專利名稱：人參水溶性蛋白的膜分離純化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用緩沖液浸提、微濾和 超濾相結(jié)合的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法。
背景技術(shù)：
人參蛋白及多肽的研究始于六十年代，主要集中于人參多肽的提取方法。1963 年，德國(guó)的F.Gstimor等人首次從人參根中檢測(cè)出多種氨基酸谷氨酸、半光氨酸、 酪氨酸等。1966年他們(Arch Pharm. 1966， 299(11): 934~937)又采用電泳的方 法從高麗白參的甲醇水提取液中得到5個(gè)小肽，未確定出一級(jí)結(jié)構(gòu)。1980年，日 本人Ando與Okada(PlantaMedica, 1980， 38: 18~21)等發(fā)現(xiàn)人參水提取液中有 一種強(qiáng)烈抑制腎上腺素誘導(dǎo)的脂肪分解的物質(zhì)，此物質(zhì)能被鏈霉蛋白酶(pronase) 破壞，估計(jì)為蛋白或肽類化合物。經(jīng)DEAE-Cellulose， S印hadex G-10， Avicel-Cellulose， Phosphoric-Cellulose等色譜手段分得一個(gè)14肽，氨基酸組成為 2Asp， Thr， Ser， 3Glu， 3Gly， Ala， Val， Leu， lle，未測(cè)出一級(jí)結(jié)構(gòu)，之后也未 査到繼續(xù)研究此肽的報(bào)道。1990年Takaku和Okada(PlantaMedica. 1990， 56: 27~30)等又報(bào)道從高麗紅參中得到一種酸性物質(zhì)，可以抑制腎上腺素誘導(dǎo)的脂肪分 解并能刺激胰島素參與的脂肪合成，并確定該酸性物質(zhì)為焦谷氨酸。同時(shí)他們還指 出紅參中可能有一種非肽物質(zhì)也有此活性。在此期間，韓國(guó)的Kim(CA. 108: 68730s， 107: 242499p)等報(bào)道從人參中分離純化到有抗脂肪分解活性的寡肽，但 未給出一級(jí)結(jié)構(gòu)。Yagi等人1994年從人參中提取到 一 種四肽成分 Val-D-Glu-D-ArG-Gly。并證明一些非蛋白氨基酸對(duì)其調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)活性至關(guān)重要。 魏俊杰等人(白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).1990， 16(5): 436~438)從生曬參中分離出兩種 人參多肽，分別是分子量為1kDa的11肽和分子量為1.3kDa的12肽，它們具有 降低2BS細(xì)胞內(nèi)多糖含量和增強(qiáng)2BS細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶活力的作用。Chen等 (P印tide Research. 1998， 52: 137 142)人利用水醇提取法，結(jié)合離子交換、凝 膠過(guò)濾和RP-HPLC從人參中分離出六種含a氨基酸的小肽，并通過(guò)氨基酸序列分 析已測(cè)定其結(jié)構(gòu)為氧化性的谷胱甘肽及其類似物，實(shí)驗(yàn)證明，它具有調(diào)節(jié)動(dòng)物睡眠 的作用。另外， 一種14肽也從人參中提取出來(lái)，結(jié)構(gòu)為 Glu-Thr-Val-Glu-lle-lle-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala，它具有強(qiáng)烈的抗脂解活 性(Jounal of Chromatography B. 1996， 687: 443~448)。吉林大學(xué)的張今等(高 等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào).1985， 61(4): 376~380)， 1985年報(bào)道用717型和732型離子
3交換樹(shù)酯柱從人參花蕾中分得兩個(gè)酸性肽，氨基酸組成分別為I :
ASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Mat-Leu-Phe-Arg ，分子量大于1.5kDa 。 II : ASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-lle-Leu-Lys，分子量大于1.2kDa。 1988年，他們(吉 林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào).1988， 4: 75~78)又按照日本人Ando的分離程序及改進(jìn)的 分離程序(用S印hadex G-25凝膠過(guò)濾)從人參中分離出一個(gè)具有胰島素作用的 14肽，認(rèn)為是Ando得到的14肽，但存在一個(gè)氨基酸的差異，并用DABITC/PICTC 雙偶合法測(cè)定了序列為 Glu-Thr-Val-Glu-lle-lle-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala。其后，又用CD譜研究了該肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)(生物化學(xué)與生物 物理學(xué)報(bào).1989， 21(2):175~176);生理活性研究表明有抗脂肪分解及降低血糖和 肝糖作用(藥學(xué)學(xué)報(bào).1990， 25(6〉: 401~402;藥學(xué)學(xué)報(bào).1990， 25(10):727~728); 對(duì)該肽的基因進(jìn)行了化學(xué)合成和克隆(生物化學(xué)雜志.1990， 6(3):193~195)。 1991 年又報(bào)道從紅參中經(jīng)DEAE-Cellulose， S印hadex G-10和RP-HPLC純化得到兩 個(gè)肽(藥學(xué)學(xué)報(bào).1991， 26(7):499~502)，其一為13肽3Gly， 2Ser， 2Glu， Ala， 2Asp， Thr， Leu， Val;另一為15月太4Gly， 3Ser， 2Glu， 2Ala， Asp， Thr， Leu， lle。測(cè)出了 15肽的N末端為Asp，各肽均未給出一級(jí)結(jié)構(gòu)。
進(jìn)入90年代中期，由于現(xiàn)代生物技術(shù)在中藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，對(duì)于人參蛋白 的研究才日益增多。應(yīng)用二維電泳技術(shù)現(xiàn)已表明人參中共有人參蛋白300多種，其 中已被報(bào)道的僅有40多種(Joumal of Chromatography B. 2005， 815: 147~155; Journal of Plant Physiology. 2004， 161: 837~845)，主要包括(1)類RNA酶蛋 白類RNA酶蛋白是人參的主要蛋白(ginseng major protein, GMP)，分子量為 28kDa，其氨基酸序列與植物的RNA酶具有高度同源性(Comparative Biochemistry and Physiology B. 2002， 132: 551~557)。 二維電泳分析顯示GMP的含量隨季 節(jié)的變化而變化，因此這一蛋白也被認(rèn)為是人參的儲(chǔ)存蛋白。(2)核糖核酸酶Lam 和Ng從人參根中分離得到一種由27kDa和29kDa兩個(gè)亞基組成的非耐熱核糖核 酸酶，其具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性(Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001， 285: 419~423)。隨后他們又從人參花蕾中分 離得到一分子量23kDa的核糖核酸酶，但卻沒(méi)有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性 (Protein Expression and Purification. 2004， 33: 195~199)。 Gennady也從人參 愈傷組織中分離得到兩種分子量都為18kDa的核糖核酸酶(FEBS Letters. 1997， 407:207~210)。(3)幾丁質(zhì)樣蛋白分子量15kDa，具有抗真菌功能(The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2001， 33， 287~297)。 (4)木聚糖酶 從人參根部提取的木聚糖酶，分子量只有15kDa，明顯低于從其他藥用植物分離得 到木聚糖酶，最適酶活溫度為50。C，具有人I型免疫缺陷病毒轉(zhuǎn)錄抑制的活性(LifeSciences. 2002， 70: 3049~3058)。 (5)皂苷p 葡萄糖苷酶從人參中分離的皂苷 (3~葡萄糖苷酶能水解人參皂苷Rg3，得到抗癌物質(zhì)人參皂苷Rh2，分子量59kDa， 最適酶活溫度為60。C(Chemical and Pharmaceutical Bulletin.2001，49:795~798)。
膜分離是在20世紀(jì)初出現(xiàn)，20世紀(jì)60年代后期迅速崛起的一門(mén)新的分離技 術(shù)。由于其兼有分離、濃縮、純化和精制的功能，又有高效、節(jié)能、環(huán)保、分子級(jí) 過(guò)濾及過(guò)濾過(guò)程簡(jiǎn)單、易于控制等特征，因此，目前已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生 物、環(huán)保、化工、冶金、能源、石油、水處理、電子、仿生等領(lǐng)域，產(chǎn)生了巨大的 經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，已成為當(dāng)今分離科學(xué)中最重要的手段之一。
膜分離技術(shù)是用半透膜作為選擇障礙層，允許某些組份透過(guò)而保留混和物中其 他組份，從而達(dá)到分離目的的技術(shù)。它具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、無(wú)相變、無(wú)化學(xué) 變化、處理效率高和省能等優(yōu)點(diǎn)，已作為一種單元操作日益受到人們極大重視。在 其發(fā)展過(guò)程中，1960年Loeb和Sourirajan制備出第一張具有高透水性和高脫鹽率 的不對(duì)稱反滲透膜是膜分離技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑，使反滲透技術(shù)大規(guī)模用于水脫 鹽成為現(xiàn)實(shí)。自此以后，不僅在膜材料范圍上有了極大擴(kuò)展，而且在制膜技術(shù)、組 件結(jié)構(gòu)及設(shè)備研制方面也取得了重大進(jìn)展。這些進(jìn)展又大大促進(jìn)了微濾和超濾技術(shù) 的發(fā)展，使整個(gè)膜分離技術(shù)迅速向工業(yè)化應(yīng)用邁進(jìn)。目前，膜分離技術(shù)已在電子工 業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護(hù)和生物工程等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。
膜分離技術(shù)由于具有如下優(yōu)點(diǎn)而使其能在生物產(chǎn)品分離、提取與純化過(guò)程中發(fā) 揮作用
(1) 處理效率高，設(shè)備易于放大；
(2) 可在室溫或低溫下操作，適宜于熱敏感物質(zhì)分離濃縮；
(3) 化學(xué)與機(jī)械強(qiáng)度最小，減少失活；
(4) 無(wú)相轉(zhuǎn)變，省能；
(5) 有相當(dāng)好選擇性，可在分離、濃縮的同時(shí)達(dá)到部分純化目的；
(6) 選擇合適膜與操作參數(shù)，可得到較高回收率；
(7) 系統(tǒng)可密閉循環(huán)，防止外來(lái)污染；
(8) 不外加化學(xué)物，透過(guò)液(酸、堿或鹽溶液)可循環(huán)使用，降低了成本，并 減少對(duì)環(huán)境的污染。
我國(guó)膜產(chǎn)業(yè)從誕生至今已近二十年的歷史，經(jīng)過(guò)行業(yè)內(nèi)廣大科技人員的努力， 膜技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)有了質(zhì)的飛躍。
超濾膜已研制出截留分子量3千、6千、1萬(wàn)、3萬(wàn)、5萬(wàn)、10萬(wàn)、15萬(wàn)及24 萬(wàn)的平板膜，紡制出截留分子量6千、1萬(wàn)、3萬(wàn)與5萬(wàn)和10萬(wàn)的雙皮層與內(nèi)皮層 中空纖維超濾膜，并組裝成不同處理量的組件與設(shè)備。該過(guò)程常用的四種組件形式
5巻式、極框式、管式、中空纖維式都有廠家生產(chǎn)，膜盒式超濾器也已開(kāi)發(fā)成功，這 對(duì)推動(dòng)我國(guó)基因生物工程的研究發(fā)展具有重要意義。 一大批重要的研究成果己向工 業(yè)生產(chǎn)推廣，國(guó)產(chǎn)反滲透和超濾組件及裝置己在超純水制備、醫(yī)藥、環(huán)保、電廠鍋 爐用水等方面替代引進(jìn)的國(guó)外設(shè)備。
中空纖維切向流過(guò)濾柱是近年來(lái)最新發(fā)展起來(lái)的膜過(guò)濾設(shè)備。其中以
QuixStand系統(tǒng)為典型代表，其主要組成部分包括 一個(gè)儲(chǔ)液器， 一個(gè)蠕動(dòng)泵，兩 個(gè)進(jìn)出口壓力表以及各種型號(hào)的中空纖維過(guò)濾柱。涵蓋微濾和超濾兩種最為常用的 領(lǐng)域，微濾有0.1pm、 0.2|jm、 0.45pm、 0.65ijm四種規(guī)格;超濾有1k、 3k、 5k、 10k、 30k、 50k、 100k、 300k、 500k、 750k十種規(guī)格，基本上可以解決大部分蛋白
質(zhì)純化的問(wèn)題。中空纖維柱具有以下優(yōu)點(diǎn)1、開(kāi)放式通道設(shè)計(jì)；2、無(wú)液體接觸死 角；3安裝不需要笨重的夾具；4、大多數(shù)可以高壓或者在線蒸汽滅菌；5、可承受
高達(dá)4bar以上的壓力；5、成本比較低；6、有多種纖維管徑可以選擇。
近年來(lái)，中空纖維切向流過(guò)濾柱被廣泛應(yīng)用在發(fā)酵液分離(細(xì)胞、細(xì)菌分離)、 裂解液澄清(細(xì)胞、細(xì)菌分離)、包涵體澄清、病毒及質(zhì)粒純化、血液制品純化、 蛋白質(zhì)純化中，并在高濃度、高粘度、高顆粒度的生物樣品純化方面具有獨(dú)特的優(yōu) 勢(shì)。在大多數(shù)的中試規(guī)模以上的下游純化中，可以替代傳統(tǒng)的離心機(jī)，大大降低了 繁瑣的實(shí)驗(yàn)操做所帶來(lái)的諸多不便，同時(shí)也節(jié)省了大量的生產(chǎn)成本。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高純度、高收率的人參水溶性蛋白的制備方法，其是 將人參勻漿液反復(fù)浸提、運(yùn)用膜分離技術(shù)得到高純度、高收率的人參水溶性蛋白，
經(jīng)BCA試劑盒檢測(cè)，蛋白含量可達(dá)50%以上。為工業(yè)化生產(chǎn)人參水溶性蛋白產(chǎn)品 提供強(qiáng)大的基礎(chǔ)保證。
本發(fā)明所述的制備方法包括如下步驟
1) 將生曬參粉成80目~100目細(xì)粉，每克細(xì)粉加入5 10ml、含0.1 0.3mol/L NaCI、 pH=7~8的0.01~0.03mol/L Tris-HCI緩沖液，進(jìn)行浸提操作，合并2~3次 浸提所得上清液，即為人參水溶性蛋白粗提液；
2) 取上述步驟獲得的人參水溶性蛋白粗提液，經(jīng)膜孔徑為0.22pm~0.65|jm的 過(guò)濾裝置進(jìn)行微濾，使樣品澄清，流速20~40ml/min，過(guò)膜壓力5~10psi，得人參 水溶性蛋白過(guò)濾液；
3) 取上述步驟獲得的人參水溶性蛋白過(guò)濾液，經(jīng)膜孔徑為10~100kDa的過(guò)濾 裝置進(jìn)行超濾，流速20 50ml/min，過(guò)膜壓力10~20psi，所得內(nèi)濾液經(jīng)真空冷凍干 燥即為人參水溶性蛋白。
6上述步驟中所述的浸提操作是于1 10'C條件下浸提12~24小時(shí)，浸提后于 1~10°C、 5000 10000r/min離心10 60min，取上清液；然后向浸提后沉淀的人參 渣中加入5 10ml/g上述緩沖液，于1 1(TC條件下再浸提12 24小時(shí)，浸提后于 1~10°C、 5000~10000r/min離心10~60min，取上清液；再合并上述2次浸提的上 清液。
進(jìn)一步地，上述步驟中是將人參水溶性蛋白粗提液經(jīng)膜孔徑為 0.22ym~0.65ym的中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn)行微濾；是將人參水溶性蛋白過(guò)濾液經(jīng) 膜孔徑為10~100kDa的中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn)行超濾并濃縮。
通過(guò)SDS PAGE凝膠電泳可判定本步驟所得產(chǎn)物為人參蛋白，因?yàn)橹挥械鞍?才會(huì)在SDS PAGE凝膠電泳上顯示條帶。分子量不同的蛋白其在SDS PAGE凝 膠電泳上的位置不同，得到的各蛋白分子量可以通過(guò)已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲 線方程來(lái)獲得。由電泳結(jié)果可知，蛋白浸提液經(jīng)過(guò)微濾和超濾兩個(gè)步驟，蛋白質(zhì)幾 乎沒(méi)有損失，證明該方法可行。
經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定，蛋白含量可達(dá)50%以上，收率可達(dá)3%以上。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)在于獲得人參水溶性蛋白的純化工藝簡(jiǎn)單、周期短、見(jiàn)效快， 較鹽析法節(jié)省了大量的人力和物力，同時(shí)除去了絕大多數(shù)的大分子和小分子雜質(zhì)而 不損失蛋白，具有純化效果好、上樣量大、收率高且可用于放大生產(chǎn)的特點(diǎn)。
圖1:人參水溶性蛋白提取工藝流程圖2:實(shí)施例1的人參水溶性蛋白的SDS PAGE電泳圖； 圖3:實(shí)施例2的人參水溶性蛋白的SDS PAGE電泳圖； 圖4:實(shí)施例3的人參水溶性蛋白的SDS PAGE電泳圖。
如圖1所示，將生曬參粉成細(xì)粉，加入中性緩沖液浸提，浸提后離心，取上清 液；然后向浸提后沉淀的人參渣中再加入上述中性緩沖液，再次浸提后離心，取上 清液；進(jìn)行2~3次浸提操作后，合并所得上清液，即為人參水溶性蛋白粗提液；然 后進(jìn)行微濾及超濾等工藝步驟后，所得內(nèi)濾液經(jīng)真空冷凍干燥即為人參水溶性蛋 白。
如圖2、圖3、圖4所示，其中M表示的是低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，自上而下分子 量依次為97kDa、 66kDa、 43kDa、 3化Da、 20kDa、 14kDa; 1-3均為人參水溶性 蛋白，其中1為浸提液中的總蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果，2為浸提液經(jīng)微濾后的總蛋白電 泳檢測(cè)結(jié)果，3為微濾后的總蛋白溶液經(jīng)超濾后的蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果。在電泳取樣過(guò)程中，微濾液和超濾液的體積與浸提液的體積保持一致。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
1 、人參水溶性蛋白的提取取生曬參若干，粉碎成80目細(xì)粉。取100g加800ml 含0.15mol/L NaCI的pH=7.4的0.01mol/L Tris-HCI緩沖液，攪拌均勻，于4。C條 件下浸提12小時(shí)，浸提后于4。C、 4000r/min離心30min，得上清液600ml;然后 向沉淀的人參渣中再加入800ml的本步驟所述緩沖液，于4'C條件下再浸提12小 時(shí)，浸提后于4。C、 4000r/min離心30min，得上清液700ml;合并2次浸提所得上 清液，即得人參水溶性蛋白粗提液1300ml;
2、 微濾取上述步驟獲得的1300ml人參水溶性蛋白粗提液，經(jīng)膜孔徑為 0.22|jm的中空纖維膜過(guò)濾裝置(型號(hào)QuixStand benchtop system, GE公司) 進(jìn)行微濾，流速20ml/min，過(guò)膜壓力10psi，獲得過(guò)濾液1200ml。再向剩余的粗提 液中加入200ml的pH=7.4的0.001 mol/L Tris-HCI緩沖液洗漆微濾，重復(fù)3次，獲 得3次過(guò)濾液共550ml。將所有過(guò)濾液合并，共1750ml。
3、 超濾取上述步驟獲得的1750ml人參水溶性蛋白過(guò)濾液，經(jīng)膜孔徑為10kDa 的中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn)行超濾、濃縮，流速20ml/min，過(guò)膜壓力10psi，當(dāng)內(nèi)濾 液為50ml時(shí)，向內(nèi)濾液加入500ml的pH=7.4的0.001 mol/L Tris-HCI緩沖液洗滌 超濾，重復(fù)3次，將內(nèi)濾液放出，約120ml;由于超濾過(guò)程中會(huì)有一些蛋白分子黏 附在中空纖維膜表面，所以我們進(jìn)一步用緩沖液沖洗纖維膜，以避免蛋白分子損失， 用上述緩沖液300ml沖洗超濾3次，將內(nèi)濾液放出，約100ml。將兩次所得內(nèi)濾液 合并，約220ml，真空冷凍干燥(真空度5x1(^Mbar，冷凍溫度-55。C )，共獲得固 體樣品3.23g。經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定，純度為51.25%，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。
實(shí)施例2:
1、 人參水溶性蛋白的提取取生曬參若干，粉碎成90目細(xì)粉。取100g加800ml 含0.15mol/L NaCI的pH=7.4的O.01mol/L Tris-HCI緩沖液，攪拌均勻，于4'C條 件下浸提12小時(shí)，浸提后于4°C、 4000r/min離心30min，得上清液620ml;然后 向沉淀的人參渣中再加入800ml的本步驟所述緩沖液，于4'C條件下再浸提12小 時(shí)，浸提后于4。C、 4000r/min離心30min，得上清液630ml;合并2次浸提所得上 清液，即得人參水溶性蛋白粗提液1250ml;
2、 微濾取上述步驟獲得的1250ml人參水溶性蛋白粗提液，經(jīng)膜孔徑為 0.45(jm的中空纖維膜過(guò)濾裝置(型號(hào)QuixStand benchtop system, GE公司)
8進(jìn)行微濾，流速25ml/min，過(guò)膜壓力6psi，獲得過(guò)濾液1100ml。再向剩余的粗提 液中加入150ml的pH=7.0的0.001 mol/LTris-HCI緩沖液洗滌微濾，重復(fù)3次，獲 得過(guò)濾液400ml。將兩次過(guò)濾液合并，共1500ml。
3、超濾取上述步驟獲得的1500ml人參水溶性蛋白過(guò)濾液，經(jīng)膜孔徑為30kDa 的中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn)行超濾、濃縮，流速25ml/min，過(guò)膜壓力8psi，當(dāng)內(nèi)濾液 為50ml時(shí)，向進(jìn)樣筒中加入500ml的pH=7.4的0.001 mol/L Tris-HCI緩沖液洗滌 過(guò)濾，重復(fù)3次，將內(nèi)濾液放出，約100ml;用上述緩沖液300ml沖洗超濾3次， 將內(nèi)濾液放出，約100ml。將兩次所得內(nèi)濾液合并，約200ml，真空冷凍干燥，共 獲得固體樣品3.47g。經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定，純度為54.65%，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。
實(shí)施例3:
1、 人參水溶性蛋白的提取取生曬參若干，粉碎成100目細(xì)粉。取100g加 800ml含0.15mol/L NaCI的pH=7.4的O.01mol/L Tris-HCI緩沖液，攪拌均勻，于 4。C條件下浸提12小時(shí)，浸提后于4。C、 4000r/min離心30min，得上清液630ml; 然后向沉淀的人參渣中再加入800ml的本步驟所述緩沖液，于4'C條件下再浸提12 小時(shí)，浸提后于4。C、 4000r/min離心30min，得上清液670ml;合并2次浸提所得 上清液，即得人參水溶性蛋白粗提液1300ml;
2、 微濾取上述步驟獲得的1300ml人參水溶性蛋白粗提液，經(jīng)膜孔徑為 0.65ym的中空纖維膜過(guò)濾裝置(型號(hào):QuixStand benchtop system, GE公司) 進(jìn)行微濾，流速32ml/min，過(guò)膜壓力5psi，獲得過(guò)濾液1150ml。再向剩余的粗提 液中加入150ml的pH=8.0的0.001 mol/L Tris-HCI緩沖液洗滌微濾，重復(fù)3次，獲 得過(guò)濾液420ml。將兩次過(guò)濾液合并，共1570ml。
3、 超濾取上述步驟獲得的1570ml人參水溶性蛋白過(guò)濾液，經(jīng)膜孔徑為50kDa 的中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn)行超濾、濃縮，流速30ml/min，過(guò)膜壓力6psi，當(dāng)內(nèi)濾液 為50ml時(shí)，向進(jìn)樣筒中加入500ml的pH=7.4的O.001mol/L Tris-HCI緩沖液洗滌 過(guò)濾，重復(fù)3次，將內(nèi)濾液放出，約100ml;用上述緩沖液300ml沖洗超濾3次， 將內(nèi)濾液放出，約100ml。將兩次所得內(nèi)濾液合并，約200ml，真空冷凍干燥，共 獲得固體樣品3.58g。經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定，純度為53.77%,電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。
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權(quán)利要求
1、人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其包括如下步驟(1). 將生曬參粉成80目～100目細(xì)粉，每克細(xì)粉加入5～10ml、含0.1～0.3mol/L NaCl、pH＝7～8的0.01～0.03mol/L Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行浸提操作，合并2～3次浸提所得上清液，即為人參總蛋白粗提液；(2). 取上述步驟獲得的人參總蛋白粗提液，經(jīng)膜孔徑為0.22μm～0.65μm的過(guò)濾裝置進(jìn)行微濾，流速20～40ml/min，過(guò)膜壓力5～10psi，即得人參總蛋白過(guò)濾液；(3). 取上述步驟獲得的人參總蛋白過(guò)濾液，經(jīng)膜孔徑為10～100kDa的過(guò)濾裝置進(jìn)行超濾并濃縮，流速20～50ml/min，過(guò)膜壓力10～20psi，所得內(nèi)濾液經(jīng)真空冷凍干燥即為人參水溶性總蛋白。
2、 如權(quán)利要求1所述的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其特征在于浸 提操作是于1 1(TC條件下浸提12~24小時(shí)，浸提后于1~10'C、5000~10000 r/min離心10 60min，取上清液；然后向浸提后沉淀的人參渣中加入5~10ml /g上述緩沖液，于1-1(TC條件下再浸提12 24小時(shí)，浸提后于1 1(TC、 5000~10000r/min離心10~60min，取上清液；再合并上述2次浸提的上清 液。
3、 如權(quán)利要求1所述的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其特征在于是將人參總蛋白粗提液經(jīng)膜孔徑為0.22nm~0.65|jm的中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn) 行微濾。
4、 如權(quán)利要求1所述的人參水溶性蛋白的分離純化制備方法，其特征在于是 將人參總蛋白過(guò)濾液經(jīng)膜孔徑為10~100kDa的中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn)行超 濾并濃縮。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用緩沖液抽提、膜分離技術(shù)純化制備人參水溶性總蛋白的方法。其是將人參粉成細(xì)粉后，加入中性緩沖液中，進(jìn)行2～3次浸提，將合并的浸提液經(jīng)膜孔徑為0.22μm～0.65μm的中空纖維膜過(guò)濾后，再經(jīng)截留分子量為10～100kDa的中空纖維膜超濾，從而獲得高純度、高收率的人參總蛋白。本發(fā)明具有純化效果好、處理量大、樣品收率高且可用于放大生產(chǎn)等特點(diǎn)。經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定，蛋白含量可達(dá)50％以上，且收率可達(dá)3％以上。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101423545SQ200810051560
公開(kāi)日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者幺寶金, 巍 張, 歌 惠, 李紅艷, 雨 趙, 趙大慶 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)