IgD-Fc-Ig融合蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種分離純化的、具有生物活性的I曲-Fc-Ig融合蛋白。
【背景技術】
[0002] 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig)是指具有抗體活性或化學結構與抗體相似的 球蛋白統(tǒng)稱。D型免疫球蛋白（I曲）包括分泌型si曲和膜結合型ml曲。人類I曲是由兩 條相同的輕鏈和重鏈組成的單體，包括可變區(qū)（V)和恒定區(qū)（C)，與IgG結構相似（WuY， LakshmiTammaSMetal.CellImmunol1999;192:194-202.)。人類的I曲有Ξ個Cδ的 結構域，Cδ1和Cδ2的結構與其他免疫球蛋白同種型的C結構域相似，Cδ3為I曲獨特的 結構域，與其他免疫球蛋白不同，缺少用來誘導折疊形成多膚骨架的屯個脯氨酸殘基，有兩 個N-連接的糖基化位點。研究表明，運些結構特征和導致的分子構型造就了I曲特殊的生 物學功能（QienKandCeruttiA.ImmunolRev；237：160-79.)〇
[0003]I曲存在于90%W上的成熟B淋己細胞表面，作為B淋己細胞表面的重要受體，近 年來在識別抗原、激發(fā)B淋己細胞和調節(jié)免疫反應上的重要作用受到越來越多的關注。研 究表明，ml曲和si曲與B淋己細胞外周清除有關，干擾免疫耐受的誘導，提出B淋己細胞 表面分子的有限交聯(lián)為淋己細胞活化的一個途徑，而廣泛交聯(lián)可W導致克隆清除。也有研 究表明，抗免疫球蛋白的抗體與成熟B淋己細胞表面的膜免疫球蛋白交聯(lián)，可導致B淋己細 胞周期停滯于G1期，進而發(fā)生細胞調亡。因此，抗Ig抗體被廣泛應用于研究Ig受體在B 淋己細胞活化及活化后調亡中的作用，在清除自身反應性B淋己細胞及治療相關疾病方面 也具有很大的潛在應用價值。許多自身免疫病患者血漿I曲增加，包括RA、系統(tǒng)性紅斑狼 瘡（systemiclupuserythematosus，SLE)等（RostenbergIandPenalozaR.ClinChim Acta1978 ;85 :319-21.);且健康人群中發(fā)現(xiàn)的成熟B淋己細胞類別轉換為I曲具有高度 自身反應性化oelschK，ZhengNYetal.JClinInvest2007;117:1558-65.);在許多類 風濕病患者中檢測到抗I曲自身抗體濃度的增加（SwensonCD,化erniackEPetal.Eur JImmunol1996 ;26 ::340-4.)。
[0004] 與I曲結合的膜受體即I曲受體（I曲receotor，I曲時，運一受體可W結合 分泌型的和膜型的I曲，包括I曲特異性的抗原和抗-δ抗體，人類I曲R分子量約為 70kDa(LakshmiTammaSM,WuYetal.CellImmunol2001 ;207 :110-7.)。I曲發(fā)揮作用 需與其唯一的受體I曲R結合，I曲結合表達在Τ淋己細胞上的I曲R，從而介導Τ淋己細胞 的活化及Τ、Β淋己細胞的相互作用。Τ淋己細胞表面存在I曲R(化iraiA，AokiIetal.J Immunol1994 ; 153 :1889-94.)，人類的CD4巧淋己細胞和CDS巧淋己細胞都表達I曲R，小 鼠體內只有CD4巧淋己細胞有表達，且兩種受體的特異性不同。I曲R與I曲結合導致可T 淋己細胞的活化，I曲R巧淋己細胞能夠增加B淋己細胞對抗原的應答能力。I曲R可能是同 種T-B淋己細胞相互作用的雙向調節(jié)信號，加強B淋己細胞產生抗體的能力。動物實驗研 究發(fā)現(xiàn)，細胞因子如IL-2、IL-4和IFN-丫，T淋己細胞促分裂劑和激活物如外源性凝集素、 己豆油醋、抗CD2和抗CD3抗體、脫氨表雄酬等可誘導I曲R的表達，I曲R在體內受免疫的 調節(jié)（XakshmiTammaSM,WuYetal.CellImmunol2001 ;207 :110-7.)。
[0005] 抗I曲抗體的研究顯示其有治療小鼠膠原性關節(jié)炎（collagen-in化ced art虹itis，CIA)的作用。也有抑制淋己瘤細胞株惡性增殖的效應。早期研究結果認為 抗I曲抗體與自身抗原的結合對自身免疫病有預防效應，可W導致對抗原的免疫耐受 (Finkelman抑.JExpMed1995 :182:279-82.)。動物實驗發(fā)現(xiàn)抗I曲抗體有治療效果，抗 I曲抗體清除成熟B淋己細胞的療效與抗BlyS抗體、抗CD22抗體和抗CD20抗體的療效相似 (MarinoE，VillanuevaJetal.Di油etes2009;58:1568-77.)，但有其突出的優(yōu)點：與運 些泛B淋己細胞清除治療缺乏特異性和調節(jié)性B淋己細胞也被清除相比，抗I曲抗體僅清 除成熟B淋己細胞，不影響B(tài)淋己細胞對T淋己細胞依賴性和非依賴性的抗原免疫，也不影 響宿主的一般B、T淋己細胞反應，運一特性提示抗I曲抗體能成為一項長期治療措施的可 能（FiorinaP，VerganiAetal.Di油etes2008;57:3013-24.);抗I曲抗體在B淋己細 胞中直接下調化yS信號通路選擇性的清除自身反應性B淋己細胞也是一項有效的策略；除 此之外，抗I曲抗體治療選擇性的提高調節(jié)性B和T淋己細胞誘導自身免疫病的免疫耐受 (MatsushitaTandTedderTF.ExpertRevNeurother2009;9:309-12.);且抗I曲抗體 對調節(jié)Th2細胞亞群偏移及適應性和先天性免疫平衡有更多的優(yōu)勢。成熟的I曲+B淋己細 胞作為人類自身免疫病自身反應性B淋己細胞的潛在來源和泛B淋己細胞清除治療后疾病 復發(fā)的預測因子，預示它們在疾病中扮演十分重要角色（FillatreauS，GrayDetal.化t RevImmunol2008;8:391-7.)。實驗也發(fā)現(xiàn)抗I曲抗體作為免疫調節(jié)物同樣能夠調節(jié)人、 鼠先天和適應性細胞因子反應。由于成熟I曲+B淋己細胞亞型在RA中的突出表現(xiàn)，可能成 為一個理想的治療祀點。循環(huán)中I曲量很少，不會被抗I曲抗體中和，也提示運一治療的安 全性。故利用I曲-Fc-Ig融合蛋白阻斷I曲和I曲R通路，可能起到良好的自身免疫病和淋 己瘤、淋己細胞白血病的治療效果。
[0006] 大腸桿菌表達外源基因的原理及方法已發(fā)表。請見例證：U.S.化t.No.6, 583, 268 ; U.S.化b.Nos.US2003/070242;US2003/0199676;US2004/0265298;US2005/0227920; PCT化b.Nos.WO03/039491 ;W0 2004/094:344 ;W0 01/55174 和WO2005/05830。
[0007] 運些參考資料中所披露的方法中包括自裂菌液上清中收集蛋白及抑從高緩慢的 降低到生理水平的蛋白復性等方法。
[0008] 在此引用的所有專利、專利申請和出版物均全文引入作為參考。需要指出的是， 本發(fā)明背景部分中參考某一出版物，并不表示承認所述出版物構成了本發(fā)明所指的現(xiàn)有技 術。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種分離純化的、具有生物活性的I曲-Fc-Ig融 合蛋白。
[0010] 本發(fā)明要解決的另外一個技術問題是提供I曲-Fc-Ig融合蛋白的制備方法。
[0011] 對于具有生物活性的I曲-Fc-Ig融合蛋白，本發(fā)明采用的技術方案是：融合蛋白 是I曲-Fc與IgGl-Fc融合。
[0012] 作為優(yōu)選，I曲是人I曲。
[0013] 作為優(yōu)選，IgGl是人IgG。
[0014] 作為優(yōu)選，IgGl-Fc融合于I曲-Fc的N-端或C-端。
[0015] 作為優(yōu)選，IgGl-Fc通過重疊延伸PCR方法與I曲-Fc相連。
[0016] 作為優(yōu)選，I曲-Fc-Ig融合蛋白具有如SEQIDNO. 3所示的氨基酸序列。
[0017] 作為優(yōu)選，I曲-Fc-Ig融合蛋白是從大腸桿菌的裂解物上清中分離純化出來。
[0018] 對于I曲-Fc-Ig融合蛋白的制備方法，本發(fā)明采用的技術方案是包括W下步驟：
[0019] (1)1曲-Fc-Ig表達載體的構建
[0020] 利用重疊PCR原理，先分別擴增出I曲-Fc和IgGl-Fc目的片段，之后利用所設計 引物的重疊性，擴增出含有I曲-Fc-Ig基因融合體的片段；
[0021] 引物如下：
[0022] 引物 1A:5'TAATACGACTCACTATAGGG3，
[0023]引物 1B:5'TGTCACAAGATTTGGGCTCGTTGAGCAGAGTCCGGGAG3，
[0024]引物 2A:5 'CTCCCGGACTCTGCTCAACGAGCCCAAATCTTGTGACA3，
[00巧]引物 2B: 5 'TTTACCCGGAGACAGGGAGAGG3，
[0026] 為了蛋白表達，將上述PCR產物連接于pGEM-T-easy克隆載體，之后，使用NocI 和SalI對產物和陽T28a(+)表達載體進行雙酶切，最后獲得含I曲-Fc-Ig片段的表達載 體陽T28a(+)-I曲-Fc-Ig;
[0027] 似表達與純化
[0028] 將表達載體陽T28a(+)-I曲-Fc-Ig轉化入化21-DE3菌株中，S0C培養(yǎng)基，37°C， IPTG0. 4mM誘導5小時表達；表達完成后，對細菌進行冰上超聲破碎，收集上清，過濾后進 行親和層析純化；所述純化選擇親和色譜的層析方法；
[002引 做保存
[0030] 將I曲-Fc-Ig融合蛋白置換到適宜的溶劑中，W便長期保存；使用超濾管對 I曲-Fc-Ig融合蛋白進行濃縮，提高產品質量。
[0031] 本發(fā)明可利用上述I曲-Fc-Ig融合蛋白制備用于檢測I曲-Fc-Ig融合蛋白的試劑 盒。
[0032] 本發(fā)明還可利用上述的I曲-Fc-Ig融合蛋白制備用于治療自身免疫病、淋己瘤、 淋己細胞白血病的生物制劑。
[0033] 本發(fā)明的有益效果是：
[0034] 提供一種具有生物活性的I曲-Fc-Ig融合蛋白。該I曲-Fc-Ig融合蛋白采用重組 表達方法，利用大腸桿菌生產I曲-Fc-Ig融合蛋白，然后通過分離、純化等步驟得到。該蛋 白可W抑制I曲/1曲受體通路，抑制過度活化的T、B淋己細胞，具有治療淋己細胞過度活化 (如自身免疫病、淋己瘤、淋己細胞白血?。╊惣膊〉臐撛趹们熬?。
【附圖說明】
[0035] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0036] 圖1A是本發(fā)明I曲-Fc-Ig融合蛋白實施例的親和層析圖譜，可見流穿峰和 I曲-Fc-Ig融合蛋白產物峰。
[0037] 圖1B是本發(fā)明I曲-Fc-Ig融合蛋白實施例的親和層析純化后組分的SDS-PAGE分 析。線道1，標準分子量；線道2,空白對照；線道3,總蛋白；線道4,HIS柱流穿產物；線道 5,HIS柱洗脫產物；線道6,HIS柱洗脫產物即ProteinA柱上樣產物；線道7,ProteinA柱 流穿產物；線道8,ProteinA柱洗脫產物即I曲-Fc-Ig融合蛋白產物。
[0038] 圖1C是本