì)粒pBac-N-Blue(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染入SF9(草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))insecT細(xì)胞以產(chǎn)生重組桿狀病毒(詳見(jiàn)Invitrogen的說(shuō)明書(shū))。然后從細(xì)胞上清液中收集桿狀病毒，通過(guò)噬斑分析進(jìn)行純化。然后，用純化的桿狀病毒感染HighFiveinsecT細(xì)胞(Invitrogen)以產(chǎn)生重組PSCA蛋白?？墒褂每筆SCA或抗His-tag抗體來(lái)檢測(cè)重組PSCA蛋白?？杉兓疨SCA蛋白，并將其用于各種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析或?qū)⑵溆米髅庖咴援a(chǎn)生PSCA特異性的多克隆和單克隆抗體。C.用于PSCA正向同源物(ortholog)的表達(dá)載體將PSCA小鼠和猴的正向同源物克隆入pcDNA3.1/MycHisVersionA(Invitrogen，Carlsbad，CA)。采用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)。該重組蛋白具有融合于羧基端的6XHis表位和myc表位。這些載體使得PSCA正向同源物得以表達(dá)，以測(cè)試抗人PSCA單克隆抗體的交叉反應(yīng)性。還將PSCA的小鼠和猴正向同源物克隆入pSRα構(gòu)建物。該pSRα構(gòu)建物產(chǎn)生了組成型表達(dá)PSCA正向同源物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。采用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)。該重組蛋白具有融合于羧基端的6XHis表位和myc表位。這些載體使得PSCA正向同源物得以表達(dá)以測(cè)試抗人PSCA單克隆抗體的交叉反應(yīng)性和用于研究PSCA正向同源物的功能活性。通過(guò)將pSRα構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入293T-10Al包裝品系或?qū)SRα和輔助質(zhì)粒(含有缺失的包裝序列)共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞，分別產(chǎn)生兩性和嗜同反轉(zhuǎn)錄病毒。使用該反轉(zhuǎn)錄病毒感染各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，使得該克隆基因，即PSCA正向同源物整合入宿主細(xì)胞系。圖7所示為轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后的小鼠和猿猴PSCA.pcDNA3.1/MycHis的表達(dá)。用小鼠PSCA.pcDNA3.1/MycHis或猿猴PSCA.pcDNA3.1/MycHis或pcDNA3.1/MycHis載體對(duì)照轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。40小時(shí)后，采用抗PSCA單克隆抗體以流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)收集細(xì)胞并進(jìn)行分析。實(shí)施例6抗原性圖譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)可通過(guò)訪問(wèn)萬(wàn)維網(wǎng)ExPasy分子生物學(xué)服務(wù)器上的ProtScale網(wǎng)站(expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)找到PSCA變體1、3和4的氨基酸圖譜。這些圖譜親水性(hydrophilicity，HoppT.P.，WoodsK.R.，1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783824-3828)；水療性(hydropathicity，KyteJ.，DoolittleR.F.，1982.J.Mol.Biol.157105-132)；可接觸殘基百分比(JaninJ.，1979Nature277491-492平均屈曲性(BhaskaranR.和PonnuswamyP.K.，1988.Int.J.Pept.ProteinRes.32242-255)；β-轉(zhuǎn)角(Deleage，G.，RouxB.1987ProteinEngineering1289-294)；以及本領(lǐng)域熟知的其他圖譜，如ProtScale網(wǎng)站上所列的，都可用于鑒定每個(gè)PSCA變體蛋白上的抗原區(qū)。PSCA變體的各個(gè)上述氨基酸圖譜都可用下面的ProtScale參數(shù)來(lái)描述1)窗口大小為9；2)與窗口種系相比，窗口邊緣占100％權(quán)重；以及3)氨基酸圖譜值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后位于0到1之間。親水性、水療性和可接觸殘基百分比用于確定親水性氨基酸(即親水性和可接觸氨基酸百分比大于0.5、親水性小于0.5的氨基酸)的分布區(qū)域。這種區(qū)域可能會(huì)暴露于水性環(huán)境中，位于蛋白質(zhì)的表面，因此可作為免疫識(shí)別位點(diǎn)，如抗體的識(shí)別位點(diǎn)。平均屈曲性和β轉(zhuǎn)角決定了二級(jí)結(jié)構(gòu)如β折疊和α螺旋中不包含的氨基酸(即β轉(zhuǎn)角和平均屈曲性大于0.5的氨基酸)的分布區(qū)域。這種區(qū)域也可能暴露于蛋白表面，因此也可用于免疫識(shí)別，如抗體的識(shí)別。上述圖譜中指示的PSCA變體蛋白的抗原序列可用于制備免疫原(不論是肽或其編碼核酸)以產(chǎn)生治療性和診斷性的抗PSCA抗體。該免疫原可以包含圖1所列的PSCA變體蛋白的任意5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，或編碼這些氨基酸的相應(yīng)核酸，也可以推算出其氨基酸圖譜，因?yàn)樽凅w所含有的序列與圖1所示的變體是一樣的。特別需要指出的是，本發(fā)明的肽免疫原可以包含至少含有圖1的5個(gè)氨基酸的肽區(qū)域，其中所含的氨基酸數(shù)目可以任意整數(shù)遞增，其中所包含的氨基酸位置在圖5的親水性圖譜中值大于0.5；至少含有圖1的5個(gè)氨基酸的肽區(qū)域，其中所含的氨基酸數(shù)目可以任意整數(shù)遞增，其中所包含的氨基酸位置在親水性圖譜中的值小于0.5；至少含有圖1的5個(gè)氨基酸的肽區(qū)域，其中所含的氨基酸數(shù)目可以任意整數(shù)遞增，其中所包含的氨基酸位置在可接觸殘基百分比圖譜中的值大于0.5；至少含有圖1的5個(gè)氨基酸的肽區(qū)域，其中所含的氨基酸數(shù)目可以任意整數(shù)遞增，其中所包含的氨基酸位置在屈曲性圖譜中的值大于0.5；以及至少含有圖1的5個(gè)氨基酸的肽區(qū)域，其中所含的氨基酸數(shù)目可以任意整數(shù)遞增，其中所包含的氨基酸位置在β轉(zhuǎn)角圖譜中的值大于0.5。本發(fā)明的肽免疫原還包含編碼上述肽段的核酸。本發(fā)明的所有免疫原，不論肽或是核酸，都可以人用單位劑量的形式體現(xiàn)，或者包含在組合物內(nèi)，這種組合物包含與人體生理環(huán)境相容的藥用賦形劑。PSCA變體蛋白1、3、4和6的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即預(yù)測(cè)α螺旋、延伸鏈和不規(guī)則螺旋是否存在及存在的位置，可利用HNN-HierarchicalNeuralNetwork方法根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸序列來(lái)推測(cè)(NPS@NetworkProteinSequenceAnalysisTIBS2000年3月，第25卷，No3[291]147-150；CombetC.，BlanchetC.，GeourjonC.和DeléageG.，http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_nn.html)，該方法通過(guò)訪問(wèn)ExPasy分子生物學(xué)服務(wù)器可以找到(萬(wàn)維網(wǎng)上的expasy.ch/tools/)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)PSCA變體1由30.89％的α螺旋、21.95％的延伸鏈和47.15％的不規(guī)則螺旋組成。PSCA變體3由14.89％的α螺旋、28.51％的延伸鏈和76.60％的不規(guī)則螺旋組成。PSCA變體4由9.52％的α螺旋、8.99％的延伸鏈和81.48％的不規(guī)則螺旋組成。PSCA變體6由24.56％的α螺旋、21.93％的延伸鏈和53.51％的不規(guī)則螺旋組成。PSCA變體蛋白上是否存在跨膜區(qū)可用萬(wàn)維網(wǎng)ExPasy分子生物學(xué)服務(wù)器上的各種跨膜預(yù)測(cè)算法進(jìn)行分析(.expasy.ch/tools/)。實(shí)施例7PSCA多克隆抗體的產(chǎn)生多克隆抗體可通過(guò)給哺乳動(dòng)物注射一次或多次免疫制劑來(lái)制備，如果需要，制劑內(nèi)可加入佐劑。一般來(lái)說(shuō)，免疫制劑和/或佐劑通過(guò)多位點(diǎn)的皮下注射或腹膜內(nèi)注射來(lái)免疫哺乳動(dòng)物。除了用全長(zhǎng)的PSCA蛋白變體來(lái)免疫以外，還可以用計(jì)算機(jī)程序來(lái)設(shè)計(jì)免疫原，例如根據(jù)氨基酸序列分析結(jié)果找到抗原性的序列以及可被免疫宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別的序列(見(jiàn)標(biāo)題為“抗原性特征和二級(jí)結(jié)構(gòu)”的實(shí)施例)。經(jīng)預(yù)測(cè)可知這種片段具有親水性、屈曲性、β轉(zhuǎn)角構(gòu)型，位于蛋白質(zhì)的表面。例如，含有PSCA蛋白變體的親水性、屈曲性、β轉(zhuǎn)角區(qū)域的重組細(xì)菌融合蛋白或多肽可作為抗原用于在新西蘭白兔體內(nèi)制備多克隆抗體或標(biāo)題為“PSCA單克隆抗體的產(chǎn)生”的實(shí)施例所描述的單克隆抗體。例如，在PSCA變體1中，這類(lèi)區(qū)域包括而不限于氨基酸28-56和氨基酸66-94。在變體3中，這類(lèi)區(qū)域包括而不限于氨基酸6-18、氨基酸27-39、氨基酸103-133和氨基酸177-189。在變體6中，這類(lèi)區(qū)域包括而不限于氨基酸19-35和氨基酸57-85。在免疫因子上連接一個(gè)已知在被免疫的哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有免疫原性的蛋白質(zhì)是有益的。這類(lèi)免疫原性蛋白包括而不限于匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制因子。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼PSCA變體4的氨基酸103-133的肽連接上一個(gè)KLH用于免疫家兔。另外，免疫制劑還可以包含PSCA變體蛋白的全長(zhǎng)或部分序列、其模擬物或融合蛋白。例如，可以利用重組DNA技術(shù)將PSCA變體的氨基酸序列與本領(lǐng)域熟知的任意一種融合蛋白伴侶相融合，如含谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和HIS標(biāo)記的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用重組技術(shù)將PSCA變體1的氨基酸18-98與GST融合，在pGEX表達(dá)載體內(nèi)表達(dá)，純化后用于免疫家兔和小鼠，可以分別制備出多克隆抗體和單克隆抗體。這種融合蛋白可用適當(dāng)?shù)挠H和基質(zhì)從被誘導(dǎo)的細(xì)菌內(nèi)純化出來(lái)?？捎糜诒景l(fā)明的其他重組細(xì)菌融合蛋白包括麥芽糖結(jié)合蛋白、LacZ、硫氧還原蛋白、NusA或免疫球蛋白的恒定區(qū)(見(jiàn)“在原核系統(tǒng)中制備PSCA”部分和FrederickM.Ausubu等編的《分子生物學(xué)最新方法》第2卷第16單元，1995；Linsley，P.S.，Brady，W.，Urnes，M.，Grosmaire，L.，Damle，N.和Ledbetter，L.(1991)J.Exp.Med.174，561-566)。除了細(xì)菌來(lái)源的融合蛋白以外，也可以使用哺乳動(dòng)物表達(dá)的蛋白抗原。這些抗原可用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體如Tag5和Fc-融合載體進(jìn)行表達(dá)(見(jiàn)“在真核系統(tǒng)中制備重組PSCA”部分)，利用這種載體進(jìn)行表達(dá)可保留翻譯后修飾過(guò)程，如天然蛋白的糖基化。在一個(gè)實(shí)施方式中，PSCA變體1的cDNA、N端先導(dǎo)肽和C端GPI錨定蛋白被克隆到Tag5哺乳動(dòng)物分泌型載體內(nèi)，并在293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。利用金屬鰲合層析技術(shù)從穩(wěn)定表達(dá)重組載體的293T細(xì)胞組織培養(yǎng)上清中純化重組蛋白。純化出的Tag5PSCA蛋白就可以用作免疫原。在免疫過(guò)程中，用佐劑混合或乳化抗原以增強(qiáng)宿主動(dòng)物的免疫反應(yīng)是有益的。佐劑的例子包括而不限于完全弗氏佐劑(CFA)和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì)A，一種合成的海藻糖二白喉菌酸鹽(trehalosedicorynomycolate)。在一個(gè)典型的免疫方法中，家兔先通過(guò)皮下注射多達(dá)200mg，一般為100-200mg的融合蛋白或肽進(jìn)行免疫，融合蛋白連接有KLH，用完全弗氏佐劑(CFA)混合。然后每?jī)芍芤淮纹は伦⑸?00mg，一般為100-200mg用不完全弗氏佐劑(IFA)混合的免疫原。每次免疫后7-10天采集血樣進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)ELISA測(cè)定抗血清的滴度。為了測(cè)定免疫血清的反應(yīng)性和特異性，如用PSCA變體3或4蛋白的GST融合蛋白免疫的家兔血清，將各自的全長(zhǎng)PSCA變體cDNA克隆到pCDNA3.1myc-his表達(dá)載體(Invitrogen，見(jiàn)實(shí)施例“在真核系統(tǒng)中制備重組PSCA”)內(nèi)。將構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)以后，通過(guò)蛋白印跡技術(shù)用抗變體血清和抗His抗體(SantaCruzBiotechnologies，SantaCruz，CA)與細(xì)胞裂解物雜交以確定與變性的突變蛋白的特異反應(yīng)性。另外，利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)以及抗293T和其他重組PSCA變體表達(dá)細(xì)胞的免疫沉淀方法來(lái)分析免疫血清以確定天然蛋白的特異性識(shí)別活性。也可以利用內(nèi)源性表達(dá)PSCA的細(xì)胞進(jìn)行蛋白印跡、免疫沉淀、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)測(cè)定蛋白的反應(yīng)性和特異性。純化PSCA變體融合蛋白如GST和MBP融合蛋白免疫的家兔抗血清以去除能與融合伴侶序列反應(yīng)的抗體，利用只含融合伴侶或除融合伴侶外還含不相關(guān)融合蛋白的親和層析柱可以純化抗血清。例如，GST-PSCA變體1融合蛋白來(lái)源的抗血清首先通過(guò)含GST蛋白共價(jià)結(jié)合的AffiGel基質(zhì)(BioRad，Hercules，Calif.)的層析柱來(lái)純化。然后通過(guò)含MBP-PSCA融合蛋白共價(jià)結(jié)合的Affigel基質(zhì)的層析柱來(lái)純化。再通過(guò)G蛋白親和層析柱來(lái)純化抗血清以分離其中的IgG組分。其他His-標(biāo)記抗原和肽免疫家兔來(lái)源的血清以及去除融合伴侶的血清通過(guò)含原始蛋白免疫原或游離肽的層析柱進(jìn)行親和純化。實(shí)施例8PSCA單克隆抗體(MAb)的產(chǎn)生在一個(gè)實(shí)施方式中，PSCA和PSCA變體的治療性多克隆抗體(“Mab”)包括能與對(duì)各蛋白特異性的表位或共有序列特異性的表位發(fā)生反應(yīng)的那些抗體，所述抗體能結(jié)合、內(nèi)化(internalize)、阻止或調(diào)節(jié)PSCA或PSCA變體的生物學(xué)功能，例如那些可去除與配基和結(jié)合伴侶相互作用的序列。用于制備這種MAb的免疫原包括那些編碼或包含胞外區(qū)或完整PSCA蛋白序列的免疫原、預(yù)測(cè)包含功能性基序的區(qū)域、或者包含經(jīng)氨基酸序列的計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)具有抗原性的PSCA蛋白變體的某個(gè)區(qū)域的免疫原。免疫原包括肽、重組細(xì)菌蛋白(例如GST-PSCA融合蛋白(圖8)和His標(biāo)記的PSCApET載體蛋白(圖6))、由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的純化His標(biāo)記蛋白(圖7)以及人和鼠的IgGFC融合蛋白。另外，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而經(jīng)基因工程改造后可高水平表達(dá)PSCA變體1的細(xì)胞，例如RAT1-PSCA、293T-PSCA、3T3-PSCA或300.19-PSCA都可用于免疫小鼠。為了制備PSCA的單克隆抗體，通常首先通過(guò)在小鼠足墊(FP)內(nèi)用與適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┗旌系?-50μg蛋白免疫原或106-107個(gè)PSCA表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行免疫。用于FP的適宜免疫方法的例子是用TiterMax(Sigma)進(jìn)行首次FP注射，然后使用含有(Qiagen)的明礬膠。在初次注射后，每周對(duì)小鼠進(jìn)行2次免疫直至處死，從淋巴結(jié)獲得B細(xì)胞用于融合。在免疫過(guò)程中，采集血樣以監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)的滴度和特異性。在大多數(shù)情況下，一旦通過(guò)ELISA、蛋白印跡、免疫沉淀、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)得到了足夠的反應(yīng)性和特異性，就可以用電細(xì)胞融合法(BTX，ECM2000)進(jìn)行細(xì)胞融合及雜交瘤制備。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了命名為Ha1-1.16、Ha1-5.99、Ha1-4.117、Ha1-4.120、Ha1-4.121和Ha1-4.37的單克隆抗體。鑒別所述抗體并顯示與細(xì)胞表面或固定化的PSCA反應(yīng)和結(jié)合。采用異源小鼠(Xenomice)技術(shù)產(chǎn)生針對(duì)PSCA的Mab，在該技術(shù)中小鼠重鏈和κ輕鏈上的基因座已被滅活且主要的人重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白座位已插入Hal-1.16，它是用PSCA-GST免疫可產(chǎn)生人γ1的異源小鼠13次后產(chǎn)生的；Hal-5.99，它用Rat1-PSCA細(xì)胞免疫可產(chǎn)生人γ2的異源小鼠6次后再用PSCA-tag5注射2次產(chǎn)生的；Ha1-4.117、HA1-4.37、Ha1-4.120和Ha1-4.121，它們是用Rat1-PSCA細(xì)胞免疫可產(chǎn)生人γ1的異源小鼠6次后再用PSCA-tag5注射4次產(chǎn)生的。所述抗PSCAMab，Ha1-1.16、Ha1-5.99、Ha1-4.117、Ha1-4.120和Ha1-4.121結(jié)合在前列腺癌異種移植物細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源性細(xì)胞表面PSCA。將命名為Ha1-5.99、Ha1-4.117、Ha1-4.120、Ha1-4.37、Ha1-1.16和Ha1-4.121的抗體在2004年5月4目送至(通過(guò)聯(lián)邦快遞)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，VA20108，并被分別給予保藏號(hào)PTA-6703、PTA-6699、PTA-6700、PTA-6702、PTA-6698、PTA-6701。從各雜交瘤細(xì)胞中分離出mRNA后，用Trizol試劑(LifeTechnologies，GibcoBRL)測(cè)定抗PSCAMAbHa1-1.16、Ha1-5.99、Ha1-4.117、Ha1-4.120、Ha1-4.121和Ha1-4.37的DNA編碼序列。純化總RNA，并進(jìn)行定量。由寡聚(dT)1218引物使用GibcoBRLSuperscriptPreamplification系統(tǒng)產(chǎn)生第一鏈的cDNA。用人免疫球蛋白可變重鏈引物和人免疫球蛋白可變輕鏈引物擴(kuò)增第一鏈cDNA。將PCR產(chǎn)物克隆入pCRScript載體(Stratagene，LaJolla)。對(duì)多個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定重鏈和輕鏈可變區(qū)。重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸和氨基酸序列列于圖2和圖3中。PSCA抗體與種系V-D-J序列的比對(duì)示于圖4A-圖4M中。實(shí)施例9PSCA抗體的篩選和鑒別采用包括ELISA、FACS、表位分組和對(duì)細(xì)胞表面上表達(dá)的PSCA的親合力測(cè)試組合來(lái)對(duì)采用標(biāo)題為“PSCA單克隆抗體(MAbs)的產(chǎn)生”的實(shí)施例中所述的步驟所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行篩選和鑒別。A.通過(guò)FACS篩選人MAb。通過(guò)FACS對(duì)針對(duì)PSCA的MAb的原發(fā)雜交瘤進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下將50μl/孔的雜交瘤上清液(純)或純化的抗體(進(jìn)行系列稀釋)加入96孔FACS板中，與表達(dá)PSCA的細(xì)胞(內(nèi)源或重組，50,000個(gè)細(xì)胞/孔)混合。將該混合物在4℃下孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞，與100μl檢測(cè)抗體(抗-hIgG-PE)一起在4℃下孵育45分鐘。孵育結(jié)束后，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞，用甲醛固定，以FACScan進(jìn)行分析。采用CellQuestPro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)心的直方圖表示的是獲自對(duì)照細(xì)胞的數(shù)據(jù)，空心的直方圖代表的是獲自PSCA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)據(jù)(圖9)。將從原始篩選物中鑒別出的陽(yáng)性雜交瘤轉(zhuǎn)移入24孔板中，收集上清液用于確證篩選。確證篩選包括對(duì)B300.19-PSCA/300.19-neo、Rat1-PSCA/Rat1-neo、PC3-PSCA/neo、SW780(膀胱癌細(xì)胞系)、LAPC9AI(前列腺癌細(xì)胞系)、HPAC(胰腺癌細(xì)胞系)進(jìn)行FACs分析，以及采用Tag5-PSCA、GST-PSCA、GST-PSCAN端、Med.C端和pET-PSCA進(jìn)行ELISA分析。B.PSCA人MAb相對(duì)親合力分析測(cè)試雜交瘤上清液以確定它們對(duì)細(xì)胞表面PSCA的相對(duì)結(jié)合親合力。在FACS緩沖液(FB)中將雜交瘤上清液從μg/ml系列稀釋到亞sub-ng/ml；采用LAPC9AI細(xì)胞在FACS結(jié)合分析中進(jìn)行評(píng)估。高親合力抗體給出高M(jìn)FI值。采用CellQuestPro軟件獲得各點(diǎn)的MFI值，并將其用于采用GraphpadPrism軟件的親合力計(jì)算(表VII和表VIII)S型劑量-響應(yīng)(可變斜率)公式。相對(duì)親合力分析的結(jié)果示于圖10中。C.表位分組通過(guò)評(píng)估PSCA抗體對(duì)LAPC9AI細(xì)胞的結(jié)合形式，根據(jù)表位對(duì)PSCA抗體進(jìn)行分組。簡(jiǎn)而言之，使少量的各抗體生物素化；然后將各生物素化抗體在4℃和過(guò)量(100x)的非生物素化抗體的存在下孵育1小時(shí)。通常，如果過(guò)量抗體與生物素化的抗體結(jié)合于相同的表位，它們之間會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。孵育結(jié)束后，洗滌細(xì)胞，將其與鏈霉抗生物素-PE在4℃下一起孵育45分鐘。洗去未結(jié)合的鏈霉抗生物素-PE后，采用FACS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。用MFI測(cè)定進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(表VII)。如表XI所示，以黃色突出的細(xì)胞表示自體競(jìng)爭(zhēng)(self-competition，100％競(jìng)爭(zhēng))，這些細(xì)胞中的MFI是對(duì)各生物素化抗體的背景對(duì)照。無(wú)顏色標(biāo)示的細(xì)胞表示兩種抗體彼此競(jìng)爭(zhēng)(低MFI)，高M(jìn)FI(以藍(lán)色突出)表示兩種抗體結(jié)合兩種不同的表位。具有相同結(jié)合模式的抗體在抗體中結(jié)合于同樣的表位。測(cè)試了抗體中6個(gè)表位組。表XI顯示PSCA4.121結(jié)合于其獨(dú)特的表位。實(shí)施例10PSCA抗體的特征鑒定和表達(dá)A.與猴PSCA和小鼠PSCA的交叉反應(yīng)性篩選MAb，并對(duì)它們與小鼠和猿猴來(lái)源的反應(yīng)能力進(jìn)行特征鑒定。該特性用于理解使用小鼠和猿猴動(dòng)物模型時(shí)MAb與細(xì)胞上和組織中PSCA的結(jié)合?？寺～J猴(Cynomolgus)和小鼠PSCA基因，在反轉(zhuǎn)錄病毒中表達(dá)并瞬時(shí)感染293-T細(xì)胞。采用下述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將_____________與各種抗體一起孵育。將測(cè)試抗體與表達(dá)獼猴或小鼠PSCA的293-T細(xì)胞一起孵育，或與表達(dá)neo基因的293T細(xì)胞一起孵育作為陰性對(duì)照。采用抗hIgG-PE檢測(cè)二抗測(cè)定特異性識(shí)別。描述特異性交叉反應(yīng)性的典型直方圖示于圖11中。示于表X中的總結(jié)顯示所有的抗人PSCA抗體中除了一種抗體以外均與猴PSCA發(fā)生交叉反應(yīng)，僅一種抗人PSCA抗體與小鼠PSCA發(fā)生交叉反應(yīng)。B.通過(guò)FACS的親合力測(cè)定測(cè)試7個(gè)一組(7)的抗人PSCA抗體對(duì)SW780細(xì)胞(一種表達(dá)高水平PSCA的人膀胱癌細(xì)胞株)上PSCA的結(jié)合親合力。將23次系列1∶2稀釋的純化抗體與SW780細(xì)胞(50,000個(gè)細(xì)胞每孔)以167nM-0.01pM的終濃度在4℃下一起孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，洗滌細(xì)胞，并將其與抗hIgG-PE檢測(cè)抗體在4℃下一起孵育45分鐘。洗去未結(jié)合的檢測(cè)抗體后，用FACS分析細(xì)胞采用CellQuestPro軟件獲得各點(diǎn)的MFI值，并將其用于采用GraphpadPrism軟件的親合力計(jì)算S型劑量-響應(yīng)(可變斜率)公式(表VII和表VIII)。7種(7)抗體的相對(duì)親合力分析的結(jié)果示于表IX中。實(shí)施例11PSCA抗體的內(nèi)化使用PC3-PSCA細(xì)胞進(jìn)行Ha1-4.121的內(nèi)化研究。簡(jiǎn)而言之，將Ha1-4.121與細(xì)胞在4℃下一起孵育90℃以使所述抗體結(jié)合于所述細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞分為兩組，在37℃下繼續(xù)孵育以進(jìn)行抗體內(nèi)化，或者在4℃下進(jìn)行孵育作為對(duì)照(無(wú)內(nèi)化作用)。37℃/4℃孵育后進(jìn)行酸洗以去除結(jié)合于細(xì)胞表面的PSCA4.121。隨后進(jìn)行的滲透能夠檢測(cè)抗體結(jié)合于內(nèi)化的PSCA。與檢測(cè)二抗一起孵育后，用FACS分析細(xì)胞或在熒光顯微鏡下觀察。在37℃下孵育2小時(shí)后約30％的Ha1-4.121被內(nèi)化(圖12)。實(shí)施例12抗體介導(dǎo)的繼發(fā)性殺傷(secondarykiliing)抗PSCA的抗體在表達(dá)PSCA的細(xì)胞中介導(dǎo)皂草素依賴(lài)性殺傷。將B300.19-表達(dá)PSCA的細(xì)胞(750個(gè)細(xì)胞/孔)在第1天接種入96孔板。隨后的天數(shù)中在各孔中加入等體積的含有2×濃度指定一抗以及2倍過(guò)量的與皂草素毒素(AdvancedTargetingSystems，SanDiego，CA)偶聯(lián)的抗人(Hum-Zap)或抗山羊(山羊-Zap)多克隆抗體的培養(yǎng)基。使細(xì)胞在37℃下孵育5天。孵育期結(jié)束后，向各孔中加入MTS(Promega)，繼續(xù)孵育4小時(shí)。測(cè)定450nM處的OD值。圖13(A)中的結(jié)果顯示PSCA抗體HA1-4.121和HA1-4.117在B300.19-PSCA細(xì)胞中介導(dǎo)皂草素依賴(lài)性細(xì)胞毒作用，而非特異性人IgG1對(duì)照抗體則沒(méi)有效果。圖13(B)中的結(jié)果顯示加入與皂草素偶聯(lián)的不識(shí)別人Fc的二抗不能介導(dǎo)細(xì)胞毒作用(圖13(A)和圖13(B))。這些結(jié)果表明藥物或毒性蛋白質(zhì)可通過(guò)使用適宜的抗PSCAMAb而選擇性地被遞送到表達(dá)PSCA的細(xì)胞中。實(shí)施例13抗體免疫介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用對(duì)PSCA抗體進(jìn)行評(píng)估以確定它們介導(dǎo)免疫依賴(lài)性細(xì)胞毒作用的能力。用RHB緩沖液(RPMI1640，GibcoLifeTechnologies，20mMHEPES)稀釋PSCA抗體(0-50μg/ml)。在RHB緩沖液洗滌表達(dá)B300.19-PSCA的細(xì)胞，以106個(gè)細(xì)胞/ml的密度使細(xì)胞重新懸浮。在典型的分析中，將50μl的PSCA抗體、50μl的稀釋兔補(bǔ)體血清(Cedarlane，Ontario，Can)和50μl細(xì)胞懸液一起加入平底組織培養(yǎng)96孔板中。將混合物在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)以促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。然后在各孔中加入50μl的AlamarBlue(BiosourceIntl.Camarillo，CA)，并在37℃下繼續(xù)孵育4-5小時(shí)。使用96孔熒光計(jì)讀取熒光，在530nm處激發(fā)，590nm處發(fā)射。結(jié)果顯示具有Ig1(HA1-4.121)或IgG2同種型(HA1-5.99.1)但不是IgG4同種型(HA1-6.46)的PSCA抗體能介導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)性溶解(圖14)。ADCC(抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用)是一種對(duì)與靶向于特異性細(xì)胞表面抗原的抗體相結(jié)合的細(xì)胞的免疫介導(dǎo)的溶解攻擊。在本申請(qǐng)中，其為PSCA。免疫細(xì)胞識(shí)別抗體的Fc部分，通過(guò)結(jié)合于白細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞的Fcγ受體激發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的溶解性攻擊。PSCA抗體介導(dǎo)該反應(yīng)的能力可通過(guò)體外用51鉻、銪或熒光分子標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，將它們?cè)谌薖SCAMAb與外周血單核細(xì)胞的存在下進(jìn)行孵育?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定靶腫瘤細(xì)胞的溶解百分比來(lái)測(cè)定腫瘤細(xì)胞的特異性溶解。所測(cè)定的常規(guī)終末點(diǎn)包括采用適宜的檢測(cè)方法測(cè)定從死亡細(xì)胞中釋放的放射性、銪或熒光染料?；蛘?，可測(cè)定胞內(nèi)酶(例如乳酸脫氫酶，LDH)的釋放。實(shí)施例14F(Ab’)2片段的產(chǎn)生產(chǎn)生MAb的F(Ab’)2片段是為了用于研究體外和體內(nèi)治療模型中保留MAb分子二價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)但缺乏免疫效應(yīng)Fc區(qū)的MAb分子的效果。將20mg的MAbHa1-4.121的20mM醋酸鈉緩沖液pH4.5與或不與固定化的胃蛋白酶(Pierce。RockfordIL)一起孵育指定的時(shí)間。通過(guò)蛋白A層析去除完整的MAb和經(jīng)消化的Fc片段。圖15所示為完整的未經(jīng)消化未還原的MAb、在指定時(shí)間取出的未還原等份的經(jīng)消化的材料以及最終消化F(ab’)2產(chǎn)物的被還原的樣品的PAGE考馬斯染色凝膠。該試劑可用于治療荷有表達(dá)PSCA的腫瘤的動(dòng)物。以該抗體片段觀察到的抗腫瘤活性可區(qū)分固有的生物活性和由免疫依賴(lài)性機(jī)制介導(dǎo)的活性。實(shí)施例15采用重組DNA法的人抗體表達(dá)為了表達(dá)重組在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的抗PSCAMAb，將抗PSCA可變重鏈和輕鏈序列克隆分別到人重鏈IgG1和輕鏈Igκ恒定區(qū)的上游。將完整的抗PSCA人重鏈和輕鏈盒克隆到克隆載體中的CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的下游。在該MAb編碼序列的下游包含聚腺苷酸化位點(diǎn)。將該重組的表達(dá)抗PSCAMAb的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入293T、Cos和CHO細(xì)胞。對(duì)從重組293-T細(xì)胞中分泌出的HA1-4.121抗體與圖Pia-3A中的細(xì)胞表面PSCA的結(jié)合進(jìn)行評(píng)估，并與由原始雜交瘤產(chǎn)生的同樣的抗體進(jìn)行比較(圖16)。實(shí)施例16HLAI類(lèi)分子和II類(lèi)分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)HLAI類(lèi)分子和II類(lèi)分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)利用純化的HLA分子進(jìn)行，所用的方法是文獻(xiàn)公開(kāi)報(bào)道的(見(jiàn)PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO94/20127和WO94/03205；Sidney等，CurrentProtocolsinImmunology18.3.1(1998)；Sidney等，J.Immunol.154247(1995)；Sette等，Mol.Immunol.31813(1994))。簡(jiǎn)言之，純化的MHC分子(5-500nM)與各種未標(biāo)記的肽抑制因子和1-10nM125I標(biāo)記的肽探針結(jié)合，共孵育后通過(guò)凝膠過(guò)濾將MHC-肽復(fù)合物與游離肽分離，測(cè)定肽結(jié)合的部分。一般來(lái)說(shuō)，在預(yù)試驗(yàn)中，需要在固定量的放射性標(biāo)記肽存在的情況下測(cè)定每種MHC制備物的滴度以確定結(jié)合10-20％的總放射性所需要的HLA分子的濃度。隨后的抑制和直接結(jié)合試驗(yàn)就用這些濃度的HLA進(jìn)行。由于在這些條件下標(biāo)記物的濃度小于HLA的濃度，IC50大于等于HLA的濃度，因此所測(cè)得的IC50值應(yīng)當(dāng)近似等于真實(shí)的KD值。肽抑制因子的濃度一般在120μg/ml到1.2ng/ml之間，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行2到4次完全獨(dú)立的試驗(yàn)。為了比較不同試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)，需要計(jì)算每種肽的相對(duì)結(jié)合指數(shù)，計(jì)算方法為陽(yáng)性對(duì)照的IC50除以每個(gè)檢測(cè)肽的IC50(一般是放射性標(biāo)記探針肽的未標(biāo)記版本)。為了構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)和進(jìn)行試驗(yàn)內(nèi)的比較，需要編纂相對(duì)結(jié)合值。這些值可以再轉(zhuǎn)換成IC50nM值，轉(zhuǎn)換方法為陽(yáng)性對(duì)照的IC50nM值除以目的肽的相對(duì)結(jié)合值。這種數(shù)據(jù)編纂方法用于比較在不同時(shí)間檢測(cè)肽所得到的數(shù)據(jù)或用不同批次的純化MHC進(jìn)行試驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)時(shí)是準(zhǔn)確而穩(wěn)定的。上述的結(jié)合分析試驗(yàn)也可用于分析含HLA超基序和/或基序的肽(見(jiàn)表IV)。實(shí)施例17“小基因”多表位DNA質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例討論了小基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。當(dāng)然，小基因質(zhì)?？梢园疚乃枋龅母鞣N組合的B細(xì)胞、CTL和/或HTL表位或表位模擬物。小基因表達(dá)質(zhì)粒一般都包含多個(gè)CTL和HTL肽表位。在本實(shí)施例中，含HLA-A2、-A3、-B7超基序的肽表位和含HLA-A1和-A24基序的肽表位與含DR超基序的表位和/或DR3表位相連接。所選擇的是PSCA來(lái)源的含HLAI類(lèi)分子超基序或基序的肽表位，這樣質(zhì)粒內(nèi)就包含了多個(gè)超基序/基序，從而確保有一個(gè)較寬的群體覆蓋范圍。同樣，選擇PSCA來(lái)源的HLAII類(lèi)表位也可以提供較寬的群體覆蓋范圍，即在小基因構(gòu)建物內(nèi)既存在含HLADR-1、-4、-7超基序的表位又存在含HLADR-3基序的表位。然后將選擇的CTL和HTL表位插入到小基因內(nèi)，使其在表達(dá)載體內(nèi)表達(dá)。這種構(gòu)建物還可能包含將HTL表位引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的序列。例如，Ii蛋白可以被融合到本領(lǐng)域所描述的一個(gè)或多個(gè)HTL表位上，其中Ii蛋白的CLIP序列被刪除，替換以HLAII類(lèi)表位序列，這樣HLAII類(lèi)表位就可以被引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，表位在此處與HLAII類(lèi)分子結(jié)合。本實(shí)施例描述了含小基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法。其他的表達(dá)載體也可用于小基因組合物，這些載體也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本實(shí)施例的小基因DNA質(zhì)粒包含一個(gè)共有的Kozak和一個(gè)共有的鼠κIg輕鏈信號(hào)序列，隨后是根據(jù)本文所描述的原則選擇的CTL和/或HTL表位。這些序列可編碼一個(gè)開(kāi)放閱讀框架，利用pcDNA3.1Myc-His表達(dá)載體可將Myc和His抗體表位標(biāo)記融合上。平均包含約70個(gè)核苷酸，其中有15個(gè)重疊核苷酸的重疊寡核苷酸可以用化學(xué)合成的方法合成，通過(guò)HPLC純化。寡核苷酸編碼所選擇的肽表位和適當(dāng)?shù)倪B接寡核苷酸、Kozak序列和信號(hào)序列。利用PCR通過(guò)三組反應(yīng)延伸重疊的寡核苷酸就可以裝配成最終的多表位小基因。利用Perkin/Elmer9600PCR儀在下列條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)95℃15秒，復(fù)性溫度(比每個(gè)引物對(duì)的最低Tm計(jì)算值低5℃)30秒，以及72℃1分鐘。例如按照如下過(guò)程制備小基因。第一輪PCR反應(yīng)使用兩種寡核苷酸，每種5mg，復(fù)性和延伸在一個(gè)例子中使用8種寡核苷酸，即4對(duì)引物，寡核苷酸1+2、3+4、5+6和7+8混合在100ml反應(yīng)液中，其中含有Pfu聚合酶緩沖液(1×＝10mMKCL，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-Cl，pH8.75，2mMMgSO4，0.1％TritonX-100，100mg/mlBSA)、dNTP各0.25mM和2.5UPfu聚合酶。通過(guò)凝膠純化全長(zhǎng)的二聚產(chǎn)物，包含產(chǎn)物1+2和3+4以及產(chǎn)物5+6和7+8的兩種反應(yīng)液混合、復(fù)性及延伸10個(gè)循環(huán)。然后兩種反應(yīng)液各取一半混合，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)的復(fù)性和延伸，加入兩側(cè)引物以擴(kuò)增全長(zhǎng)產(chǎn)物。凝膠純化全長(zhǎng)產(chǎn)物，克隆到pCR-blunt(Invitrogen)中，通過(guò)測(cè)序篩選每一個(gè)克隆。實(shí)施例18質(zhì)粒構(gòu)建物及其誘導(dǎo)免疫原性的程度一個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建物，如上述實(shí)施例所構(gòu)建的質(zhì)粒，其誘導(dǎo)免疫原性的能力可通過(guò)在體外用表位表達(dá)核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染APC，然后再測(cè)定APC提呈表位的能力來(lái)確定。這種試驗(yàn)可確定“抗原性”，可使用人APC。該試驗(yàn)測(cè)定的是表位被APC提呈的能力，如果一個(gè)表位可以被T細(xì)胞識(shí)別，那么通過(guò)定量測(cè)定細(xì)胞表面表位-HLAI類(lèi)分子復(fù)合物的密度就可以確定這種能力。定量測(cè)定可通過(guò)直接測(cè)定從APC上洗脫的肽數(shù)量來(lái)確定(見(jiàn)Sijts等，J.Immunol.156683-692，1996；Demotz等，Nature342682-684，1989)，或者通過(guò)測(cè)定溶解釋放或淋巴因子釋放的量來(lái)確定肽-HLAI類(lèi)分子復(fù)合物的數(shù)量，溶解釋放或淋巴因子釋放是由患病的或轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞誘導(dǎo)的，然后就可以確定達(dá)到相同水平的溶解釋放或淋巴因子釋放所需要的肽濃度(見(jiàn)Kageyama等，J.Immunol.154567-576，1995)。另外，免疫原性也可以通過(guò)體內(nèi)注射小鼠，然后體外測(cè)定CTL和HTL活性來(lái)確定，CTL活性和HTL活性分別用細(xì)胞毒活性測(cè)定試驗(yàn)和增殖試驗(yàn)來(lái)確定，如Alexander等，Immunity1751-761，1994所詳細(xì)描述的。例如，為了確定至少含一個(gè)HLA-A2超基序肽的DNA小基因構(gòu)建物在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL的能力，肌肉注射100mg裸cDNA免疫HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠。為了比較cDNA免疫所誘導(dǎo)的CTL水平，對(duì)照組動(dòng)物用肽組合物進(jìn)行免疫，其中肽組合物內(nèi)含有多個(gè)表位，這些表位位于一條多肽鏈上，如同小基因編碼的多肽鏈一樣。從免疫動(dòng)物體內(nèi)分離脾細(xì)胞，用兩種組合物(小基因編碼的肽表位和多表位肽編碼的肽表位)分別刺激兩次，然后通過(guò)51Cr釋放試驗(yàn)測(cè)定肽特異性的細(xì)胞毒活性。結(jié)果可顯示抗A2限制性表位的CTL反應(yīng)強(qiáng)度，從而說(shuō)明了小基因疫苗和多表位疫苗在體內(nèi)的免疫原性。因此，該試驗(yàn)的結(jié)果證明了小基因可激發(fā)針對(duì)HLA-A2超基序肽表位的免疫反應(yīng)，多表位肽疫苗也是如此。利用其他HLA-A3和HLA-B7轉(zhuǎn)基因小鼠模型通過(guò)相似的試驗(yàn)也可以評(píng)價(jià)HLA-A3和HLA-B7基序或超基序表位對(duì)CTL的誘導(dǎo)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小基因也可以激發(fā)出針對(duì)這些表位的免疫反應(yīng)。為了評(píng)價(jià)編碼II類(lèi)表位的小基因在體內(nèi)誘導(dǎo)HTL的能力，肌肉注射100mg質(zhì)粒DNA免疫DR轉(zhuǎn)基因小鼠或I-Ab-限制性小鼠，后者用于評(píng)價(jià)能與適宜鼠MHC分子發(fā)生交叉反應(yīng)的那些表位。為了比較DNA免疫所誘導(dǎo)的HTL水平，設(shè)一組對(duì)照動(dòng)物，用完全弗氏佐劑乳化的肽組合物免疫。從免疫動(dòng)物體內(nèi)分離脾細(xì)胞，純化出其中的CD4+T細(xì)胞，即HTL，用兩種組合物(小基因編碼的肽)分別刺激。通過(guò)3H胸腺嘧啶摻入增殖試驗(yàn)測(cè)定HTL反應(yīng)(見(jiàn)Alexander等，Immunity1751-761，1994)。結(jié)果表明產(chǎn)生了一定強(qiáng)度的HTL反應(yīng)，因而說(shuō)明了小基因在體內(nèi)具有免疫原性。按照上述實(shí)施例的描述構(gòu)建的DNA小基因也可以作為疫苗聯(lián)合加強(qiáng)因子通過(guò)初免-加強(qiáng)策略進(jìn)行評(píng)價(jià)。加強(qiáng)因子包括重組蛋白(見(jiàn)Barnett等，AidsRes.andHumanRetroviruses14，增刊3S299-S309，1998)或重組痘苗病毒，如表達(dá)編碼完整目的蛋白的小基因或DNA(見(jiàn)Hanke等，Vaccine16439-445，1998；Sedegah等，Proc.Natl.Acad.SciUSA957648-53，1998；Hanke和McMichael，Immunol.Letters66177-181，1999以及Robinson等，NatureMed.5526-34，1999)。例如，用于初免-加強(qiáng)策略的DNA小基因的效率首先用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)。在本實(shí)施例中，A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠用IM加100mg編碼免疫原性肽的DNA小基因免疫，其中的免疫原性肽至少包括一個(gè)含HLA-A2超基序的肽。經(jīng)過(guò)孵育期(3-9周)以后，小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射重組痘苗病毒進(jìn)行加強(qiáng)免疫，注射劑量為每只小鼠107pfu，痘苗病毒表達(dá)DNA小基因編碼的相同序列。對(duì)照鼠用100mgDNA或不含小基因的重組痘苗病毒免疫，或者用編碼小基因的DNA免疫，但是不用痘苗病毒加強(qiáng)免疫。再經(jīng)過(guò)2周的孵育期后，取小鼠的脾細(xì)胞，立即通過(guò)ELISPOT試驗(yàn)分析其肽特異性的細(xì)胞毒活性。另外，在體外用小基因或重組痘苗病毒編碼的A2限制性肽表位刺激，然后通過(guò)α、β和/或γIFNELISA來(lái)測(cè)定肽特異性的細(xì)胞毒活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)初免-加強(qiáng)策略所用的小基因所激發(fā)的針對(duì)HLA-A2超基序肽的免疫反應(yīng)比單獨(dú)的DNA強(qiáng)。利用HLA-A11或HLA-B7轉(zhuǎn)基因小鼠模型可進(jìn)行類(lèi)似的分析以評(píng)價(jià)HLA-A3或HLA-B7基序或超基序表位誘導(dǎo)CTL的能力。在人體內(nèi)實(shí)施初級(jí)加強(qiáng)方案的方法見(jiàn)下面的實(shí)施例“利用初免一加強(qiáng)策略誘導(dǎo)CTL反應(yīng)”的描述。實(shí)施例19多抗原來(lái)源的多表位疫苗組合物本發(fā)明的PSCA肽表位可與其他腫瘤相關(guān)靶抗原來(lái)源的表位組合，形成的疫苗組合物可用于預(yù)防或治療表達(dá)PSCA和該腫瘤相關(guān)靶抗原的腫瘤。例如，本發(fā)明提供的一種疫苗組合物以單鏈多肽的形似存在，該多肽鏈內(nèi)含有PSCA和腫瘤相關(guān)抗原來(lái)源的多個(gè)表位，其中表達(dá)PSCA的靶腫瘤通常也表達(dá)該腫瘤相關(guān)抗原，或者該疫苗組合物是一個(gè)或多個(gè)不連續(xù)表位的混合物。另外，疫苗還可以小基因構(gòu)建物或樹(shù)突狀細(xì)胞的形式注射，其中的樹(shù)突狀細(xì)胞已在體外被加載上肽表位。實(shí)施例20利用肽評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)本發(fā)明的肽可用于分析免疫反應(yīng)以判斷是否存在針對(duì)PSCA的特異性抗體、CTL或HTL。這種分析可用0gg等，Science2792103-2106，1998描述的方法進(jìn)行。在本實(shí)施例中，本發(fā)明的肽作為試劑而不是免疫原用于診斷或判斷預(yù)后的目的。在本實(shí)施例中，高敏感性的人白細(xì)胞抗原四聚體復(fù)合物(“四聚物”)作為有代表性的例子用于分析處于不同疾病階段的或用含A*0201基序的PSCA肽免疫后的HLAA*0201陽(yáng)性個(gè)體產(chǎn)生PSCAHLA-A*0201-特異性CTL的幾率。按照文獻(xiàn)(Musey等，N.Engl.J.Med.3371267，1997)描述的方法合成四聚體復(fù)合物。簡(jiǎn)言之，在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)合成純化的HLA重鏈(在本實(shí)施例中為A*0201)和b2-微球蛋白。通過(guò)刪除跨膜-胞質(zhì)尾巴并在COOH端添加一個(gè)含BirA酶催化生物素化位點(diǎn)的序列來(lái)修飾重鏈。通過(guò)稀釋使重鏈、b2-微球蛋白和肽重新折疊。利用快速蛋白液相色譜技術(shù)分離出45-kD的重折疊產(chǎn)物，在生物素(Sigma，St.Louis，Missouri)、5’-三磷酸腺苷和鎂離子存在的條件下利用BirA使該產(chǎn)物生物素化。以1∶4摩爾比的比例加入鏈親和素-藻紅蛋白連接物，四聚體產(chǎn)物濃縮到1mg/ml。所得到的產(chǎn)物被稱(chēng)為四聚物-藻紅蛋白。為了對(duì)患者的血樣進(jìn)行分析，約1×106PBMC在300g離心5分鐘，然后重懸到50ml冷磷酸鹽緩沖液中。利用四聚物-藻紅蛋白、抗CD8-Tricolor和抗CD38進(jìn)行三色分析。PBMC與四聚物和抗體在冰上共孵育30到60分鐘，洗滌兩次后用甲醛固定。所設(shè)定的門(mén)為大于對(duì)照樣品的99.98％。四聚物的對(duì)照包括A*0201陰性個(gè)體和A*0201陽(yáng)性非患病供體。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定四聚物染色的細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果可顯示出PBMC樣品內(nèi)包含表位限制性CTL的細(xì)胞數(shù)，從而可以很容易地確定針對(duì)PSCA表位的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，因此可判斷出暴露于PSCA或疫苗后所激發(fā)的保護(hù)性反應(yīng)或治療性反應(yīng)的狀況。實(shí)施例21通過(guò)初免加強(qiáng)策略誘導(dǎo)CTL反應(yīng)與上述實(shí)施例“質(zhì)粒構(gòu)建物及其誘導(dǎo)免疫原性的程度”所描述的用于確定DNA疫苗在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的療效相似的初免-加強(qiáng)策略在下文所描述的原則下也可用于評(píng)價(jià)疫苗在人體內(nèi)的療效。這種疫苗免疫方案包括用裸DNA初次免疫，然后再用佐劑混合的編碼疫苗的重組病毒或重組蛋白/多肽或肽混合物加強(qiáng)免疫。例如，初次免疫可以用表達(dá)載體，如實(shí)施例“小基因多表位DNA質(zhì)粒的構(gòu)建“中所構(gòu)建的表達(dá)載體，以裸核酸的形式肌肉注射(或皮下注射或ID)到多個(gè)位點(diǎn)，給藥劑量為0.5-5mg。也可以用基因槍注射核酸(0.1-1000mg)。經(jīng)過(guò)3-4周的孵育期后，再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫可以用5×107到5×109pfu的重組雞痘病毒。其他的重組病毒，如MVA、金絲雀痘病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒也可用于加強(qiáng)免疫，或者多表位蛋白或肽混合物。為了評(píng)價(jià)疫苗的療效，在免疫前、初次免疫后和加強(qiáng)免疫后采集患者的血樣。通過(guò)Ficoll-Hypaque密度梯度離心從肝素化的新鮮血樣中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用凍存液重懸后裝入凍存管冷凍儲(chǔ)存。分析樣品的CTL和HTL活性。試驗(yàn)結(jié)果表明所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)度足以達(dá)到產(chǎn)生抗PSCA治療性或保護(hù)性免疫的目的。實(shí)施例22互補(bǔ)的多核苷酸將與PSCA編碼序列互補(bǔ)的序列(圖1或圖3)或其任何部分用于檢測(cè)、降低或抑制天然PSCA的表達(dá)。雖然本文已經(jīng)描述了約含15到30個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸的用途，但是基本類(lèi)似的方法也可用于更小或更大的序列片段。利用OLIGO4.06軟件(NationalBiosciences)和PSCA的編碼序列設(shè)計(jì)適宜的寡核苷酸。為了抑制轉(zhuǎn)錄，根據(jù)最獨(dú)特的5’序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸，用于阻止啟動(dòng)子與編碼序列的結(jié)合。為了抑制翻譯，所設(shè)計(jì)的互補(bǔ)寡核苷酸可阻止核糖體結(jié)合到PSCA編碼轉(zhuǎn)錄物上。實(shí)施例23利用PSCA特異性的抗體純化天然的或重組的PSCA利用PSCA特異性的抗體通過(guò)免疫親和層析純化天然的或重組的PSCA。將抗PSCA抗體共價(jià)結(jié)合到活化的層析樹(shù)脂如CNBr活化的SEPHAROSE(AmershamPharmaciaBiotech)上制備出免疫親和層析柱。結(jié)合以后按照廠商的說(shuō)明書(shū)封閉和洗滌樹(shù)脂。含PSCA的介質(zhì)通過(guò)免疫親和層析柱，然后在允許PSCA優(yōu)先吸附的條件(如含去污劑的高離子強(qiáng)度緩沖液)下洗滌層析柱。再用打破抗體/PSCA結(jié)合的條件(如pH2到pH3的緩沖液，或高濃度的離液劑，如尿素或硫氰酸鹽離子)洗脫層析柱，收集GCR.P。實(shí)施例24鑒定可與PSCA相互作用的分子PSCA或其生物活性片段用1211Bolton-Hunter試劑標(biāo)記(見(jiàn)Bolton等(1973)Biochem.J.133529)。在上述多孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)排列的候選分子與標(biāo)記的PSCA共孵育，洗滌后檢測(cè)含標(biāo)記的PSCA復(fù)合物的所有孔。不同濃度的PSCA所得到數(shù)據(jù)用于計(jì)算PSCA與候選分子結(jié)合的數(shù)量、親和力和相互作用。實(shí)施例25測(cè)定PSCA在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用通過(guò)評(píng)價(jià)表達(dá)或缺乏PSCA的細(xì)胞的發(fā)育和生長(zhǎng)情況來(lái)確定PSCA蛋白在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。例如，在SCID小鼠一側(cè)皮下注射1×106含tkNeo空載體或PSCA的3T3細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞株(如PC3細(xì)胞)。至少有兩種策略可用(1)在啟動(dòng)子如組成型啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下進(jìn)行PSCA的組成型表達(dá)，這種組成型的啟動(dòng)子可來(lái)自病毒的基因組，如多瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日出版的UK2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥(niǎo)肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)，或者是來(lái)自于哺乳動(dòng)物的異源啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子，只要這些啟動(dòng)子與可誘導(dǎo)的載體系統(tǒng)相容即可，以及(2)在可誘導(dǎo)載體系統(tǒng)的控制下進(jìn)行可調(diào)控的表達(dá)，如蛻皮素、四環(huán)素等，只要這種啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容即可。如果腫瘤是可以觸摸到的，那么就用卡鉗測(cè)量腫瘤的體積，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后判斷PSCA表達(dá)細(xì)胞是否以更快的速度生長(zhǎng)，以及PSCA表達(dá)細(xì)胞形成的腫瘤其侵襲性特征是否已經(jīng)發(fā)生改變(如轉(zhuǎn)移能力提高、血管化、對(duì)化療藥物的敏感性降低)。另外，可以給小鼠原位植入1×105相同的細(xì)胞以判斷PSCA對(duì)前列腺內(nèi)的局部生長(zhǎng)是否有影響，以及PSCA是否影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力，特別是淋巴結(jié)和骨內(nèi)的轉(zhuǎn)移(MikiT等，OncolRes.2001；12209；FuX等，Int.JCancer.1991，49938)。PSCA骨腫瘤形成和生長(zhǎng)的影響可以通過(guò)向脛骨內(nèi)注射前列腺腫瘤細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)。該試驗(yàn)也可用于分析PSCA對(duì)候選治療性組合物的抑制效應(yīng)，如PSCA內(nèi)體、PSCA反義分子和核酶。實(shí)施例26PSCA單克隆抗體介導(dǎo)的腫瘤體內(nèi)抑制作用PSCA在腫瘤組織在細(xì)胞表面內(nèi)顯著表達(dá)，而在正常組織內(nèi)限制性表達(dá)，這就使PSCA成為抗體治療的理想靶位。PSCA同樣也是T細(xì)胞免疫治療的靶位。因此，重組細(xì)胞系如PC3-PSCA和3T3-PSCA(見(jiàn)Kaighn，M.E.等，InvestUrol，1979.17(1)16-23)和人前列腺異種移植模型，例如LAPC9AD(Saffran等，PNAS1999，101073-1078)可用于評(píng)價(jià)抗PSCA單克隆抗體在人前列腺癌異種移植鼠模型和人胰腺癌異種移植小鼠模型中的治療效應(yīng)?？贵w對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移癌形成的效應(yīng)可在鼠原位前列腺或胰腺癌異種移植模型中進(jìn)行研究?？贵w可以如本實(shí)施例所討論的那樣是未連接任何物質(zhì)的，也可以如本領(lǐng)域所熟知的那樣連接到治療性載體上?？筆SCAMAb可抑制腫瘤在胰腺和前列腺異種移植模型中的形成?？筆SCAMAb還可以抑制已有原位腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活期。這些結(jié)果說(shuō)明抗PSCAMAb可用于治療幾種局部和晚期前列腺癌、胰腺癌和表I中所列的那些癌癥(見(jiàn)Saffran，D.等，PNAS101073-1078；或訪問(wèn)站點(diǎn)pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698)。注射抗PSCAMAb可導(dǎo)致已有原位腫瘤生長(zhǎng)的抑制，阻止腫瘤轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的部位，這樣就可以顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活期。這些研究表明PSCA是免疫治療的理想靶位，PSCAMAb用于治療局部腫瘤和轉(zhuǎn)移前列腺和胰腺腫瘤時(shí)是有效的。本實(shí)施例說(shuō)明未連接任何物質(zhì)的PSCA單克隆抗體可有效地抑制人前列腺腫瘤異種移植物在SCID小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)；相應(yīng)的，這類(lèi)單克隆抗體的組合也是有效的。利用多種PSCAMAb抑制腫瘤材料和方法PSCA單克隆抗體根據(jù)實(shí)施例“PSCA單克隆抗體(MAb)的制備”所描述的方法可以制備出抗PSCA的單克隆抗體。通過(guò)ELISA、蛋白印跡、FACS和免疫沉淀技術(shù)測(cè)定抗體與PSCA結(jié)合的能力。通過(guò)ELISA和蛋白印跡試驗(yàn)獲得的抗PSCAMAb的表位圖譜數(shù)據(jù)表明該抗體可識(shí)別PSCA蛋白上的表位。利用這些抗體對(duì)前列腺腫瘤組織和細(xì)胞進(jìn)行免疫組化分析。利用Protein-G或蛋白-ASepharose層析柱從腹水或雜交瘤組織培養(yǎng)上清液中純化單克隆抗體，用PBS透析，過(guò)濾除菌后-20℃儲(chǔ)存。利用Bradfordassay(Bio-Rad，Hercules，CA)測(cè)定蛋白含量。制備治療性單克隆抗體或包含不同單克隆抗體的混合物，用于治療皮下或原位注射LAPC9AD和HPAC腫瘤異種移植物的小鼠。細(xì)胞系和異種移植物將前列腺癌細(xì)胞系PC3和LNCaP細(xì)胞系以及成纖維細(xì)胞系NIH3T3(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)分別保存在補(bǔ)充有L-谷胺酰胺和10％FBS的RPMI和DMEM中。通過(guò)Hubert等，ProcNatlAcadSciUSA，1996，96(25)14523中所述的反轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生PC3-PSCA和3T3-PSCA細(xì)胞群。LAPC-9異種移植物表達(dá)野生型雄激素受體，可產(chǎn)生前列腺特異性抗原(PSA)，通過(guò)皮下套針將其植入到6-8周齡的雄性ICR-重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(TaconicFarms)體內(nèi)(Craft，N.等，1999，5280)。按照Craft等描述的方法制備LAPC-9腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。異種移植小鼠模型在雄性SCID小鼠右腹部皮下注射1×106用基質(zhì)膠(CollaborativeResearch)按1∶1的比例混合的腫瘤細(xì)胞制備皮下(s.c.)腫瘤。為了檢測(cè)抗體對(duì)腫瘤形成的影響，在注射腫瘤細(xì)胞的同一天開(kāi)始注射抗體。對(duì)照小鼠注射純化的鼠IgG(ICN)或PBS；或者注射識(shí)別人源細(xì)胞不表達(dá)的無(wú)關(guān)抗原的純化單克隆抗體。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鼠IgG和PBS對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響無(wú)明顯差異。利用卡鉗測(cè)定腫瘤的大小，腫瘤的體積等于長(zhǎng)度×寬度×高度。當(dāng)皮下腫瘤的直徑超過(guò)1.5cm時(shí)處死小鼠。用氯胺酮/賽拉嗪麻醉后進(jìn)行原位注射。在進(jìn)行前列腺原位移植試驗(yàn)時(shí)，切開(kāi)小鼠腹部，暴露前列腺。基質(zhì)膠混合的LAPC或PC3腫瘤細(xì)胞(2×106)注射到前列腺囊內(nèi)，注射體積為10μl。為了監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，對(duì)小鼠進(jìn)行觸檢，每周采集一次小鼠血樣以測(cè)定PSA的表達(dá)水平。抗PSCAMAb可抑制表達(dá)PSCA的異種移植腫瘤的生長(zhǎng)利用HPAC和LAPC9原位模型來(lái)評(píng)價(jià)抗PSCAMAb對(duì)腫瘤形成的影響。與皮下腫瘤模型相比，原位腫瘤移植模型需要將腫瘤細(xì)胞分別直接注射到小鼠胰腺或前列腺內(nèi)，導(dǎo)致局部腫瘤的形成，腫瘤向遠(yuǎn)處部位的轉(zhuǎn)移，小鼠健康狀況的惡化，以及小鼠隨后死亡(Saffran，D.等，PNAS，同上)。這些特征使原位模型更能代表人類(lèi)疾病的進(jìn)展過(guò)程，能夠使我們根據(jù)臨床相關(guān)指標(biāo)來(lái)判斷單克隆抗體的治療效應(yīng)。相應(yīng)地將腫瘤細(xì)胞注射入小鼠前列腺，2天后將小鼠分成2組，用a)250-1000μg的抗PSCAAb；或b)對(duì)照抗體，每周3次進(jìn)行治療，持續(xù)2-5周。原位腫瘤模型的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。利用抗腫瘤特異性細(xì)胞表面蛋白的抗體如前列腺癌的抗CK20抗體通過(guò)IHC分析可研究已有原位腫瘤的小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的形成(LinS等，CancerDetectPrev.2001；25202)。原位腫瘤模型的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠研究新生血管化和血管生成。腫瘤生長(zhǎng)部分依賴(lài)于新血管的形成。雖然毛細(xì)血管系統(tǒng)和形成的血管網(wǎng)是宿主來(lái)源的，但是異種移植腫瘤也能夠調(diào)節(jié)新生血管的起始和結(jié)構(gòu)(Davidoff等，ClinCancerRes.2001；72870；SolesvikO等，Eur.JCancerClinOncol.1984，201295)。利用本領(lǐng)域熟知的方法可以研究抗體和小分子對(duì)新生血管化的影響，例如通過(guò)IHC分析腫瘤組織及其周?chē)奈h(huán)境。在4周內(nèi)給已有原位腫瘤的小鼠注射抗PSCAMAb或?qū)φ湛贵w。給兩組小鼠都加載較高的腫瘤負(fù)荷以確保在小鼠肺內(nèi)形成轉(zhuǎn)移瘤。然后處死小鼠，通過(guò)IHC分析其膀胱、肝臟、骨和肺內(nèi)是否存在腫瘤細(xì)胞。這些試驗(yàn)的結(jié)果證明抗PSCA抗體在鼠異種移植模型內(nèi)具有高效的抗前列腺癌形成和進(jìn)展的活性?？筆SCA抗體可抑制腫瘤的形成，阻止已有腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)治療小鼠的存活期。而且，抗PSCAMAb對(duì)局部前列腺腫瘤向遠(yuǎn)處位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移具有極強(qiáng)的抑制效應(yīng)，即使存在較高的腫瘤負(fù)荷。因此，抗PSCAMAb有助于改善主要臨床指標(biāo)(腫瘤生長(zhǎng))，延長(zhǎng)存活期，改善患者的健康狀況。PSCAMab對(duì)小鼠中人前列腺癌生長(zhǎng)的影響采用上述方法，將LAPC-9AI腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)皮下注射入雄性SCID小鼠。將小鼠隨機(jī)分組(各組中的n＝10)，按照指示在第0天時(shí)經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)給予HA1-4.120或同種型Mab對(duì)照起始治療。每周2次對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，總共給藥7次，直至研究的第28天。按照指示每3-4天用測(cè)徑儀測(cè)量監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Ha1-4.120顯著地抑制了皮下植入SCID小鼠的人前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)(p＜0.05)(圖18)。在另一試驗(yàn)中，將LAPC-9AI腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)皮下注射入雄性SCID小鼠。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組(各組中的n＝10)，按照指示經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)給予指定的HA1-5.99.1或同種型Mab對(duì)照起始治療。每周2次對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，總共給藥5次，直至研究的第14天。按照指示每3-4天用測(cè)徑儀測(cè)量監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果顯示全人抗PSCA單克隆抗體Ha1-5.99顯著抑制了皮下植入SCID小鼠的建立的雄激素依賴(lài)性人前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)(p＜0.05)(圖19)。在另一試驗(yàn)中，將LAPC-9AD腫瘤細(xì)胞(2.5×106個(gè)細(xì)胞)皮下注射入雄性SCID小鼠。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到40mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組(各組中的n＝10)，按照指示腹膜內(nèi)注射(i.p.)提高濃度的HA1-4.121或同種型MAb對(duì)照開(kāi)始治療。每周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行2次治療，總共給藥7次，直至研究的第21天。按照指示每3-4天用測(cè)徑儀檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究的結(jié)果顯示HA1-4.121抑制了皮下植入SCID小鼠中的建立的人雄激素依賴(lài)性前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)。結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上為顯著的是300μg劑量組第14、17和21天(p＜0.05，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，雙尾α＝0.05)和700μg劑量組第10、14、17和21天(p＜0.05，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，雙尾α＝0.05)(圖20)。在另一試驗(yàn)中，將獲自患者且雄激素依賴(lài)性的LAPC-9AD腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)注射入雄性SCID小鼠前列腺的背瓣。使腫瘤生長(zhǎng)約10天，對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。在植入腫瘤10天后用500mg人HA1-4.117、HA1-4.121或同種型對(duì)照開(kāi)始治療。每周2次經(jīng)腹膜內(nèi)遞送抗體，總共給藥7次。最后一劑后4天時(shí)，處死動(dòng)物，取出原發(fā)腫瘤并稱(chēng)重。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Ha1-4.121(p＜0.01)和Hal-4.117(p＜0.05)顯著抑制了常位移植入SCID小鼠的LAPC-9AD前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)(圖21)。在另一試驗(yàn)中，將獲自患者的雄激素依賴(lài)性LAPC-9AD腫瘤細(xì)胞(2.0×106個(gè)細(xì)胞)注射入雄性SCID小鼠前列腺的背瓣中。使腫瘤生長(zhǎng)約9天，對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。隨機(jī)分入存活組的動(dòng)物包括同種型MAb對(duì)照的11只小鼠和HA1-4.121治療組的12只小鼠。每周2次用1000μgHa1-4.121或1000μg同種型MAb對(duì)照腹膜內(nèi)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，共給藥9次。結(jié)果顯示HA1-4.121顯著(對(duì)數(shù)分級(jí)檢驗(yàn)p＜0.01)延長(zhǎng)了帶有人雄激素依賴(lài)性前列腺腫瘤的SCID小鼠的存活時(shí)間。在最后一次治療后110天，HA1-4.121治療組中的2只小鼠保持無(wú)可觸知的腫瘤的狀態(tài)(圖22)。PSCAMabs與泰索帝的聯(lián)用在小鼠的作用在另一試驗(yàn)中，將LAPC-9AI腫瘤細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物)皮下注射入雄性SCID小鼠。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到65mm3時(shí)，按照指示對(duì)動(dòng)物隨機(jī)編成4個(gè)不同的組(各組中的n＝10)。在第0天時(shí)開(kāi)始每周2次以500μg的劑量給予Ha1-4.121或同種型MAb對(duì)照，總共給藥6次。在第17天時(shí)給予最后一劑。在第0、3和7天時(shí)以5mg/kg的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)給予泰索帝。每3-4天用測(cè)徑儀檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究的結(jié)果顯示與單用對(duì)照抗體治療第28天相比，Ha1-4.121作為單用的藥劑對(duì)SCID小鼠中非雄激素依賴(lài)性前列腺癌異種移植物的生長(zhǎng)抑制達(dá)45％(ANOVA/Tukey檢驗(yàn)p＜0.05)。與單獨(dú)給予對(duì)照抗體治療相比，給予同種型MAb對(duì)照加上泰索帝對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制達(dá)28％，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。與單獨(dú)的對(duì)照抗體相比，聯(lián)合給予HA1-4.121和泰索帝具有增強(qiáng)的效果并使得腫瘤生長(zhǎng)的抑制達(dá)到69％(ANOVA/Tukey檢驗(yàn)p＜0.01)。當(dāng)將HA1-4.121與泰索帝的聯(lián)合組與HA1-4.121或同種型MAb對(duì)照加上泰索帝組相比時(shí)，均顯示出了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(ANOVA/Tukey檢驗(yàn)p＜0.05)(圖23)。人PSCAMAb在小鼠中對(duì)人胰腺癌生長(zhǎng)的影響在另一試驗(yàn)中，將人HPAC胰腺癌細(xì)胞(2×106個(gè)/小鼠)皮下注射入免疫缺陷型ICRSCID小鼠(TaconicFarm，Germantown，NY)。將小鼠隨機(jī)分組(n＝10只動(dòng)物/組)，于同一天用指定的人PSCA單克隆抗體開(kāi)始治療。每周2次經(jīng)腹膜內(nèi)遞送抗體(500mg/小鼠)，總共給藥8次。結(jié)果顯示人抗PSCA單克隆抗體Ha1-4.121、Ha1-4.117和Ha1-1.16顯著抑制了SCID小鼠中皮下移植人胰腺癌異種移植物的生長(zhǎng)。使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(雙尾，α＝0.05)(圖24)。在另一試驗(yàn)中，將HPAC細(xì)胞(3.0×106個(gè)細(xì)胞)常位移植入SCID小鼠的胰腺中。按照指示將小鼠隨機(jī)分配為3組(每組的n＝9)。在移植當(dāng)天用HA1-4.121(250μg或1000μg)或同種型MAb對(duì)照(1000μg)開(kāi)始治療。每周2次腹膜內(nèi)給予抗體，總共給藥10次。最后一劑13天后，處死動(dòng)物，取出原發(fā)腫瘤并稱(chēng)重。本研究的結(jié)果顯示所測(cè)試的兩種劑量水平的HA1-4.121均顯著抑制了SCID小鼠中人胰腺癌異種移植物的常位生長(zhǎng)。250μg和1000μgAGS-PSCA分別抑制了腫瘤生長(zhǎng)達(dá)66％和70％(Kruskal-Wallis/Tukey檢驗(yàn)分別為p＜0.01和p＜0.01)(圖25)。在尸體解剖中，在對(duì)照抗體治療組中觀察到可見(jiàn)的向淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移灶。在兩個(gè)HA1-4.121治療組中均未觀察到可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移灶。從所有動(dòng)物中取出淋巴結(jié)、肺和肝，組織學(xué)檢測(cè)移行性腫瘤的存在。用人細(xì)胞角蛋白對(duì)取自各動(dòng)物肺和淋巴結(jié)的切片進(jìn)行染色，顯微鏡下確定轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。組織學(xué)分析結(jié)果顯示用HA1-4.121治療的動(dòng)物中的淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移灶顯著減少(p＝0.0152，由Fishers精確性檢驗(yàn)測(cè)得)。轉(zhuǎn)移和侵入的發(fā)生率在用兩種濃度HA1-4.121治療的動(dòng)物中也顯著降低(p＝0.0152，由Fishers精確性檢驗(yàn)測(cè)得)。僅用1.0mg劑量的HA1-4.121治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著降低(p＝0.0498，由Fishers精確性檢驗(yàn)測(cè)得)(圖26)。人PSCAMAb在小鼠中對(duì)膀胱癌生長(zhǎng)的影響在另一試驗(yàn)中，將人SW780膀胱癌細(xì)胞(2×106個(gè)/小鼠)皮下注射入免疫缺陷型ICRSCID小鼠(TaconicFarm，Germantown，NY)。將小鼠隨機(jī)分組(n＝10只動(dòng)物/組)，在同一天用所示的人PSCAMAb開(kāi)始治療。每周2次腹膜內(nèi)遞送抗體(250mg/小鼠)，總共給藥7次。結(jié)果顯示HA1-4.117(p＝0.014)、HA1-4.37(p＝0.0056)、HA1-1.78(p＝0.001)、Ha1-5.99(p＝0.0002)和HA1-4.5(p＝0.0008)顯著抑制了SCID小鼠中皮下植入SW780膀胱腫瘤的生長(zhǎng)。用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(雙尾，α＝0.05)(圖27)。這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示PSCAMab可用于對(duì)表I中所列癌癥進(jìn)行治療和控制的治療和診斷目的。實(shí)施例27采用抗PSCA抗體對(duì)人類(lèi)進(jìn)行治療和診斷抗PSCA單克隆抗體可安全和有效地用于對(duì)人類(lèi)的診斷、預(yù)防、預(yù)測(cè)和/或治療目的。用抗PSCAMab通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化分析癌組織和腫瘤異種移植物顯示在癌中具有強(qiáng)的廣泛染色，而在正常組織中則具有顯著降低的水平或不可檢測(cè)的水平。對(duì)癌中和轉(zhuǎn)移性疾病中PSCA的檢測(cè)表明了該Mab作為診斷和/或預(yù)后指示劑的用途。因此，抗PSCA抗體可用于診斷用途，例如對(duì)腎臟的活檢樣品進(jìn)行免疫組化分析以從疑似患者中檢測(cè)癌癥。經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗PSCAMab與癌細(xì)胞特異性結(jié)合。因此，抗PSCA抗體可用于全身成像診斷用途中，例如放免閃爍掃描術(shù)和放射免疫療法(參見(jiàn)例如，PotamianosS.等，AnticancerRes20(2A)925-948(2000))，以檢測(cè)表達(dá)PSCA的局部性和轉(zhuǎn)移性癌癥。脫落或釋放到胞外環(huán)境中的PSCA胞外區(qū)，例如堿性磷酸二酯B10(Meerson，N。R.，Hepatology27563-568(1998))使得采用獲自疑似患者血清中和/或尿樣中的抗PSCA抗體進(jìn)行PSCA的診斷檢測(cè)成為可能。特異性結(jié)合PSCA的抗PSCA抗體可用于治療表達(dá)PSCA的癌癥。以非結(jié)合分子形式和結(jié)合形式使用該抗PSCA抗體，在所述結(jié)合形式中所述抗體與本領(lǐng)域中熟知的多種治療或成像分子(例如前藥、酶或放射性同位素)結(jié)合。在臨床前研究中，測(cè)試了非結(jié)合和結(jié)合的抗PSCA抗體對(duì)SCID小鼠癌癥異種移植模型(例如腎臟癌癥模型AGS-K3和AGS-K6)中腫瘤預(yù)防和生長(zhǎng)抑制的效果(參見(jiàn)例如，標(biāo)題為“PSCA單克隆抗體介導(dǎo)的體內(nèi)腫瘤抑制”的實(shí)施例)。結(jié)合的和非結(jié)合的抗PSCA抗體均可用作人臨床試驗(yàn)中的治療模式，不論是單獨(dú)或是如以下實(shí)施例中所述與其它療法結(jié)合。實(shí)施例28體內(nèi)使用人源抗PSCA抗體治療和診斷人類(lèi)腫瘤的人體臨床研究本發(fā)明的抗體可識(shí)別PSCA上的表位，用于治療某些腫瘤，如表I中所列的那些腫瘤?？紤]到多種因素，其中包括PSCA的表達(dá)水平，腫瘤如表I中所列的那些腫瘤是目前優(yōu)選的適應(yīng)證。與這些適應(yīng)證相聯(lián)系，我們成功地實(shí)施了以下三種臨床方案。I.)輔助治療作為輔助治療措施，抗PSCA抗體聯(lián)合化療藥物或抗腫瘤藥物和/或放射治療來(lái)治療患者。原發(fā)腫瘤靶位，如表I所列的那些腫瘤，用標(biāo)準(zhǔn)的治療措施進(jìn)行處理，在標(biāo)準(zhǔn)的一線和二線治療措施以外再用抗PSCA抗體處理。治療方案中設(shè)定的有效性是根據(jù)腫瘤塊的縮小以及減少標(biāo)準(zhǔn)化療藥物使用劑量的能力來(lái)判斷的。標(biāo)準(zhǔn)化療藥物使用劑量的減少使化療藥物的與劑量相關(guān)的毒性也下降，因此使我們能夠采用其他的治療措施和/或延長(zhǎng)治療周期?？筆SCA抗體可用于幾個(gè)輔助臨床研究中，與化療藥物或抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，如阿霉素(晚期前列腺癌)、順鉑(晚期頭頸癌和肺癌)、紫杉醇(乳腺癌)和多柔比星(臨床前研究)。II.)單一治療單獨(dú)使用抗PSCA抗體治療腫瘤是指只給患者使用抗體而不用化療藥或抗腫瘤藥。在一個(gè)實(shí)施方式中，單一治療措施用于治療患有晚期腫瘤且嚴(yán)重轉(zhuǎn)移的病人?；颊叩牟∏楸憩F(xiàn)出某種程度的穩(wěn)定。試驗(yàn)證明抗體對(duì)頑固的腫瘤患者也有一定療效。III.)造影劑通過(guò)將放射性核素(如碘或釔(I131，Y90)連接到抗PSCA抗體上制備放射性標(biāo)記的抗體，這種抗體可用作診斷試劑和/或造影劑。用于此目的時(shí)，標(biāo)記的抗體定位到固體腫瘤和表達(dá)PSCA的轉(zhuǎn)移灶內(nèi)。當(dāng)抗PSCA抗體用作造影劑時(shí)，抗體可以作為固體腫瘤手術(shù)治療的附加劑，用于術(shù)前掃描以及術(shù)后掃描以確定腫瘤是否被清除干凈和/或復(fù)發(fā)。在一個(gè)實(shí)施例中，(111In)-PSCA抗體作為造影劑用于I期人體臨床試驗(yàn)，篩選患有表達(dá)PSCA的腫瘤的患者(類(lèi)似的例子見(jiàn)Divgi等J.Natl.CancerInst.8397-104(1991))?；颊唠S后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的前位和后位γ射線造影。從造影結(jié)果中可以鑒定出原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移灶的部位。給藥劑量和給藥途徑如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可通過(guò)與臨床中所用的其他類(lèi)似藥物相比較確定給藥劑量。因此，抗PSCA抗體的給藥劑量范圍為5到400mg/m2，根據(jù)安全性研究的結(jié)果，可以考慮更低的劑量。與已知抗體對(duì)其靶位的親和性相比，抗PSCA的相對(duì)親和性是本領(lǐng)域技術(shù)人員確定類(lèi)似給藥方案時(shí)所用的一個(gè)參數(shù)。另外，抗PSCA抗體是完全的人源抗體，與嵌合抗體相比，其清除率相對(duì)較低；因此患者使用這種抗體時(shí)所需的劑量也要相應(yīng)減少，可能在50到300mg/m2之間依然有效。劑量單位用mg/m2，而不是常規(guī)的劑量單位mg/kg，是根據(jù)表面積來(lái)給藥的，這樣便于確定從嬰幼兒到成年人各種體形的人所需的給藥劑量。有三種不同的給藥方法可用于抗PSCA抗體的給藥。常規(guī)的靜脈給藥是大多數(shù)腫瘤所用的標(biāo)準(zhǔn)給藥方法。但是，如果腫瘤位于腹膜腔內(nèi)，如卵巢內(nèi)的腫瘤、膽管內(nèi)的腫瘤以及其他腔隙內(nèi)的腫瘤，腹膜內(nèi)注射被認(rèn)為是較好的，這樣可在腫瘤部位達(dá)到較高的抗體劑量，同時(shí)也可使抗體的清除率降到最低。某些固體腫瘤含有血管，這樣通過(guò)局部灌注給藥就比較合適。局部灌注使高劑量的抗體集中到腫瘤部位，同時(shí)使抗體的短期清除率降到最低。臨床開(kāi)發(fā)計(jì)劃(CDP)概述CDP利用和開(kāi)發(fā)抗PSCA抗體與輔助治療、單一治療和作為造影劑有關(guān)的臨床應(yīng)用潛能。先通過(guò)臨床研究證明其安全性，然后再證明其重復(fù)給藥的有效性。臨床試驗(yàn)是開(kāi)放標(biāo)簽的，標(biāo)準(zhǔn)化療與標(biāo)準(zhǔn)治療加抗PSCA抗體作比較。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，與篩選受試者有關(guān)的一個(gè)入選標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)活檢得到的其腫瘤表達(dá)PSCA的水平。與任何蛋白或抗體輸注治療措施一樣，對(duì)安全性的考慮主要與下列因素有關(guān)(i)細(xì)胞因子釋放綜合征，如低血壓、發(fā)熱、顫抖、寒戰(zhàn)；(ii)針對(duì)藥物的免疫原性反應(yīng)的發(fā)生(如患者產(chǎn)生的針對(duì)治療性抗體的抗體，或HAHA反應(yīng))；以及(iii)對(duì)表達(dá)PSCA的正常細(xì)胞的毒性。要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)并進(jìn)行隨訪以監(jiān)測(cè)這些安全性指標(biāo)。試驗(yàn)表明抗PSCA抗體用于人體時(shí)是安全的。實(shí)施例29人體臨床試驗(yàn)采用人抗PSCA抗體的單一療法抗PSCA抗體在上述輔助治療臨床試驗(yàn)中是安全的，II期人體臨床試驗(yàn)也確證了有效性并且為單一治療確定了最佳給藥劑量。經(jīng)過(guò)這個(gè)臨床試驗(yàn)以后發(fā)現(xiàn)，其安全性和臨床療效與上述輔助治療臨床試驗(yàn)的結(jié)果一樣，只是患者在接受抗PSCA抗體的同時(shí)不使用化療藥物。實(shí)施例30人體臨床試驗(yàn)采用人抗PSCA抗體的診斷成像如上所述，按照上述安全性標(biāo)準(zhǔn)用抗體進(jìn)行輔助治療是安全的，因此我們利用抗PSCA抗體作為診斷造影劑再次進(jìn)行臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)方案與本領(lǐng)域描述的那些方案基本相似，如Divgi等，J.Natl.CancerInst.8397-104(1991)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體作為診斷試劑是安全有效的。實(shí)施例31以人抗PSCA抗體和化療、放療和/或激素去除療法為輔助治療措施的人體臨床試驗(yàn)首先進(jìn)行6個(gè)靜脈注射劑量的人源抗PSCA抗體的I期臨床試驗(yàn)以評(píng)價(jià)其和固體腫瘤治療有關(guān)的安全性，這些固體腫瘤是指表I所列的腫瘤。在本研究中，以單次劑量的抗PSCA抗體作為抗腫瘤藥物或化療藥物或激素去除的輔助治療措施進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)其安全性，如本文所描述但不僅僅限于順鉑、多柔比星、阿霉素、紫杉醇、亮丙瑞林、諾雷德、氟他胺、卡索地司、尼魯米特等。試驗(yàn)方案包括約6個(gè)單次劑量的抗PSCA抗體，6個(gè)劑量逐漸升高，從約25mg/m2到約275mg/m2，試驗(yàn)過(guò)程的安排如下或可類(lèi)似如下安排在每次進(jìn)行抗體治療和化療后1周內(nèi)密切監(jiān)測(cè)患者。特別要注意評(píng)價(jià)上述的安全性指標(biāo)(i)細(xì)胞因子釋放綜合征，如低血壓、發(fā)熱、顫抖、寒戰(zhàn)；(ii)針對(duì)藥物的免疫原性反應(yīng)的發(fā)生(如患者產(chǎn)生的針對(duì)治療性抗體的抗體，或HAHA反應(yīng))；以及(iii)對(duì)表達(dá)PSCA的正常細(xì)胞的毒性。要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)并進(jìn)行隨訪以監(jiān)測(cè)這些安全性指標(biāo)。還要評(píng)價(jià)患者的臨床表現(xiàn)，特別是通過(guò)MRI或其他造影技術(shù)觀察到的瘤塊的縮小情況。試驗(yàn)證明抗PSCA抗體是安全有效的，II期臨床試驗(yàn)的目的在于進(jìn)一步確證其有效性并確定最佳治療劑量。實(shí)施例32RNA干擾(RNAi)RNA干擾(RNAi)技術(shù)應(yīng)用于與腫瘤相關(guān)的各種細(xì)胞分析中。RNAi是一種由雙鏈RNA(dsRNA)激發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。RNAi誘導(dǎo)的特異性mRNA降解使得蛋白質(zhì)表達(dá)及其后繼的基因功能發(fā)生變化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，被稱(chēng)為短干擾RNA(siRNA)的這些dsRNA具有活化靶向于降解(尤其是某些mRNA)的RNAi途徑的正確結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)ElbashirS.M.等的“Duplexesof21-nucleotideRNAsMediateRNAinterferenceinCulturedMammalianCells”，Nature411(6836)494-8(2001)。因此，RNAi技術(shù)可成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞以沉默靶基因。細(xì)胞增殖失控是癌變細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志；因此，對(duì)PSCA在細(xì)胞存活/增殖測(cè)定中的評(píng)估是相關(guān)的。因此，將RNAi用于PSCA抗原的功能。為了產(chǎn)生針對(duì)PSCA的siRNA，采用了預(yù)測(cè)具有關(guān)鍵分子參數(shù)(G∶C含量、熔點(diǎn)穩(wěn)定等)且導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)能夠顯著降低PSCA蛋白表達(dá)水平的寡核苷酸的算法。根據(jù)該實(shí)施例，使用了包含對(duì)應(yīng)于PSCA蛋白核酸ORF序列或其子序列的siRNA(雙鏈短干擾RNA)的PSCAsiRNA組合物。因此，以該方式使用的siRNA子序列的長(zhǎng)度通常為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，31、32、33、34、35或更多個(gè)連續(xù)RNA核苷酸。這些siRNA序列與mRNA編碼序列的至少部分互補(bǔ)和非互補(bǔ)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該子序列的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸，最優(yōu)選長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些siRNA在表達(dá)PSCA蛋白的細(xì)胞中獲得了PSCA抗原敲除的效果，并具有如下所述的功效。在多種細(xì)胞系中以存活/增殖MTS測(cè)試法(測(cè)定細(xì)胞代謝活性)測(cè)試所選siRNA(PSCA.b寡聚物)。基于四氮鹽的比色分析法(即，MTS)能排他地檢測(cè)出存活細(xì)胞，這是因?yàn)榛罴?xì)胞具有代謝活性并由此能將四氮鹽還原為具有顏色的甲膜化合物；而死細(xì)胞則不能。此外，按照如下的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該P(yáng)SCA.b寡聚物在表達(dá)PSCA蛋白的細(xì)胞中獲得了PSCA抗原敲除的效果并具有如下所述的功效。哺乳動(dòng)物siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染的前一天，將2×103個(gè)細(xì)胞/孔的不同細(xì)胞系以80μl(96孔板形式)種入培養(yǎng)基中(含有10％FBSw/o抗生素的RPMI1640)，用于存活/MTS測(cè)試。與PSCA特異性siRNA寡聚物平行，在每一試驗(yàn)中包括了作為對(duì)照的以下序列a)用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)和退火緩沖液(不含siRNA)模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；b)熒光素酶-4特異性siRNA(靶向的序列為5’-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3’)(SEQIDNO77)；和c)Eg5特異性siRNA(靶向的序列為5’-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3’)(SEQIDNO78)。SiRNA的使用終濃度為10nM和1μg/mlLipofectamine2000。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下首先在OPTIMEM(無(wú)血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，Invitrogen)中將siRNAs稀釋到0.1uMμM(10倍濃縮)，在室溫下孵育5-10分鐘。將Lipofectamine2000稀釋到10μg/ml(10倍濃縮)用于所有的轉(zhuǎn)染，在室溫下(RT)孵育5-10分鐘。將適量的稀釋的10倍濃縮Lipofectamine2000以1∶1的比例與稀釋的10倍濃縮siRNA混合，在室溫下孵育20-30分鐘(5倍濃縮的轉(zhuǎn)染溶液)。將20μl的5倍濃縮轉(zhuǎn)染溶液加入各樣品中，在37℃下孵育96小時(shí)后進(jìn)行測(cè)定。MTS測(cè)試MTS測(cè)試是一種確定增殖、細(xì)胞毒作用或化學(xué)敏感性測(cè)試中的存活細(xì)胞數(shù)目的比色方法，該測(cè)試是以四氮鹽化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮鎓，內(nèi)鹽；MTS(b)]和電子偶合劑(磺乙基(ethosulfate)吩嗪；PES)。如下進(jìn)行測(cè)試將少量溶液試劑直接加入培養(yǎng)孔中，孵育1-4小時(shí)，然后以96孔讀板儀記錄490nm處的吸光值。490nm處吸光值的量測(cè)定的有色甲臢產(chǎn)物量與線粒體活性和/或培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量成正比。為了揭示PSCA在細(xì)胞中的功能，通過(guò)轉(zhuǎn)染內(nèi)源性表達(dá)PSCA的細(xì)胞系來(lái)使得PSCA沉默。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種通過(guò)測(cè)定作為增殖標(biāo)記的DNA合成來(lái)分析與PSCA相關(guān)的細(xì)胞增殖的方法。使用了標(biāo)記的DNA前體(即3H-胸苷)，對(duì)其摻入DNA進(jìn)行定量。摻入DNA的標(biāo)記前體與細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞分裂量成正比。測(cè)定細(xì)胞增殖的另一種方法是進(jìn)行克隆原測(cè)試。在這些測(cè)試中，將確定數(shù)量的細(xì)胞接種于適宜的基質(zhì)上，對(duì)siRNA治療后一段生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)所形成的克隆數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。在PSCA癌癥靶標(biāo)確認(rèn)中，考慮到用細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布研究對(duì)細(xì)胞存活/增殖測(cè)試進(jìn)行補(bǔ)充。凋亡過(guò)程的生化標(biāo)記是基因組DNA片段化，這是一種會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的不可逆事件。觀察細(xì)胞中片段化DNA的一種方法是采用免疫分析法對(duì)組蛋白復(fù)合的DNA片段進(jìn)行免疫檢測(cè)(即細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISA)，該方法測(cè)定凋亡細(xì)胞胞質(zhì)中組蛋白復(fù)合的DNA片段的濃度(單核和寡核小體)。該測(cè)定無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)標(biāo)記，并能檢測(cè)在體外不增殖的細(xì)胞中的DNA降解(即新鮮分離的腫瘤細(xì)胞)。引發(fā)凋亡性細(xì)胞死亡最重要的效應(yīng)分子是胱門(mén)蛋白酶(caspase)。胱門(mén)蛋白酶是一旦活化后能在一天冬氨酸殘基的羧基位點(diǎn)進(jìn)行切割的蛋白酶，該天冬氨酸一旦活化，介導(dǎo)凋亡的極早期階段。所有的胱門(mén)蛋白酶都是作為前體酶合成的，其活化涉及天冬氨酸殘基的切割。具體而言，胱門(mén)蛋白酶3在凋亡細(xì)胞事件引發(fā)中似乎起著重要的作用。通過(guò)測(cè)定胱門(mén)蛋白酶3活性可檢測(cè)凋亡的早期事件。RNAi處理后，用蛋白質(zhì)斑跡法檢測(cè)活性胱門(mén)蛋白酶3的存在或凋亡細(xì)胞中的蛋白水解切割產(chǎn)物(即PARP)進(jìn)一步支持了對(duì)凋亡的活性誘導(dǎo)作用。由于導(dǎo)致凋亡的細(xì)胞機(jī)制是很復(fù)雜的，每種方法均具有其優(yōu)點(diǎn)和限制?？疾炱渌鼧?biāo)準(zhǔn)/終末點(diǎn)，例如細(xì)胞形態(tài)學(xué)，染色質(zhì)固縮、細(xì)胞膜起泡、凋亡小體有助于進(jìn)一步支持細(xì)胞死亡是凋亡性的。由于不是所有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的基因靶標(biāo)都是抗凋亡的，對(duì)透化細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行了測(cè)定以獲得DNA含量分布或細(xì)胞周期分布。由于漏出到細(xì)胞質(zhì)，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核含有較少的DNA(亞G1群)。此外，由于G0/G1、S和G2/M中所存在的DNA量不同，也可采用DNA染色(即碘化丙錠)區(qū)分細(xì)胞群中的不同細(xì)胞周期時(shí)期。在這些研究中，可對(duì)亞群進(jìn)行定量。對(duì)于PSCA基因，RNAi研究促進(jìn)了對(duì)該基因產(chǎn)物在癌癥途徑中的作用的理解?？蓪⑦@些活性RNAi分子用于鑒別測(cè)試中以篩選具有抗腫瘤治療活性的MAb。此外，可將siRNA作為治療劑給予癌癥患者以減輕多種癌癥類(lèi)型(包括表I中所列的那些)的惡性生長(zhǎng)。當(dāng)PSCA在細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生或凋亡中起作用時(shí)，可將其用作診斷、預(yù)測(cè)、預(yù)防和/或治療目的的靶標(biāo)。實(shí)施例33采用IHC在癌癥患者樣品中檢測(cè)PSCA蛋白利用抗體HA1-4.117檢測(cè)獲自癌癥患者的腫瘤樣品中PSCA蛋白的表達(dá)。將經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋的組織切成4微米厚的切片，置于玻璃載玻片上。對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、脫水，用抗原回收溶液(AntigenRetrievalCitraSolution；BioGenex，4600NorrisCanyonRoad，SanRamon，CA，94583)在高溫下進(jìn)行處理。然后在4℃下，將切片孵育在熒光素偶聯(lián)的人單克隆抗PSCA抗體Ha1-4.117中16小時(shí)。在緩沖液中洗滌該載玻片3次，再與兔抗熒光素一起孵育1小時(shí)，在緩沖液中洗滌后，浸入DAKOEnVision+TM過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔免疫球蛋白二抗(DAKOCorporation，Carpenteria，CA)中30分鐘。然后在緩沖液中洗滌切片，用DAB試劑盒(SIGMAChemicals)顯影，用蘇木精進(jìn)行復(fù)染色，用亮視野顯微鏡進(jìn)行分析。結(jié)果顯示前列腺癌腫瘤細(xì)胞(A，B)、膀胱轉(zhuǎn)移癌腫瘤細(xì)胞(C)和胰導(dǎo)管癌腫瘤細(xì)胞(D)中表達(dá)PSCA。這些結(jié)果表明PSCA在人癌癥中表達(dá)，抗該抗原的抗體可用作診斷試劑(圖17)。這些結(jié)果表明PSCA是癌癥中診斷、預(yù)測(cè)和治療用途中的一種靶標(biāo)。在本申請(qǐng)通篇中引用了各種網(wǎng)站資料、出版文獻(xiàn)、專(zhuān)利申請(qǐng)和專(zhuān)利(引用的站點(diǎn)用其資源統(tǒng)一定位符或URL表示，地址在萬(wàn)維網(wǎng)上)。這些參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都被完整納入到本文中作為參考。本發(fā)明并不局限于本文所描述的實(shí)施方式所規(guī)定的范圍內(nèi)，這些實(shí)施方式只是為了說(shuō)明本發(fā)明的各個(gè)方面，與其功能等價(jià)的任何修改版本都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。除了本文所描述的以外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上面的描述和說(shuō)明，應(yīng)該可以了解對(duì)本發(fā)明的模型和方法所作出的各種修改，這些修改同樣也落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。只要不偏離本發(fā)明的真正范圍和精神就可以實(shí)施這種修改或其他實(shí)施方式。表格表I呈惡性時(shí)表達(dá)PSCA的器官前列腺胰膀胱腎結(jié)腸肺卵巢乳腺表II氨基酸縮寫(xiě)表III氨基酸取代矩陣采納自GCG軟件9.0BLOSUM62氨基酸取代矩陣(封閉取代矩陣)。數(shù)值越大在相關(guān)天然蛋白質(zhì)中越可能被取代。(見(jiàn)萬(wàn)維網(wǎng)URLikp.unibe.ch/manual/blosum62.html)ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY.40-2-1-20-2-1-1-1-1-2-1-1-1100-3-2A9-3-4-2-3-3-1-3-1-1-3-3-3-3-1-1-1-2-2C62-3-1-1-3-1-4-31-10-20-1-3-4-3D5-3-20-31-3-20-1200-1-2-3-2E6-3-10-300-3-4-3-3-2-2-113F6-2-4-2-4-30-2-2-20-2-3-2-3G8-3-1-3-21-200-1-2-3-22H4-321-3-3-3-3-2-13-3-1I5-2-10-1120-1-2-3-2K42-3-3-2-2-2-11-2-1L5-2-20-1-1-11-1-1M6-20010-3-4-2N7-1-2-1-1-2-4-3P510-1-2-2-1Q5-1-1-3-3-2R41-2-3-2S50-2-2T4-3-1V112W7Y表IVHLAI類(lèi)/II基序/超基序表IV(A)HLAI類(lèi)超基序/基序黑體表示的殘基是優(yōu)選的，斜體表示的殘基不十分優(yōu)選如果某肽在上表所示基序或超基序的每個(gè)主要錨定位置具有主要錨著點(diǎn)認(rèn)為其帶有基序。表IV(B)HLAII類(lèi)超基序表IV(C)HLAII類(lèi)基序斜體表示的殘基是不十分優(yōu)選或“勉強(qiáng)可用的”殘基表IV(D)HLAI類(lèi)超基序斜體表示的殘基是不十分優(yōu)選或“勉強(qiáng)可用的”殘基表IV(E)HLAI類(lèi)基序表IV(F)HLA-超型總結(jié)不同種族人群中HLA-超型的總表型頻率表IV(G)不同HLA-超型組合計(jì)算出的群體覆蓋率各基序表示確定超型特異性的殘基。各基序加入了根據(jù)發(fā)表的數(shù)據(jù)確定的為超型內(nèi)多個(gè)等位基因所識(shí)別的殘基。括號(hào)內(nèi)的殘基也是預(yù)計(jì)為超型內(nèi)多個(gè)等位基因所耐受的額外殘基。表VI轉(zhuǎn)錄物PSCAv.1的外顯子邊界表VII用于親和力計(jì)算的各數(shù)據(jù)點(diǎn)的MFI值MFI值表VIII采用GraphpadPrism軟件計(jì)算的親和力S型劑量-響應(yīng)(可變斜率)公式Kd值表IX全長(zhǎng)人PSCAMab的基于FACS的親和力基于FACS的親和力表X與猴PSCA和/或小鼠PSCA發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體.表XIPSCAFACS分析的表位組圖例序列表<110>艾更斯司股份有限公司(AGENSYS，INC.)J.古達(dá)斯(Gudas，Jean)A.雅各波維茨(Jakobovits，Aya)X.賈(Xiao-Chi，Jia)R.K.莫里森(Morrison，RobertKendall)K.J.M.莫里森(Morrison，KarenJaneMeyrick)H.邵(Shao，Hui)P.M.查利塔-埃德(Challita-Eid，PiaM.)A.B.萊塔諾(Raitano，ArthurB.)<120>結(jié)合于PSCA蛋白的抗體以及相關(guān)分子<130>51158-20088.41<140>未授予<141>在此申請(qǐng)<150>60/616,381<151>2004-10-05<150>60/617,881<151>2004-10-12<150>60/621,310<151>2004-10-21<150>60/633,077<151>2004-12-02<150>10/857,484<151>2004-05-28<150>60/475,064<151>2003-05-30<160>78<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>990<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(18)...(389)<221>misc_feature<222>543<223>n＝a、t、c或g<400>1agggagaggcagtgaccatgaaggctgtgctgcttgccctgttgatggca50MetLysAlaValLeuLeuAlaLeuLeuMetAla1510ggcttggccctgcagccaggcactgccctgctgtgctactcctgcaaa98GlyLeuAlaLeuGlnProGlyThrAlaLeuLeuCysTyrSerCysLys152025gcccaggtgagcaacgaggactgcctgcaggtggagaactgcacccag146AlaGlnValSerAsnGluAspCysLeuGlnValGluAsnCysThrGln303540ctgggggagcagtgctggaccgcgcgcatccgcgcagttggcctcctg194LeuGlyGluGlnCysTrpThrAlaArgIleArgAlaValGlyLeuLeu455055accgtcatcagcaaaggctgcagcttgaactgcgtggatgactcacag242ThrValIleSerLysGlyCysSerLeuAsnCysValAspAspSerGln60657075gactactacgtgggcaagaagaacatcacgtgctgtgacaccgacttg290AspTyrTyrValGlyLysLysAsnIleThrCysCysAspThrAspLeu808590tgcaacgccagcggggcccatgccctgcagccggctgccgccatcctt338CysAsnAlaSerGlyAlaHisAlaLeuGlnProAlaAlaAlaIleLeu95100105gcgctgctccctgcactcggcctgctgctctggggacccggccagcta386AlaLeuLeuProAlaLeuGlyLeuLeuLeuTrpGlyProGlyGlnLeu110115120taggctctggggggccccgctgcagcccacactgggtgtggtgccccaggcct439*ttgtgccactcctcacagaacctggcccagtgggagcctgtcctggttcctgaggcacat499cctaacgcaagtttgaccatgtatgtttgcaccccttttccccnaaccctgaccttccca559tgggccttttccaggattcccacccggcagatcagttttagtgacacagatccgcctgca619gatggcccctccaaccctttctgttgctgtttccatggcccagcattttccacccttaac679cctgtgttcaggcacttcttcccccaggaagccttccctgcccaccccatttatgaattg739agccaggtttggtccgtggtgtcccccgcacccagcaggggacaggcaatcaggagggcc799cagtaaaggctgagatgaagtggactgagtagaactggaggacaagagttgacgtgagtt859cctgggagtttccagagatggggcctggaggcctggaggaaggggccaggcctcacattt919gtggggctcccgaatggcagcctgagcacagcgtaggcccttaataaacacctgttggat979aagccaaaaaa990<210>2<211>123<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>2MetLysAlaValLeuLeuAlaLeuLeuMetAlaGlyLeuAlaLeuGln151015ProGlyThrAlaLeuLeuCysTyrSerCysLysAlaGlnValSerAsn202530GluAspCysLeuGlnValGluAsnCysThrGlnLeuGlyGluGlnCys354045TrpThrAlaArgIleArgAlaValGlyLeuLeuThrVallleSerLys505560GlyCysSerLeuAsnCysValAspAspSerGlnAspTyrTyrValGly65707580LysLysAsnIleThrCysCysAspThrAspLeuCysAsnAlaSerGly859095AlaHisAlaLeuGlnProAlaAlaAlaIleLeuAlaLeuLeuProAla100105110LeuGlyLeuLeuLeuTrpGlyProGlyGlnLeu115120<210>3<211>1020<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(56)...(427)<400>3tttgaggccatataaagtcacctgaggccctctccaccacagcccaccagtgaccatg58Met1aaggctgtgctgcttgccctgttgatggcaggcttggccctgcagcca106LysAlaValLeuLeuAlaLeuLeuMetAlaGlyLeuAlaLeuGlnPro51015ggcactgccctgctgtgctactcctgcaaagcccaggtgagcaacgag154GlyThrAlaLeuLeuCysTyrSerCysLysAlaGlnValSerAsnGlu202530gactgcctgcaggtggagaactgcacccagctgggggagcagtgctgg202AspCysLeuGlnValGluAsnCysThrGlnLeuGlyGluGlnCysTrp354045accgcgcgcatccgcgcagttggcctcctgaccgtcatcagcaaaggc250ThrAlaArgIleArgAlaValGlyLeuLeuThrValIleSerLysGly50556065tgcagcttgaactgcgtggatgactcacaggactactacgtgggcaag298CysSerLeuAsnCysValAspAspSerGlnAspTyrTyrValGlyLys707580aagaacatcacgtgctgtgacaccgacttgtgcaacgccagcggggcc346LysAsnIleThrCysCysAspThrAspLeuCysAsnAlaSerGlyAla859095catgccctgcagccggctgccgccatccttgcgctgctccctgcactc394HisAlaLeuGlnProAlaAlaAlaIleLeuAlaLeuLeuProAlaLeu100105110ggcctgctgctctggggacccggccagctataggctctggggggccccgctgc447GlyLeuLeuLeuTrpGlyProGlyGlnLeu*115120agcccacactgggtgtggtgccccaggcctctgtgccactcctcacacacccggcccagt507gggagcctgtcctggttcctgaggcacatcctaacgcaagtctgaccatgtatgtctgcg567cccctgtcccccaccctgaccctcccatggccctctccaggactcccacccggcagatcg627gctctattgacacagatccgcctgcagatggcccctccaaccctctctgctgctgtttcc687atggcccagcattctccacccttaaccctgtgctcaggcacctcttcccccaggaagcct747tccctgcccaccccatctatgacttgagccaggtctggtccgtggtgtcccccgcaccca807gcaggggacaggcactcaggagggcccggtaaaggctgagatgaagtggactgagtagaa867ctggaggacaggagtcgacgtgagttcctgggagtctccagagatggggcctggaggcct927ggaggaaggggccaggcctcacattcgtggggctccctgaatggcagcctcagcacagcg987taggcccttaataaacacctgttggataagcca1020<210>4<211>123<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>4MetLysAlaValLeuLeuAlaLeuLeuMetAlaGlyLeuAlaLeuGln151015ProGlyThrAlaLeuLeuCysTyrSerCysLysAlaGlnValSerAsn202530GluAspCysLeuGlnValGluAsnCysThrGlnLeuGlyGluGlnCys354045TrpThrAla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ccatctgtc360ttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctg420ctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaa480tcgggta487<210>75<211>162<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>75MetGlnLeuThrGlnSerProAspSerLeuAlaValSerLeuGlyGlu151015ArgAlaThrIleAsnCysLysSerSerGlnAsnValLeuTyrArgSer202530AsnLysLysAsnPheLeuValTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnPro354045ProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerIleArgGluSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIle65707580SerSerLeuGlnThrGluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyr859095TyrSerThrProProThrPheGlyGlnGlyThrArgLeuGluIleLys100105110ArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspGlu115120125GlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPhe130135140TyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGln145150155160SerGly<210>76<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>FlagTag<400>76gattacaaggatgacgacgataag24<210>77<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)照序列<400>77aagggacgaagacgaacacuuctt24<210>78<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>對(duì)照序列<400>78aactgaagacctgaagacaataa2權(quán)利要求1.一種抗體或其片段(SEQIDNO)，其包括特異性結(jié)合PSCA蛋白(SEQIDNO)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。2.如權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。3.如權(quán)利要求2所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體的A.T.C.C保藏號(hào)為_(kāi)_____。4.如權(quán)利要求2所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體的A.T.C.C保藏號(hào)為_(kāi)_____。5.如權(quán)利要求2所述的抗體或片段，其特征在于，所述單克隆抗體是人源化抗體。6.如權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其特征在于，所述片段是Fab、F(ab’)2、Fv或Sfv片段。7.如權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體是全長(zhǎng)人抗體。8.如權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)是小鼠的抗原結(jié)合位點(diǎn)。9.如權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體或片段是通過(guò)重組產(chǎn)生的。10.如權(quán)利要求9所述的抗體或片段，其特征在于，所述重組蛋白包含所述抗原結(jié)合區(qū)。11.如權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體是與可檢測(cè)標(biāo)記、毒素、治療劑或化療劑偶聯(lián)的。12.如權(quán)利要求11所述的抗體或片段，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記是放射性同位素、金屬螯合劑、酶、熒光化合物、生物發(fā)光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物。13.如權(quán)利要求12所述的抗體或片段，其特征在于，所述放射性同位素包括212Bi、131I、131In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32p或Lu。14.如權(quán)利要求11所述的抗體或片段，其特征在于，所述毒素包括篦麻毒素、篦麻毒素A-鏈、阿霉素、柔紅霉素、美登醇、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、鬼臼噻吩甙、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、二羥基炭疽菌素二酮、放線菌素、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、白樹(shù)毒素、米托潔林、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素、居里菌素、巴豆毒素、刺孢霉素、Sapaonariaofficinalis抑制劑、糖皮質(zhì)激素、金他汀、金霉素、釔、鉍、康勒他丁、朵卡霉素、多羅他汀、cc1065或順鉑。15.如權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合于圖2中蛋白質(zhì)氨基酸(SEQIDNO)內(nèi)的抗原表位。16.一種產(chǎn)生權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。17.一種產(chǎn)生權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的雜交瘤。18.一種載體，其包含編碼權(quán)利要求2所述抗體的多核苷酸。19.如權(quán)利要求18所述的載體，所述載體是包含重鏈和輕鏈可變區(qū)的單鏈。20.一種藥物組合物，所述組合物包含人單位劑型的權(quán)利要求1所述的抗體或片段。21.一種用于檢測(cè)生物樣品中PSCA蛋白的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與權(quán)利要求1所述的抗體接觸，以及檢測(cè)樣品中PSCA蛋白(SEQIDNO)的結(jié)合。22.一種抑制對(duì)象中細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象編碼單鏈單克隆抗體的載體，其中該單鏈單克隆抗體包含特異性結(jié)合于PSCA蛋白(SEQIDNO)的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，從而使得所述載體將所述單鏈單克隆抗體編碼序列遞送到所述癌細(xì)胞，并使得編碼的單鏈抗體在胞內(nèi)表達(dá)。23.一種將細(xì)胞毒劑或診斷試劑遞送到表達(dá)PSCA蛋白(SEQIDNO)的細(xì)胞的方法，所述方法包括提供與權(quán)利要求1所述抗體或片段偶聯(lián)的細(xì)胞毒劑或診斷試劑，以形成抗體試劑偶聯(lián)物或片段試劑偶聯(lián)物；和將所述細(xì)胞暴露于所述抗體試劑偶聯(lián)物或片段試劑偶聯(lián)物。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞毒劑或診斷試劑選自可檢測(cè)標(biāo)記、毒素或治療劑。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記是放射性同位素、金屬螯合劑、酶、熒光化合物、生物發(fā)光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述放射性同位素包括212Bi、131I、131In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P或Lu。27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述毒素包括篦麻毒素、篦麻毒素A-鏈、阿霉素、柔紅霉素、美登醇、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、鬼臼噻吩甙、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、二羥基炭疽菌素二酮、放線菌素、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、白樹(shù)毒素、米托潔林、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素、居里菌素、巴豆毒素、刺孢霉素、Sapaonariaofficinalis抑制劑、糖皮質(zhì)激素、金他汀、金霉素、釔、鉍、康勒他丁、朵卡霉素、多羅他汀、cc1065或順鉑。28.一種用于檢測(cè)生物樣品中PSCA蛋白(SEQIDNO)的方法，所述方法包括以下步驟提供所述生物樣品和對(duì)照樣品；使所述生物樣品和所述對(duì)照樣品與特異性結(jié)合于PSCA蛋白的權(quán)利要求1所述的抗體接觸；和測(cè)定所述生物樣品和所述對(duì)照樣品中存在的物質(zhì)與PSCA蛋白和所述抗體的復(fù)合物的量。29.如權(quán)利要求28所述的方法，所述方法還包括從患有或懷疑患有表I中所列癌癥的患者中獲取所述生物樣品和所述對(duì)照樣品。30.一種組合物，所述組合物包含對(duì)應(yīng)于編碼圖2所示蛋白質(zhì)或其子序列的核酸的PSCAsiRNA(雙鏈RNA)，其特征在于，所述子序列是長(zhǎng)度為19、20、21、22、23、24或25個(gè)連續(xù)RNA核苷酸且包含與mRNA編碼序列的至少一部分互補(bǔ)和非互補(bǔ)的序列。31.一種用于鑒別調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的分子的方法，所述方法包括(a)將分子導(dǎo)入包含含有選自以下的核苷酸的核酸的系統(tǒng)(i)SEQIDNO1的核苷酸序列；(ii)編碼由圖3所示氨基酸序列組成的多肽的核苷酸序列；(iii)編碼與圖3所示氨基酸序列具有90％或以上相同性的多肽的核苷酸序列；和(iv)(i)、(ii)或(iii)核苷酸序列的片段；或?qū)y(cè)試分子導(dǎo)入包含由(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)；和(b)測(cè)定所述分子和所述核苷酸序列或蛋白質(zhì)間是否存在相互反應(yīng)，由此，所述分子和所述核苷酸序列或蛋白質(zhì)間存在相互反應(yīng)表明所述分子是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的分子。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述系統(tǒng)是在體內(nèi)的。33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述系統(tǒng)是在體外的。34.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述分子包括特異性結(jié)合于由(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的抗體或抗體片段。35.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述分子包含對(duì)應(yīng)于編碼圖2所示蛋白質(zhì)或其子序列的核酸的PSCA的siRNA(雙鏈RNA)的組合物，所述子序列是長(zhǎng)度為19、20、21、22、23、24或25個(gè)連續(xù)RNA核苷酸且包含與mRNA編碼序列的至少一部分互補(bǔ)和非互補(bǔ)的序列。36.一種治療對(duì)象癌癥的方法，所述方法包括給予診斷患有癌癥的對(duì)象通過(guò)權(quán)利要求31所述方法鑒別的分子，從而使得所述分子抑制或延緩所述對(duì)象的癌癥。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述癌癥是表I中所列的癌癥。38.一種鑒別用于治療表I中所列癌癥的治療的方法，所述方法包括(a)將分子導(dǎo)入包含含有選自以下的核苷酸的核酸的系統(tǒng)(i)SEQIDNO1的核苷酸序列；(ii)編碼由圖3所示氨基酸序列組成的多肽的核苷酸序列；(iii)編碼與圖3所示氨基酸序列具有90％或以上相同性的多肽的核苷酸序列；和(iv)(i)、(ii)或(iii)核苷酸序列的片段；或?qū)y(cè)試分子導(dǎo)入包含由(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)；和(b)測(cè)定所述分子和所述核苷酸序列或蛋白質(zhì)間是否存在相互反應(yīng)，由此，所述分子和所述核苷酸序列或蛋白質(zhì)間存在相互反應(yīng)表明所述分子是用于治療表I中所列癌癥的治療。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述系統(tǒng)是在體外的。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述系統(tǒng)是在體內(nèi)的。41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述分子包括特異性結(jié)合于由(i)、(ii)、(iii)或(iv)的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的抗體或抗體片段。42.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述分子包含對(duì)應(yīng)于編碼圖2所示蛋白質(zhì)或其子序列的核酸的PSCA的siRNA(雙鏈RNA)的組合物，所述子序列是長(zhǎng)度為19、20、21、22、23、24或25個(gè)連續(xù)RNA核苷酸且包含與mRNA編碼序列的至少一部分互補(bǔ)和非互補(bǔ)的序列。43.一種治療對(duì)象癌癥的方法，所述方法包括給予診斷患有癌癥的對(duì)象通過(guò)權(quán)利要求38所述方法鑒別的分子，從而使得所述分子抑制或延緩所述對(duì)象的癌癥。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述癌癥是表I中所列的癌癥。45.一種減少哺乳動(dòng)物中腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用治療有效量的特異性結(jié)合于PSCA(SEQIDNO)的單克隆抗體(SEQIDNO)和放療聯(lián)合治療所述哺乳動(dòng)物。46.一種減少哺乳動(dòng)物中腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用治療有效量的特異性結(jié)合于PSCA(SEQIDNO)的單克隆抗體(SEQIDNO)和化療劑聯(lián)合治療所述哺乳動(dòng)物。全文摘要描述了結(jié)合于新型PSCA蛋白的抗體及其衍生的分子、以及它們的變體，其中PSCA在正常成體組織中呈組織特異性表達(dá)，并在表I所列的癌中異常表達(dá)。因此，PSCA提供了一種用于癌癥診斷、預(yù)測(cè)、預(yù)防和/或治療的靶標(biāo)?？蓪SCA基因或其片段、或其編碼的蛋白質(zhì)、或它們的變體、或它們的片段用于引發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答；與PSCA反應(yīng)的抗體或T細(xì)胞可用于主動(dòng)或被動(dòng)免疫。文檔編號(hào)C07K14/705GK1997751SQ200580017239公開(kāi)日2007年7月11日申請(qǐng)日期2005年5月17日優(yōu)先權(quán)日2004年5月28日發(fā)明者J·古達(dá)斯,A·雅各波維茨,X·賈,R·K·莫里森,K·J·M·莫里森,H·邵,P·M·查利塔-埃德,A·B·萊塔諾申請(qǐng)人:艾更斯司股份有限公司