用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT?MAS9C，它的全長為20個氨基酸，其序列包括兩部分，所述融合肽的氨基端為HIV?1Tat蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的11個氨基酸YGRKKRRQRRR，能夠?qū)⑷诤想囊爰?xì)胞質(zhì)；所述融合肽的羧基端為Mas羧基末端9個氨基酸NTVSIETVV，能夠破壞Mas與PSD95的相互作用；所述融合肽的氨基酸序列為YGRKKRRQRRRNTVSIETVV。本發(fā)明的融合肽在破壞Mas與PSD95相互作用的同時，又保證了PSD95本身的突觸功能，能夠較好的研究PSD95對Mas功能的調(diào)控作用。
【專利說明】
用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽。
【背景技術(shù)】
[0002] mas基因由Wigler博士研究小組于1986年首次克隆出。它所編碼的蛋白質(zhì)含有325 個氨基酸，有7個疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種G蛋白偶聯(lián)受體。Mas蛋白的組織學(xué)分布比較廣 泛，在腦、睪丸、心臟、腎臟以及大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)。Mas具有多種生理功能，它能 夠有效調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)；同時它對于神經(jīng)可塑性、記憶和焦慮也有重要的調(diào)節(jié)作 用;此外，它還對腫瘤的發(fā)生有重要的影響。目前關(guān)于Mas的研究集中在功能和信號通路上， 很少有關(guān)于Mas調(diào)節(jié)蛋白的研究報道。
[0003] Mas蛋白序列的羧基端(ETVV)是典型的PDZ蛋白結(jié)合序列(ES/TXI/L/V)，推測PDZ 蛋白可能會與Mas結(jié)合而調(diào)節(jié)其生理作用。PDZ蛋白是具有H)Z結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)超級家族，目 前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有200多個成員。其名稱來源于最初發(fā)現(xiàn)的含有此結(jié)構(gòu)域的3個蛋白質(zhì)的英文名 稱首字母縮寫：P〇st_synaptic density protein-95(PSD_95)、Discs large(DLG)、Zonula occludens UZO-lhPDZ結(jié)構(gòu)域長度在90個氨基酸左右，能夠與靶蛋白羧基端特異模序結(jié) 合。PDZ蛋白通過與G蛋白偶聯(lián)受體羧基端的相互作用，對G蛋白偶聯(lián)受體的功能有重要的調(diào) 控作用，如多種PDZ蛋白：？3095、嫩61-2、？02-6￡?、0六1以及嫩61-3等可以分別與匕6七 &1腎上 腺素受體(WAR)特異結(jié)合而分別調(diào)節(jié)其多種生理功能。
[0004] PSD95(postsynaptic density protein 95,突觸后致密物質(zhì)-95)是在谷氨酸能 突觸的突觸后密集區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種腳手架蛋白，是膜結(jié)合鳥苷酸激酶GK超家族的成員之一。 PSD95具有3個PDZ結(jié)構(gòu)域，目前已經(jīng)報道它可以通過其各個PDZ結(jié)構(gòu)域與多種受體相互作 用，進(jìn)而調(diào)節(jié)受體的功能。如可以通過其H)Zl-2結(jié)構(gòu)域與Kvl受體結(jié)合而調(diào)節(jié)鉀離子通道的 電流，可以通過其roz3結(jié)構(gòu)域與m腎上腺素受體結(jié)合而抑制war減敏。作為突觸后致密物 質(zhì)，PSD95的一個重要功能是通過不同的結(jié)構(gòu)域與NMDA受體、KA受體等蛋白的羧基末端相結(jié) 合，募集谷氨酸受體及其下游多種特異的信號分子，促使特異性信號模塊的形成，從而在突 觸后水平對興奮性信號進(jìn)行整合，調(diào)節(jié)興奮性突觸及棘突的形成、成熟、維持和可塑性。
[0005] 本人前期研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素（1-7)受體Mas和突觸后致密物質(zhì)95 (PSD95)在腦 組織和細(xì)胞中存在相互作用。相關(guān)成果已發(fā)表在Biochem J.雜志上。Mas羧基末端可以特異 性地與PSD95的PDZ1-2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。Mas羧基末端的四個氨基酸決定了與PSD95相互作用 的特異性，四個氨基酸中的任何一個突變都會導(dǎo)致Mas與PSD95相互作用的消失。既然PSD95 與Mas存在相互作用，因此我們推測PSD95會對Mas的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0006] 已知PSD95能調(diào)節(jié)多種受體的功能。目前研究比較清楚的是PSD95對麗口六以. methyl-D-aspartic acid receptor，N-甲基-D-天冬氨酸受體）的調(diào)控，PSD95參與NMDAR介 導(dǎo)的腦缺血損傷。破壞PSD95與NMDAR的相互作用，可以起到對腦缺血損傷的保護(hù)作用，根據(jù) 與卩509 5相互作用的麗041?的羧基端設(shè)計的小分子穿膜肽了&1冊289(3(4&^8 6七 al. Science 2002)能夠破壞NMDAR和PSD95的相互作用，對NMDAR介導(dǎo)的腦缺血損傷起到保 護(hù)作用。既然Mas與PSD95存在相互作用，PSD95很可能對Mas介導(dǎo)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0007] 由于Mas與PSD95都在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，但是神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很低，而且PSD95本 身具有一定的突觸功能，因此采用改變PSD95表達(dá)量的方法來研究PSD95對Mas的調(diào)控作用 不僅有一定的技術(shù)難度，而且也不適用于對PSD95調(diào)控功能的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在提供一種既能夠穿透細(xì)胞膜，又能破壞Mas與PSD95的相互作用的融合 肽TAT-MAS9C。所述融合肽在破壞Mas與PSD95相互作用的同時，又保證了 PSD95本身的突觸 功能，能夠較好的研究PSD95對Mas功能的調(diào)控作用。
[0009] 本發(fā)明借鑒Tat-NR2B9c的設(shè)計原理，根據(jù)與PSD95相互作用的Mas蛋白的羧基端設(shè) 計融合肽TAT-MAS9C，該融合肽可以競爭Mas與PSD95的結(jié)合，從而破壞Mas與PSD95的相互作 用。
[0010] 鑒于此，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0011] 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C，其特殊之處在于
[0012]它的全長為20個氨基酸，其序列包括兩部分，所述融合肽的氨基端為HIV-1 Tat蛋 白的跨膜結(jié)構(gòu)域的11個氨基酸YGRKKRRQRRR，能夠?qū)⑷诤想囊爰?xì)胞質(zhì);所述融合肽的羧基 端為Mas羧基末端9個氨基酸NTVSIETVV，能夠破壞Mas與PSD95的相互作用。
[0013] 所述融合肽的氨基酸序列為YGRKKRRQRRRNTVSIETVV。
[0014] 為了某些研究需要，可以在融合肽氨基酸K上接上羅丹明，進(jìn)行熒光標(biāo)記。用于生 產(chǎn)本融合肽的方法是眾所周知的，一般的多肽合成公司都能夠利用固相合成法合成。
[0015] 本發(fā)明融合肽TAT-MAS9C的合成采用Fmoc/PyBOP方法，主要合成方法如下：
[0016] 融合肽合成在多肽自動合成儀上進(jìn)行，稱取Fmoc-val-wang resin樹脂到砂芯過 濾反應(yīng)器中，然后在合成儀中依次加入各種Fmoc-氨基酸。反應(yīng)過程中加入的FM0C-氨基酸 并不是一次全部加入反應(yīng)容器，而是按照多肽的序列順序從C端逐漸加入，每接完一個氨基 酸，需要用30%六氫吡啶脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。接完多肽的樹脂經(jīng)過甲醇清洗后干燥。然后全 部轉(zhuǎn)移至玻璃茄形瓶中，制備粗品，經(jīng)過純化、凍干得到融合肽。
[0017] 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C可用于研究PSD95對Mas功 能的調(diào)控作用，同時可將本發(fā)明的融合肽TAT-MAS9C用于制備肽類藥物，所述肽類藥物用于 治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病;尤其用于治療腦卒中以及缺備、缺氧相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)的疾??；
[0018]融合肽TAT-MAS9C的應(yīng)用方法，其特殊之處在于，具體步驟如下：
[0019] 將一定濃度的融合肽TAT-MAS9C(通常為10-5M-10-7M)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育30- 60min，融合肽就可以進(jìn)入細(xì)胞中，達(dá)到干擾效果。
[0020] 為了能夠追蹤融合肽TAT-MAS9C在細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)變化，可以在融合肽氨基酸K上接 上羅丹明，進(jìn)行熒光標(biāo)記。
[0021] 本發(fā)明的融合肽，可以競爭Mas與PSD95的結(jié)合，從而破壞Mas與PSD95的相互作用， 該融合肽在破壞Mas與PSD95相互作用的同時，又保證了PSD95本身的突觸功能，能夠較好的 研究PSD95對Mas功能的調(diào)控作用。由于Mas能夠介導(dǎo)血管緊張素（1-7)的腦缺血保護(hù)作用， 所以此融合肽可在細(xì)胞水平和動物水平研究PSD95對Mas介導(dǎo)的腦缺血保護(hù)作用的調(diào)控作 用和分子機(jī)制，為中風(fēng)等腦缺血疾病治療提供潛在的藥物靶標(biāo)。用神經(jīng)元建立氧糖剝奪 (oxygen-glucose deprivation，OGD)模型模擬腦缺血缺氧環(huán)境，研究結(jié)果初步顯示，此融 合肽能夠加強(qiáng)血管緊張素（1-7)的腦缺血保護(hù)作用，因此，此融合肽具有重要的臨床應(yīng)用價 值，有可能應(yīng)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病;尤其用于治療腦卒中以及缺血、缺氧相關(guān)的神經(jīng) 系統(tǒng)的疾病;在醫(yī)療領(lǐng)域研究中具有極其重要的理論意義和潛在的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022]圖1A:用陰性對照孵育神經(jīng)元30分鐘，融合肽在神經(jīng)元中的穿膜效果圖；
[0023]圖1B:用1(T5M融合肽孵育神經(jīng)元30分鐘，融合肽在神經(jīng)元中的穿膜效果圖；
[0024]圖2A:在轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中，融合肽能夠破壞Mas與PSD95的相互作用的干擾效果 圖；
[0025]圖2B:在轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中，融合肽不能破壞NR2B和PSD95的相互作用的干擾效果 圖；
[0026] 圖3:在神經(jīng)元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，0GD)模型中，融合肽能夠 增強(qiáng)0GD神經(jīng)元活性、加強(qiáng)血管緊張素(1-7)保護(hù)作用的效果圖；
[0027] 在圖1A-圖1B中，為了證明TAT-MAS9C的穿膜效果，用羅丹明標(biāo)記的TAT-MAS9C及羅 丹明標(biāo)記的陰性對照孵育神經(jīng)元30min，然后在熒光顯微鏡下觀察，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAT-MAS9C的穿膜效果良好。
[0028] 在圖2A-圖2B中，293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-Mas和PSD95,并加入融合肽TAT-MAS9C孵育 30min，收取細(xì)胞裂解液，進(jìn)行免疫共沉淀，初步證明了融合肽的干擾效果（圖2A)。為了證實 TAT-MAS9C的特異性，在293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了與腦缺血關(guān)系密切的，目前被廣泛研究的兩種蛋 白的質(zhì)粒:NMDA受體的亞單位NR2B和PSD95，并進(jìn)行免疫共沉淀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAT-MAS9C不能破 壞NR2B與PSD95的相互作用（圖2B)，證實了融合肽TAT-MAS9C的特異性。
[0029] 在圖3中，利用原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元建立0GD模型，模擬腦缺血缺氧環(huán)境，分別用 血管緊張素（1-7)(4叫-(1-7))，1^ 8受體拮抗劑4779及融合肽14!'-1^59(：處理細(xì)胞，利用 CCK8試劑盒檢測神經(jīng)元活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0⑶后神經(jīng)元活性降低，Ang-(l-7)能夠提高神經(jīng)元 活性;加入A779后神經(jīng)元活性降低，說明Ang-(l-7)的保護(hù)作用是通過Mas受體實現(xiàn)的。而融 合肽TAT-MAS9C能夠增加0GD神經(jīng)元活性，加強(qiáng)Ang-( 1-7)-Mas介導(dǎo)的保護(hù)作用。
【具體實施方式】
[0030] 下面就附圖對本發(fā)明作以下詳細(xì)說明。
[0031] 實施例1本發(fā)明融合肽的設(shè)計與合成
[0032] 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C，它的全長為20個氨基酸， 其序列包括兩部分，所述融合肽的氨基端為HIV-1 Tat蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的11個氨基酸 YGRKKRRQRRR，能夠?qū)⑷诤想囊爰?xì)胞質(zhì)；所述融合肽的羧基端為Mas羧基末端9個氨基酸 NTVSIETVV，能夠破壞Mas與PSD95的相互作用。所述融合肽的氨基酸序列為 YGRKKRRQRRRNTVSIETW。
[0033] 為了某些研究需要，可以在融合肽氨基酸K上接上羅丹明，進(jìn)行熒光標(biāo)記。用于生 產(chǎn)本融合肽的方法是眾所周知的，一般的多肽合成公司都能夠利用固相合成法合成。
[0034]用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的合成方法，主要步驟如 下：
[0035]合成采用Fmoc/PyBOP方法。融合肽合成在多肽自動合成儀上進(jìn)行，稱取Fmoc-val-wang resin樹脂到砂芯過濾反應(yīng)器中，然后在合成儀中依次加入各種Fmoc-氨基酸。反應(yīng)過 程中加入的FM0C-氨基酸并不是一次全部加入反應(yīng)容器，而是按照多肽的序列順序從C端逐 漸加入，每接完一個氨基酸，需要用30%六氫吡啶脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。接完多肽的樹脂經(jīng)過 甲醇清洗后干燥。然后全部轉(zhuǎn)移至玻璃茄形瓶中，制備粗品，經(jīng)過純化、凍干得到融合肽。 [0036]實施例2利用熒光顯微鏡驗證TAT-MAS9C的穿膜效果 [0037]方案：
[0038] 實驗分為兩組:A組為羅丹明標(biāo)記的陰性對照組;B組為TAT-MAS9C組。原代培養(yǎng)神 經(jīng)元7天，待突觸長成后，分別用羅丹明標(biāo)記的陰性對照和10,的TAT-MAS9C孵育神經(jīng)元 30min，將陰性對照和TAT-MAS9C洗掉，利用熒光顯微鏡拍照，觀察他們的穿膜效果。
[0039] 結(jié)果：
[0040] 洗掉肽以后，發(fā)現(xiàn)A組陰性對照穿膜效果很差，熒光強(qiáng)度很弱（圖1A)。而B組神經(jīng)元 胞漿內(nèi)，可見大量熒光標(biāo)記的TAT-MAS9C(圖1B)，說明TAT-MAS9C具有很好的穿膜效果。 [0041] 實施例3利用CoIP(免疫共沉淀)結(jié)合western blot(免疫蛋白印跡)方法驗證TAT- MAS9C的干擾效果及特異性：
[0042]方案：
[0043] 實驗分為三組，將293細(xì)胞接種在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待密度為70 %左右時，同時 用Flag-Mas和PSD95質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h后，A組培養(yǎng)基中加入陰性對照，孵育30min; B組加入終濃度為10-5M的TAT-MAS9C，孵育30min;C組加入10-6M的TAT-MAS9C，孵育30min。用 蛋白裂解液收取細(xì)胞，4°C持續(xù)混和lh，離心收集上清。lmL上清中加入50此的Anti-Flag M2Affinity Ge 1，4°C持續(xù)混和3h。離心lmin收集沉淀，用洗滌液洗滌沉淀，所得的沉淀物即 為免疫共沉淀復(fù)合物。在沉淀復(fù)合物中加入適量的蛋白上樣緩沖液，95 °C保溫5min，離心后 取上清，進(jìn)行Western blot鑒定。
[0044] 為了證明TAT-MAS9C不會破壞PSD95與NMDAR等其他蛋白的相互作用，在293細(xì)胞中 轉(zhuǎn)染了與腦缺血關(guān)系密切的，目前被廣泛研究的兩種蛋白的質(zhì)粒:NMDA受體的亞單位NR2B 和PSD95,并進(jìn)行免疫共沉淀，實驗也分為兩組:轉(zhuǎn)染24h后，A組培養(yǎng)基中加入陰性對照，孵 育30min;B組加入終濃度為10- 5M的TAT-MAS9C，孵育30min。每組用lmL蛋白裂解液收取細(xì)胞 到離心管中，4°C持續(xù)混和lh，離心收集上清。每組上清中加入1 OyL anti-NR2B抗體，4°C持 續(xù)混和2h，在兩管中分別加入50iiL的proteinA/G，4 °C持續(xù)混和過夜。離心lmin收集沉淀，并 用洗滌液洗滌沉淀，所得的沉淀物即為免疫共沉淀復(fù)合物。在沉淀復(fù)合物中加入適量的蛋 白上樣緩沖液，95°C保溫5min，離心后取上清，進(jìn)行western blot鑒定。
[0045]結(jié)果：
[0046] 在細(xì)胞裂解液中Flag-Mas和PSD95表達(dá)基本一致的前提下，用Anti-Flag M2 Affinity Gel進(jìn)行免疫沉淀，加入TAT-MAS9C后，沉淀復(fù)合物中的PSD95的含量降低。與加入 10一6M TAT-MAS9C組相比，加入10-5M的TAT-MAS9C組的沉淀復(fù)合物中，檢測到的PSD95含量更 少（圖2A)。說明TAT-MAS9C能夠破壞Mas和PSD95的相互作用，TAT-MAS9Ci^度越高，破壞作用 越強(qiáng)。
[0047] 在細(xì)胞裂解液中NR2B和PSD95表達(dá)基本一致的前提下，用NR2B抗體進(jìn)行免疫沉淀， 與未加TAT-MAS9C組相比，加入TAT-MAS9C后，沉淀復(fù)合物中的PSD95的含量并沒有減少（圖 2B)。說明TAT-MAS9C不能破壞NR2B和PSD95的相互作用，TAT-MAS9C具有一定的特異性。 [0048] 實施例4CCK8試劑盒檢測TAT-MAS9C對0GD神經(jīng)元活性的影響
[0049] 方案：
[0050] 在96孔板中接種神經(jīng)元，按照實驗分組每組設(shè)定6個復(fù)孔。原代培養(yǎng)神經(jīng)元約7天 左右，待突觸長成后，吸棄Neurobasal培養(yǎng)基，加入EBSS緩沖液(5.36mM KC1，0.116M NaCl， l.OmM NaH2P〇4,0.81mM MgS〇4，10mM HEPES，1.8mM CaCl2，14.7mM NaHC03)，將培養(yǎng)皿放到厭 氧培養(yǎng)箱(85 %N2、10 %H2、5 %⑶2)中，進(jìn)行缺氧缺糖培養(yǎng)4h，然后在EBSS中直接加入終濃 度為5mM的葡萄糖，復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)18小時。然后向每孔加入CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時，用酶 標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度。實驗分為五組:A，正常對照組(NC):不對神經(jīng)元進(jìn)行00)處理； B，實驗對照組(0GD):對神經(jīng)元進(jìn)行0⑶處理4h;C，Angl-7組:在EBSS中加入終濃度為10-7M的 Angl-7進(jìn)行0GD處理。D，A779+Ang-(l-7)組:在EBSS中加入終濃度為10-5M的A779和10- 7M的 Angl-7進(jìn)行0GD處理。E，融合肽+Ang-( 1-7)組:在EBSS中加入終濃度為10-5M的融合肽和10-7M的Ang-(l-7)進(jìn)行0GD處理。
[0051] 結(jié)果：
[0052] CCK8實驗檢測結(jié)果顯示:0⑶組細(xì)胞活性明顯降低，與NC組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué) 意義(P〈0.01)，說明0GD模型造模成功。加入Ang-( 1-7)后，神經(jīng)元活性增加，與0GD組比較差 異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈〇. 01)，說明Ang-( 1-7)對0⑶神經(jīng)元起到保護(hù)作用。加入Mas受體的拮 抗劑A779后神經(jīng)元活性降低，說明Ang-(l-7)的保護(hù)作用是通過Mas受體實現(xiàn)的。最后一組， 加入融合肽TAT-MAS9C后，0⑶神經(jīng)元活性僅次于NC組，與Ang-(l-7)組比較，差異具有統(tǒng)計 學(xué)意義(P〈〇.〇5)，說明TAT-MAS9C能夠加強(qiáng)Ang-(l-7)-Mas介導(dǎo)的對0GD神經(jīng)元的保護(hù)作用 (圖 3)。
[0053]目前，對于本發(fā)明的實施方式，主要是可以將不同濃度的TAT-MAS9C加入所研究的 細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育不同時間段，尋找針對于不同細(xì)胞進(jìn)行TAT-MAS9C孵育的合適濃度的和 孵育時間。進(jìn)一步研究TAT-MAS9C對細(xì)胞功能的影響，探討PSD95對Mas功能的影響。
[0054] 在細(xì)胞水平的基礎(chǔ)上，TAT-MAS9C可以用于動物實驗，方法和注意事項同肽類藥 物。由于Mas和PSD95都與神經(jīng)功能密切相關(guān)，并且利用0GD神經(jīng)元模型，已在神經(jīng)元水平初 步證實破壞Mas和PSD95相互作用的TAT-MAS9C能夠加強(qiáng)Ang-(l-7)-Mas介導(dǎo)的腦缺血保護(hù) 作用，因此TAT-MAS9C可用于研究治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，尤其用于治療腦卒中以及缺血、 缺氧相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。在動物實驗中，可以利用缺血再灌等模型，利用ALZET微型滲 透栗側(cè)腦室內(nèi)緩慢灌注TAT-MAS9C等藥物。缺血一定時間后，可以拔出線栓，分別再灌不同 時間，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)研究，以進(jìn)一步研究TAT-MAS9C的作用，探討PSD95對Mas功能的影響。
[0055] 如果在動物水平上發(fā)現(xiàn)TAT-MAS9C具有很好的治療作用，可以進(jìn)一步用于臨床?？?以將本發(fā)明的融合肽和藥用載體、佐劑等制成藥物組合物。這些藥用載體、佐劑等并不破壞 融合肽的藥理活性，包括:離子交換劑、氧化鋁、卵磷脂、山梨酸、膠體氧化硅、聚乙二醇等。 可以以口服用劑型、栓劑、注射等形式通過口服、腸胃外給藥、局部給藥、直腸給藥或經(jīng)由植 入性藥盒等途徑來實施治療過程。
【主權(quán)項】
1. 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C，其特征在于 它的全長為20個氨基酸，其序列包括兩部分，所述融合肽的氨基端為HIV-1 Tat蛋白的 跨膜結(jié)構(gòu)域的11個氨基酸YGRKKRRQRRR，能夠?qū)⑷诤想囊爰?xì)胞質(zhì);所述融合肽的羧基端為 Mas羧基末端9個氨基酸NTVSIETVV，能夠破壞Mas與PSD95的相互作用;所述融合肽的氨基酸 序列為 YGRKKRRQRRRNTVSIETW。2. 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的合成方法，其特征在于， 采用Fmoc/PyBOP方法在多肽自動合成儀上進(jìn)行，稱取Fmoc-val-wang resin樹脂到砂 芯過濾反應(yīng)器中，然后在合成儀中依次加入各種Fmoc-氨基酸;反應(yīng)過程中加入的FM0C-氨 基酸并不是一次全部加入反應(yīng)容器，而是按照多肽的序列順序從C端逐漸加入，每接完一個 氨基酸，需要用30%六氫吡啶脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)；接完多肽的樹脂經(jīng)過甲醇清洗后干燥;然 后全部轉(zhuǎn)移至玻璃茄形瓶中，制備粗品，經(jīng)過純化、凍干得到融合肽。3. 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C用于研究PSD95對Mas功能的 調(diào)控作用。4. 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C在制備肽類藥物中的應(yīng)用， 所述肽類藥物用于治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，尤其用于治療腦卒中以及缺血、缺氧相關(guān)的神 經(jīng)系統(tǒng)的疾病。5. 用于破壞Mas受體和PSD95相互作用的融合肽TAT-MAS9C的應(yīng)用方法，其特征在于，具 體步驟如下： 將濃度為10-5Μ-10-7Μ的融合肽TAT-MAS9C加入細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育30-60min，融合肽就可 以進(jìn)入細(xì)胞中，達(dá)到干擾效果。
【文檔編號】C07K1/04GK105820253SQ201610202332
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月31日
【發(fā)明人】卞偉華
【申請人】濱州醫(yī)學(xué)院