融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包含p75N?TR(NBP)部分和免疫球蛋白部分的p75NTR神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合蛋白(NBP)?Fc融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，p75NTR(NBP)?Fc融合蛋白用于治療疼痛和/或疼痛癥狀。
【專利說明】融合蛋白
[000。發(fā)明背景
[0002]神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(m)NF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子3(NT-3)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4/5(NT-4/5)通過4種受體：低親和力p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體 (P75NTR)和高親和力酪氨酸激酶受體化kA、TrkB和化kC發(fā)揮作用。低親和力受體P75NTR結(jié) 合并且被全部4種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子激活并且已經(jīng)報(bào)道獨(dú)立于其他受體發(fā)揮作用。但是，更選擇 性地激活化k受體，即，NGF是化kA的選擇性配體，抓NF是TrkB的配體，并且NT-3、NT-4/5是 化kC的配體。此外已經(jīng)報(bào)道，當(dāng)P75NTR蛋白和Trk蛋白共表達(dá)時(shí)，它們形成改變兩種受體的 信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)合物化Uang和Reichar化，2003，生物化學(xué)年評(píng)(Annu Rev Biochem.)72:609-42)。實(shí)際上，已經(jīng)提出P75NTR促進(jìn)每種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)其相應(yīng)Trk受體的選擇性。
[0003 ] P75NTR是腫瘤壞死因子受體超家族(TNFR-SF)的成員并且是運(yùn)個(gè)超家族中充分表 征的第一個(gè)成員。運(yùn)個(gè)超家族(在人類中由大約30個(gè)基因編碼）由配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域定義，所 述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域由首先在P75NTR中鑒定的40氨基酸富含半脫氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)的一個(gè)或 多個(gè)（一般4個(gè)）重復(fù)序列組成（Johnson等人，1986細(xì)胞（Cell )47:545-554 ;Radeke等人， 1987自然(化化re) 325:593-597)。與之相反，全部TNFR-SF家族成員的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不共有序 列基序。因此，TNFR-SF蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制大幅度變動(dòng)。
[0004] P75NTR結(jié)構(gòu)的不尋常特征是存在借助跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的半脫氨酷殘基形成的二 硫鍵連接的P75NTR二聚體。運(yùn)個(gè)二硫鍵是P75NTR進(jìn)行有效神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子依賴性信號(hào)傳導(dǎo)所 需要的并且在胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域的形成中發(fā)揮重要作用(Vilar等人，2009神經(jīng)元(Neuron) 62:72-83)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在生理學(xué)上作為非共價(jià)締合的二聚體存在(Bothwell和化OOter， 1977生物化學(xué)雜志(J Biol Chem. )252(23) :8532-6),分布半壽期為大致5分鐘（Tria等人， 1994實(shí)驗(yàn)神經(jīng)學(xué)化邱Neurol.) 127(2): 178-83)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子依賴性P75NTR激活包含神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子二聚體與P75NTR二聚體的兩個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域的C畑2-4締合化e和Garcia,2004科 學(xué)(Science) 304:870-875)。最近的研究支持一種模型，其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合造成P75NTR 二聚體的兩個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域移動(dòng)靠得更近，迫使胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域W該二硫鍵為中屯、的蝸牛錯(cuò)樣 (snail-tong-like)運(yùn)動(dòng)展開并允許胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與信號(hào)傳導(dǎo)銜接蛋白NRIF和TRAF6締合 (ViIar等人，2009細(xì)胞科學(xué)雜志（J Cell Sci )122:3351-3357 ,Vilar等人，2009神經(jīng)元 (Neuron) 62:72-83)。W前尚未在其他TNFR-SF家族成員中或任何其他膜蛋白中描述跨膜結(jié) 構(gòu)域內(nèi)二硫鍵，如P75NTR中存在的那些。
[0005] p75NTRW類似于刻缺蛋白（Notch)和0-淀粉樣前體蛋白（0-amyloid precursor protein)的切割賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的方式依次接受a-分泌酶活性和丫-分泌酶活性和基質(zhì) 金屬蛋白酶(MMP)的蛋白酶剪切，釋放其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)至細(xì)胞質(zhì)中（Jung等人，2003生物 化學(xué)雜志（J Biol 化em)，278:42161-42169;Kanning等人，2003神經(jīng)科學(xué)雜志（J Neuro-sci)23:5425-5436)Dp75NTR ICD通過運(yùn)條途徑的胞質(zhì)釋放促進(jìn)相關(guān)NRIF的信號(hào)傳導(dǎo) 化enchappa等人，2006神經(jīng)元(Neuron)SO :219-232)。在a-分泌酶活性和丫-分泌酶活性和 MMP的蛋白酶剪切后，P75NTR胞外結(jié)構(gòu)域的作用未得到充分理解。
[0006] 已經(jīng)記錄，NGF和其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF、NT-3和NT-4/5)在病理學(xué)例如因骨關(guān)節(jié) 炎、膜腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、搔癢癥和多發(fā)性硬化所致的疼痛中發(fā)揮重要作用 (Wannabe等人，2008神經(jīng)研究雜志（J化urosci Res. )86(16) :3566-74);Raychau化Uri等 人，2011關(guān)節(jié)炎風(fēng)濕病(Arthritis )63(11) :3243-52;Ba;rthel等人，2009關(guān)節(jié)炎研 究療法（A;rth;ritis Res Hier. 11)(3) =RSSilYuzzi等人，2011 細(xì)胞死亡分化（Cell Death Differ. )18:948-58;McDonald等人，2011 當(dāng)今藥物化學(xué)（Curr Med 化em. )18:2:34-44; Yamaoka等人，2007皮膚病學(xué)科學(xué)雜志（J Dermatol Sci. )46(1) :41-51)。證實(shí)針對(duì)任何神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;NGF或抓NF、NT-3和NT-4/5的選擇性抗體顯著地減少疼痛。另外，還已經(jīng)證實(shí)針 對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體P75NTR化k A、化k B或Trk C的抗體在疼痛模型中有效(Orita S等 人，2010 整形外科研究雜志（J Orthop Res.)28:1614-20;Svensson P 等人，2010 疼痛 (化in. )148:473-80; Iwakura等人，2010手外科學(xué)美國(guó)卷（J 化nd Surg Am. )35:267-73; Cirilio等人，2010細(xì)胞分子神經(jīng)生物學(xué)（Cell Mol Neurobiol. )30:51-62;Pezet等人， 2010疼痛（Pain. )90:113-25;化yashi等人，2011 疼痛雜志（J Pain. )12:1059-68;Chu等人， 2011 疼痛(Pain. )152:1832-7;Ueda等人，2010藥學(xué)科學(xué)雜志（J Pharmacol Sci. )112:438-43;加 i Iardi 等人，2010 骨（Bone. )48:389-98 ; Fukui 等人，2010 整形外科研究雜志（J Odhop Res . )2010; 28: 279-83) dF址Ui等人(2010)在一個(gè)疼痛模型中（坐骨神經(jīng)擠壓后的 機(jī)械性異常疼痛）用抗P75NTR抗體治療后顯示疼痛相關(guān)性終點(diǎn)方面的顯著功效。從運(yùn)項(xiàng)研 究得出結(jié)論，用P75NTR抑制性抗體治療減少CGRP和P75NTR表達(dá)，導(dǎo)致顯著減少疼痛。
[0007]本發(fā)明設(shè)及一種P75NTR神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合蛋白（NBP)-Fc融合蛋白。我們描述了運(yùn) 種分子的親和力和體內(nèi)動(dòng)力學(xué)，W及動(dòng)物模型中治療疼痛的有效性。p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白可用于治療疼痛和其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)性疾病，如銀屑病、濕疹、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 膀脫炎、子宮內(nèi)膜異位癥和骨關(guān)節(jié)炎。
[000引發(fā)明概述
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種P75NTR神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合蛋白（NBP)-Fc融合蛋 白，所述融合蛋白包含：
[0010] (a)p75NTR(NBP)部分;和
[0011] (b)免疫球蛋白化部分。
[0012] 優(yōu)選地，p75NTR(NBP)部分和化部分經(jīng)接頭連接。更優(yōu)選地，接頭包含式Gx的膚，其 中X是1、2、3、4、5或6。
[0013] 在根據(jù)本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，P75NTR (NBP)是人p75NTR(NBP)。在根據(jù)本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí) 施方案中，F(xiàn)c是人Fc。
[0014] 在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQIDN0.15中所述的氨基酸序列或由 SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列組成。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白W通過表面等離 子體共振在20°C所測(cè)量的約O.OlnM至約50nM之間的結(jié)合親和力化d)與NGF、BDNF、NT3或 NT4/5的任一者結(jié)合。
[0016] 在本發(fā)明的第二方面，根據(jù)本發(fā)明任何其他方面提供如所述那樣的p75NTR(NBP)- Fe融合蛋白用于治療疼痛或疼痛癥狀。
[0017] 在本發(fā)明的第S方面，提供編碼根據(jù)本發(fā)明第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的核酸分子，所述核酸分子任選地還包括編碼信號(hào)序列。
[0018] 在本發(fā)明的第四方面，提供一種用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞、可選地轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制 型表達(dá)載體，所述載體包含根據(jù)本發(fā)明的第=方面的核酸分子。
[0019] 優(yōu)選地，該復(fù)制型表達(dá)載體是病毒載體。
[0020] 在本發(fā)明的第五方面，提供一種攜帶本發(fā)明的第=方面的核酸分子的宿主細(xì)胞。
[0021] 在本發(fā)明的第六方面，根據(jù)本發(fā)明第=方面的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明第四方面的 載體用于治療疼痛或疼痛癥狀。
[0022] 疼痛或疼痛癥狀包括但不限于:急性疼痛;慢性疼痛;炎性疼痛;傷害性疼痛;神經(jīng) 病理性疼痛(neuropathic pain);痛覺過敏；異常性疼痛(allodynia);中樞性疼痛；癌疼 痛；術(shù)后疼痛；內(nèi)臟疼痛;肌肉骨骼疼痛；屯、臟或血管疼痛；頭部疼痛，包括偏頭痛；口面疼 痛，包括牙疼痛和背痛。疼痛的治療包括，但不限于，預(yù)防疼痛和/或疼痛癥狀、改善疼痛和/ 或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率，或延遲疼痛和/ 或疼痛癥狀形成或進(jìn)展。
[0023] 在第屯方面，提供根據(jù)第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根據(jù) 第S方面或第四方面的核酸或載體，其中p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或核酸分子或載體組合 中與第二藥理活性化合物組合時(shí)分別、依次或同時(shí)使用。
[0024] 在第八方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)本發(fā)明任何 方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據(jù)本發(fā)明任何方面的核酸分子或載體，和藥學(xué)上可接 受的載體和/或賦形劑。
[0025] 優(yōu)選地，藥物組合物用于W下任一種或多種情況:預(yù)防疼痛和/或疼痛癥狀、改善 疼痛和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率或延遲疼 痛和/或疼痛癥狀形成或進(jìn)展。
[00%]在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種試劑盒;其包含：
[0027] (a)根據(jù)本發(fā)明任何方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據(jù)本發(fā)明任何方面的核 酸分子或載體，或根據(jù)第八方面的藥物組合物;和
[0028] (b)用于針對(duì)W下任一種或多種情況向個(gè)體給藥有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融 合蛋白、核酸分子、載體或藥物組合物的說明書:預(yù)防或治療疼痛和/或疼痛癥狀或用于緩 解疼痛和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率，或延 遲疼痛和/或疼痛癥狀形成或進(jìn)展。
[0029] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種治療和或預(yù)防個(gè)體中疼痛和/或疼痛癥狀的方 法，所述方法包括向所述個(gè)體給藥治療有效量根據(jù)本發(fā)明任何方面的p75NTR(NBP) -Fe融合 蛋白或根據(jù)本發(fā)明任何方面的核酸分子或載體，任選地進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體， 或者根據(jù)本發(fā)明第八方面的藥物組合物。
【附圖說明】
[0030] 圖1.根據(jù)本發(fā)明的P75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0.1)。。分泌 酶切割位點(diǎn)和丫分泌酶切割位點(diǎn)W粗體顯示。IgGlFc部分W斜體顯示。
[0031] 圖2.圖4中所述的核酸序列（SEQ ID NO.4)的翻譯產(chǎn)物（SEQ ID NO.2)，從起始密 碼子至終止密碼子。
[0032] 圖3.根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO. 3) JgGlFc部分W斜體顯示。p75NTR(NBP)部分和Fc部分之間的接頭序列加下劃線顯示。
[0033] 圖4.從5'克隆位點(diǎn)至3'克隆位點(diǎn)的完整產(chǎn)物基因的核酸序列(SEQ ID NO.4)
[0034] 圖5.p75-NTR(NBP)-Fc融合蛋白變體：l:p75_NTR-p75-NTR序列（SEQ ID N0.6);2: 市售p75-NTR-Fc融合蛋白（SEQ ID NO. 7); 3: p75_Fc-Fc序列相對(duì)于IgGlza的Lonza恒定區(qū) 被修飾的市售p75-NTR-Fc融合蛋白（SEQ ID N0.8);4:p75_Fc_C222S-Fc序列相對(duì)于IgGlza 的Lonza恒定區(qū)被修飾及位置222處額外半脫氨酸突變成絲氨酸的市售P75-NTR-FC融合蛋 白（沈Q ID ^.9);5:口75_。(3_64別-變體1，提出的具有4殘基甘氨酸接頭的口75-腫1?斗(3融合 蛋白（SEQ ID N0.10);6:p75_Fc_G4Sxl-變體2,所提出的具有單個(gè)四甘氨酸絲氨酸接頭的 P75-NTR-FC融合蛋白（SEQ ID N0.11);7:p75_Fc_G4Sx2-變體3,提出具有兩個(gè)四甘氨酸絲 氨酸接頭的p75-NTR-Fc融合蛋白（SEQ ID N0.12);8:IgGlza的Lonza恒定區(qū)（SEQ ID NO.13)。
[0035] 在運(yùn)個(gè)比對(duì)結(jié)果中，一種格式方案用來突出顯示推定性受體、Fc-融合蛋白和Fc恒 定區(qū)之間具有相似性的區(qū)域:加框的類型用來顯示變體蛋白和P75-NTR之間序列相同的區(qū) 域;單下劃線用來顯示全部化-融合蛋白和Lonza IgGlza化之間序列相同的區(qū)域;斜體用 來顯示在P75-NTR和化恒定區(qū)交界處的接頭區(qū)域;雙下劃線和粗體類型用來顯示接頭區(qū)域 外部序列不相同的位置，在等同于親本P75-NTR Fc-融合蛋白中222的位置處。
[0036] 圖6:p75NTR-Fc在MIA誘導(dǎo)的曬齒動(dòng)物OA模型中顯著減少疼痛。沖<0.1并且*沖< 0.05
[0037] 圖7:根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO. 15) JgGlFc部分W斜體顯示。p75NTR(NBP)部分和化部分之間的接頭序列加下劃線顯 /J、- O
[003引發(fā)明詳述
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種P75NTR神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合蛋白（NBP)-Fc融合蛋 白，所述融合蛋白包含：
[0040] (a)p75NTR(NBP)部分;和
[0041 ] (b)免疫球蛋白化部分。
[0042] 優(yōu)選地，p75NTR(NBP)部分和化部分經(jīng)接頭連接。更優(yōu)選地，接頭包含式Gx的膚，其 中X是1、2、3、4、5或6。
[0043] 在根據(jù)本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，P75NTR (NBP)是人p75NTR(NBP)。在根據(jù)本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí) 施方案中，F(xiàn)c是人Fc。
[0044] 在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQIDN0.15中所述的氨基酸序列或由 SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列組成。
[0045] 優(yōu)選地，P75NTR神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合蛋白p75NTR(NBP)是聚乙二醇化的，進(jìn)一步優(yōu)選 地它是糖基化的。
[0046] 本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白優(yōu)選地與NGF、抓NF、NT3或NT4/5的任一者或多 者W約0.OlnM至約50nM之間的結(jié)合親和力化d)結(jié)合。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合親和 力化d)在約 0.0111]\1和約0.111]\1、0.化]\1、0.511]\1、111]\1、1.511]\1、化]\1、2.511]\1、化]\1、3.511]\1、411]\1、 4.5nM、5nM、5.5nM、6nM、6.5nM、7nM、7.5nM、8nM、8.5nM、9nM、9.5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、 30nM、35nM、40nM、45nM或50nM的任一者之間，如針對(duì)NGF、抓NF、NT3或NT4/5的體外結(jié)合測(cè)定 法中如本文所述那樣測(cè)量，優(yōu)選地通過表面等離子體共振在2(TC測(cè)量。在一些其他的優(yōu)選 實(shí)施方案中，結(jié)合親和力化d)是或小于約250pM、300pM、350pM、400pM、450pM、500pM、550pM、 600口]?、6509]\1、7009]\1、7509]\1、8009]\1、8509]\1、9509]\1或1碰的任一者，如采用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在 p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的體外結(jié)合測(cè)定法中如本文所述那樣測(cè)量，優(yōu)選地通過表面等離 子體共振在20°C所測(cè)量。在又一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合親和力化d)是約0.3nM或約 InM,如采用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的體外結(jié)合測(cè)定法中如本文所述那 樣測(cè)量，優(yōu)選地通過表面等離子體共振在20°C所測(cè)量。
[0047] 優(yōu)選地，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-化融合蛋白用于治療疼痛或疼痛癥狀的用途。不 希望受任何具體理論約束，發(fā)明人認(rèn)為通過實(shí)現(xiàn)前述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、抓NF、NT3或NT4/5 的功能活性(定義為調(diào)節(jié)或者上調(diào)或下調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的功能活性），例如，前述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子因其與其相應(yīng)受體相互作用而產(chǎn)生的功能活性，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實(shí)現(xiàn)治療疼 痛或疼痛癥狀的效力。
[004引優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實(shí)現(xiàn)抓NF的功能活性，如通過W下任一者的功 能測(cè)定法所評(píng)估:神經(jīng)元和突觸的生長(zhǎng)和分化、神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)中的存活和分化、Trk信號(hào) 傳導(dǎo)、體外或體內(nèi)刺激軸突增生。
[0049] 優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實(shí)現(xiàn)NGF的功能活性，如通過測(cè)量NGF與化kA結(jié) 合和TrkA激活所評(píng)估，如經(jīng)典神經(jīng)元存活測(cè)定法（如在Cowan等人，神經(jīng)科學(xué)年鑒 (Annu.Rev.Neurosci . )2〇01 ;24:55I-GOO中提供）中所展示。
[0050] 優(yōu)選地，p75NTR( NBP)-化融合蛋白實(shí)現(xiàn)NGF的功能活性，如通過測(cè)量NT3與內(nèi)源性 Trk受體結(jié)合和內(nèi)源性Trk受體活性激活所評(píng)估，如在化k受體憐酸化、促分裂原活化蛋白激 酶憐酸化報(bào)道分子測(cè)定法或細(xì)胞存活和神經(jīng)突延展測(cè)定法中所展示。
[0051 ] 優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實(shí)現(xiàn)NT4/5的功能活性，如通過測(cè)量NT4/5體外 或體內(nèi)憐酸化和激活測(cè)定法所評(píng)估，例如，在髓銷堿性蛋白(MBP)憐酸化測(cè)定法或可選地在 體內(nèi)在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)/堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生 (angiogenesis)的基質(zhì)膠血管發(fā)生測(cè)定法中所評(píng)估。
[0化2] 優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、NT3、抓NF和NT4/5中一者 或多者的接觸殘基結(jié)合，如化和Garcia(2001)科學(xué)(Science), 301，第870-805頁(yè)中所顯示。
[0053] 優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白是可溶的，優(yōu)選地可溶于水性溶液中，優(yōu)選地可 溶于生物流體如血清、血漿、血液中。
[0054] 如本文所用，術(shù)語"Fe"或"免疫球蛋白化"或"Ig Fe"理解為意指免疫球蛋白鏈恒 定區(qū)的簇基端部分，優(yōu)選地免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的簇基端部分，或其部分。優(yōu)選地，免疫 球蛋白化包含1) CHl域、CH2域和C冊(cè)域，任選地連同免疫球蛋白較鏈區(qū)，2 )邸1域和C肥域，任 選地連同免疫球蛋白較鏈區(qū)，3 )CH1域和CH3域，任選地連同免疫球蛋白較鏈區(qū)，4)CH2域和 CH3域，任選地連同免疫球蛋白較鏈區(qū)或5)選自但不限于CH1、CH2和CH3的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié) 構(gòu)域的組合，任選地與免疫球蛋白較鏈區(qū)組合。優(yōu)選地，免疫球蛋白Fc至少包含免疫球蛋白 較鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和C冊(cè)結(jié)構(gòu)域，和任選地CHl結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，免疫球蛋白Fc包含具有W下 同種型的免疫球蛋白的Fc或Fc部分或由其組成，所述同種型包括但不限于IgG、IgM、IgA、 1邑0、1旨6，進(jìn)一步優(yōu)選地1旨61、1旨62、1旨63、1旨64、1旨41、1旨42、31旨4，更優(yōu)選地1旨61、1旨62或 IgG4，最優(yōu)選地IgGl。任選地，免疫球蛋白Fe還包含了起到使補(bǔ)體固定或抗體依賴性細(xì)胞毒 性最小化或改善與Fe受體結(jié)合的親和力的氨基酸突變、缺失、置換或化學(xué)修飾。
[0055] 進(jìn)一步優(yōu)選地，免疫球蛋白化包含W下任一者或由其組成：（a)CH2域或其部分和 CH3域或其部分，（b)CH2域或其部分，或（c)CH3域或其部分，其中免疫球蛋白化或其部分具 有W下同種型，所述同種型包括但不限于1邑6、1邑1、1邑4、1曲、1巧、進(jìn)一步優(yōu)選地1邑61、1邑62、 I gG3、I gG4、I gA 1、I gA2、SI gA、更優(yōu)選地 I gG 1、I gG2或 I gG4，最優(yōu)選地 I gG 1。
[0056] 優(yōu)選地，免疫球蛋白化包含免疫球蛋白重鏈的簇基末端區(qū)域或由其組成，并且可 W包含來自IgGJgA或I曲抗體同種型的CH2域和/或C冊(cè)域或其部分，或來自IgM或I巧的C肥 域和/或C冊(cè)域和/或CH4域或其部分。優(yōu)選地，免疫球蛋白化包含化片段或由其組成，所述化 片主要段包含CH3和小部分的CH2,如通過胃蛋白酶消化免疫球蛋白可衍生。優(yōu)選地，免疫球 蛋白化包含完整Fe區(qū)或由其組成，所述完整化區(qū)包含C肥和C冊(cè)，額外地與較鏈區(qū)連接，所述 較鏈區(qū)是在完整免疫球蛋白中連接CHl區(qū)和C肥區(qū)的重鏈短片段，如可W通過木瓜蛋白酶消 化免疫球蛋白產(chǎn)生。優(yōu)選地，免疫球蛋白較鏈區(qū)包含較鏈區(qū)或較鏈區(qū)的部分或由其組成，所 述較鏈區(qū)或較鏈區(qū)的部分源自IgG、優(yōu)選人IgG,更優(yōu)選地選自但不限于IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4,最優(yōu)選IgGl,或可選地是前述較鏈區(qū)實(shí)施方案的物種變體或等位變體。所述較鏈區(qū)或 免疫球蛋白較鏈區(qū)的部分可W位于Fe區(qū)的C或N末端處，優(yōu)選地在N末端處。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，免疫球蛋白Fe優(yōu)選地包含免疫球蛋白的化或化 的部分或由其組成，所述免疫球蛋白在CH2區(qū)中包含野生型序列的減少化效應(yīng)子功能的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸突變。優(yōu)選地，運(yùn)些突變是A330、P331至S330、S331(氨基酸編號(hào)相對(duì)于野生 型IgGl序列，其中CH2區(qū)域處于人重鏈IgGl恒定區(qū)中[歐洲免疫學(xué)雜志化ur.J. Immunol.) (1999)29: 2613-2624]。優(yōu)選地，免疫球蛋白化是糖基化并且在生理抑高度帶電，因此有助 于增溶p75NTR(NBP)dFc區(qū)還允許通過抗Fe酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定巧LISA)檢測(cè)p75NTR(NBP)，例 如出于診斷目的。本發(fā)明的p75NTR(NBP)優(yōu)選地在正常糖基化位點(diǎn)處使Ig Fe糖基化的細(xì)胞 中合成。
[0化引優(yōu)選地，免疫球蛋白化包含人免疫球蛋白化區(qū)或由其組成。
[0059]根據(jù)本發(fā)明，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白優(yōu)選地顯示出有利的生物學(xué)特性:改善的 p75NTR(NBP)溶解度和/或p75NTR(NBP)穩(wěn)定性和/或改善的p75NTR(NBP)血清半壽期。改善 的溶解度是合乎需要的，旨在p75NTR(NBP)的生物利用率在給藥時(shí)最大化并且可W確定并 實(shí)施p75NTR(NBP)的精確劑量。改善的溶解度有利于克服聚集體問題，所述聚集體是不想要 的，在體內(nèi)遞送時(shí)造成疼痛并且導(dǎo)致潛在的炎癥。改善的血清半壽期具有W下優(yōu)點(diǎn):促進(jìn)在 治療使用期間為實(shí)現(xiàn)遞送的p75NTR(NBP)的等同治療作用或維持治療作用所要求的劑量水 平減少或給藥頻率減少。在血液或血清中延長(zhǎng)的半壽期和更高的穩(wěn)定性具有如下優(yōu)點(diǎn)：允 許較少頻率給藥和/或較低給藥水平的劑量方案，因此減少體內(nèi)潛在毒性或副作用。在運(yùn)種 情況下，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白在其治療作用方面更強(qiáng)有力和/或在循環(huán)中更穩(wěn)定。所得 的較低或較少給藥頻率在最小化與p75NTR(NBP)給藥可能相關(guān)的任何潛在毒性作用或副作 用方面是有利的。p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的分子量還超過單獨(dú)的p75NTR(NBP)增加，運(yùn)具 有W下優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)靜脈內(nèi)給藥時(shí)，該分子將充分留在血液循環(huán)中，從而降低滲透至非目的部位 (例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)）的風(fēng)險(xiǎn)，并且產(chǎn)生適于在祀向的組織中停留或濃縮的分子。
[0060] 優(yōu)選地，與單獨(dú)的p75NTR(NBP)相比，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白顯示改善的P75NTR (NBP)溶解度和/或改善的p75NTR(NBP)穩(wěn)定性和/或改善的血清半壽期。優(yōu)選地，改善的溶 解度是在水性溶液(如水）中的、優(yōu)選地含有賦形劑如緩沖劑和/或鹽、優(yōu)選地在生理pH、優(yōu) 選地在抑5至抑8之間、優(yōu)選地在約抑7時(shí)的溶解度，或是在生物流體如血清或血液中的 溶解度。優(yōu)選地，改善的穩(wěn)定性是在一段時(shí)間范圍內(nèi)、在一個(gè)儲(chǔ)存時(shí)間期間或在冷凍和融化 后p75NTR(NBP)蛋白的活性或結(jié)構(gòu)完整性因變性、氧化、片段化或聚集效應(yīng)所致的穩(wěn)定性。 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可W由變性、氧化、團(tuán)集或聚集的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量判定，可W通過本文中公開的結(jié)合測(cè) 定法或功能測(cè)定法測(cè)量活性的穩(wěn)定性，測(cè)量蛋白質(zhì)血清半壽期的方法是已知的。
[0061 ]優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W從多種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞W高水平表達(dá)W 提供單一種類并且可W有效地通過親和層析純化，例如通過與金黃色葡萄球菌 (Staphylococ州S aureus)蛋白A結(jié)合來純化。優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W二聚 化，并且優(yōu)選地，與單獨(dú)的p75NTR(NBP)相比，二聚體對(duì)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、抓NF、NT3或 NT4/5具有增加的親和力。更緊密的結(jié)合具有更高效力和更高治療功效的優(yōu)點(diǎn)，如通過 p75NTR(NBP)效果所判定，例如，如通過本文中公開的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子功能測(cè)定法所測(cè)定。更 高的效力具有如下益處:p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W按較低劑量使用W實(shí)現(xiàn)相同的治療 功效，因此減少體內(nèi)潛在毒性或副作用。
[0062] 優(yōu)選地，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白具有約或大于W下任一者的體內(nèi)半壽 期：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、 54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、 104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、 142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、 180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208或210小時(shí)+/-1小時(shí)， 本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白進(jìn)一步優(yōu)選地具有約或大于24小時(shí)的體內(nèi)半壽期。
[0063] 本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白進(jìn)一步優(yōu)選地具有約或大于W下任一者的體 外半壽期：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、 50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、 100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、 138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、 176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208或210日+/-1日，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白進(jìn)一步優(yōu)選地具有約或大于6日的體外半壽期。優(yōu) 選地在約生理pH、在緩沖的水性溶液，優(yōu)選地在20°C或37 °C測(cè)量穩(wěn)定性。
[0064] 根據(jù)前述優(yōu)選實(shí)施方案，體內(nèi)半壽期優(yōu)選地是在大鼠中的半壽期或在人類中的半 壽期，更優(yōu)選地是在人類中的半壽期。優(yōu)選地，在體內(nèi)給藥例如通過靜脈內(nèi)或皮下注射后， 從本發(fā)明p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的血清測(cè)量水平確定半壽期。
[0065] p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的p75NTR(NBP)和免疫球蛋白化部分可W由接頭連接。 接頭優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸或由其組成或者包含具有如下個(gè)氨基酸的多膚序列或 由其組成:優(yōu)選地約1至約25個(gè)氨基酸、優(yōu)選地1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)氨基酸的任意個(gè)氨基 酸、進(jìn)一步優(yōu)選地約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 個(gè)氨基酸的任一 個(gè)氨基酸，最優(yōu)選地13個(gè)氨基酸。
[0066] 優(yōu)選地，接頭包含缺少任何穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)如a螺旋、0鏈、310螺旋和Pi螺旋、多聚脯 氨酸螺旋、a折疊的氨基酸的多膚序列或由其組成。優(yōu)選地，接頭區(qū)域包含限定柔性或動(dòng)態(tài) 或非結(jié)構(gòu)化多膚如柔性環(huán)、隨機(jī)卷曲或柔性轉(zhuǎn)角的氨基酸的多膚序列或由其組成，經(jīng)常發(fā) 現(xiàn)運(yùn)類非結(jié)構(gòu)化多膚連接大蛋白質(zhì)分子中的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。
[0067] 優(yōu)選地，接頭是如下氨基酸的多膚序列，所述氨基酸包含p75NTR(NBP)中大于或約 50 %的甘氨酸和/或丙氨酸和/或絲氨酸，進(jìn)一步優(yōu)選地包含p75NTR(NBP)中大于或約55 %、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的甘氨酸和/或丙氨酸和/或絲氨酸。 接頭區(qū)域優(yōu)選地包含如下氨基酸的多膚序列或由其組成，所述氨基酸包含甘氨酸和絲氨酸 二者，優(yōu)選地甘氨酸的比例大于絲氨酸的比例，接頭區(qū)域優(yōu)選地包含柔性接頭或由其組成。
[0068] 不希望受任何具體理論約束，發(fā)明人認(rèn)為，柔性接頭克服或防止空間位阻，其中與 單獨(dú)的p75NTR(NBP)相比時(shí)，所述空間位阻可能干擾p75NTR(NBP)-Fc融合物的前述神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子結(jié)合能力或生物活性。因此，接頭區(qū)域優(yōu)選地允許p75NTR(NBP)部分和免疫球蛋白化 部分之間的柔性并且與單獨(dú)的游離或天然p75NTR(NBP)相比，允許保留或改善P75NTR (NBP)-Fc融合蛋白的前述生物活性，如使用如本文所述的結(jié)合測(cè)定法通過與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 的結(jié)合所測(cè)定。
[0069] 進(jìn)一步優(yōu)選地，接頭是免疫上惰性的，從而它不觸發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解，不刺激抗體 依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，不活化小膠質(zhì)細(xì)胞或T細(xì)胞。優(yōu)選地，接頭區(qū)域在運(yùn)些活 性的一種或多種活性方面減弱。
[0070] 進(jìn)一步優(yōu)選地，接頭包含從結(jié)構(gòu)分析或結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中已知或預(yù)測(cè)為柔性或動(dòng)態(tài)或非 結(jié)構(gòu)化多膚或缺少穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的多膚或由其組成。
[0071 ]最優(yōu)選地，接頭包含式Gx的膚或由其組成，其中X是1、2、3、4、5或6。
[0072] 本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白還可W包含蛋白酶剪切位點(diǎn)，所述剪切位點(diǎn)任 選地間插在p75NTR(NBP)部分和免疫球蛋白化部分之間。該蛋白酶剪切位點(diǎn)可W位于接頭 中或接頭與p75NTR(NBP)部分或/和免疫球蛋白化部分的交界處。p75NTR(NBP)可W任選地 在配制和或?yàn)橹委熌康慕o藥之前從免疫球蛋白Fc部分切下。
[0073] 備選地，本發(fā)明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W經(jīng)工程化W移除蛋白酶剪切位 點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可W移除a分泌酶切割位點(diǎn)和丫分泌酶切割位點(diǎn)。在一個(gè)特別 優(yōu)選的實(shí)施方案中，移除序列GSSQPWTRGTTDNDIEGR MD(SEQ ID N0.5)。
[0074] 在其他的優(yōu)選實(shí)施方案中，可W改變p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白中的某些氨基酸W 改善特性如產(chǎn)率或溶解度。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案是將位置222處的半脫氨酸殘基變成 絲氨酸殘基，發(fā)現(xiàn)所述改變?cè)谥圃煸摰鞍踪|(zhì)期間從C冊(cè)細(xì)胞表達(dá)時(shí)減少蛋白質(zhì)的聚集。
[0075] 優(yōu)選地，接頭和/或免疫球蛋白化部分不損害或不明顯損害p75NTR(NBP)部分：
[0076] (a)對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、抓NF、NT3或NT4/5的功能活性的影響（定義為調(diào)節(jié)或上調(diào) 或下調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的功能活性），
[0077] (b)針對(duì)NGF、抓NF、NT3或NT4/5中任一者的結(jié)合親和力，結(jié)合親和力在約O.lnM至 約50nM之間，
[007引 （C)與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、NT3、抓NF和NT4/5每一者、優(yōu)選地與人NGF、NT3、抓NF和 NT4/5結(jié)合的能力。
[0079] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供編碼根據(jù)第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc 融合蛋白的核酸分子。優(yōu)選地，該核酸分子用于治療疼痛。
[0080] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該核酸分子還可W包含編碼信號(hào)序列，優(yōu)選地 P75NTR信號(hào)序列的區(qū)域，例如DNA或RNA序列。
[0081] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可復(fù)制表達(dá)載體，所述載體 包含第=方面的核酸分子，優(yōu)選地該載體是病毒載體。優(yōu)選地，該載體用于治療疼痛的用 途。
[0082] 進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明的W上方面，提供一種表達(dá)本發(fā)明的核酸分子或載體W產(chǎn)生或 分泌p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的方法。優(yōu)選地，該方法包括將核酸分子或載體引入細(xì)胞并 且在其中表達(dá)所述核酸W產(chǎn)生或分泌p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白。優(yōu)選地，將核酸分子或載 體體外引入細(xì)胞中，可選地體內(nèi)引入。優(yōu)選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的表達(dá)是體外表 達(dá)，任選地進(jìn)一步分離并純化，備選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的表達(dá)優(yōu)選地是體內(nèi)表 達(dá)，體內(nèi)表達(dá)優(yōu)選地構(gòu)成基因治療。優(yōu)選地，載體是可復(fù)制表達(dá)載體，任選地用于轉(zhuǎn)染哺乳 動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選地，載體是病毒載體。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種攜帶第=方面或第四方面的核酸分子或載體 的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供用于治療疼痛或疼痛癥狀的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白，或用于治療疼痛或疼痛癥狀的核酸或載體。疼痛或疼痛癥狀可W包括但不限于：
[0085] (a)急性疼痛和/或自發(fā)性疼痛，
[0086] (b)慢性疼痛和或持續(xù)性疼痛，
[0087] (C)炎性疼痛，包括W下任一種:關(guān)節(jié)炎疼痛、因骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生 的疼痛、因炎性腸病、銀屑病和濕疹產(chǎn)生的疼痛，
[0088] (d)傷害性疼痛，
[0089] (e)神經(jīng)性疼痛，包括痛苦的糖尿病性神經(jīng)病或與瘤疹后神經(jīng)痛相關(guān)的疼痛，
[0090] (f)痛覺過敏，
[0091] (g)異常性疼痛，
[0092] 化）中樞性疼痛、中樞性中風(fēng)后疼痛、因多發(fā)性硬化產(chǎn)生的疼痛、因脊髓損傷產(chǎn)生 的疼痛或因帕金森病或癒痛產(chǎn)生的疼痛，
[0093] (i)癌癥疼痛，
[0094] (j)術(shù)后疼痛，
[0095] 化）內(nèi)臟疼痛，包括消化道內(nèi)臟疼痛和非消化道內(nèi)臟疼痛，因胃腸(GI)素亂所致的 疼痛、因功能性腸病癥(FBD)產(chǎn)生的疼痛、因炎性腸?。↖BD)產(chǎn)生的疼痛、因痛經(jīng)、盆腔疼痛、 膀脫炎、間質(zhì)性膀脫炎或膜腺炎產(chǎn)生的疼痛，
[0096] (1)肌肉骨骼疼痛、肌痛、纖維肌痛、脊柱炎、血清陰性(非類風(fēng)濕性)關(guān)節(jié)病、非關(guān) 節(jié)風(fēng)濕病、抗肌萎縮蛋白病、糖原分解、多發(fā)性肌炎、化脈性肌炎，
[0097] (m)屯、臟或血管疼痛、因屯、絞痛(angina)、屯、肌梗死、二尖瓣狹窄、屯、包炎、雷諾氏 現(xiàn)象、硬皮病(scleredoma)、硬皮病或骨骼肌局部缺血所致的疼痛，
[0098] (n)頭部疼痛，其包括偏頭痛、有先兆偏頭痛、無先兆偏頭痛、化集性頭痛、緊張型 頭痛。
[0099] (O) 口面疼痛，其包括牙疼痛、飄額肌筋膜疼痛或耳鳴，或
[0100] (P)背痛、滑囊炎(menstrual pain)、月經(jīng)疼痛、偏頭痛、牽涉痛、蘭叉神經(jīng)痛、超敏 (hypersensitisation)、因脊柱創(chuàng)傷和/或變性或腦卒中（stroke)產(chǎn)生的疼痛D
[0101] 疼痛的治療包括，但不限于，預(yù)防疼痛和/或疼痛癥狀、改善疼痛和/或疼痛癥狀、 控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率，或延遲疼痛和/或疼痛癥狀形 成或進(jìn)展。
[0102] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的 p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根據(jù)第蘭方面和第四方面的核酸分子或載體，其中P75NTR (NBP)-Fc融合蛋白或核酸分子或載體在組合中與第二藥理活性化合物組合時(shí)分別、依次或 同時(shí)使用。優(yōu)選地，組合的第二藥理活性化合物可W包括但不限于：
[0103] ?阿片類鎮(zhèn)痛藥，例如嗎啡（morphine)、海洛因 （hero in)、氨嗎啡酬 (hydromorphone)、鞋嗎啡酬（OX ymorphone)、左啡諾（Ievorphanol)、左洛啡焼 (Ievallorphan)、美沙酬（methadone)、賊替晚（meperidine)、芬太尼（fentanyl)、可卡因 (cocaine)、可待因（codeine)、雙氨可待因（diihydrocodeine)、鞋考酬（0巧codone)、氨可酬 化y虹ocodone)、右丙氧芬（propo巧phene)、納美芬（nalmefene)、締丙嗎啡（nalorphine)、 納洛酬（naloxone)、納曲酬（naltrexone)、下丙諾啡（buprenoi'phine)、布托啡諾 (butorphanol)、納布啡(na化uphine)或噴他佐辛（pentazocine);
[0104] ?非醬體抗炎藥（NSAID)，例如阿司匹林、雙氯芬酸（diclofenac)、二氣尼柳 (diflusinal)、依托度酸（etodolac)、芬布芬（fenbufen)、非諾洛芬（fenoprofen)、氣苯柳 (fIufenisal)、氣比洛芬（flurbiprofen)、布洛芬（ibuprofen)、嘲噪美辛（indomethacin)、 酬洛芬（ketoprofen)、酬咯酸（ketorolac)、甲氯芬那酸（meclofenamic acid)、甲芬那酸 (mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、薰了美酬（nabumetone)、薰普生（naproxen)、尼 美舒利（nimesulide)、硝基氣比洛芬（nitrof Iurbiprofen)、奧沙控秦（olsalazine)、奧沙 普秦（oxaprozin)、保泰松（phenylbutazone)、f?羅昔康（piroxicam)、柳氮(6黃fI比晚 (sulfasalazine)、舒林酸（sulindac)、托美了（tolmetin)或佐美酸（zomepirac);
[010日]?己比妥類鎮(zhèn)靜劑，例如異戊己比妥（amobarbital)、阿普比妥（aprobarbital)、 仲下己比妥（butabarbital)、布他比妥(butabital)、甲苯比妥(mephobarbital)、美沙比妥 (me t harb i tal )、美索比妥（me thohexital)、戊己比妥（pentobarbital)、苯己比妥 (phenobai'tital)、司可己比妥（secobarbital)、他布比妥（ta化Utal)、塞米樂（theamylal) 或硫噴妥（thiopental);
[0106] ?具有鎮(zhèn)靜作用的苯二氮草（b e n Z O d i a Z e P i n e )，例如氯氮幕 (chlordiazepoxide)、氯控孽酉堇(CIorazepate)、地西泮(diaz邱am)、氣西泮(f Iurazepam)、 勞控西泮（Iorazepam)、奧沙西泮（oxazepam )、替馬西泮（temazepam)或SP坐侖 (triazolam);
[0107] ?具有鎮(zhèn)靜劑作用的Hi掉抗劑，例如苯海控明（diphenhydramine)、fl比控明 (pyrilamine)、異丙嗦（promethazine)、氯苯那敏（chIorpheniramine)或氯環(huán)利嗦 (chlorcyclizine);
[0108] ?鎮(zhèn)靜劑，如格魯米特（glutethimide )、甲丙氨醋（meprobamate )、甲唾酬 (methaqualone)^^^^if tk#(dichloralphenazone)；
[0109] ?骨骼肌松弛藥、例如己氯芬（baclofen)、卡立普多（carisoprodol)、氯P坐沙宗 (chlorzoxazone)、環(huán)苯扎林（cyclobenzaprine)、美索己莫(methocarbamol)或鄰甲苯?？?明（orphrenadine);
[0110] ? MWDA受體掉抗齊I」，例如右美沙芬（dextromethoi'phan) (( + )-3-H-N-甲基嗎啡 喃）或其代謝物右啡焼(dextrorphan)(( + )-3-H-N-甲基嗎啡喃）、氯胺酬(ketamine)、美金 巧Ij (memantine)、fl比咯并唾嘟奎寧（pyrroloquinoline quinine)、順-4-(麟醜甲基）-2-賊晚 簇酸、布地品（budipine)、EN-323UMorphiDex帶，嗎啡和右美沙芬（dextromethOTphan) 的組合制劑）、托化醋（topiramate)、奈控美生(neramexane)或培凈福太(perzinfotel)，包 括NR2B掉抗劑，例如艾芬地爾Qfe叩rodil)、曲索羅地(traxoprodil)或（-)-(R)-6-{2-[4-(3-氣苯基)-4-鞋-1-賊晚基]-1-?乙基-3,4-二氨-2(1H)-唾嘟酬；
[0111] ? Q-腎上腺素能藥，例如多沙蜂嗦（doxazosin)、坦索羅辛（tamsulosin)、可樂定 (clonidine)、脈法辛（guanfacine)、右美托咪定（dexmetatomidine)、莫達(dá)非尼 (111〇(13爭(zhēng)111。）、或4-氨基-6,7-二甲氧基-2-(5-甲焼-亞礦醜氨基-1，2,3,4-四氨異唾嘟-2-基)-5-(2-化晚基)唾蜂嘟；
[0112] ? S環(huán)抗憂郁藥，例如地昔帕明（desipramine)、丙米嗦（imipramine)、阿米替林 (amitriptyline)或去甲替林(nortriptyline);
[0113] ?抗驚厥藥，例如卡馬西平、控莫S嗦（lamotrigine)、托fI比醋（topiratmate)或丙 戊酸鹽（valproate);
[0114] ?速激版(NK)掉抗齊I」，特別地是NK-3、NK-2或NK-I掉抗劑，例如（aR，9R)-7-[3,5- 雙(S氣甲基）芐基]-8,9,10,11-四氨-9-甲基-5-(4-甲基苯基)-7H-[l，4]二氮雜環(huán)辛并 [2，1-容][1，7]-薰晚-6-13-二酬（了八1(-637)、5-[[(2民，35)-2-[(1民)-1-[3,5-雙(蘭氣甲基） 苯基]乙氧基-3-(4-氣苯基)-4-嗎嘟基]-甲基]-1,2-二氨-3H-1，2,4-SP坐-3-酬(MK-869)、 阿瑞化坦（aprepitant)、控奈匹坦（Ianepitant)、達(dá)匹坦（dapitant)或3-[ [2-甲氧基-5-(蘭氣甲氧基)苯基]-甲氨基]-2-苯基賊晚(2S，3S);
[011日]?毒葦堿掉抗劑，例如奧昔布寧（oxybutynin)、托特羅定（tolterodine)、丙賊維 林（propiverine)、曲司氯饋（tropsium chloride)、達(dá)非那新（darifenacin)、索利那辛 (soIifenacin)、替米維林（temiverine)和異丙托饋（ipratropium);
[0116] ?C0X-2選擇性抑制劑，例如塞來考昔（celecoxib)、羅非考昔（rofecoxib)、帕瑞 考昔（parecoxiLb)、伐地考昔（valdecoxib)、地控考昔（deracoxiib)、依托考昔（etoricoxib) 或魯米考昔（lumiracoxiLb);
[0117] ?煤焦油鎮(zhèn)痛藥，尤其樸熱息痛(paracetamol);
[0118] ?神經(jīng)安定藥，如氣賊利多（droperidol)、氯丙嗦（chlorpromazine)、氣賊晚醇 (haloperidol)、奮乃靜（perphenazine)、硫利達(dá)嗦（thioridazine)、美索達(dá)嗦 (mesoridazine)、S氣控嗦（trifluoperazine)、氣奮乃靜（fIuphenazine)、氯氮平 (clozapine)、奧氮平（olanzapine)、利培酬（risperidone)、齊控西酬（Ziprasidone)、唾硫 平（quetiapine)、舍嘲噪（sertindole)、阿立賊 P坐（aripiprazole)、索奈賊 口坐 (sonepiprazole)、布南色林（blonanserin)、伊潘立酬（iloperidone)、贓羅匹隆 (perospirone)、雷氯必利（raclopride)、佐替平（ZOtepine)、聯(lián)苯蘆諾（bifeprunox)、阿塞 那平（asenapine)、魯拉西酬（Iuras idone)、氨橫必利（amisulpr ide)、己拉皮利酬 (balaperidone)、帕林朵（palindore)、依利色林（邱Iivanserin)、奧沙奈坦（osanetant)、 利莫納班(rimonabant)、美蘭納坦(mecline;rtant)、Miraxi〇n夠或沙立佐坦（sarizotan);
[0119] ?香草素受體(vanilloid receptor)激動(dòng)劑（例如樹膠脂毒素(resinferatoxin) 或括抗劑（例如辣椒平（capsazepine));
[0120] ? 0-腎上腺素能藥如普糞洛爾（propranolol);
[0121 ] ?局部麻醉藥如美西律(mexiletine);
[0122] ?皮質(zhì)類固醇如地塞米松（dexamethasone);
[012引 ? 5-HT受體激動(dòng)劑或括抗劑，特別地5-HTiB/iD激動(dòng)劑如依立曲坦(eletriptan)、舒 馬曲坦（sumatriptan)、那拉曲坦（naratriptan)、佐米曲坦（zolmihiptan)或利扎曲坦 (rizatriptan)；
[0124] ? 5-HT2A雙體括抗劑如R( + )-a-(2,3-二甲氧基-苯基)-1-[2-(4-氣苯乙基）]-4-贓 晚甲醇(MDk100 907);
[01巧]?膽堿能（煙堿)鎮(zhèn)痛藥，如異丙克蘭（ispronicline)(TC-1734)、化)-N-甲基-4-(3-化晚基)-3-下締-1-胺(RJR-2403)、（R)-5-(2-日丫下晚基甲氧基)-2-氯化晚(ABT-594)或 尼古下；
[0126] ?化巧多飯（Tramado愼）；
[0127] . PDEV抑制劑，如5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-贓嗦基-橫酷基)苯基]-1-甲基-3-正丙基-1,6-二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚-7-酬（西地那非（sildenafil))、（6R，12aR)-2， 3，6，7，12，12a-六氨-2-甲基-6-(3，4-亞甲二氧苯基)-化嗦并[2 '，1' ： 6，1 ]-化晚并[3，4-b ] 嗎隙-1,4-二酬（IC-351或他達(dá)拉非（tadalafil))、2-[2-乙氧基-5-(4-乙基-贓嗦-1-基-1-橫酷基）-苯基]-5-甲基-7-丙基-3H-咪挫并[5，1-門[1，2,4]立嗦-4-酬（伐地那非 (￥曰'(16]1曰門1))、5-(5-乙酷基-2-了氧基-3-11比晚基）-3-乙基-2-(1-乙基-3-日丫了晚基）-2, 6- 二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚-7-酬、5-(5-乙酷基-2-丙氧基-3-化晚基)-3-乙基-2-(1-異丙基-3-日丫下晚基)-2,6-二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚-7-酬、5-[2-乙氧基-5-(4-乙基贓 嗦-1-基橫酷基川比晚-3-基]-3-乙基-2-[2-甲氧乙基]-2,6-二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚- 7- 酬、4-[(3-氯-4-甲氧芐基）氨基]-2-[(25)-2-(徑甲基川比咯燒-1-基]-N-(喀晚-2-基甲 基)喀晚-5-甲酯胺、3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6,7-二氨-IH-化挫并[4,3-d]喀晚-5-基)-N-[2-( 1-甲基[I比咯燒-2-基）乙基]-4-丙氧基苯橫酷胺；
[01 巧]?大麻素（cannabinoid);
[0129] ?促代謝型谷氨酸鹽亞型1受體(mGluRl)括抗劑；
[0130] ?血清素再吸收抑制劑，如舍曲林（sertraline)、舍曲林代謝物-去甲基舍曲林、 氣西汀（f Iuoxetine)、諾氣西?。╪orf IuoxetineK氣西汀去甲基代謝物）、氣伏沙明 (fluvoxamine)、帕羅西汀(paroxetine)、西獻(xiàn)普蘭山;[1日109招111)、西獻(xiàn)普蘭代謝物-去甲基 西獻(xiàn)普蘭（(16311161：1171。；[1日10口抑111)、艾司西獻(xiàn)普蘭（63。；[1日10口^111)、(1,1-芬氣拉明（(1,1-fenfluramine)、非莫西?。╢emoxetine)、伊福西?。╥foxetine)、氯基度硫平 (cyanodothiepin)、利托西汀（Iitoxetine)、達(dá)泊西?。╠apoxetine)、奈法挫酬 (nefazodone)、西文氯胺（cericl amine)和曲挫酬（trazodone);去甲腎上腺素 (noradrenalineK去甲腎上腺素 （norepinephrine ))再吸收抑制劑，如馬普替林 (maprotiline)、洛非帕明（Iofepramine)、米氮平（mirtazepine)、徑丙替林 (oxaprotiline)、非挫拉明（fezolamine)、托莫西?。╰omoxetine)、米安色林(mianserin)、 安非他酬（buproprion)、安非他酬代謝物-?安非他酬化ydroxyb叫roprion)、諾米芬辛 (nomifensine)和維洛沙秦(ViIoxazine)( VivalaiT貨）、.特別地是選擇性去甲腎上腺素再 吸收抑制劑如瑞波西汀(reboxetine)、尤其(S，S)-瑞波西??；
[0131] ?血清素-去甲腎上腺素再吸收雙重抑制劑，如文拉法辛（venlafaxine)、文拉法 辛代謝物O-去甲基文拉法辛（〇-desmethylvenlafaxine)、氯米帕明（clomipramine)、氯米 帕明代謝物-去甲基氯米帕明（desmethylclomipramine)、度洛西?。╠uloxetine)、米那普 侖(milnacipran)和丙咪嗦（imipramine);
[0132] .誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS)抑制劑，如S-[2-[(l-亞氨乙基)氨基]乙基]-心同 型半脫氨酸、S-[2-[(l-亞氨乙基)氨基]乙基]-4,4-二氧代半脫氨酸、S-[2-[(l-亞氨乙 基)氨基]乙基]-2-甲基-k半脫氨酸、（2S，5Z)-2-氨基-2-甲基-7-[(l-亞氨乙基)氨基]-5-庚締酸、2-[[(lR，3S)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基）下基]硫代]-5-氯-3-化晚甲臘；2-[[(13,35)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基)-下基]硫代]-4-氯苯臘、（25,41〇-2-氨基-4-[[2-氯-5-(S氣甲基）苯基]硫代]-5-嚷挫下醇、2-[[(13,35)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基）下 基]硫代]-6-(S氣甲基)-3-化晚甲臘、2-[[(lR，3S)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基）下基]硫 代]-5-氯苯臘、N-[4-[2-(3-氯節(jié)氨基）乙基]苯基]嚷吩-2-甲脈或脈基乙基二硫酸；
[0133] ?乙酷膽堿醋酶抑制劑，如多奈贓齊(donepezil);
[0134] ?前列腺素 E2亞型4(EP4)括抗劑，如N-[({2-[4-(2-乙基-4,6-二甲基-IH-咪挫并 [4,5-c]化晚-1-基）苯基]乙基}氨基）-幾基]-4-甲基苯橫酷胺或4-[(lS)-1-({[5-氯-2-(3-氣苯氧基川比晚-3-基]幾基}氨基）乙基]苯甲酸；
[0135] ?白S締 B4括抗劑;如1-(3-聯(lián)苯基-4-基甲基-4-?-苯并二氨化喃-7-基)-環(huán)戊 燒簇酸(CP-105696)、5-[2-(2-簇乙基)-3-[6-(4-甲氧苯基)-祀-己締基]氧苯氧基]-戊酸 (0N0-4057)或DPC-I1870，
[0136] ? 5-脂加氧酶抑制劑，如齊留通^11611*〇11)、6-[(3-氣-5-[4-甲氧基-3,4,5,6-四 氨-2H-化喃-4-基])苯氧甲基]-1-甲基-2-哇諾酬(ZD-2138)或2,3,5-S甲基-6-(3-化晚基 甲基）、1，4-苯釀(CV-6504);
[0137] ?鋼通道阻滯劑，如利多卡因（Iidocaine);或
[013引 ? 5-HT3括抗劑，如昂丹司瓊(ondansetron);
[0139] W及它們藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑化物。
[0140] 根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種治療、預(yù)防、緩解、控制、減少個(gè)體中疼痛形成 或進(jìn)展或任何前述疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率或延遲疼痛形成或進(jìn)展或任何前述疼痛 和/或疼痛癥狀的方法，所述方法包括向個(gè)體給藥有效量的根據(jù)第一方面或第二方面或其 優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體。
[0141] 本發(fā)明適用于人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。優(yōu)選地，個(gè)體是哺乳動(dòng)物，例如伴侶動(dòng)物 如馬、貓或犬或家畜如羊、?；蜇i。最優(yōu)選地，個(gè)體是人。
[0142] 根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供一種用于治療、預(yù)防、緩解、控制、減少疼痛形成或進(jìn) 展或任何前述疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率或延遲疼痛形成或進(jìn)展或任何前述疼痛和/或 疼痛癥狀的組合物，所述組合物包含根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的P75NTR (NBP)-Fc融合蛋白，或根據(jù)第S方面和第四方面的核酸分子或載體和藥學(xué)上可接受的載體 和/或賦形劑。
[0143] 優(yōu)選地，制備根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白或根據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物用于或適于口服、舌 下、頰部、局部、直腸、吸入、透皮、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、屯、內(nèi)、骨內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng) 粘膜、陰道、玻璃體內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、關(guān)節(jié)周、局部或皮內(nèi)給藥。
[0144] 優(yōu)選地，制備根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白、或根據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物是用于或適 于疼痛發(fā)作之前和/或期間和/或之后給藥或用于或適于運(yùn)類用途。
[0145] 優(yōu)選地，制備根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-Fc或根 據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物用于或適于每周1次至 7次之間給藥，進(jìn)一步優(yōu)選地每月1次至4次之間給藥、進(jìn)一步優(yōu)選地每6個(gè)月時(shí)間1次至6次 之間給藥，進(jìn)一步優(yōu)選地每年1次至12次給藥。優(yōu)選地，將藥物意在或制備意在W包括但不 限于W下的時(shí)間外周地給藥:每日1次、每2、3、4、5或6日1次、每周1次、每2周1次、每3周1次、 每月1次、每2個(gè)月1次、每3個(gè)月1次、每4個(gè)月1次、每5個(gè)月1次、每6個(gè)月1次、每7個(gè)月1次、每8 個(gè)月1次、每9個(gè)月1次、每10個(gè)月1次、每11個(gè)月1次或每年1次。
[0146] 進(jìn)一步優(yōu)選地，將根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-Fc 融合蛋白或根據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物意在或 制備意在通過包括但不限于W下的一個(gè)或多個(gè)途徑外周地給藥：口服、舌下、經(jīng)頰地、局部、 直腸、通過吸入、經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或肌內(nèi)、通過屯、內(nèi)給藥、骨內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng) 粘膜、陰道、玻璃體內(nèi)、表皮、關(guān)節(jié)內(nèi)、關(guān)節(jié)周或局部途徑。
[0147] 優(yōu)選地，制備根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白，或根據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物用于或適于 W約0.05mg/ml至約200mg/ml之間的濃度；優(yōu)選地在W如下任一個(gè)濃度：約0.05mg/ml、 0.Img/ml、0.5mg/ml、Img/ml、5mg/ml、1Omg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、 85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml、lOOmg/ml、IlOmg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、lSOmg/ ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml 或 200mg/ml+/-約 10 % 誤差，最優(yōu)選地在獸醫(yī) 應(yīng)用中W約3mg/ml及人類中Wo. Img/ml給藥。
[0148] 優(yōu)選地，制備根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白或根據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物用于或適于 W約0 . Img/kg至約200mg/kg體重之間的濃度;優(yōu)選地在W如下任一個(gè)濃度：約0.5mg/kg、 Img/kg、5mg/kg、lOmg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/ kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、7〇mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、 95mg/kg、lOOmg/kg、11Omg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/ kg、180mg/kg、190mg/kg或約200mg/kg體重+/-約10 %誤差，最優(yōu)選地在獸醫(yī)應(yīng)用中W約 lOmg/kg及人類中Wo. 3mg/kg給藥。
[0149 ]根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供一種試劑盒，其包含：
[0150] (a)根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的p75NTR(NBP)-化融合蛋白，或 根據(jù)第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物;和
[0151] (b)針對(duì)W下任一種或多種情況向個(gè)體給藥有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋 白、核酸分子、載體或藥物組合物的說明書:預(yù)防或治療疼痛和/或疼痛癥狀或用于緩解疼 痛和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率，或延遲疼 痛和/或疼痛癥狀形成或進(jìn)展。
[0152] 該試劑盒可W包含一個(gè)或多個(gè)容器，所述容器含有本文所述的p75NTR(NBP)-Fc融 合蛋白、核酸、載體或藥物組合物，和根據(jù)本發(fā)明任何方法和用途的使用說明書。試劑盒還 可W包含選擇適于治療的個(gè)體的描述，所述選擇基于鑒定該個(gè)體是否具有疼痛或疼痛癥狀 或面臨具有運(yùn)種疼痛或疼痛癥狀的風(fēng)險(xiǎn)。用于給藥藥物組合物的說明書可W包含信息，如 關(guān)于預(yù)期治療的劑量、給藥方案和給藥途徑。
[0153] 根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供根據(jù)第一方面或第二方面或其優(yōu)選實(shí)施方案的 p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據(jù)第S方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥 物組合物用于W下任一種或多種情況:預(yù)防或治療病狀或病狀的癥狀或緩解該病狀或該病 狀的癥狀、控制該病狀或該病狀的癥狀、減少該病狀或該病狀的癥狀發(fā)生率，或延遲該病狀 或該病狀的癥狀形成或進(jìn)展，所述病狀與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5的任一種或 多種相關(guān)。
[0154] -NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子）與至少兩類受體P75NTR和化kA(-種參與軸突生長(zhǎng)、支化和 伸長(zhǎng)的跨膜酪氨酸激酶)結(jié)合。與NGF相關(guān)的病狀和癥狀是已知的。NGF在炎性病癥和疼痛中 表達(dá)并與之相關(guān)[蛋白質(zhì)序列NP_002497.2，NP_038637]。另外，已經(jīng)顯示NGF在許多屯、血管 疾病如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥、2型糖尿病和代謝綜合征中W及在多發(fā)性硬化中發(fā)揮作 用。降低的NGF血漿水平（W及另外降低的抓NF血漿水平）已經(jīng)與急性冠狀動(dòng)脈綜合征和代 謝綜合征相關(guān)。NGF還與各種精神病癥相關(guān)，如癡呆、抑郁、精神分裂癥、孤獨(dú)癥、Rett綜合 征、神經(jīng)性厭食和神經(jīng)性貪食，并且還已經(jīng)設(shè)及阿爾茨海默病和神經(jīng)變性病的形成。還已經(jīng) 顯示NGF加速傷口愈合，并且存在它可W用于治療皮膚潰瘍和角膜潰瘍的證據(jù)，已經(jīng)顯示它 減少神經(jīng)變性并在大鼠中促進(jìn)外周神經(jīng)再生。
[01W] -m)NF(腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)是在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間支持神經(jīng)元存活和生長(zhǎng)的神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[蛋白質(zhì)序列肥_001137277.1、肥_001041604]。抓^結(jié)合細(xì)胞表面受體化48和 P75NTR并且還調(diào)節(jié)a-7煙酸受體的活性。與抓NF相關(guān)的病狀和癥狀是已知的。已經(jīng)顯示抓NF 在生理疼痛和病理疼痛傳遞方面、特別在其中發(fā)現(xiàn)BDNF合成大大增加的急性疼痛、炎性疼 痛和神經(jīng)性疼痛的模型中發(fā)揮重要作用;還已經(jīng)顯示抓NF在慢性疼痛病狀W及其他病狀如 濕疹和銀屑病中上調(diào)。在抑郁、精神分裂癥、強(qiáng)迫性障礙、阿爾茨海默病、亨廷頓病病、Rett 綜合征和癡呆W及神經(jīng)性厭食和神經(jīng)性貪食中觀察到BDNF的下調(diào)。
[0156]-神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4(NT-4)，也稱作神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-5(NT-5)，是優(yōu)勢(shì)地經(jīng)P75NTR受體 和化kB受體傳導(dǎo)信號(hào)并促進(jìn)外周感覺交感神經(jīng)神經(jīng)元存活的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。運(yùn)種蛋白質(zhì)的 成熟膚在檢查過的全部哺乳動(dòng)物（包含人、豬、大鼠和小鼠）中是相同的[蛋白質(zhì)序列NP_ 006170，NP_937833LNT-4大多由背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)元和椎旁和椎前交感神經(jīng)節(jié)、脊 髓背角和腹角中的那些神經(jīng)元合成，并且發(fā)現(xiàn)在許多組織（包括前列腺、胸腺、胎盤和骨骼 肌）中表達(dá)。與NT-4/5相關(guān)的病狀和癥狀是已知的。NT4/5中的缺陷與原發(fā)性開角型青光眼 的易患性相關(guān)。還已經(jīng)顯示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子子4有助于乳腺癌細(xì)胞存活并且是抑制腫瘤生長(zhǎng) 的祀。NT-4/5已知參與疼痛-信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，如傷害性疼痛，還在皮膚慢性炎性病癥中觀察 到NT-4/5的上調(diào)，如皮炎、濕疹、異位性皮炎的癢疹病灶。在阿爾茨海默病、亨廷頓病病中觀 察到NT-4/5的下調(diào)。
[0157] -神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)，是結(jié)構(gòu)上與0-NGF、抓NF和NT-4相關(guān)并控制哺乳動(dòng)物神 經(jīng)元存活和分化及成體神經(jīng)系統(tǒng)維持的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并且在人胎盤中表達(dá)時(shí)可W影響胚 胎中神經(jīng)元的發(fā)育。與NT3相關(guān)的病狀和癥狀是已知的。通過基因打祀產(chǎn)生的NTF3-缺陷小 鼠顯示嚴(yán)重的肢體運(yùn)動(dòng)缺陷。NT-3通過化k受體進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 的生長(zhǎng)和存活[蛋白質(zhì)序列NP_001096124.1和NP_032768]。人、小鼠和大鼠 NT-3的氨基酸序 列相同。已知NT3及其同族受體，酪氨酸激酶C(TrkC),調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛和傷害性疼痛和傷害 感受及本體感受機(jī)制，例如NT3表達(dá)在神經(jīng)病理動(dòng)物的小DRG細(xì)胞中增加。NT3表達(dá)還與神經(jīng) 病如糖尿病性多發(fā)性神經(jīng)病和HIV相關(guān)性神經(jīng)病、大纖維神經(jīng)病(包括萎縮)相關(guān)，它還參與 痛覺過敏(通常有害的刺激的闊值下降）、異常性疼痛(無害刺激變得有害）和自發(fā)性疼痛 (明顯缺乏刺激的情況下疼痛）的形成并且是肌肉疼痛的已知調(diào)節(jié)物。
[0158] 現(xiàn)在將參W下實(shí)施例描述本發(fā)明，其中提供所述實(shí)施例W說明而非限制本發(fā)明。 實(shí)施例
[0159] p75NTR-Fc序列的免疫原性計(jì)算機(jī)檢驗(yàn)（In silico immunogenixy testing)
[0160] 目前利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生廣泛類型的生物藥物，包括新類別的基于單克隆抗體 (HiAb)的Fc(可結(jié)晶片段）的多功能治療性融合蛋白化Uang 2009生物技術(shù)新觀點(diǎn)（Curr Opin Biotechnol)，20(6)，692-9)。治療性蛋白與化結(jié)構(gòu)域融合通過兩種不同方式延長(zhǎng)分 子的血清半壽期，增強(qiáng)生物制藥的總體治療作用。首先，通過pH依賴的新生Fc受體(Fe化)結(jié) 合作用，再循環(huán)性Fc-融合物減少治療性蛋白在內(nèi)體中的降解。其次，相對(duì)治療性分子，通過 添加 Fc-結(jié)構(gòu)域和通過化-介導(dǎo)的與治療性蛋白二聚化增加分子大小有助于限制腎清除作 用。
[0161] 可W通過將兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域直接連接在一起產(chǎn)生融合蛋白。但是，運(yùn)可能在 所得的融合蛋白中導(dǎo)致不利的分子特性，如受損的生物活性(Bai等人，2005美國(guó)科學(xué)院院 刊（Proc.化tl. Acad. Sci.) 102 7292-7296)、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊（Zhao等人，2008蛋白質(zhì)表達(dá) 和純化（Protein Expr. Purif . )61 ,73-77)或低產(chǎn)率（Amet等人，2009制藥研究 (Pharm. ReS.) 26，523-528)。可W在結(jié)構(gòu)域之間插入接頭序列W解決運(yùn)些潛在問題，但是必 須考慮幾種因素 W選出適宜的接頭。首先，接頭必須反映融合蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的總體預(yù)期 功能。在一些情況下，結(jié)構(gòu)域必須獨(dú)立地發(fā)揮作用，因此需要接頭柔性。相反，如果將結(jié)構(gòu)域 固定，則可能需要?jiǎng)傂越宇^。第二，接頭不得通過翻譯后修飾(PTM)向融合蛋白引入任何不 想要的官能性。最后，必須考慮接頭和接頭旁側(cè)區(qū)域的潛在免疫原性，因?yàn)榻宇^可W是不天 然存在于人體中的從頭設(shè)計(jì)序列。
[0162] 大部分治療性蛋白不同程度地具有免疫原性(Van Walle等人，2007生物治療專家 意見化邱ert Opin Biol Ilier. )7(3):405-18,Stas等人，2009抗體療法的免疫原性評(píng)價(jià) (Immunogenicity assessment of antibody therapeutics.)劍橋大學(xué)出片反社（Cambridge University Press)，劍橋）并且甚至所謂全人類抗體治療藥可能含有免疫原性區(qū)域 化arding等人，2010單克隆抗體(MAbs. )2,256-265)。免疫原性是誘導(dǎo)Th(輔助T細(xì)胞(T-helper))反應(yīng)的能力，其中獨(dú)特T細(xì)胞受體識(shí)別與抗原呈遞細(xì)胞上展示的HLA II類分子結(jié) 合的膚時(shí)，所述反應(yīng)觸發(fā)。膚從抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)化的蛋白質(zhì)生成，所述蛋白質(zhì)隨后通過內(nèi)體 切割途徑加工。僅對(duì)HLA II類分子具有足夠親和力的膚將呈遞在細(xì)胞表面上，并且或許可 能觸發(fā)化反應(yīng)。
[0163] 因此，可W通過移除Th表位降低免疫原性潛力，一個(gè)稱作去免疫化的過程 (化amberlain 2002監(jiān)管評(píng)估（The RegulatoiT Review)5,4-9!Baker和Jones2007藥物發(fā) 現(xiàn)和發(fā)現(xiàn)的新觀點(diǎn)（化rr.Opin Drug Discov.Devel. )10,219-227)。運(yùn)通過W下方式實(shí)現(xiàn)： 預(yù)測(cè)治療性蛋白中的哪些膚可W與HLA II類分子結(jié)合并隨后引入置換消除或減少膚對(duì)HLA II類分子的結(jié)合親和力。
[0164] 存在幾個(gè)化A II類基因并且?guī)缀蹙哂懈叨榷鄳B(tài)性。另外，HLA II類分子由a和0 鏈組成，所述鏈各自衍生自不同基因，所述基因連同內(nèi)在多態(tài)性一起進(jìn)一步增加變異。具體 而言，每位個(gè)體表達(dá)基因：DRA/DRB、DQA/DQB和DPA/DPB。運(yùn)些基因當(dāng)中，僅DRA無多態(tài)性。此 外，'第二'DRB基因（DRB3、DRB4或DRB5)也可W是存在的，其產(chǎn)物也與DRA鏈結(jié)合。
[0165] 去免疫化期間，重點(diǎn)在于DR同種異型，已知W比DQ和DP更高的水平表達(dá)化aupeze 等人，1999 人類免疫學(xué)化 um. Immunol. )60,591-597, Gansbacher 和 Zier 1988 細(xì)胞免疫學(xué) (Cell Immunol. )117,22-34，Berdoz等人，1987免疫學(xué)雜志（J.Immunol. )139，1336-1341， SUmz等人，1989免疫學(xué)雜志（J. Immunol. )143,3081-3086) eDR同種異型通常通過DRB基因 提到，因?yàn)镈RA基因保持恒定，例如DRBl *01:01，其中數(shù)字是等位基因特異的。
[0166] 個(gè)體表位的嚴(yán)重性評(píng)定基于混雜標(biāo)準(zhǔn)，即與特定表位結(jié)合的HLA同種異型的數(shù)目， W及群體中同種異型的重要性(頻率)和HLA:膚復(fù)合物結(jié)合強(qiáng)度的定性評(píng)定。由于已經(jīng)選擇 個(gè)體的T細(xì)胞群體不識(shí)別'自身膚'，所W可能篩選正在對(duì)下述膚去免疫化的蛋白質(zhì)，所述膚 對(duì)應(yīng)于正常情況下不應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)化反應(yīng)的（已知）自身膚。盡管不知道哪些內(nèi)源蛋白在T細(xì)胞 成熟期間內(nèi)化并且因此產(chǎn)生自身膚，但是抗體屬于運(yùn)些內(nèi)源蛋白化irschmann等人，1995免 疫學(xué)雜志（J. Immunol.) 155,5655-5662,Verreck等人，1996免疫遺傳學(xué)（Immunogenetics) 43，392-397，化rding等人，2010單克隆抗體(MAbs.) 2，256-265)。
[0167] P75-NTR Fc-融合蛋白設(shè)計(jì)
[0168] P75-NTR Fc-融合蛋白的化部分的特定同種異型是IgG pCon載體IgGza(見上文）。
[0169] P75-NTR Fc-融合蛋白的設(shè)計(jì)按幾個(gè)階段推進(jìn)：
[0170] ?確定化-融合蛋白中待使用的P75-NTR序列的確切結(jié)構(gòu)?？紤]幾種因素，包括：
[0171] Dp75-NTR Fc-融合物應(yīng)當(dāng)能夠結(jié)合幾種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，至少包括NGF、抓NF、NT-3 和NT-4;必須在P75-NTR Fe-融合蛋白中保留柔性。
[0172] 。不想要的a-分泌酶切割位點(diǎn)存在于p75-NTR-Fc(SEQ ID N0.1)上的胞外結(jié)構(gòu)域 中，運(yùn)些切割位點(diǎn)必須從該序列移除，因?yàn)樗鼈儗⑹艿角懈畈⑶乙虼藴p少p75-化產(chǎn)物在體 內(nèi)的生物學(xué)活性和PK譜(PK profile)。原始的p75-Fc產(chǎn)物(參見SEQ ID NO. 1)含有a-分泌 酶切割位點(diǎn)并且與SEQ ID NO.3相比，半壽期和生物學(xué)活性（PK/PD)因此顯著減少（見下 文)。
[0173] 鑒定了適用于P75-NTR Fc-融合蛋白中連接胞外P75-NTR結(jié)構(gòu)域和化的適宜實(shí)證 性接頭。排除了含有可能潛在參與翻譯后修飾(PTM)的位點(diǎn)的接頭序列。
[0174] 使用具有化區(qū)的適宜部分的所確定的P75-NTR構(gòu)建體，使用不同的潛在接頭序列， W計(jì)算機(jī)方式構(gòu)建P75-NTR Fc-融合蛋白的幾種變體。嘗試P75-NTR胞外結(jié)構(gòu)域C末端、Fc較 鏈區(qū)和潛在接頭的結(jié)構(gòu)建模和分析(參見表1)。
[0175] 使用化ibase?，對(duì)具有不同接頭序列的變體篩選潛在化表位。
[0176] 基于預(yù)測(cè)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，提出表達(dá)的序列3p75-NTR Fc-融合蛋白（SEQ ID NO.3)。
[0177] Fc-融合蛋白序列分析
[0178] 13種目前可用的治療性Fc-融合蛋白的蛋白質(zhì)序列從美國(guó)采用名稱化SAN)網(wǎng)址獲 得化ttp://www.曰m曰-曰ssn.org/曰m曰/pub/physici曰n-resources/medic曰l-science/)。在可 能的情況下，將蛋白質(zhì)序列交叉參比并且相對(duì)于其他在線資源（如在線專利信息網(wǎng)址)檢 查。使用在線資源，研究級(jí)Fc-融合蛋白的蛋白質(zhì)序列從其他商業(yè)供應(yīng)商獲得。
[0179] 為了鑒定衍生多種化-融合蛋白的推定性親本序列，使用MAFFT，將化-融合蛋白序 列與自有Lonza IgG pCon載體的翻譯蛋白質(zhì)產(chǎn)物比對(duì)化atoh等人,2002核酸研究(Nucleic Acids Res. )30,3059-3066)。比對(duì)的化-融合蛋白序列隨后在其中化-融合物開始匹配IgG 序列的位置處截短。為了確定IgG序列在何處開始，使用=個(gè)連續(xù)IgG殘基標(biāo)準(zhǔn)。
[0180]使用無 IgG序列的截短型Fc-融合蛋白序列，進(jìn)行加 iprot數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt協(xié)會(huì) (The UniProt Consodium) ,UniProt發(fā)布2012-09-0ct3,2012)自有副本的Blast檢索 (Altschul等人，1997核酸研究(Nucleic Acids Res. )253389-3402)，W鑒定匹配最接近的 蛋白質(zhì)序列。每個(gè)Fc-融合蛋白序列隨后針對(duì)化iprot數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的匹配最接近的序列和 匹配最接近的Lonza IgG pCon序列手工再比。隨后提取融合配偶體和化區(qū)之間的交界并且 產(chǎn)生兩個(gè)集合，一個(gè)集合針對(duì)13種治療性Fc-融合蛋白和一個(gè)結(jié)合針對(duì)市售Fc-融合蛋白。 隨后從運(yùn)兩個(gè)集合限定接頭區(qū)域。
[0181] 市售化-融合蛋白序列集合隨后在其中相對(duì)于匹配最接近的Lonza IgG pCon序列 找到序列同一性的N末端位置處截短。隨后分選截短的序列并且生成無冗余序列集合。
[0182] Epibase?免疫概況分析
[0183] 使用Global集合中的85個(gè)HLA II類同種異型，對(duì)化-融合蛋白變體進(jìn)行化ibase? 免疫概況分析。
[0184] 僅使用HLA結(jié)合作用預(yù)測(cè)，就免疫原性風(fēng)險(xiǎn)比較Fc-融合蛋白變體是非常困難的。 運(yùn)是因?yàn)閹讉€(gè)重要因素未考慮：
[0185] ..結(jié)合膚可能不由加工裝置生成并且因此它將從未作為膚-HLA復(fù)合物由抗原 呈遞細(xì)胞暴露于化細(xì)胞。
[0186] ??膚-HLA復(fù)合物可能不被化細(xì)胞識(shí)別。
[0187] 鑒于運(yùn)些考慮，可W使用化化ase?免疫概況分析在變體序列之間進(jìn)行S個(gè)類型的 定量比較。首先，可W比較DRBl、DRB3/4/5、DQ和DP同種異型集合中每個(gè)集合的關(guān)鍵表位數(shù) 目，其中與相同組的多個(gè)同種異型結(jié)合的膚計(jì)為一個(gè)。運(yùn)種表位計(jì)數(shù)顯示，每個(gè)集合內(nèi)部獨(dú) 特表位的數(shù)目和變體之間的差異掲示完全移除或添加潛在化表位。
[0188] 由于許多表位，尤其雜亂表位，結(jié)合多個(gè)同種異型，獨(dú)特化表位計(jì)數(shù)的變化可能模 糊變體間免疫原性潛力的實(shí)際減少或增加。因此，第二定量比較是在全部化表位范圍內(nèi)每 個(gè)HLA同種異型水平上，其中變體的每種同種異型的結(jié)合膚計(jì)數(shù)，連同血清型和群體頻率一 起，允許在血清型水平或同種異型水平比較。其=，表達(dá)最差情況下免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的近似評(píng) 分可W如下計(jì)算：
[0189] 評(píng)分=I：(表位計(jì)數(shù)X同種異型頻率）
[0190] 從預(yù)測(cè)與給定同種異型結(jié)合的表位的數(shù)目和受影響同種異型的等位基因頻率計(jì) 算每個(gè)受影響同種異型的乘積。本研究中使用的全部受影響DRBl、DRB3/4/5、DQ和DP同種異 型的乘積。應(yīng)當(dāng)指出個(gè)體同種異型評(píng)分不是借此測(cè)量免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的絕對(duì)度量，因?yàn)閼?yīng)當(dāng) 考慮全部選擇的HFA同種異型(01?81、01^3/4/5、09和0口）。
[0191] 認(rèn)為人抗體種系序列（如衍生自Lonza pCon IgG化的那些)無免疫原性，因?yàn)樗?們存在于呈遞給人免疫系統(tǒng)的循環(huán)型抗體池中并且可W視為自身膚。類似地，認(rèn)為P75-NTR 內(nèi)在地?zé)o免疫原性，因?yàn)樗谌梭w中天然表達(dá)。因此，從展示的計(jì)數(shù)評(píng)分和免疫原性評(píng)分排 除因完全從人抗體種系序列或從P75-NTR衍生的膚產(chǎn)生的關(guān)鍵表位。
[0192] 結(jié)構(gòu)建模
[0193] 使用Lonza的建模平臺(tái)，生成所提出的P75-NTR Fc-融合蛋白的結(jié)構(gòu)模型。基于其 序列同一性，W及模板結(jié)構(gòu)的定性結(jié)晶學(xué)量值，如分辨率m埃(A)計(jì)），將P75-NTR和化部 分的候選結(jié)構(gòu)性模板片段評(píng)分、排序并且從自有抗體數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)選出。
[0194] 生成結(jié)構(gòu)性模板片段與P75-NTR Fc-融合蛋白的序列比對(duì)結(jié)果。模板片段連同序 列比對(duì)結(jié)果由MODEF陽(yáng)R(Sal等人，1993分子生物學(xué)雜志（J.Mol. Biol )234,779-815)處理。 運(yùn)個(gè)方案產(chǎn)生從所比對(duì)的結(jié)構(gòu)性模板集合導(dǎo)出的構(gòu)象性約束。通過共輛梯度法和模擬退火 優(yōu)化法產(chǎn)生滿足運(yùn)些約束的全體結(jié)構(gòu)?；谘苌缘鞍捉Y(jié)構(gòu)評(píng)分的能量評(píng)分和滿足構(gòu)象約 束，從運(yùn)個(gè)全體選出一個(gè)或多個(gè)模型結(jié)構(gòu)。檢查模型并且使用側(cè)鏈優(yōu)化算法，將祀和模板之 間差異的位置的側(cè)鏈優(yōu)化并使能量最小化。一套可視化和計(jì)算工具用來評(píng)估各結(jié)構(gòu)的構(gòu)象 變異性，W及結(jié)構(gòu)域的核屯、堆積和局部堆積W選擇一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選的模型。
[01M] P75-NTR Fc-融合蛋白設(shè)計(jì)
[0196] 設(shè)計(jì)了P75-NTR Fc-融合蛋白的S個(gè)接頭變體。鑒于嘗試在最終Fc-融合蛋白中 P75-NTR區(qū)域內(nèi)保留柔性的設(shè)計(jì)約束因素和避開不利的a分泌酶和丫分泌酶切割位點(diǎn)的要 求，將胞外P75-NTR序列在位置G237處截短。原始P75NTR-FC序列1 (SEQ ID NO. 1)在位置 A250處截短。已經(jīng)在P75-NTR的胞外部分中位置241-242和位置244-245之間鑒定到a分泌酶 切割位點(diǎn)（Zampieri等人，2005生物化學(xué)雜志（J Biol化em)280,14563-71)并且已經(jīng)通過 位置282的區(qū)域內(nèi)的序列同源性推斷出一個(gè)推定性丫分泌酶切割位點(diǎn)。從序列1的PK/PD顯 而易見，與序列3(SEQ ID NO.3)相比，序列USEQ ID NO. 1)的PK和生物學(xué)活性顯著減少。從 運(yùn)些實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，a分泌酶位點(diǎn)和丫分泌酶位點(diǎn)促成體內(nèi)活性減少。
[0197] 為變體所選擇的接頭的關(guān)鍵要求是Fc-融合蛋白中允許融合配偶體的柔性W避免 引入能夠造成PTM的任何殘基并維持低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。
[019引存在兩類可用于連接P75-NTR至Fc恒定區(qū)的接頭，實(shí)證性接頭和衍生自天然蛋白 質(zhì)的接頭。衍生自天然蛋白質(zhì)的接頭可能引入能夠造成不利PTM的位點(diǎn)并且歸因于其性質(zhì)， 可能具有更大的引入免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。出于運(yùn)些原因，期待對(duì)實(shí)證性接頭進(jìn)一步研究并且 可W將它們廣義地劃分為柔性或剛性。下文列出重復(fù)單元實(shí)證性接頭的序列，連同它們的 柔性分類：
[0199] ? (G4S)廣柔性
[0200] ? Gx-柔性
[0201] ? A(EAAAK)XA-剛性(SEQ ID NO. 14)
[020^ ? (PA)X-剛性
[0203] 鑒于需要柔性W確保與最終Fc-融合蛋白中的多個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性配體（至少包括 NGF、抓NF、NT3和NT4)結(jié)合，僅考慮柔性接頭。
[0204] 基于運(yùn)些考慮，構(gòu)建=種變體:一種使用聚甘氨酸接頭的變體和兩種使用四甘氨 酸絲氨酸接頭的變體。變體均將原始P75-NTR序列中的G209(表達(dá)的蛋白質(zhì)，參見序列3(SEQ ID NO. 3))視為接頭序列的部分。此外，變體在與原始P75-NTR Fe-融合蛋白序列USEQ ID NO. 1)中位置222等同的位置含有半脫氨酸至絲氨酸突變。圖5中顯示變體的接頭區(qū)域。
[0205] 使用化化ase?，分析圖1中所示的每種變體和其余序列的免疫原性潛力。下文在表 1中顯示影響Global集合中85種HLA II類同種異型的關(guān)鍵表位的預(yù)測(cè)免疫原性評(píng)分。另外， 表1中還顯示受非關(guān)鍵表位影響的同種異型的數(shù)目信息。
[0206] 表1:總結(jié)計(jì)算的關(guān)鍵表位評(píng)分
[0207]
[0208] 基于預(yù)測(cè)的免疫原性和缺少能夠PTM的任何位點(diǎn)，變體l(p75_Fc_G4xl)具有S種 變體的最佳特征并且產(chǎn)生W便體內(nèi)檢驗(yàn)。
[0209] 序列 1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75NTR-Fc對(duì)NGF的親和力
[0210] Biacore忍片W其中蛋白A胺法偶聯(lián)于流動(dòng)小室1和2的實(shí)驗(yàn)制備。測(cè)量與捕獲的 p75-Fc結(jié)合的NGF的單循環(huán)動(dòng)力學(xué)。
[0211] 忍片表面的結(jié)合容量(Rmax)取決于配體(融合蛋白）的固定化水平。對(duì)于動(dòng)力學(xué)研 究，建議50RU-100RU的Rmax。通過使用p75-Fc和NGF的分子量，可W計(jì)算融合蛋白的所需固定 水平。
[0212] Rmax= (NGF分子量/融合蛋白分子量)x固定化水平X化學(xué)計(jì)量比率:50 = (13,500/ 102,000)x固定化水平XI。
[0213] 因此，要求的固定化水平=(102,000/13,500)x 50 = 378RU。在單一循環(huán)動(dòng)力學(xué)之 前，將序列USEQ ID N0.1)和序列3(SEQ ID N0.3)p75NTR-化和NTR-化固定在蛋白A忍片 上。
[0214]使用手工運(yùn)行，序列化75-Fc(SEQ ID NO.3)捕獲到蛋白A忍片的流動(dòng)小室2上直至 約380抓的所需水平實(shí)現(xiàn)。運(yùn)個(gè)過程用22秒注射W流速IOiil/分鐘和序列化75-Fc(SEQ ID N0.3)濃度10iig/ml進(jìn)行，運(yùn)導(dǎo)致418RU融合蛋白捕獲到蛋白A表面上。
[0別引在第一種情況下，現(xiàn)聯(lián)lOnM、5nM、2.5nM、1.25nM和0.625nM的NGF濃度。測(cè)試運(yùn)些濃 度，因?yàn)槿诤系鞍椎腒d近似處于運(yùn)個(gè)NGF濃度范圍內(nèi)部。
[0216] 單一循環(huán)動(dòng)力學(xué)方法設(shè)及：
[0217] -W30iil/分鐘注射0.625nM NG巧禍獲的p75-Fc上持續(xù)120秒 [0別引-隨后W1.25nM，隨后2.5nM、5nM和IOnM注射NGF，重復(fù)運(yùn)個(gè)過程
[0219] -在已經(jīng)注射NGF終濃度后，通過使運(yùn)行緩沖液化BS-EP)在忍片流過，進(jìn)行600秒解 離相。
[0220] 一旦完成，通過按30iil/分鐘注射IOmM甘氨酸HCl，pH2持續(xù)60秒，使忍片再生恢復(fù) 其蛋白A表面。
[0221] 隨后通過按流速IOiil/分鐘WlOiig/ml濃度注射38秒，將序列USEQ ID N0.1)p75-Fc捕獲到忍片上。運(yùn)實(shí)現(xiàn)430RU所需水平。隨后重復(fù)上文描述的單一循環(huán)動(dòng)力學(xué)法。
[0222] 數(shù)據(jù)分析
[0223] 按W下方式使用Biacore T200評(píng)價(jià)軟件VI，分析融合蛋白-NGF結(jié)合數(shù)據(jù)：
[0224] -記錄NGF與流動(dòng)小室2上的融合蛋白結(jié)合(Fe = 2)和NGF在對(duì)照流動(dòng)小室1上流過 (Fc = I;單獨(dú)的蛋白A)的數(shù)據(jù)。
[0。引-來自化=1的數(shù)據(jù)隨后從化=2扣除W產(chǎn)生"2-r結(jié)合數(shù)據(jù)。
[0226] -隨后從全部2-1結(jié)合數(shù)據(jù)扣除注射OnM(單獨(dú)的皿S-EP運(yùn)行緩沖液)時(shí)2-1結(jié)合數(shù) 據(jù)W控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間基線的任何漂移。
[0227] -最后，數(shù)據(jù)則擬合于1:1結(jié)合模型W計(jì)算結(jié)合特征，包括結(jié)合速率化a)、解離速率 化d)和親和力化D)。
[022引-
[0229] 與捕獲的序列1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75-Fc融合蛋白結(jié)合的NGF 的單一循環(huán)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)
[0230] 兩種融合蛋白與NGF的結(jié)合特征均是400pM(SEQ ID N0.1)和360pM(SEQ ID NO. 3)。從運(yùn)些研究顯而易見，序列3(SEQ ID NO. 3)對(duì)NGF具有比序列USEQ ID NO. 1)更大 的親和力。
[0231] 序列1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75NTR-Fc的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)
[0232] 運(yùn)項(xiàng)研究中使用抵達(dá)時(shí)重120g-150g的雄性Wistar大鼠（來自英國(guó)查爾斯河 (化arles River UK))。每只動(dòng)物在抵達(dá)時(shí)受到檢查并且外觀顯得健康。將它們隨機(jī)分配至 兩個(gè)籠子之一并且按尾上印記的刺青，對(duì)每只大鼠分配一個(gè)獨(dú)特識(shí)別編號(hào)。在第0日啟動(dòng)研 究前，動(dòng)物適應(yīng)于動(dòng)物設(shè)施至少10天。
[0233] 一旦大鼠已經(jīng)適應(yīng)其環(huán)境，則將它們轉(zhuǎn)移至其中實(shí)施全部體內(nèi)流程的儲(chǔ)藏室/流 程室。如1986年內(nèi)政部動(dòng)物（科學(xué)流程）法案（Home Office Animals(Scientific ProceduresMct)中推薦，通過設(shè)定成產(chǎn)生12小時(shí)光照-黑暗循環(huán)(07:00開燈，19:00關(guān)燈） 的巧光燈，對(duì)動(dòng)物給予照明。調(diào)節(jié)各房間的空氣并且常規(guī)測(cè)量空氣溫度(2rc+/-2°c)和相 對(duì)濕度。
[0234] 大鼠采食照射的膳食(科學(xué)的動(dòng)物食品與工程學(xué)(Scientific Animal Food and 化gineering)，Augy，法國(guó)）并且整個(gè)研究期間可隨意獲得高壓滅菌水。檢查每個(gè)批次的膳 食并且常規(guī)篩查組成和污染物。將筑窩材料和籠子高壓滅菌并且每個(gè)籠子獨(dú)立通風(fēng)（IVC系 統(tǒng))。
[0235] 研究如此設(shè)計(jì)，從而存在如表2中所概述的5個(gè)處理組。
[0236] 表2:處理組
[0238] 在第2、4、6、8、12和15日在大致相同的時(shí)間（早10點(diǎn)-11:30點(diǎn)），從大鼠尾靜脈取得 血液樣品并制備血漿。
[0239] 從尾靜脈對(duì)血液采樣
[0240] 將大鼠置于設(shè)定在38°C的加溫盒中持續(xù)最少5分鐘但不超過10分鐘，W引起尾靜 脈血管舒張并且促進(jìn)出血。將大鼠束縛于適宜的大小限位器(restrainer)中，使用無菌23 號(hào)針頭穿刺尾靜脈并且允許血液流入CB300微量采血管(Sarste化16，444)。在全部時(shí)間點(diǎn) 從每只大鼠采集最少I(K)山和最多30化1的血液。選擇不同部位W反復(fù)采樣并且大鼠在整個(gè) 手術(shù)期間平靜。大鼠良好耐受反復(fù)血液采樣，無渺紫跡象。采集的血液用來制備血漿。
[0241] 來自屯、臟的最終血液樣品
[0242] 在異氣燒麻醉藥作用下通過屯、臟穿刺，用Terumo Iml注射器和23號(hào)針頭取得最終 血液樣品（termina 1 b 1 ood samp 1 eS)。隨后通過頸椎脫白法處死動(dòng)物。采集的血液用來制 備血清。
[0243] 血漿制備
[0244] 將含有來自尾靜脈的血液的微量采血管溫和地顛倒幾次W確保與抗凝血?jiǎng)?鐘-EDTA)良好混合。采血管隨后置于冰上，之后W2700X g離屯、10分鐘，并且將血漿等分入聚丙 締管(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每只動(dòng)物兩份等分試樣，例外是在第2日，此時(shí)僅制備一個(gè)等分試樣）。全 部血漿樣品立即冷凍并膽存在-80°C直至需要。
[0245] 血清制備
[0246] 允許在第15日通過屯、臟穿刺采集的血液在室溫在聚丙締管中凝固2小時(shí)至3小時(shí) (最長(zhǎng)3小時(shí)）。隨后將凝固的血液W4000X g離屯、5分鐘并且將血清等分到聚丙締管(每只動(dòng) 物兩份等分試樣）。血清樣品立即冷凍并膽存在-80°C。
[0247] 血漿p75NTR-Fc的測(cè)定
[0248] 使用針對(duì)p75NTR(R&D Systems)和IgGlFc ELISA(R&D Systems)的改良化ISA作為 確定完整P75NTR-FC總血漿濃度的手段，測(cè)量血漿P75NTR-FC。
[0249] 測(cè)定序列1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75NTR-Fc的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。
[0巧0]
["i-u I J 二口 k巴
[0巧2] 與序列3(沈9 10側(cè).3)相比，通過移除序列1(沈9 10側(cè).1)975饑'1?斗(3的〇分泌酶 切割位點(diǎn)和丫分泌酶切割位點(diǎn)，則顯著地改善P75NTR-FC的PK及隨后改善效力，如慢性治療 后通過疼痛評(píng)分所評(píng)估。序列1 (SEQ ID NO. 1 )p75NTR-Fc的a分泌酶切割位點(diǎn)和丫分泌酶切 割位點(diǎn)使得運(yùn)種化合物不適合作為治療疼痛和與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子生物學(xué)有關(guān)的其他病變(例 如呼吸道疾病)的體內(nèi)藥物。
[0巧3] 序列3(569 10^.3)是穩(wěn)定的，與序列1(569 10^.1)相比，具有改善的?1(/抑特 征和更大的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子親和力。
[0254] ?75饑'3斗。(沈9 10備.3)有鎮(zhèn)痛性。
[0巧5] 運(yùn)項(xiàng)研究的目的是研究口75卿3斗(3(569 10顯.3)長(zhǎng)期暴露對(duì)大鼠中艦乙酸單鋼 (MIA)所致骨關(guān)節(jié)炎(OA)的疼痛效力的影響。
[0256] 先前，我們還已經(jīng)證實(shí)，可W通過使用雙足平衡測(cè)痛儀（incapacitance tester) 測(cè)量靜態(tài)承重進(jìn)行自發(fā)性疼痛的評(píng)定并且運(yùn)種與膝部組織病理學(xué)相關(guān)。使用疼痛新治療藥 的臨床前研究已經(jīng)因其引起數(shù)據(jù)偏倚的能力受到批評(píng)。為了解決運(yùn)個(gè)問題，隨機(jī)選擇左膝 和右膝用于誘導(dǎo)0A，并且因每日?qǐng)?zhí)行體內(nèi)任務(wù)的全部操作員不知道每個(gè)膝部的狀態(tài)。一般 從文獻(xiàn)得知，OA的誘導(dǎo)僅在右膝實(shí)施，但是在此前研究中，我們發(fā)現(xiàn)無論使用什么時(shí)間點(diǎn)或 MIA劑量，在左膝與右膝中誘導(dǎo)OA之間無恒定差異。
[0巧7] MIA的制備
[0258] 按0.3mg/50]il ETF-PBS(用于每次關(guān)節(jié)內(nèi)注射的體積）制備MIA，運(yùn)等同于6mg/ml 母液。稱量出302mg MIA并溶解于中50.3ml ETF-PBS。提前一天制備MIA并且避光膽存在4°C 直至需要。
[0巧9] 動(dòng)物
[0260]運(yùn)項(xiàng)研究中使用抵達(dá)時(shí)重110g-130g的44只雄性Wistar大鼠（來自英國(guó)查爾斯 河）。每只動(dòng)物在抵達(dá)時(shí)受到檢查并且外觀顯得健康。將它們隨機(jī)分配至兩個(gè)籠子之一并且 按尾上的刺青，對(duì)每只大鼠分配一個(gè)獨(dú)特識(shí)別編號(hào)。在第0日啟動(dòng)研究前，動(dòng)物適應(yīng)于動(dòng)物 設(shè)施至少10天。一旦大鼠已經(jīng)適應(yīng)其環(huán)境，則將它們轉(zhuǎn)移至其中實(shí)施全部體內(nèi)流程的儲(chǔ)藏 室/流程室。如1986年內(nèi)政部動(dòng)物(科學(xué)流程)法案中推薦，通過設(shè)定成產(chǎn)生12小時(shí)光照-黑 暗循環(huán)(07:00開燈，19:00關(guān)燈)的巧光燈，對(duì)動(dòng)物給予照明。調(diào)節(jié)各房間的空氣并且常規(guī)測(cè) 量空氣溫度(2 rc+/-2 °C)和相對(duì)濕度。
[0261] 大鼠采食照射的膳食(科學(xué)的動(dòng)物食品與工程學(xué)，Augy,法國(guó)）并且可隨意獲得高 壓滅菌水。檢查每個(gè)批次的膳食并且常規(guī)篩查組成和污染物。將筑窩材料和籠子高壓滅菌 并且每個(gè)籠子獨(dú)立通風(fēng)（IVC系統(tǒng)）。
[0262] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0263] 研究如此設(shè)計(jì)，從而存在5組動(dòng)物:對(duì)照人抗體(n = 6)、0.3mg/kg P75NTR-FC (SEQ ID N0.3)、lmg/kg p75NTR-Fc(沈Q ID N0.3)、3mg/kg p75NTR-Fc(沈Q ID N0.3)和3mg/kg PG-007(輝瑞他尼珠單抗(Tanezumab)的生物仿制藥抗NGF抗體）。
[0264] 每5天通過皮下注射給藥抗體和975饑'3斗(3(5日9 10^.3)，持續(xù)25天。
[0265] 在第-2日清晨，測(cè)量體重和從尾靜脈取得基線血液樣品。在大致相同的時(shí)間，在 第-1日，測(cè)量基線靜態(tài)承重。在第0日，再次在大致相同的時(shí)間，將全部大鼠用相應(yīng)的抗體或 P75NTR-FC融合蛋白處理。S小時(shí)后，向全部動(dòng)物給予關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.3mg MIA至一個(gè)膝部 化TF-PBS注入對(duì)側(cè)膝部）。
[0%6] 處理的隨機(jī)化
[0267] 在啟動(dòng)本研究之前，將大鼠稱重并且每個(gè)籠兩只大鼠隨機(jī)分配至處理組，從而每 個(gè)組中動(dòng)物的平均體重大致相等。除每只大鼠分配特定處理組之外，還實(shí)施進(jìn)一步隨機(jī)化， 從而將每只大鼠的左膝或右膝用MIA注射(來自每只大鼠的對(duì)側(cè)膝部用ETFPBS注射）。使用 Mac用微軟Excel (版本14.1.1)中的隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器生成處理組分配和每只大鼠的哪個(gè)膝 部接受治療。不接觸動(dòng)物的員工實(shí)施隨機(jī)化流程和分配。
[0268] 對(duì)每只動(dòng)物標(biāo)記兩個(gè)7ml聚丙締小瓶W指示左膝或右膝（總計(jì)88個(gè)小瓶）。兩個(gè)人 (一個(gè)人評(píng)定并檢查主要隨機(jī)化工作薄并且一個(gè)人等分關(guān)節(jié)內(nèi)注射用溶液)準(zhǔn)備運(yùn)88個(gè)小 瓶。等分過程依次實(shí)施，從而首先灌裝MIA小瓶，接著剩下的小瓶用ETF-PBS灌裝(運(yùn)是用于 每只動(dòng)物的對(duì)側(cè)膝部小瓶）。在整個(gè)體內(nèi)研究期間，科學(xué)家不知道全部動(dòng)物的處理狀態(tài)。
[0269] 動(dòng)物手術(shù)
[0270] 膝部的關(guān)節(jié)內(nèi)注射
[0271] 全部大鼠均使用Boyles裝置，通過吸入異氣燒麻醉。剔除每只動(dòng)物的兩個(gè)膝部上 的毛發(fā)并且膝部用乙醇擦拭。使用0.5ml無菌Becton Dickinson Micro-Fine膜島素注射器 連同隨附的27號(hào)（27G)針頭，用ETF-PBS中的SOiil 0.3mg MIA或單獨(dú)ETF-PBS經(jīng)骸初帶內(nèi)注 射每只膝部。
[0272] 自發(fā)性疼痛的評(píng)定
[0273] 通過使用雙足平衡測(cè)痛儀(林頓儀器化inton Instruments),英國(guó)）測(cè)量左后肢和 右后肢的承重，測(cè)定每只動(dòng)物的自發(fā)性疼痛。將大鼠置于雙足平衡測(cè)痛儀上適當(dāng)大小的有 機(jī)玻璃動(dòng)物盒中，從而它們后足坐在分離的傳感器上。盒的大小允許大鼠在不擠壓的情況 下舒適地坐下，但是類似地不允許它有足夠空間轉(zhuǎn)身。一旦大鼠坐穩(wěn)并平靜，記錄每個(gè)肢體 的承重5秒并且記錄W克計(jì)由雙后肢發(fā)出的平均力量。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定每只大鼠后爪的 重量分布5次(我們事先已經(jīng)展示其正確性），并且計(jì)算5個(gè)讀數(shù)的均數(shù)。通過右側(cè)肢體的重 量除W雙后肢的總重量，將各個(gè)承重?cái)?shù)據(jù)換算成重量分布。
[0274] MIA誘導(dǎo)OA后的自發(fā)性疼痛測(cè)量
[0275] 使用雙足平衡測(cè)痛儀測(cè)量經(jīng)過后肢的重量分布，評(píng)定自發(fā)性疼痛。在基線和在MIA 處理后的3周實(shí)施評(píng)定。
[0276] 數(shù)據(jù)在圖6中顯示并且作為總重量對(duì)后肢的比例顯示。
[0277] 對(duì)于從未用過藥的動(dòng)物，后肢上重量比例之間不存在統(tǒng)計(jì)顯著差異并且理論期望 值是0.5。
[0278] 對(duì)于對(duì)照抗體處理的動(dòng)物，與未處理的肢體相比，在處理的肢體上存在統(tǒng)計(jì)顯著 更少的重量(39%與61%)。在用抗NGF抗體(PG-007他尼珠單抗生物仿制藥3mg/kg)處理的 動(dòng)物和用P75NTR-FC(沈Q ID N0.3)按0.3mg/kg和Img/kg處理的那些動(dòng)物中，在處理的后肢 體上重量比例之間不存在統(tǒng)計(jì)(P<〇.01)顯著差異并且理論期望值為〇.5(雙后肢之間均勻 分布)在測(cè)量的任何時(shí)間點(diǎn)。與相應(yīng)的對(duì)照相比，3mg/kg的P75NTR-FC(SEQ ID NO.3)的鎮(zhèn)痛 作用甚至更統(tǒng)計(jì)顯著(P<〇.05)。
[02巧]從運(yùn)些研究顯而易見，P75NTR-化（SEQ ID NO.3)在OA的MIA大鼠模型中具有鎮(zhèn)痛 性。p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)的鎮(zhèn)痛作用比針對(duì)抗NGF抗體(PG-007:生物相似的輝瑞抗NGF 抗體他尼珠單抗)在相似劑量皮下3mg/kg時(shí)觀察到的鎮(zhèn)痛作用更大。
[0280] P75NTR-FC分子序列3和序列15對(duì)各個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的親和力的改善在意料之外 [0%1]從文獻(xiàn)和現(xiàn)有技術(shù)普遍認(rèn)為，對(duì)p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的親和力低并且對(duì)全部神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子具有約InM的相似親和力（IcMm等人，2012實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究化XP Cell Res)318 (11): 1221-8)。另外，阿波羅生命科學(xué)（Apollo Life Sciences)(分子及其嵌合分子US 20090232808A1)的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)一步例示p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體對(duì)各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的親和 力的相似性。"NGF是一種作為427個(gè)氨基酸糖蛋白合成的I型膜蛋白，運(yùn)種糖蛋白包含一個(gè) 28氨基酸信號(hào)膚。NGFW相等的親和力結(jié)合全部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子"。
[0282] 從Biacore等離子體共振研究中，我們已經(jīng)證實(shí)使用GGG接頭間隔團(tuán)與人IgGlFc偶 聯(lián)的序列3和序列15的結(jié)合親和力顯著變化。
[0283] 表3:序列3和序列15對(duì)每種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的Biacore親和力 「W841
[0285] 降低等電點(diǎn)（pi):
[0286] 序列3和在阿波羅生命科學(xué)(Apollo Life Science)現(xiàn)有技術(shù)中公開的那些序列 理論上具有4.11的pi。然而，運(yùn)兩類分子顯著糖基化，導(dǎo)致實(shí)際上Pl處于3-4范圍內(nèi)。
[0287] 序列15具有4.23的理論P(yáng)l并且比其他P75NTR較少糖基化。從而，Pl處于4-5范圍 內(nèi)。運(yùn)提供勝過序列3和阿波羅生命科學(xué)現(xiàn)有技術(shù)中先前公開的序列的顯著優(yōu)點(diǎn)(配制改善 和分子結(jié)構(gòu)的變異性較小，原因在于糖基化位點(diǎn)和糖基化數(shù)量的變異）。
[0288] 本發(fā)明在范圍方面不受本文中描述的具體實(shí)施方案限制。實(shí)際上，除了本文描述 的那些修改之外，本發(fā)明的各種修改將因前文描述和附圖是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。運(yùn) 類修改意在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。另外，如果適宜，本文所述的全部實(shí)施方案將視為 與任何和全部其他一致性實(shí)施方案廣義適用和與之可組合。
[0289]本文中援引多種出版物是，其公開內(nèi)容通過引用的方式完整并入。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種P75NTR神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合蛋白（NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含： (a) p75NTR(NBP)部分；和 (b) 免疫球蛋白Fc部分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR(NBP)部分和Fc部 分經(jīng)接頭連接。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述接頭包含式Gx的肽，其中X 是1、2、3、4、5或 6。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR (NBP)是人 p75NTR(NBP)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述Fc是人Fc。6. 根據(jù)任何一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含 SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列組成。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含 SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列組成。8. 根據(jù)任何一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR (NBP)以通過表面等離子體共振在20°C所測(cè)量的約O.OlnM至約50nM之間的結(jié)合親和力(Kd) 與NGF、BDNF、NT3或NT4/5的任一者結(jié)合。9. 根據(jù)任何一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，用于治療疼痛或疼痛 癥狀的用途。10. -種核酸分子，所述核酸分子編碼根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的p75NTR (NBP)-Fc融合蛋白，任選地還包括編碼信號(hào)序列。11. 一種可復(fù)制表達(dá)的載體，所述載體用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞、任選地用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 所述載體包含根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸分子。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的可復(fù)制表達(dá)的載體，其中所述載體是病毒載體。13. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞攜帶根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸分子。14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求11或12中任一項(xiàng)所述的載體，用 于治療疼痛或疼痛癥狀的用途。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至8或權(quán)利要求9中任一項(xiàng)所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根據(jù) 權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)所述的核酸或載體，其中所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或核酸分 子或載體在組合中與第二藥理活性化合物組合時(shí)分別、依次或同時(shí)使用。16. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至8或權(quán)利要求9中任一項(xiàng)所 述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求11至14所述的核酸分子或載體，和藥學(xué)上可 接受的載體和/或賦形劑。17. -種試劑盒，所述試劑盒包含： (a) 根據(jù)權(quán)利要求1至8或權(quán)利要求9中任一項(xiàng)所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據(jù) 權(quán)利要求10至14所述的核酸分子或載體，和 (b) 針對(duì)以下任一種或多種情況向個(gè)體給藥有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白、 核酸分子、載體或藥物組合物的說明書:預(yù)防或治療疼痛和/或疼痛癥狀或用于緩解疼痛 和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發(fā)生率，或延遲疼痛 和/或疼痛癥狀形成或進(jìn)展。18. -種治療和或預(yù)防個(gè)體中疼痛和或疼痛癥狀的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給 藥治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至8或權(quán)利要求9中任一項(xiàng)所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白 或根據(jù)權(quán)利要求10至14所述的核酸分子或載體，任選地進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】C07K14/705GK105873943SQ201480060027
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年9月18日
【發(fā)明人】S·韋斯特布魯克
【申請(qǐng)人】利維塞普特有限公司