專(zhuān)利名稱(chēng)：卵黃水溶性蛋白質(zhì)組分的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體是應(yīng)用超濾技術(shù)從雞卵黃中分離提取 四種水溶性蛋白質(zhì)組分的方法，產(chǎn)品純度均達(dá)到85%以上，部分產(chǎn)品純度高于95%。
背景技術(shù)：
雞卵黃含有119種蛋白質(zhì)，占總質(zhì)量的17.8%。其中，大部分與脂肪結(jié)合形成脂 蛋白，而水溶性的蛋白質(zhì)相對(duì)較少，常見(jiàn)的種類(lèi)有卵黃免疫球蛋白、卵黃蛋白、卵黃 磷蛋白、卵黃高磷蛋白等。
卵黃免疫球蛋白是指雞卵黃中存在的主要免疫球蛋白，是母雞在接受免疫后的 7 10天，即卵黃成熟期，由母雞血液中的免疫球蛋白IgG選擇性的轉(zhuǎn)移到卵黃中而 形成的。所以，卵黃免疫球蛋白相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的IgG，而哺乳動(dòng)物的IgG則是初級(jí) 免疫應(yīng)答中最重要的抗體。在抗感染中起到主力軍的作用，能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的 吞噬作用，中和細(xì)菌毒素的毒性，并能夠與病毒抗原結(jié)合使病毒失去感染宿主細(xì)胞的 能力。
目前，通過(guò)母雞免疫來(lái)獲得抗體已得到廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是獲得抗體的最佳途徑 之一。因?yàn)榕c哺乳動(dòng)物的IgG相比，卵黃免疫球蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)①由于種系距離 相差較大，禽類(lèi)的卵黃免疫球蛋白與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白之間不會(huì)發(fā)生交叉血清學(xué)反 應(yīng)，這有利于提高免疫診斷檢測(cè)的特異性和敏感性；②卵黃免疫球蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。在 pH3-12之間，75。C以下，活性基本不受影響；③無(wú)需采血，只需收集雞蛋，且價(jià)廉 易得。到目前為止，通過(guò)母雞免疫的方法已獲得包括SARS病毒在內(nèi)的多種抗體。
卵黃磷蛋白和卵黃高磷蛋白是雞卵黃中最主要的兩種磷蛋白，也是雞蛋的重要營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)。它們之間存在較強(qiáng)的親和作用，常結(jié)合形成囊狀顆粒。卵黃磷蛋白的分子呈 球形，由80%的蛋白質(zhì)和20%的脂肪構(gòu)成；卵黃高磷蛋白占卵黃干重的2%，分子內(nèi) 50%的氨基酸為絲氨酸，且90%已磷酸化。
目前，從卵黃中分離蛋白質(zhì)的主要方法有鹽析法、聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提 法、中鏈脂肪酸法、表面活性劑法等。然而這些技術(shù)均存在一定的局限性，其中，鹽析法和聚乙二醇沉淀法容易引起蛋白質(zhì)的失活和變性；氯仿抽提法、中鏈脂肪酸法、 表面活性劑法的處理周期較長(zhǎng)，存在殘留問(wèn)題。
膜分離法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力， 對(duì)雙組份或多組分的混合物進(jìn)行分離、提純和富集的方法。膜分離技術(shù)是20世紀(jì)50 年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高效分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有分離效率高、能耗 低、可連續(xù)操作、易于放大、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。
超濾膜是指膜孔徑在1 100nm之間，具有不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。由于其孔徑尺 寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。超 濾分離是分子級(jí)的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，同時(shí)使小分子溶質(zhì)透過(guò)；有時(shí)也 可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷， 再通過(guò)蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達(dá)到分離的目的。目前， 在生物加工領(lǐng)域，超濾技術(shù)常用于蛋白質(zhì)的純化與濃縮，在工業(yè)上已有較多應(yīng)用，但 由于自然體系中蛋白質(zhì)種類(lèi)復(fù)雜，且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高 純度的功能蛋白質(zhì)的實(shí)例極少，且這方面的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)單、易于放大的四種卵黃水溶性蛋白 質(zhì)超濾提取方法，且所有產(chǎn)品純度均能達(dá)到85%以上，部分產(chǎn)品純度高于95%。 本發(fā)明采取的技術(shù)路線是使用超濾法直接分離，按如下步驟實(shí)現(xiàn)
1. 將雞蛋的蛋殼、蛋清和蛋黃膜除去，取蛋黃液；
2. 使用去離子水將卵黃液稀釋至6 15倍，最佳為7 10倍，充分?jǐn)嚢?0 30分 鐘后，于-20°<:冷凍8 12小時(shí)，再解凍；
3. 將上述部分解凍液在4'C下離心，棄去沉淀，取上清液；
4. 利用截留分子量為30 100kDa的市售超濾膜對(duì)上述步驟得到的上清液進(jìn)行超 濾分離，分離條件4'C、 pH4.0 10.0，最佳為pH6.0 8.0，獲得截流液A和濾出液 A'，濾出液A'即為卵黃高磷蛋白溶液；
5. 利用截留分子量為70 150kDa的市售超濾膜對(duì)步驟4得到的截留液A進(jìn)行超 濾分離，分離條件4°C、 pH4.0 10.0，最佳為pH6.0 8.0，獲得截流液B和濾出液 B，，截留液B為高純度的卵黃免疫球蛋白溶液，而濾出液B'是一種未知的卵黃水溶 性蛋白質(zhì)溶液，該蛋白質(zhì)的分子量為50kDa，等電點(diǎn)(pl)為8.0;6. 將步驟2得到的部分解凍液在4'C條件下放置1 2小時(shí)，取上層清液部分，利 用0.22pm的濾紙過(guò)濾，取母液；7. 利用截留分子量為300kDa的市售超濾膜對(duì)步驟6得到的母液進(jìn)行超濾分離， 分離條件4°C、 pH6.0 7.0，所得截留液C為卵黃磷蛋白溶液；8. 將所得到的濾出液A'、濾出液B'、截留液B和截留液C分別凍干10 12小 時(shí)，即獲得四種卵黃水溶性蛋白質(zhì)干粉。本發(fā)明直接應(yīng)用超濾分離技術(shù)從雞卵黃中提取了四種水溶性蛋白質(zhì)組分，其中包 括卵黃免疫球蛋白、卵黃磷蛋白、卵黃高磷蛋白和一種分子量為50kDa的未知蛋白。 由于超濾膜是指膜孔徑在1 100nm，具有不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。其孔徑尺寸與生物 大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。超濾分離是 分子級(jí)的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，而使小分子溶質(zhì)透過(guò)，有時(shí)也可以通過(guò)調(diào) 節(jié)溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷，再通過(guò)蛋白 質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達(dá)到分離的目的。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l，從黃皮雞蛋中提取卵黃水溶性蛋白質(zhì)組分的方法，步驟1. 取八個(gè)新鮮的黃皮雞蛋，用自來(lái)水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后， 用注射器針頭輕輕將蛋黃膜剌破，收集蛋黃液，約100mL;2. 使用去離子水將上述步驟獲得的卵黃液稀釋至700mL，放入攪拌子，充分?jǐn)嚢?20分鐘后，置于-2(TC冷凍8小時(shí)，再解凍；3. 取上述解凍液400mL，在4。C下、用3000rpm離心，棄去沉淀，取上清液，約 350mL;4. 利用截留分子量為30kDa的市售聚砜膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分離， 分離條件為4'C、 pH6.0，濾出液為卵黃高磷蛋白溶液，純度87.3%;5. 利用截留分子量為70kDa的市售再生纖維素膜對(duì)步驟4得到的截留液進(jìn)行第二 次超濾分離，分離條件為4°C、 pH6.0，獲得的截留液為卵黃免疫球蛋白溶液，純度 95.1%;濾出液是分子量為50kDa的未知蛋白溶液，純度96%;6. 取步驟2所獲得的解凍液300 mL，在4。C條件下放置1小時(shí)，取上層清液部分， 利用0.22pm的濾紙過(guò)濾，取母液；7. 利用截留分子量為300kDa的市售超濾膜對(duì)步驟6得到的母液進(jìn)行超濾分離，分離條件4'C、 pH6.0，獲得的截留液為卵黃磷蛋白溶液，純度98.4%;8.將得到的四種蛋白質(zhì)溶液置于-6(TC冷阱中凍干10小時(shí)，可獲得卵黃高磷蛋白 干粉約406mg、卵黃免疫球蛋白干粉約610mg、卵黃磷蛋白干粉約724mg、 50kDa的 未知蛋白干粉約730mg。實(shí)施例2，從白皮雞蛋中提取卵黃水溶性蛋白質(zhì)組分的方法，步驟1. 取六個(gè)新鮮的白皮雞蛋，用自來(lái)水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后， 用注射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約76mL;2. 使用去離子水將上述步驟獲得的卵黃液稀釋至760mL，放入攪拌子，充分?jǐn)嚢?30分鐘后，置于-20'C冷凍12小時(shí)，再解凍；3. 取上述解凍液420mL，在4。C下、用6000rpm離心，棄去沉淀，取上清液，約 360mL;4. 利用截留分子量為100kDa的市售聚砜膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分離， 分離條件為4'C、 pH8.0，濾出液為卵黃高磷蛋白溶液，純度85.2%;5. 利用截留分子量為150kDa的市售聚砜膜對(duì)步驟4得到的截留液進(jìn)行第二次超 濾分離，分離條件為4'C、pH8.0，獲得的截留液為卵黃免疫球蛋白溶液，純度91.8%; 濾出液是分子量為50kDa的未知蛋白溶液，純度95.4%;6. 取步驟2所獲得的解凍液340mL，在4。C條件下放置2小時(shí)，取上層清液部分， 利用0.22pm的濾紙過(guò)濾，取母液；7. 利用截留分子量為300kDa的市售超濾膜對(duì)步驟6得到的母液進(jìn)行超濾分離， 分離條件4"、 pH7.0，獲得的截留液為卵黃蛋白溶液，純度98.1%;8. 將得到的四種蛋白質(zhì)溶液置于-6(TC冷阱中凍干12小時(shí)，獲得卵黃高磷蛋白干 粉約302 mg、卵黃免疫球蛋白干粉約483mg、卵黃蛋白干粉約658mg、 50kDa的未知 蛋白干粉約597 mg。實(shí)施例3，從雞蛋中提取卵黃水溶性蛋白質(zhì)組分的方法，步驟1. 取十個(gè)新鮮的雞蛋，用自來(lái)水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后，用 注射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約122mL;2. 使用pH5.0、 200mM的磷酸鹽緩沖溶液將上述步驟獲得的卵黃液稀釋至 1000mL，放入攪拌子，充分?jǐn)嚢?5分鐘后，置于-20。C冷凍10小時(shí)，再解凍；3. 取上述解凍液600mL，在4t下、用5000rpm離心，棄去沉淀，取上清液，約515mL;4. 利用截留分子量為100kDa的市售聚砜膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分離， 分離條件為4°C、 pH7.0，濾出液為卵黃高磷蛋白溶液，純度86.7%;5. 利用截留分子量為100kDa的市售再生纖維素膜對(duì)步驟4得到的截留液進(jìn)行第 二次超濾分離，分離條件為4°C、 pH7.0，獲得的截留液為卵黃免疫球蛋白溶液，純 度93.6%;濾出液是分子量為50kDa的未知蛋白溶液，純度92.8%;6. 取步驟2所獲得的解凍液400mL，在4。C條件下放置1.5小時(shí)，取上層清液部 分，利用0.22pm的濾紙過(guò)濾，取母液；7. 利用截留分子量為300kDa的市售超濾膜對(duì)步驟6得到的母液進(jìn)行超濾分離， 分離條件4'C、 pH6.0，獲得的截留液為卵黃蛋白溶液，純度98.3%;8. 將得到的四種蛋白質(zhì)溶液置于-6(TC冷阱中凍干11小時(shí)，獲得卵黃高磷蛋白干 粉約558 mg、卵黃免疫球蛋白干粉約840mg、卵黃蛋白干粉約880mg、 50kDa的未知 蛋白干粉約972 mg。本發(fā)明工藝僅涉及稀釋、凍融、離心、過(guò)濾和超濾五個(gè)簡(jiǎn)單步驟，相對(duì)目前的工 業(yè)、實(shí)驗(yàn)室提取工藝，具有操作簡(jiǎn)單、分離濃縮同步進(jìn)行、活性損失小、回收率高的 特點(diǎn)，且未使用有機(jī)溶劑，可有效避免傳統(tǒng)提取方法中有機(jī)溶劑引起的蛋白變性，杜 絕了有機(jī)溶劑殘留造成的產(chǎn)品安全隱患；能耗低、環(huán)境污染小、分離效率高、產(chǎn)品純 度可調(diào)控、控制因素單一，便于工業(yè)放大。
權(quán)利要求
1.一種卵黃水溶性蛋白質(zhì)組分的提取方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行①將雞蛋的蛋殼、蛋清和蛋黃膜除去，取蛋黃液；②使用去離子水將卵黃液稀釋至6～15倍，充分?jǐn)嚢?0～30分鐘后，于-20℃冷凍8～12小時(shí)，再解凍；③將上述部分解凍液在4℃下離心，棄去沉淀，取上清液；④利用截留分子量為30～100kDa的市售超濾膜對(duì)上述步驟得到的上清液進(jìn)行超濾分離，分離條件4℃、pH4.0～10.0，獲得截流液A和濾出液A’，濾出液A’即為卵黃高磷蛋白溶液；⑤利用截留分子量為70～150kDa的市售超濾膜對(duì)步驟④得到的截留液A進(jìn)行超濾分離，分離條件4℃、pH4.0～10.0，獲得截流液B和濾出液B’，截留液B即為高純度的卵黃免疫球蛋白溶液，而濾出液B’是一種未知的卵黃水溶性蛋白溶液，該蛋白質(zhì)的分子量為50kDa，等電點(diǎn)(pI)為8.0；⑥將步驟②得到的部分解凍液在4℃條件下放置1～2小時(shí)，取上層清液部分，利用0.22μm的濾紙過(guò)濾，取母液；⑦利用截留分子量為300kDa的市售超濾膜對(duì)步驟⑥得到的母液進(jìn)行超濾分離，分離條件4℃、pH6.0～7.0，所得截留液C為卵黃磷蛋白溶液；⑧將所得到的濾出液A’、濾出液B’、截留液B和截留液C分別凍干10～12小時(shí)，即獲得四種卵黃水溶性蛋白質(zhì)干粉。
2. 依據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃水溶性蛋白質(zhì)組分的提取方法，其特征是使用去 離子水將卵黃液稀釋至7~10倍。
3. 依據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃水溶性蛋白質(zhì)組分的提取方法，其特征是步驟④ 和步驟⑤中所說(shuō)的超濾分離的條件為pH6.0 8.0、 4°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取卵黃水溶性蛋白質(zhì)的方法，屬于生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域，主要是應(yīng)用超濾分離技術(shù)，經(jīng)過(guò)稀釋、凍融、離心、過(guò)濾和超濾五個(gè)簡(jiǎn)單步驟，即可從卵黃中提取四種高純度的卵黃水溶性蛋白質(zhì)，其中包括卵黃免疫球蛋白、卵黃磷蛋白、卵黃高磷蛋白和一種分子量為50kDa的未知蛋白，在提取過(guò)程中，未使用有機(jī)溶劑，有效避免了有機(jī)溶劑引起的蛋白變性，杜絕了溶劑殘留造成的產(chǎn)品安全隱患。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101402672SQ20081015969
公開(kāi)日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者劉建國(guó), 娟 楊, 王晶冰 申請(qǐng)人:中國(guó)石油大學(xué)(華東)