專利名稱：一種大腸桿菌重組雞α-γ二價干擾素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大腸桿菌重組雞α - Y 二價干擾素及其制備方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前家禽腫瘤病和病毒病感染引起的雞馬立克氏病、新城疫、傳染性法氏囊病、傳 染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、腦脊髓炎、流感、傳染性貧血、病毒性肝炎等病毒病給養(yǎng)禽 業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，今年來已經(jīng)成為危害雞業(yè)最為嚴(yán)重的疾病之一。對家禽腫瘤病和 病毒病的有效治療一直是困擾禽病防治的重大難題之一。雞的免疫系統(tǒng)以及在病原感染或 注射疫苗時所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)與PURU動物相似，所以可以考慮應(yīng)用細(xì)胞因子來控制疾病。 相對來說，禽類的飼養(yǎng)簡單、廉價，出籠時間短，而且數(shù)量較大，這就需要考慮所用疫苗或者 治療藥物的經(jīng)濟(jì)價值。綠色食品工程的啟動，人們對食品安全的重視的升溫，常用抗病毒藥 物帶來的嚴(yán)重的藥物殘留危及人類的健康，這些問題得到社會的普遍關(guān)注。所以，養(yǎng)禽業(yè)迫 切需要新一代的天然治療方法。在病原感染和疫苗免疫中，干擾素等細(xì)胞因子可調(diào)控免疫 反應(yīng)的類型與反應(yīng)強度，是一種高效的、天然的治療方法。而按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行治療，很難 在短時間內(nèi)控制病情，而使用基因工程干擾素則可以使機體迅速的抗病毒增殖，抗腫瘤增 生，并能提高免疫力。在臨床上應(yīng)用，不但效果明顯，而且無藥物殘留，能在病毒性感染的早 期對其進(jìn)行有效的治療。利用生物技術(shù)手段研制開發(fā)畜禽用干擾素(IFN)是在化學(xué)藥物禁 用后抵抗畜禽疫病有力武器，IFN具有廣譜的抗病毒作用，表現(xiàn)在毒增殖量減少，細(xì)胞損傷 程度降低，同時具有提高機體免疫力的雙重作用?？捎糜诜乐坞u新城疫、禽流感、法氏囊病。 本發(fā)明選擇干擾素的基因工程表達(dá)產(chǎn)物開發(fā)出綠色高效抗感染生物制劑，實現(xiàn)基因工程表 達(dá)干擾素產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明涉及的一種重組雞α - Y 二價干擾素具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效， 未見臨床聯(lián)合應(yīng)用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
1、根據(jù)GenBank中雞IFN-α基因設(shè)計引物對，利用PCR技術(shù)克隆，在成熟肽基 因兩側(cè)設(shè)計一對引物，分別加入合適的酶切位點，將其亞克隆在表達(dá)載體PET上，轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)形式，結(jié)果為蛋白以包涵體形 式表達(dá)，破碎菌體提取包涵體純化后，利用半胱胺酸-半胱胺酸再氧化法對純化后的包涵 體變性液進(jìn)行分段稀釋法復(fù)性。通過細(xì)胞病變抑制法測定復(fù)性液體的抗病毒活性，得到雞 α _干擾素。2、根據(jù)GenBank中雞IFN-γ基因序列，去掉信號肽區(qū)，對其成熟肽區(qū)進(jìn)行大腸桿 菌密碼子偏好性改造和mRNAde 5’端耳機結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在序列兩端同時設(shè)立BgI II與 Hand III酶切位點，進(jìn)行合成和TA克隆測序驗證。再經(jīng)過表達(dá)載體的構(gòu)建、重組表達(dá)載 體的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)，在經(jīng)過電泳后確定表達(dá)形式，通過鎳柱純化目的蛋白并抗病毒活性檢 測，最后得到了雞Y-干擾素。
3、通過基因設(shè)計與合成，表達(dá)子載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)、目的蛋白純化及獲得活性 物質(zhì)而制成。將雞α-干擾素和雞Y-干擾素成熟基因克隆至PET載體上，轉(zhuǎn)化至宿主菌 BL21 (DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到了目的蛋白，經(jīng)過水泡性口炎病毒-雞胚成纖維細(xì)胞 系統(tǒng)測定具有很高的抗病毒活性。本發(fā)明的優(yōu)點在于利用大腸桿菌表達(dá)雞α-干擾素，以包涵體形式表達(dá)，通過變 性復(fù)性后具有廣譜的抗病毒作用，而大腸桿菌表達(dá)雞Y-干擾素分泌表達(dá)，通過純化蛋白 后具有免疫調(diào)節(jié)活性和一定的抗病毒活性，二者聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用，本發(fā)明所 得二價干擾素可優(yōu)于單獨應(yīng)用任何一種干擾素對新城疫和法氏囊的治療和預(yù)防。
具體實施例方式根據(jù)GenBank中雞IFN-α基因設(shè)計引物對，利用PCR技術(shù)克隆IFN-α基因，在成 熟肽基因兩側(cè)設(shè)計一對引物，分別加入合適的酶切位點，將其亞克隆在表達(dá)載體PET上，轉(zhuǎn) 化BL21(DE3)后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)形式，結(jié)果為蛋白以包涵體形 式表達(dá)，破碎菌體提取包涵體純化后，利用半胱胺酸_半胱胺酸再氧化法對純化后的包涵 體變性液進(jìn)行分段稀釋法復(fù)性。通過細(xì)胞病變抑制法測定復(fù)性液體的抗病毒活性，得到雞 α-干擾素。再根據(jù)GenBank中雞IFN-γ基因序列，去掉信號肽區(qū)，對其成熟肽區(qū)進(jìn)行大 腸桿菌密碼子偏好性改造和mRNAde 5’端耳機結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在序列兩端同時設(shè)立BgI II 與Hand III酶切位點，進(jìn)行合成和TA克隆測序驗證。再經(jīng)過表達(dá)載體的構(gòu)建、重組表達(dá)載 體的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)，在經(jīng)過電泳后確定表達(dá)形式，通過鎳柱純化目的蛋白并抗病毒活性檢 測，最后得到了雞干擾素。
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌重組雞α-Υ 二價干擾素，其特征在于其主要成分為大腸桿菌重組雞 α - Y 二價干擾素，為無色至微黃的澄明液體，無肉眼可見不溶物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大腸桿菌重組雞α-Υ二價干擾素，其特征在用大腸桿 菌表達(dá)的雞α-干擾素和雞Y-干擾素制成二價干擾素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大腸桿菌重組雞α-γ二價干擾素的制備方法，其特 征在于通過基因設(shè)計與合成，表達(dá)子載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)、目的蛋白純化及獲得活性物 質(zhì)而制成。將雞α-干擾素和雞Y-干擾素成熟基因克隆至PET載體上，轉(zhuǎn)化至宿主菌 BL21 (DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到了目的蛋白，經(jīng)過水泡性口炎病毒-雞胚成纖維細(xì)胞 系統(tǒng)測定具有很高的抗病毒活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大腸桿菌重組雞α-γ二價干擾素及其制備方法。本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤效果好、提高畜禽免疫力的，能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)控制病情的干擾素。其組分為大腸桿菌重組雞α-擾素、大腸桿菌雞γ-干擾素；其制備方法為基因設(shè)計，表達(dá)載體構(gòu)建，誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白質(zhì)純化及活性檢測即得。該藥品為畜禽病毒病治療替代藥物，利用大腸桿菌表達(dá)雞α-擾素、雞γ-干擾素，具有廣譜的抗病毒作用。通過純化蛋白后具有免疫調(diào)節(jié)活性和一定的抗病毒活性，二者聯(lián)合應(yīng)用于臨床具有明顯的協(xié)同作用。本發(fā)明制成的二價干擾素可優(yōu)于單獨應(yīng)用任何一種干擾素對新城疫和法氏囊病的治療和預(yù)防效果。
文檔編號C07K14/57GK102108096SQ200910256418
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者宋麗, 張瑞麗, 王春元, 賈德強, 邱梅, 郝智慧 申請人:青島六和藥業(yè)有限公司, 青島康地恩藥業(yè)有限公司