一種新型trail融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種新型TRAIL融合蛋白，含有TGF?α第三環(huán)區(qū)的序列，具有極強(qiáng)的特異性腫瘤殺傷作用；并公開了新型TRAIL融合蛋白的編碼基因及其表達(dá)途徑，融合蛋白的生產(chǎn)方法，以及該蛋白質(zhì)在治療腫瘤等疾病中的應(yīng)用。
【專利說明】
一種新型TRAIL融合蛋白
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及新型TRAIL融合蛋白，以及利用基因工程技術(shù)生產(chǎn) 該融合蛋白的方法以及其作為藥物治療腫瘤和其它相關(guān)疾病的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] TRAIL(TNF_related apoptosis-inducing ligand,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo) 配體)也稱為Apo2L(Apo_21igand,凋亡素-2配體），是腫瘤壞死因子超家族的一個(gè)成員[1]， 其正式命名為腫瘤壞死因子超家族成員l〇(Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10) JRAIL分子由281個(gè)氨基酸殘基組成，是一個(gè)典型的II型跨膜蛋白，18-38氨基 酸殘基形成具有螺旋結(jié)構(gòu)的單次跨膜區(qū)，氨基端位于胞漿內(nèi)，羧基段的39-281氨基酸殘基 位于細(xì)胞外。TRAIL胞外部分可以被蛋白酶切割，釋放進(jìn)入組織間液和血液中，形成可溶性 的分子形式(sTRAIL) [2]。重組表達(dá)的一些人源sTRAIL片段，如對(duì)應(yīng)于胞外95-281、104-281 或114-281的TRAIL序列，都具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性；安進(jìn)公司和羅氏公司合作開發(fā)的 TRAIL(114-281)重組蛋白，稱為杜拉樂明（Dulanermin)，已進(jìn)入臨床研究[3]。
[0003] TRAIL作用于至少五個(gè)內(nèi)源性的受體[4]。只有膜受體TRAIL-R1和TRAIL-R2含有胞 內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域而能向細(xì)胞內(nèi)傳遞死亡信號(hào)，因此，TRAIL只能通過激活這兩個(gè)死亡受體(也 分別稱為DR4和DR5)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TRAIL只有形成同型三聚體，才具有受體激活活性。應(yīng)用 死亡受體了1^幾-1?1和了1^11^-1?2的激動(dòng)性單克隆抗體，也能產(chǎn)生一樣的生物效應(yīng)[5,6]。 TRAIL-R3、TRAIL-R4和可溶性受體0PG可能作為拮抗性受體調(diào)節(jié)TRAIL的活性。
[0004] 死亡受體激動(dòng)劑具有抑制腫瘤的生理活性，并具有先天的腫瘤特異性和選擇性， 它們極可能成為更高效的腫瘤治療藥物。在大量臨床前研究中，許多sTRAIL以及TRAIL-R1 和TRAIL-R2的激動(dòng)性單克隆抗體，展現(xiàn)了良好的抗腫瘤效果，但這些TRAIL受體激動(dòng)劑在臨 床實(shí)驗(yàn)中，盡管毒性較低，有很高的安全性，在個(gè)別病人有持續(xù)的抗腫瘤作用，卻沒有獲得 確定的臨床療效[7-9]。
[0005] 常規(guī)的重組sTRAIL臨床療效不佳，可能歸因于其藥代動(dòng)力學(xué)上有限的劑量暴露， 如杜拉樂明的半衰期在人體少于lh。缺乏療效也可能是由于TRAIL受體在許多正常細(xì)胞和 組織的廣泛表達(dá)，全身治療時(shí)，大多數(shù)sTRAIL結(jié)合到正常組織中相對(duì)過剩的TRAIL受體上， sTRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的吸附量下降，因而活性降低[10]。此外，由于拮抗性受體TRAIL-R3和 TRAIL-R4在腫瘤中的廣泛表達(dá)，sTRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞激動(dòng)性死亡受體的結(jié)合進(jìn)一步被限制， 治療效果受到嚴(yán)重?fù)p害。TRAIL-R1和TRAIL-R2的激動(dòng)性單克隆抗體，具有很好的藥代動(dòng)力 學(xué)特征，對(duì)TRAIL受體的結(jié)合有很高的類型特異性，但在臨床研究中也沒有獲得更好的療效
[11]。
[0006] 通過某些方法，提高TRAIL的活性，是增強(qiáng)其臨床有效性的發(fā)展目標(biāo)。如通過與白 蛋白融合，可以明顯提高TRAIL的血漿半衰期[12];主要針對(duì)DR4和DR5的型特異性TRAIL突 變體[13，14 ]，能夠提高其對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng);TRAIL可以與針對(duì)腫瘤標(biāo)志物的抗 體或其片段融合[15,16]，這種融合蛋白通過抗原靶向性，促使其對(duì)預(yù)定的細(xì)胞表面目標(biāo)抗 原結(jié)合，導(dǎo)致選擇性腫瘤細(xì)胞聚集，并通過旁觀者效應(yīng)，即利用表面交聯(lián)有TRAIL蛋白的細(xì) 胞對(duì)缺乏抗原的鄰近腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，產(chǎn)生增強(qiáng)的藥理活性[17]。但融合的靶向/效應(yīng) 域的分子可能干擾TRAIL的結(jié)構(gòu)形成和生物活性[18]。
[0007] EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生長因子受體）是受體酪氨酸激 酶ErbB家族中的一個(gè)類型(ErbBl)，參與調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化和迀移等多種重要的生 物事件，在多種腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)。EGFR與相應(yīng)配體EGF、TGF-a等結(jié)合，可以誘導(dǎo)受體自 身二聚體化，同時(shí)由其胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生自身磷酸化而活化，激活下游一系列級(jí) 聯(lián)酶促信號(hào)傳導(dǎo)過程，將生長信號(hào)傳遞至核內(nèi)。EGFR是一個(gè)有確定意義的藥物靶點(diǎn)[19];抗 EGFR的單克隆抗體，和特異性靶向EGFR酪氨酸激酶活性的小分子抑制劑如吉非替尼 (gef itinib)以及埃羅替尼（erlotinib)，可以有效地治療一些EGFR陽性腫瘤的患者?？?EGFR藥物抑制EGFR信號(hào)通路，能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性[20]?？笶GFR抗體與 sTRAIL形成的重組融合蛋白，靶向EGFR陽性腫瘤細(xì)胞，既能迅速滅活EGFR介導(dǎo)的有絲分裂 信號(hào)，又能有效地激活TRAIL受體，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性[21， 22]。
[0008] EGFR的天然配體EGF、TGF-a等或其有效結(jié)合片段，以及設(shè)計(jì)合成的人工肽片，與強(qiáng) 效的細(xì)胞毒素通過融合重組或聯(lián)結(jié)反應(yīng)，能夠生成靶向EGFR陽性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒素或免 疫毒素[23-26]。這些聯(lián)結(jié)/融合物與EGFR結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，或通過免疫反 應(yīng)，殺傷腫瘤細(xì)胞。相比于抗體融合，配體融合或聯(lián)結(jié)分子具有更小的分子質(zhì)量和體積，易 于向腫瘤組織內(nèi)滲透，可能獲得更穩(wěn)定的療效，也更利于生產(chǎn)制備。
[0009] 作為EGFR的天然配體的小分子量多肽TGF-a，與EGF有著相似的分子結(jié)構(gòu)與功能； 它們?cè)陔逆渻?nèi)部均存在3對(duì)二硫鍵，將約50個(gè)氨基酸長度的肽鏈折疊成三環(huán)結(jié)構(gòu)。TGF-a第 三環(huán)區(qū)（TGF3L)能結(jié)合EGFR，但不具有TGF-a和EGF的促細(xì)胞分裂增殖活性[27]。人TGF3L與 TNFa融合形成的融合蛋白，對(duì)鼠腫瘤L929細(xì)胞具有與TNFa相同的毒性作用，而對(duì)兩種人腫 瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯高于原型TNFa[28]。人TGF3L與超抗原的N-端或C-端融合，均能增加 其免疫治療活性[24]。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0038] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題，一方面是提供一種包含TRAIL的新型融合蛋白、編碼融合 蛋白的基因序列、含有該基因序列的表達(dá)載體和/或宿主細(xì)胞，并提供一種表達(dá)該融合蛋白 的方法;另一方面，提供一種TRAIL融合蛋白作為高效抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明的技術(shù)方案，第一方面是提供了一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋 白是包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是TGF-a來源的多肽， 而所述第二結(jié)構(gòu)域是結(jié)合TRAIL受體的多肽。
[0040]上述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白基本上由第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域 組成，其中所述第一結(jié)構(gòu)域?yàn)門GF-α的至少一部分，所述第二結(jié)構(gòu)域?yàn)門RAIL蛋白的胞外域 的至少一部分。
[00411上述融合蛋白，其特征在于，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是人TGF-α(SEQ. ID. NO. 1)，而所 述第二結(jié)構(gòu)域是人TRAIL( SEQ. ID. NO. 2)。
[0042]上述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白，其中所述第一結(jié)構(gòu)域?yàn)門GF-α第三 環(huán)區(qū)SEQ.ID.N0.3,所述第二結(jié)構(gòu)域?yàn)門RAIL蛋白的胞外域的至少一部分。
[0043] 上述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是SEQ. ID. N0.8，或與SEQ. ID. N0.8具有 至少95 %序列同一性的融合蛋白。
[0044] 本發(fā)明的技術(shù)方案，第二方面是提供了一種核酸分子、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。
[0045] 上述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有編碼本發(fā)明第一方面所述融合蛋 白的基因序列，優(yōu)選SEQ ID N〇:7所示的基因序列。
[0046] 上述表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包含本方面所述的核酸分子，連接于載 體的啟動(dòng)子用于核酸分子編碼蛋白的表達(dá)。
[0047] 上述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有本方面所述的核酸分子或表達(dá)載 體。
[0048]本發(fā)明的技術(shù)方案，第三方面是提供了一種采用如下步驟生產(chǎn)目的蛋白或多肽的 方法：（1)擴(kuò)增適宜的宿主細(xì)胞；（2)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白；（3)分離制備融合蛋白； 和/或(4)對(duì)融合蛋白進(jìn)行體外復(fù)性，以獲取生物活性蛋白；其特征在于，該步驟（1)中的宿 主細(xì)胞是本發(fā)明第二方面所述的宿主細(xì)胞。
[0049] 本發(fā)明的技術(shù)方案，第四方面是提供了一種制備抗腫瘤藥物的方法，其特征在于， 制備的抗腫瘤藥物包含本發(fā)明第一方面所述融合蛋白。
[0050] 本發(fā)明的技術(shù)方案，第五方面是提供了 一種制備抗腫瘤藥物的方法，其特征在于， 制備的抗腫瘤藥物包含本發(fā)明第二方面所述核酸分子、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。
[0051] 本發(fā)明技術(shù)方案，第六方面提供了新型融合蛋白在預(yù)防和治療腫瘤相關(guān)疾病、 TRAIL相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
[0052] 發(fā)明詳述：
[0053]本發(fā)明的目的是提供一種新型TRAIL融合蛋白，提供一種制備新型TRAIL融合蛋白 及其編碼基因、表達(dá)載體的方法，提供所述融合蛋白編碼基因和表達(dá)載體的表達(dá)步驟，以及 提供一種新型TRAIL融合蛋白的使用方法。
[0054]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，TRAIL蛋白與TGF-a第三環(huán)區(qū)（TGF3L)連接，形成新的融合蛋白，具有 比TRAIL蛋白更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用；這種增強(qiáng)作用主要體現(xiàn)在對(duì)TRAIL敏感的腫瘤細(xì) 胞，而對(duì)TRAIL毒性不敏感的正常細(xì)胞仍然沒有活性。對(duì)許多TRAIL敏感的人腫瘤細(xì)胞，該融 合蛋白的特異性腫瘤殺傷作用可以提高百倍，甚至千倍;對(duì)鼠腫瘤L929細(xì)胞，該融合蛋白的 腫瘤殺傷作用仍可以提高百倍以上。極高活性的TRAIL融合蛋白，有可能克服目前TRAIL和 同類藥物在臨床研究應(yīng)用中出現(xiàn)的療效不確定的缺點(diǎn)，發(fā)揮其應(yīng)有的高效抗腫瘤作用。 [0055]新的TRAIL融合蛋白的活性，可能由TGF3L與EGFR的結(jié)合作用介導(dǎo)。但本發(fā)明不把 其具體活性機(jī)制作為發(fā)明的基礎(chǔ)或限定條件。
[0056]本發(fā)明所述新的TRAIL融合蛋白，含有TRAIL的功能性結(jié)構(gòu)域，和TGF-α第三環(huán)區(qū) (TGF3L)或結(jié)構(gòu)域。TRAIL的功能性結(jié)構(gòu)域指能結(jié)合TRAIL受體的結(jié)構(gòu)域。由已知晶體結(jié)構(gòu)可 知，TRAIL的功能性結(jié)構(gòu)域，位于其胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，起始于約120位氨基酸殘基左右，至羧基端 終末281位氨基酸殘基；用于重組表達(dá)，含有功能性結(jié)構(gòu)域的TRAIL片段，常見有114-281， 104-281，95-281或含更多氨基端序列的TRAIL分子片段，主要是其胞外結(jié)構(gòu)區(qū)。TGF-α第三 環(huán)區(qū)（TGF3L)，為其兩端半胱氨酸殘基涵蓋的由10個(gè)殘基數(shù)組成的片段，融合表達(dá)時(shí)，經(jīng)常 采用含兩端延伸序列，殘基數(shù)15-20長度的分子。二者融合時(shí)，可以使其序列直接連接，也可 以通過一個(gè)間隔序列間接連接。二者的連接順序可變，即TGF3L可位于TRAIL結(jié)構(gòu)域的氨基 端或羧基端。融合蛋白中兩種結(jié)構(gòu)域可以是單拷貝數(shù)，也可以分別包含更多的拷貝數(shù)。 TGF3L可根據(jù)需要進(jìn)行適合的氨基酸殘基取代、缺失或添加;TRAIL結(jié)構(gòu)域也可以是其氨基 酸殘基取代、缺失或添加的變異體，甚至是含TRAIL結(jié)構(gòu)域的TRAIL環(huán)化變構(gòu)體（中國專利申 請(qǐng)2011800680194)，因此獲得對(duì)各受體亞型的不同親和力，或獲得其它需要的特征，只要這 些變體提供與野生型蛋白質(zhì)類似水平的藥理學(xué)活性，均被包括在本發(fā)明中。
[0057]本發(fā)明的融合蛋白可以進(jìn)一步包括有助于蛋白質(zhì)純化、增加重組蛋白的表達(dá)、或 者增加重組蛋白的溶解性的一個(gè)或多個(gè)另外的多肽結(jié)構(gòu)域。這種純化/表達(dá)/促進(jìn)溶解性的 結(jié)構(gòu)域，包括但不限于金屬螯合肽，如組氨酸標(biāo)簽。在純化結(jié)構(gòu)域和TGF3L/TRAIL之間可包 含可切割的間隔序列，如TEV、因子Xa或腸激酶識(shí)別序列，可利于純化后標(biāo)簽的去除。
[0058] 制備新型TRAIL融合蛋白，需要首先獲得編碼TRAIL結(jié)構(gòu)域和TGF3L的基因克隆。通 常，根據(jù)已知的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，用從相應(yīng)組織或細(xì)胞中提取的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 可直接獲得cDNA克??；更簡單的，可以人工合成與天然編碼DNA序列相同的基因序列；也可 以按照其氨基酸序列，用公知的設(shè)計(jì)方法，依宿主的基因偏好，合成不同密碼子偏好的基因 序列；也容易從其它商業(yè)途徑獲得所需的基因克隆。上述二者的編碼基因可以依照需要進(jìn) 行編碼突變，以獲得不同的變異體。
[0059] 可以按公知的方法，構(gòu)建編碼本發(fā)明所述融合蛋白的表達(dá)載體。用常規(guī)的分子生 物學(xué)手段，首先將編碼TRAIL結(jié)構(gòu)域和TGF3L的基因直接共碼連接。它們的連接順序可以根 據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。上述基因片段也可以通過含有編碼間隔序列的基因片段連接。上述獲得 的融合蛋白編碼基因，按公知的方法插入合適的表達(dá)載體，得到表達(dá)上述融合蛋白的重組 載體。也可以將需要的基因片段按合適的順序依次連接到表達(dá)載體上。上述表達(dá)載體包括 但不限于原核表達(dá)載體和各種真核表達(dá)載體?？蛇x擇各種商品化的表達(dá)載體，如表達(dá)載體 PQE系列，pET系列等，也可采用自行改造或構(gòu)建的表達(dá)載體。
[0060] 按公知的方法將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌、 其它原核細(xì)胞、各種真核生物細(xì)胞。在合適的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的宿主細(xì)胞經(jīng)破碎 裂解，收取融合蛋白產(chǎn)物。細(xì)菌表達(dá)的TRAIL融合蛋白通常以包涵體形式存在，可經(jīng)過體外 復(fù)性獲得活性產(chǎn)物。表達(dá)產(chǎn)物可以通過公知的方法純化。
[0061] TRAIL融合蛋白可以在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行化學(xué)修飾。 通過體內(nèi)或體外的多肽化學(xué)衍生，形成如乙酰化、磷酸化、羧基化或糖基化修飾。這些修飾 通常不改變蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，而能夠改善其抗蛋白水解性能或其它理化性能。另外，用D-氨 基酸、非天然氨基酸或非氨基酸類似物替代或添加，獲得修飾的融合蛋白，也包含在本發(fā)明 范圍內(nèi)。
[0062]本發(fā)明的TRAIL融合蛋白，具有與TRAIL蛋白類似的腫瘤殺傷頻譜，但由于其極強(qiáng) 的活性，可用于臨床腫瘤患者的治療。該融合蛋白也可能用于其它TRAIL相關(guān)的疾病的治 療。
[0063]本發(fā)明的TRAIL融合蛋白作為藥物施用的典型方法，為腸胃外的途徑，通過靜脈 內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或者腹膜內(nèi)注射，或通過輸注或任何其它可接受的全身給藥方法。通過靜 脈輸注的施用方法是優(yōu)選方案。另外，已知多種蛋白質(zhì)口服的治療性遞送方法，也可以應(yīng)用 于本發(fā)明的治療性融合蛋白。
[0064] 融合蛋白可配制于無毒、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，或與其它合 適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受 的載體或添加劑。這類載體包括但不限于:鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油及其組合。鋅離子 可以穩(wěn)定TRAIL的三聚體分子，是一種合適的添加劑;一些還原性分子如巰基乙醇，可以保 持TRAIL分子內(nèi)巰基免被氧化，以維持其生物活性，也是一類合適的添加劑。藥物劑型應(yīng)與 給藥方式相匹配。本發(fā)明的TRAIL融合蛋白也可以被制成針劑形式，用例如生理鹽水或含有 葡萄糖和其他輔劑的水溶液，通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。其它形式的藥物組合物，也可通過常 規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液等宜在無菌條件下制造。配制好的藥物組合物可 以通過前述途徑進(jìn)行給藥?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師 技能范圍之內(nèi)的。此外，本發(fā)明的TRAIL融合蛋白還可與其他治療劑一起使用。
[0065] 本發(fā)明也可考慮通過基因治療方法施用融合蛋白，例如，施用編碼融合蛋白的核 酸。本發(fā)明所述融合蛋白的編碼核酸序列已完全公開，通過重組DNA方法獲得及改造這種核 酸的方法完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。為了在特定細(xì)胞獲得重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的最大 化，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同樣也完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)?；蛑委煼椒ㄔ诒绢I(lǐng)域中 也是熟知的
[0066]有益技術(shù)效果：
[0067] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，相對(duì)于TRAIL與抗體、與白蛋白、與TGF-α全蛋白形成的融合蛋 白，這種新型TRAIL融合蛋白分子量小，容易穿透腫瘤組織，可能獲得更有效的治療效果。且 較小的分子量更容易采用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，有效降低其生產(chǎn)成本。
[0068] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，這種新型TRAIL融合蛋白相對(duì)于重組sTRAIL，應(yīng)該還具有 EGFR靶向的特點(diǎn)，擁有雙靶向功能，具有極高的生物活性。
【附圖說明】：
[0069]圖1.人重組TRAIL的原核表達(dá)。
[0070] 重組TRAIL在E.coli TG1中進(jìn)行表達(dá)，收取未誘導(dǎo)全菌樣品（_)、IPTG誘導(dǎo)全菌樣 品（ + )、誘導(dǎo)菌可溶性上清樣品（S)、和不溶性包涵體樣品（I)，在13%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行 電泳分離檢測。誘導(dǎo)后融合蛋白以包涵體形式在宿主菌內(nèi)有效蓄積。Μ為蛋白電泳marker及 其分子量(kD);箭頭所指為表達(dá)產(chǎn)物TRAIL條帶位置。
[0071] 圖2.TGF3L-TRAIL融合蛋白的表達(dá)。
[0072]融合蛋白在E.coli TG1中表達(dá)樣品：收取未誘導(dǎo)全菌樣品（_)、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)全菌樣 品( + )、誘導(dǎo)上清樣品（S)、誘導(dǎo)包涵體樣品（I)，在13%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳檢測。融合 蛋白以包涵體形式高效表達(dá)。Μ為蛋白電泳marker及其分子量(kD);箭頭所指為融合蛋白條 帶位置。
[0073]圖3.重組可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人胚肺成纖維細(xì)胞 HELF，各自的細(xì)胞殺傷活性量效曲線的比較。
[0074] 圖4.重組可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人表皮癌細(xì)胞A431，各 自的細(xì)胞殺傷活性量效曲線的比較。
[0075] 圖5.重組可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人宮頸癌細(xì)胞Hela，各 自的細(xì)胞殺傷活性量效曲線的比較。
[0076] 圖6.重組可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人肝癌細(xì)胞Bel-7402， 各自的細(xì)胞殺傷活性量效曲線的比較。
[0077] 在實(shí)施例、權(quán)利要求和敘述中所涉及的序列如下：
[0078] 1 ·人TGF-α氨基酸序列（SEQ · ID · N0 · 1)
[0079] 2 ·人TRAIL氨基酸序列（SEQ· ID · NO · 2)
[0080] 3 · TGF-a第三環(huán)區(qū)氨基酸序列（SEQ· ID·NO· 3)
[0081 ] 4.人TRAIL114-281在表達(dá)載體中的編碼核酸序列（SEQ. ID.NO.4)
[0082] 5 ·人TRAIL114-281 表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列（SEQ· ID·NO· 5)
[0083] 6.人TGF-a第三環(huán)區(qū)及其下游編碼基因的序列（SEQ. ID.NO.6)
[0084] 7 ·融合蛋白 TGF3L-TRAIL基因編碼序列（SEQ· ID · NO · 7)
[0085] 8 ·融合蛋白 TGF3L-TRAIL氨基酸序列（SEQ· ID · NO · 8) 實(shí)施例：
[0086] 下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍。常規(guī)質(zhì)粒構(gòu)建所涉及的PCR、酶切、連接等實(shí)驗(yàn)，以及蛋白質(zhì)表達(dá)所涉及的轉(zhuǎn)化、 細(xì)菌培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)為本領(lǐng)域研究人員所熟悉，所以具體相關(guān)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)沒有詳細(xì)注明，具體可 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著)所述常規(guī)實(shí)驗(yàn)條 件。
[0087]實(shí)施例1:蛋白表達(dá)載體構(gòu)建
[0088]以含有人TRAIL cDNA序列的質(zhì)粒pMD-TRAIL(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司）為 模板，用引 物TL5 ataggatccGTGAGAGAAAGAGGTCCTC和TL3 atactcgagTTAGCCAACTAAAAAGGCCC 擴(kuò)增編碼人 TRAIL 的 114-281 片段。經(jīng) BamHI 和 Xhol 雙酶 切，插入PQE30的BamHI和Sail酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成pQE30-TRAIL表達(dá)載體，翻譯閱讀框 (SEQ. ID. N0.4)含有載體的His-Tag編碼。
[0089]設(shè)計(jì)合成的引物TGFL5 ataggatccGTTTGCCACTCTGGTTACGTTGG，TGFL CCACTCTGGTTACGTTGGTGCTCGTTGCGAACACGCTGACCTGCTG和TGFL3 ataagatctACCACCCAGCAGGTCAGCGTGTTC經(jīng)混合PCR擴(kuò)增，獲得含有編碼TGF-α第三環(huán)區(qū)及其 下游序列的基因（SEQ.ID.N0.6);基因片段經(jīng)Bgin酶切，與BamHI酶切的TRAIL114-281連 接；再經(jīng)TGFL5和TL3引物擴(kuò)增，獲得的編碼TGF-α第三環(huán)區(qū)與TRAIL 114-281融合基因 (SEQ. ID. N0.7)用BamHI和Xhol雙酶切，插入pQE80L的BamHI和Sail酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成 PQE80L-TGL3-TRAIL表達(dá)載體。融合蛋白（SEQ. ID. N0.8)中，TGF序列與TRAIL結(jié)構(gòu)域由GGRS 四個(gè)氨基酸殘基組成的短間隔序列連接;表達(dá)產(chǎn)物含有載體編碼的His-Tag。
[0090] 實(shí)施例2:融合蛋白原核表達(dá)
[0091] 將相關(guān)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli TG1感受態(tài)，得到目的工程菌株。具體實(shí)施例均采 用實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模搖瓶表達(dá)。在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C條件下振蕩活化過夜， 之后將過夜培養(yǎng)物按1:100轉(zhuǎn)到新的含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(500mL)中，37°C振蕩培養(yǎng) 至合適對(duì)數(shù)生長期，經(jīng)ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)約4小時(shí)。
[0092] 菌液于4°C條件下，7000rpm離心5min后棄上清，收集菌體，用10mL體積的roS重懸 后，加入Triton X-100使其終濃度為1%，混勻，反復(fù)凍融裂解，超聲破菌20min。裂解液于4 °C，12000rpm離心5min后棄上清，得包涵體，-20 °C保存。
[0093]實(shí)施例3:包涵體的洗滌與溶解
[0094]將包涵體沉淀用包涵體洗液A(50mM Tris-HCl，pH 7.6,3%Triton X-100和20mM EDTA)重懸，于4°C，12000rpm離心5min，重復(fù)洗滌兩次;再用包涵體洗滌液B(含50禮1^8_ HCl，pH 7.6,0.5%Triton X-100，1M NaCl，2M尿素）重復(fù)洗滌兩次。用包涵體溶解液A(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10M尿素，ΙΟπιΜβ-巰基乙醇，pH 9.0)溶解包涵體，離心收取上清，用 含有50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 9.0的緩沖液迅速稀釋至尿素濃度為3M，以待下一步 純化。
[0095]實(shí)施例4:蛋白純化與復(fù)性
[0096]采用固定化Ni2+螯合層析法純化變性蛋白。層析柱用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液 (50mM Tris-HCl，100mM NaCl，3M尿素 ，pH 9.0)平衡，樣品用含有50-500mM咪唑的結(jié)合緩沖 液進(jìn)行梯度洗脫。
[0097] 洗脫樣品中加入硫酸銨至70%飽和度，于4°C，12000rpm離心15min，沉淀用溶解緩 沖液B(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，5M鹽酸胍，30mM DTT，pH 8.0)重新溶解。澄清溶液分6 次緩慢加入到約為其4倍體積的復(fù)性液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，0.5M尿素，0.4]?1^-Arg，2mM DTT，lmM ZnS04，pH 9.7)中，兩次之間間隔1小時(shí)。在200倍體積的透析復(fù)性液 (50mM Tris-HCl，100mM NaCl，2mM DTT，pH 8.0)中進(jìn)行透析，換液3-4次，間隔4-10小時(shí)。于 4°C，12000rpm離心15min，得到復(fù)性蛋白上清。
[0098]實(shí)施例5:蛋白電泳與定量
[0099] SDS-PAGE凝膠按常規(guī)方法配制。復(fù)性蛋白溶液40μ1，加入10μ1的5 X SDS上樣緩沖 液（300mM Tris-HCl(pH 6·8)、20%β-巰基乙醇、20%SDS、25%甘油、0.05%溴酚藍(lán)），沸水 浴5min，制備完成后置于-20°C保存。
[0?00] 蛋白樣品上樣，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行 13 % SDS-PAGE。考馬斯亮藍(lán)R-250染色，對(duì)脫色后的凝膠蛋白條帶用QuantiScan軟件進(jìn)行灰 度掃描，依據(jù)BSA定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算融合蛋白含量。
[0101] 實(shí)施例6:細(xì)胞培養(yǎng)與活性測試
[0102] 各細(xì)胞株在含有10%胎牛血清(杭州生物工程材料有限公司），100U/mL青霉素和 100yg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibico公司）中培養(yǎng)，溫度為37°C，二氧化碳濃度 為5% 〇
[0103] 將待測蛋白用培養(yǎng)基等比稀釋成一系列濃度。
[0104] 將細(xì)胞消化成為單個(gè)細(xì)胞后，按一定濃度加入96孔培養(yǎng)板（100μL孔），置于37°C， 5%C02的孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。加入不同濃度待測蛋白，作用72小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，每孔加入 lOOyL含0.5mg/ml MTT的RPMI-1640培養(yǎng)基。置于37°C，5%C02的孵箱培養(yǎng)4小時(shí)，棄去培養(yǎng) 液，每孔加入DMSO 150yL，常溫下震搖lOmin，使藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，用Bi〇-Rad450型酶標(biāo)儀 測定每孔吸光度，檢測波長570nm、參考波長655nm〇
[0105] 按公式計(jì)算各孔的抑制百分率，及每組劑量中的平行孔抑制百分率的平均數(shù)和標(biāo) 準(zhǔn)差：
[0106] 未加細(xì)胞未加藥為本底，即為100%抑制；只加細(xì)胞未加藥物的為陰性對(duì)照，即為 0%抑制。
[0107] 待測品抑制率％ =(陰性對(duì)照0D-待測化合物00)八陰性對(duì)照0D-本底0D) X 100%
[0108] 設(shè)TRAIL( 114-281)實(shí)驗(yàn)組，和融合蛋白實(shí)驗(yàn)組。
[0109] 表1.重組可溶性TRAIL與TGF3L-TRAIL融合蛋白的體外抗腫瘤活性(3-5次平行實(shí) 驗(yàn)IC50的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，nM)，以及融合蛋白活性相對(duì)TRAIL的增強(qiáng)倍數(shù)(各平行實(shí)驗(yàn)增強(qiáng) 倍數(shù)的平均值）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 包含第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是TGF-α來源的多 肽，而所述第二結(jié)構(gòu)域是結(jié)合TRAIL受體的多肽。2. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，基本上由第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域組成，其中所述第一 結(jié)構(gòu)域?yàn)門GF-α的至少一部分，所述第二結(jié)構(gòu)域?yàn)門RAIL蛋白的胞外域的至少一部分。3. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一結(jié)構(gòu)域是人TGF-a，而所述第二結(jié)構(gòu)域是 人TRAIL。4. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一結(jié)構(gòu)域?yàn)門GF-a第三環(huán)區(qū)，具有 SEQ.ID.NO. 3所示的氨基酸序列，所述第二結(jié)構(gòu)域?yàn)門RAIL蛋白的胞外域的至少一部分。5. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是SEQ. ID.N0.8所不的氣基酸序列。6. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白與SEQ.ID.NO. 8具有至少95%序列同 源性。7. -種核酸分子，其特征在于所述的核酸分子含有編碼權(quán)利要求1中所述的融合蛋白 的核苷酸序列。8. -種表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求7所述的核酸序列。9. 一種宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求7所述的核酸分子。10. -種生產(chǎn)方法。所述的生產(chǎn)方法包括以下步驟： A. 獲得編碼權(quán)利要求1中所述融合蛋白的基因序列 B. 將步驟A中所得的序列插入到合適的載體中，得到相應(yīng)的核酸構(gòu)建體 C. 將步驟B所得的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到適宜的宿主細(xì)胞 D. 在適宜的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)步驟C中的宿主細(xì)胞，并從中分離出表達(dá)的新型融合蛋 白。11. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的融合蛋白。12. 權(quán)利要求1所述的融合蛋白作為預(yù)防和治療腫瘤相關(guān)疾病藥物的應(yīng)用。13. 權(quán)利要求12所述腫瘤是乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、口腔癌、宮頸癌、 胰腺癌、皮膚癌、腎癌等之一。14. 編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的編碼基因，作為治療腫瘤藥物的使用方法。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK106046170SQ201610221487
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年4月11日 公開號(hào)201610221487.5, CN 106046170 A, CN 106046170A, CN 201610221487, CN-A-106046170, CN106046170 A, CN106046170A, CN201610221487, CN201610221487.5
【發(fā)明人】王楠, 閆征, 王燕
【申請(qǐng)人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所