一種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以水溶性苯胺藍(lán)（AB）為探針測(cè)定殼聚糖（CTS）含量的方法，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)水溶性苯胺藍(lán)與殼聚糖結(jié)合形成離子締合物，能引起溶液的共振瑞利散射光(RRS)顯著增強(qiáng)，并出現(xiàn)新的RRS光譜。殼聚糖?水溶性苯胺藍(lán)體系在0.01～3.5μg/mL范圍內(nèi)與殼聚糖濃度呈線性關(guān)系，線性方程：ΔI=2597.4c?40.584，R2=0.9992，檢測(cè)限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量時(shí)，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性不受殼聚糖分子量的影響，能夠準(zhǔn)確測(cè)定殼聚糖含量。該方法不僅靈敏高，且選擇性好，能用于復(fù)雜樣品的測(cè)定，精密度和加標(biāo)回收率結(jié)果令人滿意。
【專利說明】
一種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及殼聚糖含量測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，更具體 地，涉及一種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖(CTS)是甲殼素脫乙?；a(chǎn)物，其化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺（1，4)_2_氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，是自然界含量?jī)H次于纖維素的第二大天然有機(jī)高分子化合物。它是甲殼類 (蝦、蟹)動(dòng)物、昆蟲的外骨骼的主要成分。殼聚糖及其衍生物是重要的生物活性物質(zhì)，具有 抗腫瘤，抗凝血，減肥降脂和增強(qiáng)免疫力等功能，可作為醫(yī)藥保健品、食品、化妝品等的添加 劑及制備人造皮膚和手術(shù)縫合線等的重要原料。因此，殼聚糖在生物醫(yī)學(xué)，環(huán)境衛(wèi)生和食品 等領(lǐng)域都有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 隨著殼聚糖廣泛應(yīng)用，殼聚糖的準(zhǔn)確定量顯得十分重要。目前，國(guó)內(nèi)外用于殼聚糖 定量分析的方法主要集中在分光光度法和熒光法。目前，光譜法測(cè)定殼聚糖普遍忽略了殼 聚糖作為高分子天然產(chǎn)物，其分子量從幾千到百萬不等，當(dāng)樣品中殼聚糖分子量與標(biāo)準(zhǔn)品 差異較大時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生一定的系統(tǒng)誤差，影響準(zhǔn)確測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供水溶性苯胺藍(lán)在作為定量分析殼聚糖 的探針中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)水溶性苯胺藍(lán)與殼聚糖結(jié)合形成離子締合物，能引起溶液的共振 瑞利散射光(RRS)顯著增強(qiáng)，并出現(xiàn)新的RRS光譜。殼聚糖-水溶性苯胺藍(lán)體系在0.01~3.5y g/mL范圍內(nèi)與殼聚糖濃度呈線性關(guān)系，線性方程：AI = 2597.4c-40.584，R2 = 0.9992,檢測(cè) 限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量時(shí)，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性 不受殼聚糖分子量的影響，而且，以水溶性苯胺藍(lán)為探針可以分析復(fù)雜樣品如殼聚糖負(fù)載 鑭除氟水樣中殼聚糖的測(cè)定，因此，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)水溶性苯胺藍(lán)在作為定量分析殼聚糖 的探針中的應(yīng)用。
[0008]以水溶性苯胺藍(lán)為探針的定量分析殼聚糖的方法。
[0009] -種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法，包括如下步驟：
[0010] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配置n個(gè)成梯度濃度的殼聚糖溶液和1個(gè)空白試劑，向n個(gè)成梯度 濃度的殼聚糖溶液和1個(gè)空白試劑中分別加入2倍體積的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，然后再分 別加入等體積的水溶性苯胺藍(lán)，混合均勻后得到稀釋后的成濃度梯度的殼聚糖待測(cè)溶液， 靜置反應(yīng)，檢測(cè)殼聚糖待測(cè)溶液的共振瑞利散射強(qiáng)度，具體為以Ae X = Aem進(jìn)行同步掃描，記 錄RRS光譜，并于349nm處分別測(cè)量離子締合物的I和試劑空白的IQ，A I = I-IQ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，進(jìn)一步得線性方程；
[0011] 樣品檢測(cè)：向經(jīng)過初步處理后的待測(cè)樣品的上清液中，加入2倍體積的甘氨酸-鹽 酸緩沖溶液，然后再加入等體積的水溶性苯胺藍(lán)，混合均勻后靜置反應(yīng)，檢測(cè)共振瑞利散射 強(qiáng)度，由上述線性方程計(jì)算出待測(cè)樣品中殼聚糖的濃度。
[0012] 優(yōu)選地，所述甘氨酸-鹽酸緩沖溶液的pH值為1.7。
[0013] 優(yōu)選地，所述水溶性苯胺藍(lán)的濃度為1 .〇X 10-4mol/L。
[0014] 優(yōu)選地，所述靜置反應(yīng)的溫度為100°(：，反應(yīng)時(shí)間為101^11。反應(yīng)后4.5小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定， 在4.5h內(nèi)檢測(cè)殼聚糖待測(cè)溶液的共振瑞利散射強(qiáng)度。
[0015] 優(yōu)選地，待測(cè)樣品初步處理的步驟如下:將待測(cè)樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解， 待完全溶解后離心，得上清液，上清液稀釋后用于共振瑞利散射法檢測(cè)。
[0016] 優(yōu)選地，可以向待測(cè)樣品中加入適量EDTA掩蔽劑降低離子干擾物對(duì)殼聚糖的影 響。更優(yōu)選地，所述H)TA掩蔽劑的加入濃度為0.001m 〇l/L。
[0017] 更優(yōu)選地，一種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法，包括以下步驟：
[0018] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:在一系列10.OOmL的比色管中，按先后順序分別加入lmL濃度分 別為0.1、0.5、1、3、5、10、20、30、35yg/mL的殼聚糖溶液，pHl. 7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液 2.00mL，l .OX l(T4m〇l/L水溶性苯胺藍(lán)1.00mL，以蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻得到濃度分別 為0.01、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00、3.50噸/11^的殼聚糖待測(cè)溶液，靜置反應(yīng) 10分鐘，以Xex = Aem進(jìn)行同步掃描，記錄RRS光譜，并于349nm處分別測(cè)量離子締合物的I和 試劑空白的1〇, A 1 = 1-1〇,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步得線性方程；
[0019] 樣品檢測(cè)：將〇 . 4g待測(cè)樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶 解后離心，取2.5mL上清液，并定容至100mL，作為樣品操作液，取lmL樣品操作液，加入2mL的 pH為1.7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，再加入lmL的1.0 X l(T5m〇l/L水溶性苯胺藍(lán)，用水定容至 10mL，混合均勻后，靜置10分鐘，檢測(cè)共振瑞利散射強(qiáng)度，由線性方程計(jì)算出待測(cè)樣品中殼 聚糖的濃度。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0021] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)水溶性苯胺藍(lán)與殼聚糖結(jié)合形成離子締合物，能引起溶液的共振 瑞利散射光(RRS)顯著增強(qiáng)，并出現(xiàn)新的RRS光譜。殼聚糖-水溶性苯胺藍(lán)體系在0.01~3.5y g/mL范圍內(nèi)與殼聚糖濃度呈線性關(guān)系，線性方程：AI = 2597.4c-40.584，R2 = 0.9992,檢測(cè) 限6.94ng/mL。更重要的是，以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量時(shí)，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性 不受殼聚糖分子量的影響，能夠準(zhǔn)確測(cè)定殼聚糖含量。該方法不僅靈敏高，且選擇性好，能 用于復(fù)雜樣品的測(cè)定，精密度和加標(biāo)回收率結(jié)果令人滿意。
【附圖說明】
[0022]圖1為復(fù)合光譜圖。
[0023] 圖2為CTS-AB締合的機(jī)制圖。
[0024]圖 3 為共振瑞利散射圖譜；其中 l.CTS 1.0yg/mL;2.AB 1.0X10-5mol/L;3-7.AB (1 ? 0 X 10-5mol/L)-CTS(0 ? 05,0.5，1.5,2.5,3.5yg/mL)締合物。
[0025]圖4為緩沖溶液種類的影響。
[0026] 圖5為pH的影響。
[0027]圖6為緩沖液用量的影響。
[0028]圖7為染料濃度的影響。
[0029]圖8為溫度的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例 只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特 殊說明，均為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑 和材料。
[0031] 水溶性苯胺藍(lán)(AB)操作液（1.00 X 10-4m〇l/L):精密稱取0.0184g水溶性苯胺藍(lán)，用 水溶解，于250mL容量瓶中定容，搖勻，備用。
[0032] 0.3mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖溶液：（22.44g甘氨酸+17.52g NaCl )/L與NaOH或HC1溶 液按不同比例配制調(diào)節(jié)而成。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 一、光譜分析：在10mL的比色管中，加入lmL殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.00yg/mL)、pH為 1.7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液2. OOmL、濃度為1.0 X l(T4m〇l/L水溶性苯胺藍(lán)操作液1. OOmL，純 水定容至刻度，搖勻。掃描CTS-AB的紫外分光光譜和共振瑞利散射光譜，復(fù)合光譜圖見圖1。 圖1(a)和(b)是室溫下和100°C加熱后的CTS、AB以及CTS-AB離子締合物的紫外分光光譜圖。 比較圖1(a)和(b)，無論是室溫下的還是加熱后的AB和CTS-AB締合物均有兩個(gè)相同的吸收 峰，分別在Xl = 316nm和A2 = 588nm處，且兩者的吸收強(qiáng)度幾乎相同。但是，與圖1(a)相比，圖 1(b)的AB，CTS-AB締合物的光譜圖均在A = 220nm處有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰。這是由于在加熱 以后，AB發(fā)生0-31的吸收轉(zhuǎn)移。圖1(c)和(d)是常溫下和100°C加熱后的共振瑞利散射光譜 的比較。加熱前后的CTS和AB共振瑞利散射光譜幾乎沒有差別，共振瑞利散射強(qiáng)度都很弱。 CTS-AB離子締合物加熱前后最大共振瑞利散射峰均在A = 349nm，但是100°C加熱后的共振 瑞利散射強(qiáng)度大大增強(qiáng)了。當(dāng)共振瑞利散射特征峰位于或者接近紫外吸收帶，那么散射過 程就會(huì)通過共振吸收光能，從而產(chǎn)生再散射，這樣大大的增強(qiáng)了散射的強(qiáng)度，從而產(chǎn)生共振 瑞利散射。比較紫外吸收分光光譜和共振瑞利散射光譜，最大共振瑞利散射峰X = 349nm，正 好在紫外吸收光譜吸收峰316nm附近。因此，共振瑞利散射的強(qiáng)度大大增強(qiáng)。
[0035] CTS-AB離子締合:AB分子中包含3個(gè)-S03-和1個(gè)-NH2。在強(qiáng)酸性溶液中，-NH 2質(zhì)子化 成-NH3+，AB就以兩性染料的形式存在強(qiáng)酸性溶液中。當(dāng)溶液的pH上升，-NH2質(zhì)子化的水平會(huì) 下降。因此，在弱酸性溶液中，AB分子帶的3個(gè)-S0廠會(huì)完全解離，故AB以AB 3^的形式存在。CTS 在中性的水溶液中的pKa值是6.3，但是當(dāng)溶液中pH彡6.0，殼聚糖的-NH2會(huì)質(zhì)子化成-NH 3+， 在弱酸性的溶液中溶解性增強(qiáng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)在pH 1.0~3.0緩沖溶液介質(zhì)中，AB和CTS 會(huì)形成較穩(wěn)定的締合物且共振瑞利散射的強(qiáng)度與殼聚糖濃度成正比。CTS-AB締合的機(jī)制如 圖2,帶正電荷的-NH 3+和帶負(fù)電荷-S0廠電中和形成離子締合物。但是，當(dāng)CTS-AB締合物加熱 后，AB分子中自帶的相鄰的-NH 3+和-SOf可能發(fā)生締合，離子締合物締合更加完全更加緊 密，共振瑞利散射強(qiáng)度也大大增強(qiáng)。
[0036]二、共振瑞利散射圖譜:在一系列1 OmL比色管中，依次加入適量的殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 或者樣品操作液、適宜pH的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液2.00mL、水溶性苯胺藍(lán)操作液1.00mL，以 水定容，搖勻，于l〇〇°C水浴分別10min、3min。在F-2500上，選擇激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為 5nm，以Aex = Aem進(jìn)行同步掃描，記錄共振瑞利散射光譜，并分別于349nm處分別測(cè)量殼聚 糖-水溶性苯胺藍(lán)體系的共振瑞利散射光強(qiáng)度I，以及試劑空白的1〇，計(jì)算△ I = 1-1〇。結(jié)果如 圖3所示，由圖3可知，單純的殼聚糖、水溶性苯胺藍(lán)存在時(shí)，各自的共振瑞利散射光強(qiáng)度都 非常弱，但是，當(dāng)殼聚糖與水溶性苯胺藍(lán)在水浴條件下締合后，其共振瑞利散射大大增強(qiáng)， 且出現(xiàn)特征峰，CTS-AB的共振瑞利散射光譜的特征峰出現(xiàn)在349nm處且與殼聚糖的濃度成 良好的線性關(guān)系。
[0037]三、共振瑞利散射法條件優(yōu)化：
[0038] 1、緩沖溶液:考察了 B-R緩沖溶液、NaAc-HAc緩沖溶液及甘氨酸-鹽酸緩沖溶液對(duì) CTS-AB體系的影響，由圖4可知，CTS-AB離子締合物在甘氨酸-鹽酸緩沖體系中隨著殼聚糖 濃度升高其A I升高的較快且線性關(guān)系良好，故后續(xù)條件實(shí)驗(yàn)和殼聚糖測(cè)定均選用甘氨酸-鹽酸緩沖體系。
[0039] 2、pH的選擇及緩沖用量:在酸性條件下篩選pH，如圖5，發(fā)現(xiàn)CTS-AB體系在1.5~ 4.5范圍內(nèi)A I值較大，進(jìn)一步篩選可知在PH1.6~1.8時(shí)出現(xiàn)A I最大，最終選擇PH1.7作為 最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。同時(shí)考察了緩沖溶液的用量，如圖6，CTS-AB體系選擇加入2. OmL甘氨酸-鹽 酸緩沖溶液。
[0040] 3、染料濃度：固定其他試劑用量，測(cè)定體系在不用濃度染料時(shí)的共振瑞利散射強(qiáng) 度I，同時(shí)測(cè)定對(duì)應(yīng)濃度染料的試劑空白1〇,用A I對(duì)染料濃度作圖，結(jié)果如圖7。在CTS-AB體 系中，AB濃度為1.0 X l(T5m〇l/L時(shí)，體系的A I最大，因此選擇1. 〇 X l(T5m〇l/L為AB的最佳濃 度。
[0041] 4、溫度的影響：考察了反應(yīng)溫度對(duì)共振瑞利散射強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)考察了室溫 (23 ? 5 °C)、30 °C、40 °C、50 °C、60 °C、70 °C、75 °C、80 °C、90 °C 和 100 °C對(duì)殼聚糖-染料體系的影 響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)共振瑞利散射強(qiáng)度有很大影響。圖8顯示，CTS-AB體系的共振瑞利散射 強(qiáng)度隨著溫度的上升急劇上升，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇l〇〇°C作為實(shí)驗(yàn)條件。
[0042] 5、反應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間：在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了反應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間，CTS-AB 體系在水浴100 °C時(shí)反應(yīng)lOmin即反應(yīng)完全，4.5h內(nèi)穩(wěn)定。
[0043] 6、加入次序的影響：在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了溶液加入次序?qū)舱袢鹄⑸鋸?qiáng) 度的影響，有二種加入次序：（1)殼聚糖-緩沖溶液-染料；（2)殼聚糖-染料-緩沖溶液； (3)染料-緩沖溶液-殼聚糖。CTS-AB體系三種加入次序測(cè)得三組RRS值用單因素方差分 析，在P>0.05，說明三組加入次序RRS值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，三種加入次序?qū)舱袢鹄⑸錄] 有影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用第三種加入次序。
[0044] 7、離子強(qiáng)度的影響：考察離子強(qiáng)度的影響一般選用NaCl或者KC1。本研究均選用 NaCl作為考察離子強(qiáng)度影響。CTS-AB體系在NaCl濃度低于O.lmol/L時(shí)，對(duì)共振瑞利散射的 強(qiáng)度幾乎沒有影響。
[0045] 8、線性關(guān)系與檢出限：在優(yōu)化條件下，制備CTS-AB的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，選取標(biāo)準(zhǔn)曲 線中最低殼聚糖濃度，平行制備13份測(cè)試液，同時(shí)制備試劑空白（n=13)，測(cè)定后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，算得該方法檢出限。結(jié)果見表1。
[0046] 表 1
[0048] 9、分子量的影響：從斜率顯著性檢驗(yàn)結(jié)果:CTS-AB體系P = 0.448>0.05，說明這種 方法測(cè)定殼聚糖含量時(shí)不受殼聚糖分子量的影響。
[0049] 10、共存物質(zhì)干擾：
[0050] 在選定條件下，實(shí)驗(yàn)考察了多種常見物質(zhì)對(duì)殼聚糖定量分析的影響，結(jié)果見表2。 CTS-AB體系對(duì)干擾物質(zhì)的耐受比較好，是一種選擇性很好的方法。對(duì)于未知的樣品，很難知 道樣品中是否存在干擾物質(zhì)。但是，金屬離子的存在與電導(dǎo)率是成正相關(guān)的。所以，我們?cè)?3. Oyg/mL殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液中分別添加了 Fe3+，Ca2+，Mg2+，Cu2+，Zn 2+，測(cè)定其電導(dǎo)率，分別是 433.7±25.54ys/cm，431.7±16.56ys/cm，444.7±5.507ys/cm，427.7±6.351ys/cn^P 535.3±9.451y S/cm。三種殼聚糖樣品（奧利維殼聚糖膠囊、艾得蘭殼聚糖膠囊和殼聚糖負(fù) 載鑭除氟水樣）的電導(dǎo)率分別是 490.0 ± 5.196ys/cm，490.7 ± 8.083ys/cm 和 657.3 ± 16.26y s/cm，這說明樣品可能存在某種或某幾種干擾物質(zhì)。在三種殼聚糖樣品中加入0.0001mol/L 的EDTA掩蔽劑后，三種殼聚糖樣品的電導(dǎo)率均低于200y S/cm。因此，在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)，能 將測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差控制在低于5% (表3)。
[0051 ] 表2干擾物質(zhì)的影響（cCTS:2.0yg/mL)
[0053]表3(ccTS:3.0lig/mL)
[0055] 應(yīng)用例1
[0056] 使用本發(fā)明建立的共振瑞利散射法檢測(cè)市場(chǎng)上常規(guī)使用的兩類殼聚糖藥品，第一 類樣品是殼聚糖膠囊，包括奧利維和艾得蘭兩個(gè)品牌的膠囊，第二類樣品是殼聚糖負(fù)載鑭 除氟后的水樣品。檢測(cè)方法如下：
[0057] 1、樣品預(yù)處理：（1)殼聚糖膠囊:分別準(zhǔn)確稱取0.0400g殼聚糖膠囊粉末(奧利維和 艾得蘭兩個(gè)品牌），用〇. 5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶解后于6000r/min 離心15min，取2.5mL上清液，加入O.Olmol/L的EDTA溶液lmL，后以純水定容至lOOmL，作為樣 品操作液。
[0058] (2)殼聚糖復(fù)合除氟劑脫氟后水樣:取1.00g殼聚糖，溶于60ml 5 %乙酸溶液，按鑭 與殼聚糖質(zhì)量比為1:10加入硝酸鑭溶液，用5%氨水調(diào)節(jié)至pH5.0~6.0,攪拌反應(yīng)60min，然 后滴加25 %氨水使改性殼聚糖完全析出，過濾，洗滌，70°C烘干，制得鑭改性殼聚糖吸附劑。 采用該吸附劑對(duì)8.95mg/L含氟水樣進(jìn)行靜態(tài)除氟實(shí)驗(yàn)，條件為:pH 4~8，140r/min振蕩速 度下于室溫吸附150min，過濾后得除氟后水樣。
[0059] 2、樣品含量測(cè)定及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)：于1 OmL比色管中加入一定體積的樣品操作 液，平行6份，同時(shí)制備試劑空白和殼聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算樣品中殼聚糖含量，結(jié)果見表4。從 實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，CTS-AB體系測(cè)定奧利維樣品殼聚糖平均含量964.0mg/g，艾得蘭樣品殼聚糖 平均含量為891.2mg/g，殼聚糖負(fù)載鑭除氟后水樣殼聚糖平均含量0.6124yg/mL，RSDS〇.94 ~1.26%。同時(shí)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定加標(biāo)回收率，得CTS-AB體系三種樣品平均加標(biāo)回收率 為 100.3~103.2%，RSD為2.7~4.8%。
[0060]表4樣品中殼聚糖測(cè)定結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 水溶性苯胺藍(lán)在作為定量分析殼聚糖的探針中的應(yīng)用。2. 以水溶性苯胺藍(lán)為探針的定量分析殼聚糖的方法。3. -種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法，其特征在于，包括如下步驟： 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配置η個(gè)成梯度濃度的殼聚糖溶液和1個(gè)空白試劑，向η個(gè)成梯度濃度 的殼聚糖溶液和1個(gè)空白試劑中分別加入2倍體積的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，然后再分別加 入等體積的水溶性苯胺藍(lán)，混合均勻后得到稀釋后的成濃度梯度的殼聚糖待測(cè)溶液，靜置 反應(yīng)，檢測(cè)殼聚糖待測(cè)溶液的共振瑞利散射強(qiáng)度，具體為以Ae X=Aem進(jìn)行同步掃描，記錄 RRS光譜，并于349nm處分別測(cè)量離子締合物的I和試劑空白的io, Δ1 = l-i〇,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，進(jìn)一步得線性方程； 樣品檢測(cè)：向經(jīng)過初步處理后的待測(cè)樣品的上清液中，加入2倍體積的甘氨酸-鹽酸緩 沖溶液，然后再加入等體積的水溶性苯胺藍(lán)，混合均勻后靜置反應(yīng)，檢測(cè)共振瑞利散射強(qiáng) 度，由上述線性方程計(jì)算出待測(cè)樣品中殼聚糖的濃度。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述甘氨酸-鹽酸緩沖溶液的pH值為1.7。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述水溶性苯胺藍(lán)的濃度為1.0 Χ10-4 mol/L〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述靜置反應(yīng)的溫度為100°C，反應(yīng)時(shí)間為 10min〇7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品初步處理的步驟如下：將待 測(cè)樣品用〇.5mol/L的醋酸溶液溶解，待完全溶解后離心，得上清液，上清液稀釋后用于共振 瑞利散射法檢測(cè)。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，向待測(cè)樣品中加入適量EDTA掩蔽劑降低離 子干擾物對(duì)殼聚糖的影響。9. 一種以水溶性苯胺藍(lán)為探針測(cè)定殼聚糖含量的方法，其特征在于，包括以下步驟： 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:在一系列10 . OOmL的比色管中，按先后順序分別加入lmL濃度分別為 0.1、0.5、1、3、5、10、20、30、35yg/mL的殼聚糖溶液，pHl. 7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液2. OOmL， 1.0 X 1(T4 mol/L水溶性苯胺藍(lán)1.00mL，以蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻得到濃度分別為0.01、 0·05、0·10、0·30、0· 50、1·00、2· 00、3.00、3.5(^8/!1^的殼聚糖待測(cè)溶液，靜置反應(yīng)10分 鐘，以Aex=Aem進(jìn)行同步掃描，記錄RRS光譜，并于349nm處分別測(cè)量離子締合物的I和試劑 空白的Λ，Δ 1 = I-i〇，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步得線性方程； 樣品檢測(cè)：將〇.4g待測(cè)樣品用0.5mol/L的醋酸溶液溶解，定容至100mL，待完全溶解后 離心，取2.5mL上清液，并定容至100mL，作為樣品操作液，取lmL樣品操作液，加入2mL的pH為 1.7的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，再加入lmL的1.0 Χ10-4 mol/L水溶性苯胺藍(lán)，用水定容至 10mL，混合均勻后，靜置10分鐘，檢測(cè)共振瑞利散射強(qiáng)度，由線性方程計(jì)算出待測(cè)樣品中殼 聚糖的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/63GK106053399SQ201610369656
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】白研, 蘇政權(quán), 張偉愛, 馬彩娟
【申請(qǐng)人】廣東藥科大學(xué)