專利名稱：Rage融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般來說涉及晚期糖化終末產(chǎn)物(“AGE”)，更具體來說涉及含有晚期糖 化終末產(chǎn)物受體(“RAGE”)的一些融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白與AGE和其他RAGE配體 (例如S100和HMGB1)結(jié)合，包含本發(fā)明融合蛋白的組合物可用于治療疾病。
背景技術(shù)：
晚期糖化終末產(chǎn)物(AGE)是蛋白非酶糖化和氧化的結(jié)果。它們出現(xiàn)在包括自身免 疫病相關(guān)性組織疾病在內(nèi)的壓力相關(guān)的環(huán)境下；并且可能在由氧化或髓過氧化物酶途徑所 產(chǎn)生的炎癥組織中形成。AGE與許多糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥有關(guān)。例如，糖尿病性腎病、腎小 球基膜增厚和腎小球系膜擴張的特征結(jié)構(gòu)改變伴有AGE的積聚，這會導(dǎo)致腎小球硬化癥和 間質(zhì)纖維化。長期輸注AGE給非糖尿病大鼠會導(dǎo)致類似的形態(tài)改變和顯著的蛋白尿的發(fā) 展。已經(jīng)顯示諸如氨基胍等AGE抑制劑能夠在糖尿病動物模型中防止糖尿病性腎病，最近 顯示其在一個臨床試驗中對糖尿病患者會產(chǎn)生相同作用。而且，AGE是經(jīng)充分驗證的糖尿 病性視網(wǎng)膜病的治療靶標(biāo)。大量糖尿病小鼠和大鼠研究已經(jīng)證明了抑制AGE形成在治療此 疾病中的有益效果。動脈粥樣硬化在糖尿病患者中顯著加速，其與心血管和腦血管死亡率的更高風(fēng)險 相關(guān)。動物和人的研究已經(jīng)表明AGE在動脈硬化病變的形成和發(fā)展中起著重要的作用。糖 尿病血管組織中AGE積累的增加與內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、和平滑肌細胞功能的改變相關(guān)。AGE與單核細胞、巨噬細胞、微血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、間質(zhì)細胞和神經(jīng)元上的 細胞表面受體相互作用。晚期糖化終末產(chǎn)物受體(RAGE)是細胞表面受體免疫球蛋白超家 族的成員。RAGE由三個胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和參與信號傳導(dǎo)的胞質(zhì)結(jié) 構(gòu)域構(gòu)成。除AGE外，RAGE還結(jié)合多種配體，包括S100/鈣粒蛋白、兩性素(amphoterin)/ HMGB1和淀粉樣纖維(amyloid fibril)。RAGE通過包括NF_ k B的信號級聯(lián)起作用。RAGE 表達在RAGE配體存在下上調(diào)并且在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者的關(guān)節(jié)中升高。RAGE具有缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的分泌型異構(gòu)體，其稱為可溶性RAGE(sRAGE)。已 經(jīng)顯示sRAGE的給藥能修復(fù)創(chuàng)傷愈合(Goova等人(2001)Am. J. Pathol. 159，513-525) 并且抑制糖尿病性動脈粥樣硬化(Park等人(1998)Nat Med. 4(9) 1025-31)。在TO 2004/016229A2 (ffyeth,Madison,NJ)和美國專利申請公布 2006/0057679A1 (0，Keefe，T.等 人)中公開了由RAGE配體結(jié)合元件和免疫球蛋白元件構(gòu)成的融合蛋白。仍然需要治療AGE介導(dǎo)的疾病(如與AGE的量增加相關(guān)的疾病)的新方法。本發(fā) 明滿足了這種需求和其他的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于治療與AGE的量增加相關(guān)的疾病的材料和方法。在一個實施方式中，本發(fā)明提供包含至少一個多肽的融合蛋白，所述多肽包含(a)第一氨基酸序列，其與 晚期糖化終末產(chǎn)物(RAGE)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的哺乳動物受體至少95%相同，該第一氨基酸 序列能夠結(jié)合RAGE配體；和(b)第二氨基酸序列，其與人重鏈免疫球蛋白IgG4恒定結(jié)構(gòu) 域或其片段至少95%相同；其中所述第一氨基酸序列包含至少一個相對于野生型RAGE配 體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變。在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明的融合蛋白可以進一步包含在 所述第一氨基酸序列與所述第二氨基酸序列之間的連接子序列。在一些實施方式中，所述 RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以來自哺乳動物RAGE，例如人RAGE。適宜的哺乳動物RAGE配體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域可以包含SEQ ID NO 6的氨基酸1-344或SEQ ID NO 6的氨基酸24-344。在一 個實施方式中，本發(fā)明的融合蛋白可以包含選自下列的氨基酸序列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ IDN0:6和SEQ ID NO :8。在一個實施方式中，本發(fā)明的分離的融合蛋白包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :8。在另一個實施方式中，本發(fā)明的分離的融合蛋白由SEQ ID NO 6 或SEQ ID N0:8組成。在本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明的融合蛋白還可以包含在RAGE 氨基酸序列和IgG4氨基酸序列之間的連接子。本發(fā)明還構(gòu)思了編碼本發(fā)明融合蛋白的核 酸分子(例如，DNA或RNA分子)以及表達編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸分子的宿主細胞。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明融合蛋白和藥物上可接受的賦形劑或稀釋劑的藥物組 合物。本發(fā)明提供治療AGE介導(dǎo)的疾病的方法。此類疾病包括特征在于患者(例如，諸如 人等哺乳動物)中AGE量增加的任何疾病。治療AGE介導(dǎo)的疾病的方法包括給予患有AGE 介導(dǎo)的疾病的患者治療有效量的包含本發(fā)明融合蛋白的藥物組合物?？梢酝ㄟ^本發(fā)明方法 治療的疾病的實例包括但不限于糖尿病性腎??；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；和自身免疫疾病，如皮 炎、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎性眼炎(uveitis ophthalmia)、自身免疫性肺炎、胰 島素依賴性糖尿病、自身免疫性炎眼、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素耐受、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿 病性視網(wǎng)膜病和硬皮病。本發(fā)明的任何融合蛋白都可以用于實施本發(fā)明的方法。在一個實 施方式中，本發(fā)明的方法可以使用包含SEQ ID NO :6或SEQ IDN0 :8的融合蛋白來實施。在 另一個實施方式中，本發(fā)明的方法可以使用由SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8組成的融合蛋 白來實施。在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明提供在有需要的哺乳動物(例如，人)中降 低RAGE結(jié)合的配體水平的方法。此類方法可以包括給予哺乳動物RAGE配體降低量的本發(fā) 明的融合蛋白。在其他實施方式中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明DNA序列的重組表達載體；用載體轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的宿主細胞；以及制備融合蛋白的方法，其包括在適于有效表達融合蛋白的 條件下培養(yǎng)用編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明融合蛋白或其片段的組合物。在一些實施方式中，本發(fā) 明包括包含本發(fā)明融合蛋白或其片段的組合物，所述融合蛋白或其片段直接或間接與放射 性同位素、螯合劑、毒素、熒光染料、生物素、肽表位，如his-標(biāo)簽、myc-標(biāo)簽或糖連接。本 發(fā)明的其他實施方式包括為了改變?nèi)诤系鞍椎纳锇胨テ诨蚬δ芎吞腔凅w而與另一 蛋白融合的本發(fā)明融合蛋白。本發(fā)明的這些和其他方面將參考下列詳細說明而顯而易見。附圖簡述


圖1是顯示在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對白 細胞淤滯的影響的柱形圖。圖2A-2D是顯示在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白 對各視網(wǎng)膜層視網(wǎng)膜血管透性的影響的柱形圖。圖3是顯示在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對視 網(wǎng)膜蛋白硝化的影響的柱形圖。圖4是顯示在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對 ICAM視網(wǎng)膜表達的影響的柱形圖。圖5A是顯示在患糖尿病10個月后糖尿病小鼠中示例性RAGE-Ig融合蛋白對每平 方毫米視網(wǎng)膜組織所觀察到的無細胞毛細血管數(shù)的影響的柱形圖。圖5B是顯示在患糖尿 病10個月后示例性RAGE-Ig融合蛋白對糖尿病小鼠中所觀察到的每1000個毛細血管細胞 中的周影細胞(pericyte ghost)數(shù)的影響的柱形圖。圖6是顯示在患糖尿病10個月后糖尿病小鼠中示例性RAGE-Ig融合蛋白對50% 響應(yīng)的接觸閾值的影響的柱形圖。圖7提供顯示實施例3的實驗方案的流程圖。圖8是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對測 試動物體重的影響的線形圖。圖9是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對關(guān) 節(jié)炎發(fā)病率的影響的柱形圖。圖10是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對關(guān) 節(jié)炎發(fā)作的影響的柱形圖。圖11是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對關(guān) 節(jié)炎發(fā)病率與時間的函數(shù)的影響的線形圖。圖12是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對關(guān) 節(jié)炎嚴重程度與時間的函數(shù)的影響的線形圖。圖13是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對所 觀察到的關(guān)節(jié)炎爪子數(shù)與時間的函數(shù)的影響的線形圖。圖14A-14D是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋 白對關(guān)節(jié)形態(tài)隨融合蛋白量增加的變化的影響的顯微照片。圖15是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對滑 膜炎(黑柱)和關(guān)節(jié)翳(灰柱)的影響的柱形圖。圖16是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對邊 緣糜爛(marginal erosion)(黑柱)和結(jié)構(gòu)改變(architectural change)(灰柱)的影響 的柱形圖。圖17是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對整 體組織學(xué)關(guān)節(jié)炎評分的影響的柱形圖。圖18是顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對關(guān) 節(jié)基質(zhì)蛋白丟失的影響的柱形圖。圖19A-19D是甲苯胺藍染色切片的顯微照片，其顯示在II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小
6鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白對關(guān)節(jié)基質(zhì)蛋白丟失的影響。實施方式定義如本文所用的術(shù)語“晚期糖化終末產(chǎn)物受體”或RAGE是指氨基酸序列基本上類似 于天然哺乳動物RAGE氨基酸序列且以配體-受體特異性方式結(jié)合一種或多種RAGE配體的 蛋白。術(shù)語“晚期糖化終末產(chǎn)物”和“AGE”是指還原糖與蛋白的游離氨基、脂和上述核酸的 非酶反應(yīng)而形成的異源分子群。如本文所用“RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“RAGE-LBD”是指保持著以配體-受體特 異性方式結(jié)合RAGE配體的能力的任何哺乳動物RAGE蛋白或哺乳動物RAGE蛋白的任何部 分。具體地，不受限制，RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括具有一個或多個跨膜RAGE蛋白胞外結(jié)構(gòu) 域的多肽。參見表6，適宜的RAGE-LBD可以包含至少SEQ IDN0 :6的氨基酸1_99、或氨基 酸24-99、或氨基酸1-208、或氨基酸24-208、或氨基酸1_301、或氨基酸24-301、或氨基酸 1-344、或氨基酸 24-344。如本說明書內(nèi)容中用于定義融合蛋白純度的術(shù)語“分離的”是指所述蛋白基本上 不含在制備期間與其相關(guān)的其他蛋白，包括但不限于基本上沒有在細胞培養(yǎng)基中融合蛋白 表達期間存在的其他蛋白。例如，本發(fā)明的分離的蛋白可以含有1-25 %、20-25 %、15-20 %、 10-15%、5-10%、1-5%或少于約2%質(zhì)量的制備過程的蛋白污染物殘余物。然而，包含本發(fā) 明的分離的蛋白的組合物可以含有作為穩(wěn)定劑、載體、賦形劑或聯(lián)合治療劑添加的其他蛋 白。 如本文所用，“蛋白”和“多肽”可互換。如本文所用“治療”疾病或病癥是指改善患者疾病或病癥的至少一個體癥或癥狀。術(shù)語“核酸”是指多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)和(適當(dāng)時)核糖核酸(RNA)。 該術(shù)語還應(yīng)理解為包括如由核苷酸類似物制備的RNA或DNA的等同物、類似物；和如所述 實施方式所應(yīng)用的單鏈(正義和反義)和雙鏈多核苷酸。本文所用的術(shù)語“或”意思可以與術(shù)語“和/或”互換使用，除非上下文中清楚指 明并非如此。術(shù)語“％相同”是指兩種氨基酸序列之間或兩種核苷酸序列之間的序列同一 性。％同一性可以通過比較為比較的目的而進行比對的各序列中的位置來確定。百分 比同一性的表示是指所比較的序列共有位置的相同氨基酸或核酸數(shù)目的函數(shù)。可以使 用多種比對算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST作為GCG 序列分析包(University of Wisconsin, Madison, Wis.)的一部分而獲得，其可以例如 默認設(shè)置使用。ENTREZ可以通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnologylnformation)、美國國家醫(yī)學(xué)圖書館(National Library of Medicine)、美 國國立健康研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Md)獲得。在一個實施方 式中，兩個序列之間的％同一性可以通過用空格重為1的GCG程序(例如，稱重各氨基酸空 格如同其為單一氨基酸一樣)或兩個序列之間的核苷酸錯配確定。序列同一性可以通過比較參考序列或參考序列的亞序列與測試序列(例如，核苷 酸序列、氨基酸序列等)來確定。最佳地，在任意數(shù)目殘基所限定的比較窗口內(nèi)比對參考序 列和測試序列。為了獲得最佳的比對，可以將增加或缺失(如空格)引入測試序列。本發(fā)明的％序列同一性通過如下方法來測定測定兩個序列上存在相同殘基的位置數(shù)，用匹配 位置的數(shù)除以比較窗口內(nèi)序列的總長度，再乘以100得出百分數(shù)。除了匹配位置數(shù)之外，在 計算百分比序列同一性時還要考慮空格數(shù)和大小。序列同一性通常使用計算機程序來確定。代表性程序是可在美國國家生物技術(shù) 信息中心(NCBI，http //www, ncbi. nlm. nih. gov/)公開獲得的BLAST (基本局部比對搜 索工具(Basic Local Alignment Search Tool))程序。此程序比較測試序列鏈段與數(shù)據(jù) 庫中的序列以測定匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性，然后鑒別并僅報告顯著性高于閾值的那些匹配。 適宜的BLAST程序版本是容許空格的版本，例如2. X版(Altschul等人，Nucleic Acids Res 25(17) =3389-402,1997) 鑒別與本發(fā)明蛋白具有序列同一性的蛋白的其他適宜程 序包括但不限于PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated BLAST，Zhang 等人，Nucleic Acids Res 26(17) =3986-90,1998)和 PSI-BLAST (位置特異性疊加 BLAST (Position-Specific IteratedBLAST)，Altschul 等人，Nucleic Acids Res 25(17) :3389_402，1997)。這些程序 可以在上述NCBI網(wǎng)站公開獲得，可以默認設(shè)置使用以確定根據(jù)本發(fā)明的序列同一性。融合蛋白本發(fā)明提供一種分離的融合蛋白，該分離的融合蛋白包含至少一種多肽，所述多 肽包含(a)第一氨基酸序列，其與晚期糖化終末產(chǎn)物(RAGE)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的哺乳動物 受體至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同，該第一氨基酸 序列能夠結(jié)合RAGE配體；和(b)第二氨基酸序列，其與人重鏈免疫球蛋白IgG4恒定結(jié)構(gòu)域 或其片段至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同；其中所述 第一氨基酸序列包含相對于野生型RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個突變、或至少兩個突 變、或至少三個突變、或1至4個突變、或1至10個突變?？梢栽诘谝话被嵝蛄兄邪l(fā)生的 突變的實例是通過(例如)使RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域更加耐受蛋白水解降解來增加融合蛋 白穩(wěn)定性的那些突變，如使融合蛋白更加耐受弗林蛋白酶(furin)樣蛋白酶的那些。適宜 的第二氨基酸序列片段包括保持著增加融合蛋白血清半衰期的能力的片段，其與相同的僅 第一氨基酸序列的血清半衰期部分相關(guān)。優(yōu)選地，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列衍生 自人RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人IgG4。本發(fā)明的融合蛋白還可以包含除RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和IgG4恒定結(jié)構(gòu)域或其片 段之外的一個或多個氨基酸序列。例如，本發(fā)明的融合蛋白可以包含連接子序列，該連接子 序列可插入RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和IgG序列之間。本發(fā)明的融合蛋白可以包含一種或多 種標(biāo)簽序列，例如，諸如6-組氨酸等純化標(biāo)簽序列。本發(fā)明的融合蛋白可以包含一個或多 個市售抗體所識別的表位，例如，c-myc (EQKLISEEDL，SEQ ID NO 9)和自流感血細胞凝集素 蛋白的表位標(biāo)簽衍生的血細胞凝集素(YPYDVPDYA，SEQ ID NO: 10)。可以使用本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所熟知的任何哺乳動物RAGE蛋白來實施本發(fā) 明。優(yōu)選地，使用RAGE蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域來鑒別可以突變并用作融合蛋白第一氨基酸序 列的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。哺乳動物RAGE蛋白的適宜實例包括但不限于靈長類、人(例如， GenBank 登錄號 NP_001127 和 NP_751947)、鼠(例如，GenBank 登錄號 NP_031451)、犬(例 如，GenBank登錄號AAQ81297)、大鼠(例如，GenBank登錄號NP_445788)、貓、牛(例如， GenBank登錄號AAI20128)、羊、馬和豬(例如，GenBank登錄號AAQ73283) RAGE結(jié)構(gòu)域。包含對野生型序列的一種或多種改變或修飾的RAGE氨基酸序列可以用于本發(fā)明。這種改變或修飾包括但不限于點突變、自N末端的缺失、自C末端的缺失、內(nèi)部缺失、 以及它們的組合?？梢詫⑷魏胃淖兓蛐揎椧隦AGE序列來用于本發(fā)明，只要所得蛋白保 留生物活性即可，例如，保留結(jié)合一個或多個RAGE配體的能力。本發(fā)明的融合蛋白還包括 具有或不具有內(nèi)源糖基化模式的那些，包括但不限于其中第一氨基酸序列衍生自哺乳動物 RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，該哺乳動物RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域伴有或不伴有相關(guān)的 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然模式糖基化。可以使用任何適宜的IgG Fc區(qū)域來實施本發(fā)明，優(yōu)選地，該區(qū)域來自IgG4分子， 例如GenBank登錄號AAH25985的氨基酸殘基149-473。用于本發(fā)明的IgG區(qū)域可以是 IgG4Fc區(qū)域，并且可以包含IgG4分子的一個或多個CH2和CH3區(qū)域。適宜的融合蛋白實例在下列表中提供。表1提供人RAGE_IgG4Fc融合蛋白基因序列的核苷酸序列。表1 人 RAGE_IgG4Fc 融合基因序列(SEQ ID NO :1)。
ATGGCAGCCGGAACAGCAGTTGGAGCCTGGGTGCTGGTCCTCAGTctgtggggggcagtagtaggtgct caaaacatcacagcccggattgGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCCTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGGTGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGAATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACACCGGGCCTTGCGCACAGCCCCCATCCAGCCCCGTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGGTCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCLAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA黑體文本為RAGE信號序列的編碼序列，正常文本為人RAGE的編碼序列，下劃線文 本為IgG4Fc區(qū)域的編碼序列。表2 人RAGE-IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。maagtavgaw vlvlslwgav vgaqnitari geplvlkckg apkkppqrle 50WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PWDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ 100AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY 150PAGTLSWHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG 200DPRPTFSCSF SPGLPRHRAL RTAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA 250PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS 300CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALAASTKGP 350SVFPLAPCSR STSESTMLG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 400LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTKTYTCNYD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC 450PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SQEDPEVQFN 500ffYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRWSVL TVLHQDffLNG KEYKCKVSNK 550GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 600IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR ffQEGNYFSCS 650VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K671黑體文本為RAGE信號序列的氨基酸序列，正常文本為人RAGE的氨基酸序列，下劃 線文本為IgG4Fc區(qū)域的氨基酸序列。
表3 人RAGE-連接子_IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO 3)。
ctgtggggggcagtagtaggtgct caaaacatcacagcccggattgGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCCTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGGTGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGAATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACACCGGGCCTTGCGCA
典 TEQGGAQSCGISMMXSOTMGfETOGAOEGMjGOTGCTGGTCCTCAGTTCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCC GGTAGCGGCTCCG
GAAGTGGG GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG
GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACtacacacagaagagcctctccctgtctctcgggaaatga黑體文本為RAGE信號序列的編碼序列，正常文本為人RAGE的編碼序列，雙下劃線 文本為肽連接子的編碼序列，單下劃線文本為IgG4Fc區(qū)域的編碼序列。表4 人RAGE-連接子_IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。MAAGTAVGAW VLVLSLWGAV VGA QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE 50WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PffDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ 100AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY 150PAGTLSffHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG 200DPRPTFSCSF SPGLPRHRAL RTAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA 250PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS 300CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALA GSGSGS 350Gastkgpsvf plapcsrsts estaalgcly kdyfpepvtv swnsgaltsg 400VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE 450SKYGPPCPSC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE 500DPEVQFNffYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDffLNGKEY 550KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV 600KGFYPSDIAV EffESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRffQE 650GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK678黑體文本為RAGE信號序列的氨基酸序列，正常文本為人RAGE的氨基酸序列，雙下 劃線文本為肽連接子的氨基酸序列，單下劃線文本為IgG4Fc區(qū)域的氨基酸序列。
表5 人 RAGE 變體 _IgG4Fc 融合基因序列(SEQ ID NO 5)。
ATGGCAGCCGGAACAGCAGTTGGAGCCTGGGTGCTGGTCCTCA
GTCTGTGGGGGGCAGTAGTAGGTGCT caaaacatcacagcccggattggcgagccactggtgctgaagtgtaagggggcccccaagaaaccaccccagcggctggaatggaaactgaacacaggccggacagaagcttggaaggtcctgtctccccagggaggaggcccctgggacagtgtggctcgtgtccttcccaacggctccctcttccttccggctgtcgggatccaggatgaggggattttccggtgccaggcaatgaacaggaatggaaaggagaccaagtccaactaccgagtccgtgtctaccagattcctgggaagccagaaattgtagattctgcctctgaactcacggctggtgttcccaataaggtggggacatgtgtgtcagagggaagctaccctgcagggactcttagctggcacttggatgggaagcccctggtgccgaatgagaagggagtatctgtgaaggaacagaccaggagacaccctgagacagggctcttcacactgcagtcggagctaatggtgaccccagcccggggaggagatccccgtcccaccttctcctgtagcttcagcccaggccttccccgacgccgggccttgcacacagcccccatccagccccgtgtctgggagcctgtgcctctggaggaggtccaattggtggtggagccagaaggtggagcagtagctcctggtggaaccgtaaccctgacctgtgaagtccctgcccagccctctcctcaaatccactggatgaaggatggtgtgcccttgccccttccccccagccctgtgctgatcctccctgagatagggcctcaggaccagggaacctacagctgtgtggccacccattccagccacgggccccaggaaagccgtgctgtcagcatcagcatcatcgaaccaggcgaggaggggccaactgcaggctctgtggga
ggatcagggctgggaactctagccctggccgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA
黑體文本為RAGE信號序列的編碼序列，正常內(nèi)容為人RAGE變體的編碼序列，黑體 下劃曲線字母為引入變體hRAGE序列中的點突變位點，下劃線文本為IgG4Fc區(qū)域的編碼序 列。表6 人RAGE變體_IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。1 MAAGTAVGAW VLVLSLWGAV VGA QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE51 WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PffDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ101 AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY151 PAGTLSffHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG201 DPRPTFSCSF SPGLPR R RAL H TAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA251 PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS301 CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALAASTKGP351 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSffNSGAL TSGVHTFPAV401 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC451 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN501 ffYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRVVSVL TVLHQDffLNG KEYKCKVSNK551 GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD601 IAVEffESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR ffQEGNVFSCS651 VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K黑體文本為RAGE信號序列的氨基酸序列，正常文本為人RAGE變體的氨基酸序列， 黑體下劃曲線字母為引入變體hRAGE序列中的點突變位點，下劃線文本為IgG4Fc區(qū)域的氨 基酸序列。表7 人RAGE變體-連接子_IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO 7)。
ATGGCAGCCGGAACAGCAGTTGGAGCCTGGGTGCTGGTCCTCAgtctgtggggggcagtagtaggtgct caaaacatcacagcccggATTGGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCTTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGG
TGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCT
GCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGA
ATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACGCCGGGCCTTGCACACAGCCCCCATCCAGCCCCGTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGGTCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCC GGTAGCGGCTCCGGAAGTGGG GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA黑體文本為RAGE信號序列的編碼序列，正常文本為人RAGE變體的編碼序列，黑體下劃曲線字母為引入變體hRAGE序列中的點突變位點，雙下劃線文本為編碼肽連接子的序 列，下劃線文本為IgG4Fc區(qū)域的編碼序列。表8 人RAGE變體-連接子_IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO 8)。1 MAAGTAVGAW VLVLSLWGAV VGA QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE
51 WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PffDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ101 AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY151 PAGTLSffHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG201 DPRPTFSCSF SPGLPR .R RAL H TAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA251 PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS
301 CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT T AT A .GSGSGS351gASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SffNSGALTSG401 VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE451 SKYGPPCPSC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE501 DPEVQFNffYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDffLNGKEY551 KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV601 KGFYPSDIAV EffESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRffQE651 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK黑體文本為RAGE信號序列的氨基酸序列，正常文本為人RAGE變體的氨基酸序列， 黑體下劃曲線字母為引入變體hRAGE中的點突變位點，雙下劃線文本為肽連接子的氨基酸 序列，下劃線文本為IgG4Fc區(qū)域的氨基酸序列。RAGE融合蛋白的表達本發(fā)明的融合蛋白可以通過本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所已知的任何蛋白表達系統(tǒng) 來制備，例如，真核表達系統(tǒng)、細菌表達系統(tǒng)和病毒表達系統(tǒng)?？梢允褂枚喾N宿主表達載體 系統(tǒng)來表達本發(fā)明的融合蛋白。這類宿主系統(tǒng)代表了本發(fā)明融合蛋白可以在其中制備的溶 媒，隨后融合蛋白可以從其中純化。此類系統(tǒng)包括但不限于諸如細菌、酵母等微生物、昆蟲 細胞或植物細胞。視表達系統(tǒng)而定，酵母或哺乳動物表達系統(tǒng)(例如，C0S-7細胞)中表達的 RAGE可與天然分子的分子量和糖基化模式類似或輕微不同。細菌(如大腸桿菌(E. coli)) 中RAGE DNA表達提供非糖基化的分子?？梢允褂脳U狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中獲得不 同的糖基化模式。具有滅活的N-糖基化位點的哺乳動物RAGE功能突變體類似物可以通過 寡核苷酸合成和連接或通過定點突變技術(shù)來制備?？梢允褂媒湍副磉_系統(tǒng)以均勻的還原碳 水化合物形式以好的產(chǎn)率制備這些類似蛋白?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法獲得編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸分子，并測定 多核苷酸的核苷酸序列。根據(jù)本文的教導(dǎo)和已知的RAGE多肽序列及其鑒別的或可鑒別的 配體結(jié)合元件、以及重鏈IgG恒定結(jié)構(gòu)域的已知序列，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法確定 編碼這些多肽的核苷酸序列，即，可以將已知編碼特定氨基酸的核苷酸密碼子以能夠產(chǎn)生 編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸的方式組裝?？梢愿鶕?jù)所用的表達系統(tǒng)來選擇核苷酸密碼子， 例如通過選擇對應(yīng)于表達系統(tǒng)中所存在的較高豐度tRNA分子的密碼子，則可以表達較高 水平的融合蛋白。編碼融合蛋白的這種多核苷酸可以由化學(xué)合成的多核苷酸組裝(例如， 如Kutmeier等人，Biotechniques 17:242(1994)中所述)，簡言之，其包括合成含有編碼 融合蛋白的序列部分的重疊寡核苷酸；退火和連接這些寡核苷酸；然后通過聚合酶鏈式反 應(yīng)(PCR)擴增經(jīng)連接的寡核苷酸。本發(fā)明融合蛋白(包括含有融合蛋白片段或其變體或者由融合蛋白片段或其變 體組成的其他分子)的重組表達可能需要構(gòu)建含有編碼融合蛋白的多核苷酸的表達載體。一旦得到了編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸，便可以通過重組DNA技術(shù)使用該領(lǐng)域內(nèi)所熟 知的技術(shù)來制備產(chǎn)生融合蛋白的載體。這類含有RAGE-Fc編碼序列的表達載體還可以含有 適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制信號/序列，例如核糖體結(jié)合位點(即，Kozak序列)、內(nèi)部核糖體進 入位點(IRES)、和多腺苷酸化位點等。編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸分子可以如下轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞中使用復(fù)制缺陷 型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如，源自莫洛尼鼠類白血病病毒(MLV)或HIV的載體)和水泡性口 膜炎病毒G蛋白(VSV-G)制成假性病毒以穩(wěn)定插入到編碼本發(fā)明融合蛋白的單拷 貝核酸分 子中進入分裂的細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒以RNA形式傳遞編碼的基因，進入細胞后將其反轉(zhuǎn)錄成 DNA，穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中。在單個細胞中多個基因的插入可能增加融合蛋白的表 達和分泌。多次感染也可以增加整合的基因拷貝數(shù)從而增加表達的融合蛋白量。編碼融合 蛋白的整合的基因由于它們存在于基因組中而通過細胞分裂保持在細胞中。在一些實施方式中，本發(fā)明提供表達本發(fā)明融合蛋白的穩(wěn)定細胞系?？焖僦苽?穩(wěn)定的蛋白高度表達的哺乳動物細胞系的一個適宜的方法是使用GPEx 表達系統(tǒng)(Gala Biotech, a business unit of Catalent Pharma Solutions, Middleton, WI. , Bleck, Gregory Τ. , Bioprocessingjournal. com 9 月 /10 月 2005 第 1—7 頁)。此方法可能必須制 備基于MMLV的復(fù)制缺陷型的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞(例如，CHO 細胞)。該載體可以整合到細胞的基因組中，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系。分離的融合蛋白的純化本發(fā)明的分離的融合蛋白可以如下制備培養(yǎng)適宜的宿主/載體系統(tǒng)以表達本發(fā) 明DNA序列的重組翻譯產(chǎn)物，然后使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)將其從培養(yǎng)基或細胞提取物中純化。例如，首先可以使用市售蛋白濃縮過濾器(例如，Ami con或Mi 11 iporePe 11 i con超 純過濾單元)濃縮上清液，該上清液來自將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基的系統(tǒng)。濃縮步驟之后， 將濃縮物應(yīng)用到適宜的純化基質(zhì)上。例如，適宜的親和基質(zhì)可以包含例如，結(jié)合在適宜支 架上的AGE或凝集素或蛋白A或蛋白G或抗體分子?；蛘撸梢圆捎藐庪x子交換樹脂，例如 具有二乙基氨基乙基(DEAE)側(cè)基的基質(zhì)或基底?；|(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖 維素或蛋白純化中常用的其他類型?；蛘?，可以采用陽離子交換步驟。適宜的陽離子交換 劑包括含有磺丙基或羧甲基的各種不溶性基質(zhì)。優(yōu)選磺丙基。細菌培養(yǎng)所制備的重組蛋白通常如下分離首先從細胞團提取，然后是一次或多 次濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟。最后，可以使用高效液相色譜(HPLC)進 行最后的純化步驟。重組哺乳動物RAGE表達中所采用的微生物細胞可以通過任何方便的 方法破碎，其包括凍融循環(huán)、超聲波、機械破碎或使用細胞裂解劑。以分泌蛋白形式表達本發(fā)明融合蛋白的酵母發(fā)酵很大程度上簡化了純化。得自大 規(guī)模發(fā)酵的分泌的重組蛋白可以通過由Urdal等人(J. Chromatog. 296 :171，1984)所公開 的那些類似的方法進行純化。此參考文獻描述了在制備性HPLC柱子上純化重組人GMCSF 的兩個連續(xù)的、反相HPLC步驟。藥物組合物本發(fā)明的融合蛋白可以適于給予有需要的患者的方式配制，例如可以配制成藥物 組合物。本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。如本文所用“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有的生理上適應(yīng)的溶劑、分散介質(zhì)、涂劑、抗 菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。在一個實施方式中，所述載體適于腸胃外給藥。 載體可適合于給藥到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(例如，以脊柱內(nèi)或腦內(nèi)方式)?；蛘撸鲚d體可適合 于靜脈內(nèi)、皮下、腹腔或肌內(nèi)給藥。在另一實施方式中，所述載體適于口服給藥。藥學(xué)上可 接受的載體包括無菌水溶液或分散劑(dispersion)和無菌可注射溶液或或分散劑的臨時 制劑的無菌粉末。藥學(xué)上活性物質(zhì)的這類介質(zhì)和藥劑的用途在本領(lǐng)域中是熟知的。任何常 規(guī)的介質(zhì)或藥劑除非與本發(fā)明的融合蛋白不相容，否則其在本發(fā)明藥物組合物中的用途也 涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。還可以將輔助活性化合物摻入組合物中。適宜的載體通常在所采用的劑量和濃度下對接受者是無毒的。通常本發(fā)明藥物組 合物的制備必須將本發(fā)明融合蛋白與下列物質(zhì)的一種或多種混合緩沖劑、抗氧化劑(如 抗壞血酸)、低分子量(小于約10個殘基)多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、 海藻糖、蔗糖或糊精)、螯合劑(如，EDTA)、谷胱甘肽以及其他穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖 鹽或與同種血清白蛋白混合的鹽水是示例性的合適稀釋劑。本發(fā)明融合蛋白的治療性給藥本發(fā)明包括將本發(fā)明融合蛋白以藥物組合物形式給予有需要的患者(例如，哺乳 動物，尤其是人)，所述藥物組合物包含本發(fā)明的融合蛋白和藥物上可接受的稀釋劑或載 體。本發(fā)明還提供用此類組合物治療人類疾病的方法。通常，本發(fā)明的方法包括給予包含藥學(xué)上有效量的本發(fā)明融合蛋白的藥物組合 物。所采用的藥學(xué)上的有效量可以根據(jù)諸如個體的疾病狀況、年齡、性別和體重等因素而改變。本發(fā)明融合蛋白的藥學(xué)上的有效量可以為約1 μ g融合蛋白/Ikg患者體重至約 500mg融合蛋白/Ikg患者體重、或約10 μ g融合蛋白/Ikg患者體重至約500mg融合蛋白 /Ikg患者體重、或約100 μ g融合蛋白/Ikg患者體重至約500mg融合蛋白/Ikg患者體重、 或約Img融合蛋白/Ikg患者體重至約500mg融合蛋白/Ikg患者體重、或約IOmg融合蛋白 /Ikg患者體重至約500mg融合蛋白/Ikg患者體重、或約IOOmg融合蛋白/Ikg患者體重至 約500mg融合蛋白/Ikg患者體重、或約100 μ g融合蛋白/Ikg患者體重至約25mg融合蛋白 /Ikg患者體重、或約Img融合蛋白/Ikg患者體重至約25mg融合蛋白/Ikg患者體重、或約 5mg融合蛋白/Ikg患者體重至約25mg融合蛋白/Ikg患者體重、或約IOmg融合蛋白/Ikg 患者體重至約25mg融合蛋白/Ikg患者體重、或約15mg融合蛋白/Ikg患者體重至約25mg 融合蛋白/Ikg患者體重、或約100 μ g融合蛋白/Ikg患者體重至約IOmg融合蛋白/Ikg患 者體重、或約Img融合蛋白/Ikg患者體重至約IOmg融合蛋白/Ikg患者體重、或約2. 5mg 融合蛋白/Ikg患者體重至約IOmg融合蛋白/Ikg患者體重、或約5mg融合蛋白/Ikg患者 體重至約IOmg融合蛋白/Ikg患者體重、或約7. 5mg融合蛋白/Ikg患者體重至約IOmg融 合蛋白/Ikg患者體重。在一些實施方式中，本發(fā)明融合蛋白的藥學(xué)上的有效量可以為0.5mg融合蛋白 /Ikg患者體重、Img融合蛋白/Ikg患者體重、2mg融合蛋白/Ikg患者體重、3mg融合蛋白 /Ikg患者體重、4mg融合蛋白/Ikg患者體重、5mg融合蛋白/Ikg患者體重、6mg融合蛋白 /Ikg患者體重、7mg融合蛋白/Ikg患者體重、8mg融合蛋白/Ikg患者體重、9mg融合蛋白 /Ikg患者體重、或IOmg融合蛋白/Ikg患者體重。
單位劑型是指適合用作待治療的哺乳動物患者的單位劑量的物質(zhì)離散單位；每個單位含有預(yù)定量的本發(fā)明融合蛋白，該預(yù)定量經(jīng)計算能與所需的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生所需的 治療效果。本發(fā)明融合蛋白的單位劑型可以為約Img至約lOOOmg、約25mg至約lOOOmg、 約 50mg 至約 lOOOmg、約 IOOmg 至約 lOOOmg、約 250mg 至約 lOOOmg、約 500mg 至約 lOOOmg、 約IOOmg至約500mg、約200mg至約500mg、約300至約500mg、或約400mg至約500mg。本 發(fā)明融合蛋白的單位劑量可以為約100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg或700mg。本發(fā)明組合物可以以下水平包含本發(fā)明融合蛋白組合物總重量的約0. 1重量％ 至約20重量％、約0. 1重量％至約18重量％、約0. 1重量％至約16重量％、約0. 1重量％ 至約14重量％、約0. 1重量％至約12重量％、約0. 1重量％至約10重量％、約0. 1重量％ 至約8重量％、約0. 1重量％至約6重量％、約0. 1重量％至約4重量％、約0. 1重量％至 約2重量％、約0. 1重量％至約1重量％、約0. 1重量％至約0.9重量％、約0. 1重量％至約 0.8重量％、約0. 1重量％至約0. 7重量％、約0. 1重量％至約0.6重量％、約0. 1重量％至 約0.5重量％、約0. 1重量％至約0.4重量％、約0. 1重量％至約0.3重量％、或約0. 1重 量％至約0. 2重量％。本發(fā)明的藥物組合物可以以下水平包含一種或多種本發(fā)明融合蛋白組合物總重 量的約1重量％至約20重量％、約1重量％至約18重量％、約1重量％至約16重量％、 約1重量％至約14重量％、約1重量％至約12重量％、約1重量％至約10重量％、約1重 量％至約9重量％、約1重量％至約8重量％、約1重量％至約7重量％、約1重量％至約 6重量％、約1重量％至約5重量％、約1重量％至約4重量％、約1重量％至約3重量％、 或約1重量％至約2重量％。本發(fā)明藥物組合物可以以下水平包含一種或多種本發(fā)明融合 蛋白以組合物的總重量計約0. 1重量％、約0.2重量％、約0.3重量％、約0.4重量％、約 0. 5重量％、約0.6重量％、約0.7重量％、約0.8重量％、約0.9重量％、約1重量％、約2 重量％、約3重量％、約4重量％、約5重量％、約6重量％、約7重量％、約8重量％、或約 9重量％?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以給予單次推注，可以隨時間 分幾次給予劑量，或者可以根據(jù)治療情況的緊迫性按比例減少或增加劑量。特別有利的是 以單位劑型配制腸胃外組合物以方便藥劑的給藥和均一性?？梢耘渲票景l(fā)明的組合物，并 通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射方式給予。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物可以皮下或肌 內(nèi)方式給予。在一些實施方式中，劑量方案可能要求給予重復(fù)劑量，例如，給予每周一次的劑 量。治療方案可能要求一段時間(例如，四周)的每周劑量，然后進行次數(shù)較少的“維持”劑 量方案(例如，一月一次或兩月一次)。可以調(diào)節(jié)劑量方案以取得期望的治療結(jié)果。本發(fā)明方法包括抑制人的AGE依賴性炎癥反應(yīng)的方法，該方法包括給予有效量的 藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的融合蛋白。本發(fā)明的方法包括抑制AGE介導(dǎo)的生物活性的方法，該方法包括給予包含一種或 多種本發(fā)明的融合蛋白的藥物組合物。如上文所討論，AGE參與了多種疾病或病況，如自 身免疫病?？梢允褂帽景l(fā)明的融合蛋白治療、改善、檢測、診斷、預(yù)測或監(jiān)控的自身免疫紊 亂疾病或病況包括但不限于皮炎、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎性眼炎、自身免疫性 肺炎、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性炎眼、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素耐受、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和硬皮病。可以使用本發(fā)明方法治療或預(yù)防的其他病癥一般可以具有如下的特征包括其中 受影響的細胞顯示RAGE或一種或多種RAGE配體表達升高的任何病癥；或者可以通過降低 RAGE功能治療(即，可以消除或改善一個或多個癥狀)的任何病癥。例如，RAGE功能可以 通過給予破壞RAGE和RAGE配體之間相互作用的藥劑來降低。RAGE表達的增加與幾種病理狀態(tài)有關(guān)如糖 尿病性血管病變、腎病、視網(wǎng)膜病、神 經(jīng)病、以及其他病癥，包括阿爾茨海默氏(Alzheimer)病和血管壁的免疫/炎性反應(yīng)。RAGE 配體在受包括關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)在內(nèi)的許多炎性病癥影響的組織中產(chǎn)生。淀 粉狀蛋白在組織中的沉積引起對細胞的多種毒性效應(yīng)，其是被稱為淀粉樣病變的疾病的特 征。RAGE與β折疊纖維狀材料結(jié)合，如在β淀粉樣肽、Abeta、支鏈淀粉、血清淀粉樣蛋白 A和朊病毒源肽中所發(fā)現(xiàn)的。RAGE還以升高的水平在具有淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)的組織中表達。 因此，RAGE參與了淀粉樣蛋白病癥。RAGE-淀粉樣蛋白相互作用被認為能導(dǎo)致氧化應(yīng)激，該 氧化應(yīng)激會導(dǎo)致神經(jīng)元退化。多種RAGE配體，尤其是SlOO/鈣粒蛋白、兩性素(HMGBl)家族的那些在發(fā)炎的組 織中產(chǎn)生。這種觀察現(xiàn)象在急性炎癥(如對脂多糖刺激(如在膿毒中)的反應(yīng)中所看到 的)和慢性炎癥(如在各種形式的關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病等中所看到的)中都是 確定的。心血管疾病，且尤其是從動脈粥樣硬化斑塊產(chǎn)生的那些也被認為是具有實質(zhì)的炎 性組分。此類疾病包括閉塞性疾病、血栓性疾病和栓塞性疾病，分別如咽峽炎、脆性斑塊病 癥(fragile plaquedisorder)和腦栓塞。腫瘤細胞還顯示出RAGE配體(尤其是兩性素) 的表達增高，這表明癌癥也是RAGE相關(guān)的病癥。此外，慢性炎癥的氧化作用和其他方面可 能對某些腫瘤的發(fā)生起作用。AGE是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎性疾病的治療靶標(biāo)。因此，可以用本發(fā)明組合物治療的RAGE相關(guān)病癥除了上述自身免疫性疾病之外 還包括淀粉樣病變(例如阿爾茨海默氏病)、克隆氏(Crohn)病、急性炎性疾病(例如， 膿毒)、休克(例如，敗血性休克、出血性休克)、心血管疾病(例如，動脈粥樣硬化、中風(fēng)、 脆性斑塊病癥、咽峽炎和再狹窄)、糖尿病(尤其是糖尿病中的心血管疾病)、糖尿病并發(fā) 癥、朊病毒相關(guān)病癥、癌癥、血管炎和其他血管炎綜合征，如壞死性血管炎(necrotizing vasculitide)、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。下列實例僅為示例目的提供，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實施例下列實施例中，小鼠實驗使用融合蛋白進行，該融合蛋白包含與鉸鏈區(qū)融合的小 鼠RAGE的胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基1-342)、小鼠IgG2a重鏈FC區(qū)域的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。 構(gòu)建體使用GPEx 表達系統(tǒng)在CHO細胞中表達。所用的小鼠RAGE序列在下表中提供。表9 (SEQ ID NO 11)小鼠 RAGE 序列MPAGTAARAff VLVLALffGAV AGGQNITARI GEPLVLSCKG APKKPPQQLE WKLNTGRTEAWKVLSPQGGP WDSVARILPN GSLLLPATGI VDEGTFRCRA TNRRGKEVKS NYRVRVYQIPGKPEIVDPAS ELTASVPNKV GTCVSEGSYP AGTLSffHLDG KLLIPDGKET LVKEETRRHPETGLFTLRSE LTVIPTQGGT HPTFSCSFSL GLPRRRPLNT APIQLRVREP GPPEGIQLLV
EPEGGIVAPG GTVTLTCAIS AQPPPQVHWI KDGAPLPLAP SPVLLLPEVG HEDEGTYSCVATHPSHGPQE SPPVSIRVTE TCDEGPAEGS VGP.srj GTT A LAEPRGPTIK PCPPCKCPAP
NLLGGPSVFI _ FPPKIKDVLM ISLSPIVTCV VVDy_sEDDPD__VQ_I SWFVNNV__EVHTAQTQTHREDYN S T LRV VSALPIQHQD WMS GKΕ FKCK VNN KP.I.S KPK GS VRAPQVYVLPPPEEEMTKKQ VTLTCMVTDF MPEDIYVEffT NNGKTELNYK NTEPVLDSDG SYFMYSKLRVEKKNffVERNS YSCSVVHEGL HNHHTTKSFS RTPGK 其中RAGE信號肽=下劃盲線；RAGE胞外結(jié)構(gòu)域=無下劃線；小鼠 IgG2a鉸鏈區(qū)=雙下劃線;小鼠IgG2aCH2區(qū)域處工.劃.線；和小鼠
IgG2aCH3區(qū)域=下劃曲線。實施例1 在小鼠中本發(fā)明的RAGE融合蛋白對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病的影響。小鼠中鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病是本領(lǐng)域內(nèi)公認的用于糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜 改變的模型(參見 IG, Drel VR, Kumagai AK, Szabo C, Pacher P, Stevens MJ. Early diabetes-induced biochemical changes in the retina comparison of ratand mouse models.Diabetologia. 2006 Oct 49(10) :2525_33·)。本實驗包括5個處理組，每組有15只C57BL/6小鼠1)非糖尿病對照；2)含有糖 尿病對照的小鼠，在研究前連續(xù)5天以45mg/kg的鏈脲佐菌素處理開始誘導(dǎo)糖尿?。?)還 接受10 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的鏈脲佐菌素處理的小鼠，3次注射/周；4)還 接受100 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的鏈脲佐菌素處理的小鼠，3次注射/周；以及 5)還接受300 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的鏈脲佐菌素處理的小鼠，3次注射/周。在研究期間，評估小鼠的體重、血糖、糖血紅蛋白(GHb)、蛋白尿和觸覺敏感性(作 為感覺神經(jīng)功能的量度)。在研究最后將小鼠處死，使用熒光探針評估視網(wǎng)膜血管透性、白 細胞對視網(wǎng)膜毛細血管的粘附和NF- κ B-調(diào)節(jié)的蛋白表達(COX、ICAM、iNOS)。來自歷時兩個月的研究的結(jié)果研究了在C57BL/6J小鼠中RAGE-Ig融合蛋白對糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜生理和代謝 改變的發(fā)展的影響。以3種不同的濃度(10yg、100yg和300yg)腹腔給予融合蛋白，每 周3次。沒有看到任何劑量的藥物對糖尿病小鼠的體重增益或總體健康有不利影響。在非 糖尿病對照、糖尿病對照、糖尿病+10μ gRAGE-Ig融合蛋白、糖尿病+100 μ g RAGE-Ig融合 蛋白和糖尿病+300 μ gRAGE-Ig融合蛋白組中的非禁食血糖水平分別為155士24mg/dl (均 值 士 SD)、358 士 38、417 士 36、376 士 36 和 370 士 55。在短期研究中測量的視網(wǎng)膜病相關(guān)的參數(shù)為(1)白細胞淤滯、(2)視網(wǎng)膜血管對 內(nèi)源性白蛋白的透性、⑶視網(wǎng)膜蛋白的硝化、以及⑷視網(wǎng)膜ICAM和C0X-2的表達。1.白細胞游滯方法在糖尿病2個月時，通過經(jīng)由心臟導(dǎo)管完全灌注PBS從麻醉的動物的脈管 系統(tǒng)去除血液。然后按之前所述用熒光素偶聯(lián)的伴刀豆球蛋白A凝集素(20yg/ml，在PBS 中；Vector Laboratories, Burlingame, CA)灌注動物(參見 Joussen 等人，F(xiàn)ASEB J. 2004 S??；18(12) 1450-2) 0通過熒光顯微鏡使平鋪視網(wǎng)膜成像，對粘附到血管壁的白細胞數(shù)進 行計數(shù)。
結(jié)果在糖尿病2個月的小鼠中顯示出與非糖尿病小鼠相比顯著增加的白細胞淤 滯(P < 0. 05)。白細胞淤滯在用RAGE-Ig融合蛋白處理的任何組織都沒有受到抑制(參見 圖1)。2.血管透性 方法在糖尿病2個月時，將眼睛進行冰凍切片(10 μ m)，在甲醇中固定10分鐘， 在PBS中洗滌4次。將各切片在山羊抗小鼠血清白蛋白(Abcam，Cambridge MA ；AB8940 ； 1 2000稀釋)中孵育2小時。洗滌，然后將切片在FITC標(biāo)記的二抗(AB 6743 ； 1 1000 稀釋)中孵育90分鐘。在熒光顯微鏡下，測定4個視網(wǎng)膜層(內(nèi)網(wǎng)層、內(nèi)核層、外網(wǎng)層、夕卜 核層)中的每層在3個不同位置的平均熒光量。各位置的熒光量是10次隨機測量的平均 值，各視網(wǎng)膜層的熒光量是該層內(nèi)3個不同位置的熒光平均值。結(jié)果在所研究的4個視網(wǎng)膜層的每個中糖尿病都引起非血管性視網(wǎng)膜中熒光強度顯 著增加(即，由于白蛋白泄漏到血管外)。該結(jié)果顯示在圖2中(2A內(nèi)網(wǎng)層、2B內(nèi)核層、2C 外網(wǎng)層、2D外核層)。為了評估內(nèi)核層和外核層中的白蛋白，我們有意地測量了核之間的薄 間距，所以這些數(shù)字可能不如來自網(wǎng)層的那些有力，在網(wǎng)層中沒有核破壞我們的測量。3.視網(wǎng)膜蛋白的硝化方法在糖尿病2個月時，分離視網(wǎng)膜并將其勻漿化。進行斑點印跡，將來自每只 動物的50 μ g蛋白勻漿點印到硝酸纖維素膜上。將膜用牛奶(5%)封閉、洗滌、用抗硝基酪 氨酸(Upstate Biotechnology, Inc. #05-233 ； 1 500 稀釋)免疫染色 2 小時，然后用二 抗(Bio-Rad山羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物；1 1000稀釋)染色1小時。充分洗滌，然后通 過增強化學(xué)發(fā)光法(ECL，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)使通過抗體檢測的 免疫染色顯像。免疫染色依賴性的化學(xué)發(fā)光記錄在膜上，對免疫染色的點的密度進行定量。 結(jié)果表示為非糖尿病對照中檢測的值的百分比。結(jié)果結(jié)果顯示在圖3中。來自糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜勻漿顯示了預(yù)期的蛋白硝化增加。 治療以劑量依賴方式抑制了這種翻譯后修飾。蛋白的硝化被認為是氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激的參數(shù)。4.視網(wǎng)膜ICAM和C0X-2的表達方法分離視網(wǎng)膜并對其進行超聲處理，將上清液用作全視網(wǎng)膜提取物。通 過SDS-PAGE將樣品(50 μ g)分餾，電轉(zhuǎn)染到硝酸纖維素膜上，在含有0. 02 %吐溫20和 5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽中封閉膜。使用ICAM-I抗體(1 200稀釋；Santa Cruz Biotechnology)和C0X-2抗體，然后用二抗1小時。洗滌，然后通過增強化學(xué)發(fā)光法使結(jié)果 可視化。結(jié)果結(jié)果顯示在圖4中，由于ICAM-I在內(nèi)皮細胞上的表達在白細胞向血管壁的粘附 (白細胞淤滯)中起著關(guān)鍵的作用，我們測量了糖尿病和治療對視網(wǎng)膜中ICAM-I表達的影 響。兩個月的糖尿病確實引起了視網(wǎng)膜ICAM-I表達的顯著增加。RAGE-Ig融合蛋白的給藥 導(dǎo)致了 ICAM表達劑量依賴性的降低，最高劑量顯著抑制了這種表達。與C0X-2分子量一致的免疫染色條帶的表達在糖尿病中沒有增加，在得到治療的動物中也沒有改變(未顯示)。在RAGE-Ig融合蛋白作用的這種短期研究中選擇了終點用途，因為發(fā)現(xiàn)所有都與 早期(退行)糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)展有關(guān)，即，已發(fā)現(xiàn)抑制糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜毛細血管 退化的各種治療也抑制這些缺陷。RAGE的抑制并不抑制與視網(wǎng)膜中血管透性和硝化應(yīng)激相關(guān)的異常現(xiàn)象。硝化應(yīng)激 還被認為是氧化應(yīng)激的標(biāo)記。然而，RAGE抑制劑不抑制與白細胞淤滯相關(guān)的異?，F(xiàn)象。實施例2 在小鼠中本發(fā)明的RAGE融合蛋白對長期鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病的影響。小鼠中鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病是本領(lǐng)域內(nèi)公認的用于糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜 改變的模型(參見 IG, Drel VR, Kumagai AK, Szabo C, Pacher P, StevensMJ)。Early diabetes-induced biochemical changes in the retina comparison ofrat and mouse models.Diabetologia. 2006 Oct 49(10) :2525_33·)本長期實驗包括5個處理組，每組有25只C57BL/6小鼠1)非糖尿病對照；2)含 有糖尿病對照的小鼠，研究前連續(xù)5天以45mg/kg的鏈脲佐菌素處理開始誘導(dǎo)糖尿病；3) 還接受10 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的鏈脲佐菌素處理的小鼠，3次注射/周；4) 還接受100 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的鏈脲佐菌素處理的小鼠，3次注射/周；以 及5)還接受300 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的鏈脲佐菌素處理的小鼠，3次注射/ 周。在研究期間，評估小鼠的體重、血糖、糖血紅蛋白(GHb)、蛋白尿和觸覺敏感性(作 為感覺神經(jīng)功能的量度)。在研究最后將小鼠處死，定量評估視網(wǎng)膜中的組織病理和神經(jīng)退 行性變。在長期研究中測量的視網(wǎng)膜病相關(guān)的參數(shù)為(1)無細胞毛細血管、(2)周影細胞 和(3)神經(jīng)節(jié)細胞。還在長期研究中測量了作為外周神經(jīng)病變標(biāo)記的爪子對輕觸的敏感 性。糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織病理在糖尿病10個月后，將眼睛固定在福爾馬林中，從每只動物中分離一個視網(wǎng)膜， 在流動的自來水中洗滌過夜，在粗制胰島素溶液中消化2小時，如我們之前所報道的那樣。 通過用單根頭發(fā)制成的“刷子”輕輕移去神經(jīng)細胞分離視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)。當(dāng)神經(jīng)細胞全部 清除后，將所分離的脈管系統(tǒng)展放在顯微鏡載玻片上，干燥過夜，用蘇木精和高碘酸-希夫 (Schiff)染色，脫水并蓋上蓋玻片。退行性(無細胞)毛細血管在對應(yīng)于遮蔽形式的中間 視網(wǎng)膜(200X放大倍率)的6-7個視野里定量。無細胞毛細血管鑒定為在沿其長度上任 何地方都沒有核的毛細血管大小的血管，以每平方毫米視網(wǎng)膜面積的值報告。周影細胞由 周細胞消失的毛細血管基膜中伸出的“腫塊”的普遍性來估計。至少檢測了遮蔽形式的中間 視網(wǎng)膜(400 X放大倍率)的5個視野內(nèi)的1，000個毛細血管細胞(內(nèi)皮細胞和周細胞)。 排除任何已經(jīng)是無細胞血管的影細胞。為了研究糖尿病對視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變的影響，對神經(jīng)節(jié)細胞層的細胞進行計 數(shù)。將經(jīng)福爾馬林固定的眼睛包埋在石蠟中，通過視網(wǎng)膜穿過視神經(jīng)縱向切片，用蘇木 精-伊紅染色。神經(jīng)節(jié)細胞層中的細胞數(shù)在視神經(jīng)兩 側(cè)的兩個區(qū)域內(nèi)(中間視網(wǎng)膜和臨近 視神經(jīng)的后部視網(wǎng)膜)進行計數(shù)。對視神經(jīng)兩側(cè)的相當(dāng)?shù)膮^(qū)域取平均值，表示為每單位長度的數(shù)。結(jié)果如根據(jù)前面的工作所預(yù)期的，長期糖尿病導(dǎo)致了視網(wǎng)膜中退行性無細胞毛 細血管數(shù)顯著增加(圖5A)。RAGE-Ig融合蛋白的所有劑量都顯著地抑制這種毛細血管退 行，而對高血糖的嚴重程度沒有任何影響。糖尿病還傾向于增加周細胞退化(周影細胞)， 但是其結(jié)果沒有達到統(tǒng)計學(xué)顯著性的程度(圖5B)。我們之前發(fā)現(xiàn)在糖尿病C57BL/6小鼠 中檢測周細胞丟失比糖尿病大鼠或更大的物種中要難得多，我們現(xiàn)在認為它在此模型中是 血管疾病的不可靠參數(shù)。可能結(jié)果在對照糖尿病中沒有檢測到顯著的周細胞丟失，我們在 這些小鼠中沒有檢測到RAGE-Ig融合蛋白對周細胞丟失的任何影響。在這些C57BI/6小鼠中糖尿病并不誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層中細胞數(shù)目的減少 (即，神經(jīng)退行性變)。此結(jié)果與此小鼠模型之前的研究一致。在不存在糖尿病對視網(wǎng)膜神 經(jīng)退行性變影響的情況下，我們不能估計抑制劑是否會對神經(jīng)退行性變有影響。對輕觸的敏感性(外周神經(jīng)病的標(biāo)記)患有糖尿病性神經(jīng)病的患者可能表現(xiàn)出多種異常的感覺，包括自發(fā)疼痛，輕觸引 起的疼痛以及感覺過敏。不斷增加的數(shù)據(jù)表明糖尿病嚙齒動物會再現(xiàn)這種感覺過敏并發(fā)展 觸覺異常痛敏(tactile allodynia)。在嚙齒動物中，將這測量成爪子觸覺反應(yīng)閾值。方法將小鼠(糖尿病8個月)轉(zhuǎn)移到鋼絲網(wǎng)底的測試籠中，使其適應(yīng)10至15分 鐘。使用測痛絲(Von Frey filaments)測定縮足反射的50%機械縮足反射閾值。將一系 列硬度呈對數(shù)增加的細絲(以屈曲重為0.6g的那根開始)以能引起細絲屈曲的壓力順次 施加到右后爪的腳底面上。將爪子抬起記錄為陽性反應(yīng)，選擇較輕的細絲用于下一個測量。 如果5秒后沒有反應(yīng)，則在之后選擇接下來最重的細絲使用。繼續(xù)此方法，直到在最初的行 為改變后進行了 4次測量或直到發(fā)生了 5次連續(xù)的陰性(6g)或4次連續(xù)陽性(0.4g)反應(yīng)。 使用所得的陽性和陰性評分順序計算50%縮足反應(yīng)閾值。結(jié)果糖尿病顯著增加了爪子對輕觸的敏感性，這表明糖尿病動物與非糖尿病動 物相比需要較低量的壓力來縮回它們的爪子(圖6)。這種糖尿病誘導(dǎo)的缺陷能被各劑量的 sRAGE-Ig融合蛋白顯著抑制。視網(wǎng)膜病使用RAGE-Ig融合蛋白的研究采用2種持續(xù)時間的糖尿病進行。(1) 長期(10個月)研究以評估治療對小鼠中發(fā)展的糖尿病性視網(wǎng)膜病的長期組織病理的影 響；以及(2) 2-3個月的研究以評估可能對長期組織病理產(chǎn)生影響的治療的生理和分子效 應(yīng)。選擇了關(guān)于RAGE-Ig融合蛋白影響的生理和分子終點研究是因為在其他研究中發(fā)現(xiàn)它 們均與早期(退行)糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)展有關(guān)(很可能有原因地相關(guān))。所有三個劑 量的治療均清楚且顯著地抑制糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)退化。同樣，所有三個劑量的 藥劑似乎也都抑制這些小鼠中糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜透性增加。這些結(jié)果具有重要的臨床意 義，因為早期(非增殖階段)糖尿病性視網(wǎng)膜病仍然是基于血管病理(血管阻塞和退化以 及透性增加)定義的。治療對來自糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜中測量的分子和生理終點的影響是混合的。RAGE 的抑制確實抑制與硝化應(yīng)激相關(guān)的異?，F(xiàn)象，硝化應(yīng)激是視網(wǎng)膜中氧化應(yīng)激的標(biāo)記。然而， RAGE抑制劑不抑制與白細胞淤滯相關(guān)的異?，F(xiàn)象。 所述治療缺乏對白細胞淤滯的影響是 令人吃驚的，因為另一研究小組最近報導(dǎo)了他們的sRAGE確實能抑制糖尿病中白細胞淤滯 的增加。然而我們使用RAGE-Ig融合蛋白開始研究時產(chǎn)生的證據(jù)(Diabetes 57:1387-93，2008)表明藥物治療對糖尿病中視網(wǎng)膜白細胞淤滯的效應(yīng)并不預(yù)示所述治療對糖尿病中視 網(wǎng)膜毛細血管退化的效應(yīng)。因此，所述治療缺乏對視網(wǎng)膜白細胞淤滯的效應(yīng)也決不會削弱 所觀察到的藥物效應(yīng)的意義。令人驚奇地，藥物對糖尿病動物視網(wǎng)膜中ICAM-I的表達和蛋白的硝化的影響似 乎具有劑量效應(yīng)，然而此劑量效應(yīng)對于視網(wǎng)膜毛細血管透性和退化則不明顯。這似乎表明 ICAM和硝化均不參與糖尿病中視網(wǎng)膜血管的缺陷，盡管我們使用ICAM-I敲除動物的數(shù)據(jù)與此結(jié)論矛盾。很清楚的是所述藥物確實到達了視網(wǎng)膜，確實施加了生物效應(yīng)，并且確實顯示了 至少抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病的早期血管病變的顯著藥物能力。感覺神經(jīng)病其他人員已經(jīng)假定晚期糖化終末產(chǎn)物(AGE)和這些AGE與RAGE的相 互作用能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，上調(diào)神經(jīng)中的NF-kB和各種NF-kB介導(dǎo)的促炎基因，并促進神經(jīng)功 能障礙，包括改變的痛覺。本發(fā)明的數(shù)據(jù)與RAGE介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)促進糖尿病性神經(jīng)病至少 一些方面的發(fā)展的證據(jù)相一致，并且提供了 sRAGE-Ig融合蛋白在長期研究中抑制此過程 的證據(jù)。實施例3 使用II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型的RAGE-Ig融合蛋白評定用II型膠原免疫敏感性小鼠品系，II型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的主要組分，其誘導(dǎo)進行 性炎性關(guān)節(jié)炎(Wooley 等人 Journal of Experimental Medicine 1981;154:688-700)。 膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)在臨床上的表征為紅斑和水腫，受影響的爪子寬度增加通常為 100%。已經(jīng)開發(fā)出一種臨床評分指數(shù)來評估關(guān)節(jié)變形和脊椎炎的疾病進展(Wooley， Methods In Enzymology 1988;162:361-373)。受影響的關(guān)節(jié)的組織病理表現(xiàn)出滑膜炎、 關(guān)節(jié)翳形成、以及軟骨和骨質(zhì)糜爛，它們還可以用指數(shù)來表示。免疫實驗室的結(jié)果包括高的 II型膠原抗體水平和高丙球蛋白血癥?，F(xiàn)在已經(jīng)很好地建立了此模型以測試關(guān)節(jié)疾病的 免疫治療方法(Staines 等人 British Journal of Rheumatology 1994 ；33 (9) :798_807)， 并且已經(jīng)將其成功地用于生物和藥理學(xué)藥劑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的研究(Wooley等 入Arthritis Rheum 1993 ；36 1305-1314 ；Wooley^AJournal oflmmunology 1993 ；151 6602-6607)。gAGE受體的拮抗被認為是RA的潛在治療靶標(biāo)。在患有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的小 鼠中阻斷gAGE會導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的臨床和組織學(xué)跡象降低，疾病改善與關(guān)節(jié)炎爪子組織中 TNFa、IL-6和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-13水平降低有關(guān)(Hofmann等人。Genes Immun 2002 ；3 (3) :123_135)。這表明膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎對RAGE靶向的治療是敏感的。此試驗將評估在用II型膠原免疫時開始給予的三個劑量的RAGE-Ig融合蛋白對 CIA的影響。實驗設(shè)計顯示在圖7中。自Jackson實驗室獲得40只8-10周齡的DBA/lLacJ小鼠，實驗之前讓它們在實驗 室中適應(yīng)至少10天。在實驗開始時所有動物重量均大于16克。將小鼠分在以下4個處理 組之一中1)每天腹腔注射100 μ 1無菌PBS ；2)每天腹腔注射100 μ 1含有10 μ g RAGE-Ig 融合蛋白的無菌PBS ；3)每天腹腔注射100 μ 1含有100 μ g RAGE-Ig融合蛋白的無菌PBS ； 和4)每天腹腔注射100 μ 1含有300 μ g RAGE-Ig融合蛋白的無菌PBS。初次給藥3天后，在所有小鼠尾巴基部皮內(nèi)注射在弗氏(Freimd)完全佐劑(FCA)中的 οομ g牛II型膠原。通過每天檢測疾病的發(fā)作(其被記錄下來)來監(jiān)控小鼠。每周 稱重小鼠，并記錄總體健康狀況。對受關(guān)節(jié)炎影響的動物進行臨床估計，每周5次直到免疫 后10周，爪子測量每周進行3次。在免疫后10周沒有關(guān)節(jié)炎體癥的小鼠被認為是疾病陰 性的。結(jié)果總體健康和毒性在試驗期間沒有急性中毒事件發(fā)生，實驗持續(xù)期間所有動物都存 活。治療耐受良好，沒有觀察到不利的體癥，如毛發(fā)纏結(jié)或刺激。小鼠重量(圖8)表明在 試驗過程中重量輕微改變，其通常由于各動物對應(yīng)于疾病發(fā)作的短暫重量損失。這些變化 在組間都沒有達到統(tǒng)計學(xué)顯著的程度。關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和發(fā)作試驗中膠原關(guān)節(jié)炎的最終發(fā)病率顯示在圖9中。對照小組 達到100%發(fā)作，這在經(jīng)典的膠原關(guān)節(jié)炎模型中是不常見的，經(jīng)典的膠原關(guān)節(jié)炎模型中通常 發(fā)病率介于80 % -100 %。用10 μ g/天RAGE處理小鼠達到了 80 %的發(fā)病率，發(fā)病率沒有顯 著降低。用IOOyg/天RAGE處理的小鼠顯示出60%的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率，該發(fā)病率顯著低于對 照組(ρ < 0. 05)。令人驚奇的是用300 μ gRAGE處理的小鼠中關(guān)節(jié)炎發(fā)病率為100%，因此 與對照發(fā)病率類似。疾病發(fā)作的天數(shù)的平均值(和SEM)顯示在圖10中。疾病發(fā)作在對照組中是典型 的，第一次出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的平均天數(shù)是38. 6。用IOyg或IOOyg RAGE處理的小鼠中疾病發(fā) 作表面上延遲到42. 5，其并沒有達到統(tǒng)計學(xué)顯著的程度。然而，疾病發(fā)作在用300yg RAGE 處理的小鼠中則顯著延遲(p<0. 05)。因此，盡管高劑量的小鼠不顯示疾病發(fā)病率的降低， 但是臨床上明顯的關(guān)節(jié)炎發(fā)展的時間則明顯增加。通過RAGE處理對疾病發(fā)作的調(diào)控可以容易地通過疾病發(fā)病率與時間的曲線來估 計(圖11)。對照組中觀察到了典型的CIA的快速疾病發(fā)作特征，用IOyg或IOOyg RAGE 處理的小鼠的結(jié)果是疾病發(fā)作延遲，關(guān)節(jié)炎最終發(fā)病率降低。約8周后，用300yg RAGE處 理的小鼠以類似的模式發(fā)展疾病，但是一系列晚期的關(guān)節(jié)炎動物導(dǎo)致疾病發(fā)病率高但疾病 發(fā)作延緩。疾病嚴重程度和進展處理動物和對照動物中累積關(guān)節(jié)評分的分析表現(xiàn)出RAGE治 療對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎嚴重程度的顯著影響(圖12)。對照小鼠發(fā)展為典型的慢性進行 性疾病，累積的關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著增加。相反，用任何劑量的RAGE處理的小鼠都顯示出顯著 的關(guān)節(jié)炎評分降低。自免疫后43天開始對照和處理組之間的差異達到了統(tǒng)計學(xué)顯著(ρ <0. 001)的高水平，而且這種差異在整個試驗中都保持著。盡管IOOyg/天的RAGE治療 取得最低的關(guān)節(jié)炎累積評分，但是在RAGE組之間的關(guān)節(jié)炎評分沒有顯著差異，這表明取得 了閾值”效應(yīng)，而不是經(jīng)典的劑量依賴效應(yīng)。對RAGE治療對關(guān)節(jié)炎爪子數(shù)的影響的分析(圖13)顯示出對疾病進展的顯著影 響。再次，從43天開始觀察到了對所涉及的爪子數(shù)目的顯著影響。顯著性水平在ρ < 0. 001 至ρ < 0. 025內(nèi)變化，這可能反映了 RAGE對疾病嚴重程度的影響比對關(guān)節(jié)炎進展的影響更 為顯著；然而，所涉及的爪子的最大數(shù)量(40)則比最大的累積疾病評分(120)更為有限。 同樣，在RAGE處理組之間沒有顯著變化，盡管100 μ g RAGE組顯示出最高水平的關(guān)節(jié)炎延遲。結(jié)果表明RAGE蛋白的給藥在使用預(yù)防性方案給予時對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生了明顯的影響。任何劑量的RAGE注射都沒有明顯的毒性作用，并且處理似乎是良好耐受的。在每天接受IOOyg的小鼠中總體疾病發(fā)病率顯著降低，在用300 μ g/天處理的小鼠中觀察 到疾病發(fā)作的延遲。然而，臨床活性最明顯的指征是在疾病評分和關(guān)節(jié)炎爪子計數(shù)的降低 中所觀察到的，其中自免疫后43天開始檢測到了 RAGE處理的小鼠與對照動物之間的明顯 區(qū)別。在此方面，對照小鼠經(jīng)受了典型的重度關(guān)節(jié)炎進展，而所有劑量的RAGE處理都會延 遲疾病進展。組織病理學(xué)評估在完成臨床評估研究時取出所有小鼠的四肢，儲存在福爾馬林中 性緩沖溶液中。在10%甲酸中將關(guān)節(jié)脫鈣18天，脫水，包埋在石蠟塊中。沿縱軸切片，固 定，并用蘇木精和伊紅或甲苯胺藍染色。將樣本切至約中線，然后固定徑向中心的樣品進行 評定。這使得能夠進行一致的形貌評定。固定5至10個樣品(通常為每個載玻片4至6 個樣品)。染色后，用蓋玻片永久性地粘合載玻片。以盲態(tài)方式評定至少每個樣本的3個獨 立切片，評定者不知道組的分配。在前肢，對所有肘、腕和掌關(guān)節(jié)進行評分，而所有的膝、踝、 跖關(guān)節(jié)則用后瓜評分。不評價趾，因為切片步驟除去了大部分的PIP關(guān)節(jié)。對載玻片進行 滑膜炎、關(guān)節(jié)翳形成、邊緣糜爛和結(jié)構(gòu)改變(大部分是半脫位)和破壞的存在的評定。然后 將基于這些收集點的總體評分賦值給各切片。評分系統(tǒng)基于如下滑膜炎通過滑膜厚度來判斷，如下評分小于3個細胞厚為0 ;3至5個細胞厚為 1 ;6至10個細胞厚為2 ； 10-20個細胞厚為3 ；20-30個細胞厚為4。關(guān)節(jié)翳形成如下評分無關(guān)節(jié)翳為0 ；存在微絨毛為1 ；清楚的關(guān)節(jié)翳附著為2 ；明 顯的關(guān)節(jié)翳附著為3 ；關(guān)節(jié)空間被關(guān)節(jié)翳填充為4。邊緣糜爛如下評分無可見的糜爛為0 ；囊連接區(qū)域內(nèi)微小的凹痕為1 ；清楚的軟 骨糜爛為2 ；糜爛延伸到軟骨下骨為3 ；骨和軟骨嚴重糜爛為4。結(jié)構(gòu)改變?nèi)缦略u分正常關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)為0 ；水腫性改變?yōu)? ；關(guān)節(jié)面輕微半脫位為2 ； 關(guān)節(jié)面嚴重半脫位為3 ；完全纖維化和膠原橋連為4?？傮w評分反映如下經(jīng)典的正常關(guān)節(jié)外觀為0 ；微小變化為1，與緩解期一致，可為 臨床正常；確定的炎性關(guān)節(jié)炎為2 ；嚴重的炎性糜爛性疾病為3 ；損壞的糜爛性關(guān)節(jié)炎為4。軟骨和骨基質(zhì)降解使用甲苯胺藍組織化學(xué)染色對連續(xù)切片進行軟骨基質(zhì)組分染 色。評定了甲苯胺藍切片的蛋白聚糖丟失。將關(guān)節(jié)面的染色與生長板染色相比較，如下評 分無蛋白聚糖丟失為0，正常甲苯胺藍染色；微量蛋白聚糖丟失為1，表面軟骨染色有些丟 失；中度蛋白聚糖丟失為2，表面軟骨有弱染色；顯著的蛋白聚糖丟失為3，表面軟骨無甲苯 胺藍染色；嚴重蛋白聚糖丟失為4，軟骨深處無甲苯胺藍染色。結(jié)果膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的組織病理學(xué)結(jié)果。評估切片的疾病炎性參數(shù)和糜爛參數(shù)。關(guān) 節(jié)炎的外觀(圖14)表明了在對照(PBS處理)組中此時間點有典型的炎性糜爛性病理學(xué)， 具有滑膜肥大和滑膜增生的典型關(guān)節(jié)炎特征，具有顯著的關(guān)節(jié)翳附著和邊緣糜爛。10 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白的處理(圖14B)導(dǎo)致了炎性參數(shù)和糜爛性參數(shù)的適 度改變，糜爛和受損軟骨表面的外觀總體改善。用100 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白的處理(圖 14C)導(dǎo)致關(guān)節(jié)翳形成和糜爛與對照相比較減少，并且總體差異相當(dāng)明顯。然而，300μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白的給藥(圖14D)則導(dǎo)致了比鹽水對照中所看到的病理狀況嚴重程度似乎 略低的關(guān)節(jié)炎，但是還相當(dāng)嚴重，具有滑膜肥大和滑膜增生，具有顯著的關(guān)節(jié)翳附著和邊緣糜爛。炎性評分的分析(圖15)表明所有劑量的RAGE-Ig融合蛋白處理的小鼠與對照 (鹽水處理)動物相比炎癥減少。然而，僅在100 μ g/ml組中滑膜炎顯著減少P < 0. 05)，關(guān) 節(jié)翳形成顯示出與評分中類似的減少(P < 0. 03)。使用10 μ g/ml或300 μ g/ml的RAGE-Ig 融合蛋白觀察到的炎性疾病參數(shù)的減少沒有達到統(tǒng)計學(xué)顯著的程度。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的糜爛性特征(關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中的糜爛和改變)改變的評估顯示了 類似的影響模式。觀察到用100 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白處理的組與對照(鹽水處理)的 動物相比關(guān)節(jié)糜爛顯著減少(ρ <0.01) 16)，而在用10 μ g/ml和300 μ g/ml RAGE-Ig 融合蛋白處理的小鼠中觀察到的減少則沒有達到顯著程度。組織病理學(xué)參數(shù)與總體組織學(xué)關(guān)節(jié)炎評分的組合(圖17)反映了個體病理參數(shù)的 結(jié)果。對照(鹽水)處理的動物與100 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白處理的小鼠之間觀察到了 的顯著的差異(P < 0. 02)，10 μ g/ml處理的小鼠中總體評分剛達到顯著程度(ρ = 0. 05)， 而使用300 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白則沒有觀察到總體疾病評分的顯著減少。檢測甲苯胺藍染色的切片以測定RAGE-Ig融合蛋白是否對關(guān)節(jié)炎性關(guān)節(jié)的基質(zhì) 蛋白丟失有影響。數(shù)據(jù)(顯示在圖18和19中)表明RAGE-Ig融合蛋白確實能防止蛋白聚 糖丟失，但是這種影響僅在100 μ g/ml劑量下是統(tǒng)計學(xué)顯著的(ρ <0.05)。PBS對照組顯 示了嚴重的軟骨基質(zhì)(蛋白聚糖和膠原)丟失，在用300μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白處理的 小鼠中看到了在近側(cè)關(guān)節(jié)面染色的顯著丟失。相反，給予10 μ g/ml或100 μ g/ml RAGE-Ig 融合蛋白則很好地保存了基質(zhì)蛋白。組織學(xué)結(jié)果證明了表明下列現(xiàn)象的臨床數(shù)據(jù)用RAGE-Ig融合蛋白處理膠原誘導(dǎo) 的關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致了對疾病發(fā)病率和嚴重程度的影響。組織學(xué)參數(shù)在100 μ g/ml處理的小鼠中 達到了統(tǒng)計學(xué)上顯著的高水平，并且在用10μ g/ml處理的小鼠中總體的病理情況達到了 統(tǒng)計學(xué)顯著的程度。根據(jù)評定，100 μ g/ml的RAGE-Ig融合蛋白良好保持了關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，并且 所有關(guān)節(jié)炎參數(shù)顯著降低?？傮w印象是RAGE-Ig融合蛋白阻斷了關(guān)節(jié)炎的糜爛期，因為炎 癥改變程度所受的影響比次級疾病參數(shù)要小。用300yg/ml RAGE-Ig融合蛋白處理的小 鼠沒有受到與低劑量相同程度的保護，再次得出了對此水平蛋白給藥的抑制性反應(yīng)的可能 性?？傮w上，這些結(jié)果與研究中進行的臨床觀察一致，證明了 RAGE-Ig融合蛋白可以起到抗 關(guān)節(jié)炎的作用。盡管本發(fā)明參考其具體實施方式
進行了詳細描述，但是對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 顯而易見的是可以在不背離本文的精神和范圍的情況下對本文進行各種修改和變型，這些 修改和變型可以在隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)進行。本 文所有的專利和公開物都以引用方式 并入本文，引用的程度如同各單獨的公開物全文特別且單獨地以引用方式并入一般。
權(quán)利要求
一種分離的融合蛋白，其包含至少一種多肽，所述多肽包括(a)第一氨基酸序列，其與晚期糖化終末產(chǎn)物(RAGE)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的哺乳動物受體至少95％相同，所述第一氨基酸序列能夠結(jié)合RAGE配體；和(b)第二氨基酸序列，其與人重鏈免疫球蛋白IgG4恒定結(jié)構(gòu)域或其片段至少95％相同；其中所述第一氨基酸序列包含至少一個相對于野生型RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其中所述哺乳動物RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來 自人RAGE。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其中所述第一氨基酸序列包含SEQID NO 6的氨基酸1-344。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其中所述第一氨基酸序列包含選自下列的 氨基酸序列SEQ ID NO 6的氨基酸1-99、氨基酸24-99、氨基酸1-208、氨基酸24-208、氨 基酸1-301、氨基酸24-301、氨基酸1-344、或氨基酸24-344。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含選自SEQID NO :2、 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQIDN0:6的氨 基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列由SEQID NO :6組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，還包含在所述第一氨基酸序列和所述第二 氨基酸序列之間的連接子。
9.一種編碼融合蛋白的分離的核酸，所述融合蛋白包含至少一種多肽，所述多肽包括(a)第一氨基酸序列，其與晚期糖化終末產(chǎn)物(RAGE)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的哺乳動物受體 至少95%相同，所述第一氨基酸序列能夠結(jié)合RAGE配體；和(b)第二氨基酸序列，其與人重鏈免疫球蛋白IgG4恒定結(jié)構(gòu)域或其片段至少95%相 同，其中所述第一氨基酸序列包含至少一個相對于野生型RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸，其中所述哺乳動物RAGE配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自 人 RAGE。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸，其中所述第一氨基酸序列包含SEQID N0:6的 氨基酸1-344。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸，其中所述第一氨基酸序列包含選自下列的氨 基酸序列SEQ ID NO 6的氨基酸1-99、氨基酸24-99、氨基酸1-208、氨基酸24-208、氨基 酸1-301、氨基酸24-301、氨基酸1-344、或氨基酸24-344。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸，其中所述融合蛋白包含選自SEQID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO :6。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸，其中所述融合蛋白具有由SEQIDN0:6組成的 氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的核酸，還包含編碼連接子的序列，所述連接子在所述 第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列之間。
17.重組宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸。
18.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白和藥物上可接受的載體。
19.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的融合蛋白和藥物上可接受的載體。
20.一種治療AGE介導(dǎo)的疾病的方法，其包括給予患有AGE介導(dǎo)的疾病的哺乳動物治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物組合 物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述疾病為糖尿病性腎病。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述疾病為自身免疫疾病。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述疾病選自皮炎、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化、 葡萄膜炎性眼炎、自身免疫性肺炎、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性炎眼、系統(tǒng)性紅斑狼 瘡、胰島素耐受、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和硬皮病。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述融合蛋白包含SEQID NO :6的氨基酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述融合蛋白的氨基酸序列由SEQID NO :6組成。
27.一種降低有需要的哺乳動物中RAGE結(jié)合的配體水平的方法，其包括給予哺乳動物 RAGE配體降低的量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供新的治療法和治療與晚期糖化終末產(chǎn)物受體(RAGE)活化相關(guān)的疾病的方法。
文檔編號C07K14/00GK101842382SQ200880102246
公開日2010年9月22日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月14日
發(fā)明者D·M·希爾伯特, G·T·布萊克 申請人:卡拉狄加制藥公司