專(zhuān)利名稱(chēng)：可溶性病毒特異性t細(xì)胞受體組合物的制作方法
可溶性病毒特異性T細(xì)胞受體組合物
發(fā)明的
背景技術(shù)：
病毒感染，例如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)諸如HIV-I的感 染以及丙型肝炎病毒(HCV)的感染，是一項(xiàng)重大的公共健康問(wèn) 題。有許多種藥物目前4皮用來(lái)治療感染了這類(lèi)病毒感染的個(gè)體， 例如，包括逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)抑制劑以及蛋白酶(PI)抑制劑在內(nèi) 的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。盡管這些試劑對(duì)于HIV (人類(lèi)免疫缺陷病 毒)感染的治療是有效的，對(duì)藥物抗性品系以及病毒的蓄積藥物 毒性的研究發(fā)展仍然是一個(gè)受關(guān)注的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了用于i貪斷以及治療病毒感染的方法以及纟且合 物。所述的方法是以對(duì)來(lái)自于細(xì)"包毒性T細(xì)力包克隆的T細(xì)"包受體 基因序列的識(shí)別為基礎(chǔ)的，其中所述的T細(xì)月包受體基因序列對(duì) HIV-I (人類(lèi)免疫缺陷病毒-I)或者HCV (丙型肝炎病毒)具有 特異性。因此，本發(fā)明包括分離的T細(xì)胞受體基因以及由該基因 編碼的多肽，其編碼可溶性T細(xì)胞受體多肽或者蛋白，其中所述 的受體多肽或者蛋白能夠與HIV-I或者HCV以及由該基因編碼 的多肽之上的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位發(fā)生特異性的結(jié)合。
上述表位包括一種短的、8至11個(gè)肽，或者由一種短的8至 11個(gè)肽組成，其中所述的肽依靠一種細(xì)月包表面與I類(lèi)主要組織相 容性復(fù)合體(MHC )抗原相連4妄，其中所述的I類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體是例如HLA (人類(lèi)白細(xì)月包抗原)分子。所述的表位包括 與天然產(chǎn)生的HIV蛋白或者HCV蛋白相一致的多肽序列，或者 包括來(lái)自于天然產(chǎn)生的HIV蛋白或者HCV蛋白的多肽序列。
所述的T細(xì)月包受體基因既編碼T細(xì)月包受體的a鏈，也編碼T 細(xì)胞受體的P鏈。所述的T細(xì)胞受體oc4連以及T細(xì)胞受體的|3鏈 均包括一種恒定區(qū)(C區(qū))， 一種可變區(qū)(V區(qū))以及一種互補(bǔ) 決定區(qū)3(CDR3)區(qū)域，或者由上述三個(gè)區(qū)域構(gòu)成。所述的CDR3 區(qū)域介導(dǎo)抗原肽/主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)復(fù)合體間的相互反 應(yīng)，由一種1至90個(gè)核香的隨4幾序列組成，其中所述的隨4幾序 列是由體細(xì)月包重組而產(chǎn)生的。這些基因序列#:用來(lái)構(gòu)建重組 HIV-I或者HCV-特異性可溶性T細(xì)胞受體分子，所述的T細(xì)月包 受體分子被用來(lái)進(jìn)行體外i貪斷以及體內(nèi)治療。例如，這些可溶性
T細(xì)胞受體可以作為著色劑，用來(lái)在體外試-驗(yàn)中對(duì)患者來(lái)源的組 織樣本或者體液樣本呈現(xiàn)出的HIV-I或者HCV細(xì)胞毒性T細(xì)胞 表位進(jìn)行4企測(cè)?？梢匀芜x的，所述的可溶性T細(xì)胞受體多肽可以 與 一種可4企測(cè)的標(biāo)記物相連接，所述的可才全測(cè)的標(biāo)記物是例如熒 光分子。所述的可4企測(cè)的標(biāo)記物與所述的受體多肽相連4妄或者相 共扼，從而促進(jìn)了診斷。而且，大量的可溶性單鏈I類(lèi)HLA (人 類(lèi)白細(xì)胞抗原)限制的T細(xì)胞受體多肽被固定于固體載體之上， 所述的固體載體是例如木片或者平板。例如，將所述的T細(xì)胞受 體以 一種樣i:陣列的形式進(jìn)4亍構(gòu)建，用于對(duì)過(guò)程中的病毒表位進(jìn)4亍 識(shí)別以及檢測(cè)。對(duì)于治療目的而言，將細(xì)胞毒性分子或者細(xì)胞因 子連4妻或者結(jié)合至所述的T細(xì)月包受體(TCR)上。
優(yōu)選的可溶性T細(xì)胞受體構(gòu)建包括下列與T細(xì)胞受體a、 (3 鏈對(duì)相一致的序列Vb序歹'J CASSQGVTLLN (序歹。4 )以及Va5 序列CAETY (序列6 )。在I類(lèi)人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA )分子A2 中這種可溶性T細(xì)胞受體具有序列5 (HIV-Ivpr:人類(lèi)免疫缺陷
7病毒j病毒蛋白)的表位特異性。上述T細(xì)胞受體序列的衍生物 同樣被包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。衍生的T細(xì)胞受體的特征是對(duì) I類(lèi)人類(lèi)白細(xì)胞抗原限制性表位具有更高的結(jié)合親和性，在下文 的表l中所示。例如， 一種矛;于生的可、溶性T細(xì)月包受體構(gòu)建體相對(duì) 于參考序列4以及參考序列6而言，可能包4舌1、 2、 3、 4或者 更多個(gè)保守的或者非保守的氨基酸取代基，并且與含有上述初始 參考序列的構(gòu)建體相比，其具有增加了的表位結(jié)合親和性的特 征。 一種優(yōu)選的具有丙型肝炎病毒(HCV)表位結(jié)合特異性的可 溶性T細(xì)胞受體構(gòu)建體包括下列與T細(xì)胞受體a、 P鏈對(duì)相一致 的序列Va序歹'J CAVNEYGQNFV (序歹'J 27 )以及Vb序列 CAWSGGLNTEAF (序列29 )。這種可溶性T細(xì)胞受體構(gòu)建體具 有序列28的表位結(jié)合特異性，其為一種HCV肽，同樣存在于I 類(lèi)HLA分子A2中。上述T細(xì)胞受體序列以及其他T細(xì)胞受體 序列以及它們的結(jié)合特異性和HLA限制性在表1中所示。
"基本上是純的"指的是已經(jīng)從天然伴隨其存在的組分中分 離出來(lái)的核酸、多肽或者其他分子。典型的，當(dāng)多肽具有的至少 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、或者甚至99%重量的部分是不含 蛋白質(zhì)以及與其天然相結(jié)合的天然產(chǎn)生的有才幾分子時(shí)，則所述的 多肽在基本上是純的。例如，可以通過(guò)下述方法來(lái)獲得一種本質(zhì) 上純的多肽乂人天然來(lái)源中進(jìn)行分離，在細(xì)l包中進(jìn)行重組核酸的 表達(dá)，其中所述的細(xì)胞在正常情況下不對(duì)所述蛋白進(jìn)行表達(dá)，或 者通過(guò)化學(xué)合成的方法。 一種蛋白分離片段指的是具有所述參考 蛋白的序列的一部分的肽，其中所述的序列比全部序列短，并且 不含有天然產(chǎn)生的側(cè)翼區(qū)。 一種分離的多肽缺少一個(gè)或者多個(gè)氨 基酸，其中所述的氨基酸是所述天然產(chǎn)生的分子中的參考片段的 側(cè)翼。當(dāng)一個(gè)具體的多肽分子或者核酸分子祐:i人為與一種^皮定義了長(zhǎng)度的參考多肽分子或者參考核酸分子具有特定的同 一性百分?jǐn)?shù)時(shí)，則所述的同 一 性百分?jǐn)?shù)是相對(duì)于所述的參考多肽分子或者參考核酸分子而言的。因此，當(dāng)一種肽與具有100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的參考多肽具有50%的同一性時(shí)，則所述的肽可以是一種具有50個(gè)氨基酸的多肽，所述的50個(gè)氨基酸與所述參考多肽的50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的部分是完全相同的。它也可能是一種具有100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽，其中有50%的氨基酸在其完整的長(zhǎng)度內(nèi)與所述參考多肽是相同的。同樣的規(guī)則也適用于核酸分子。
對(duì)于多肽而言，所述參考多肽序列的長(zhǎng)度將通常為至少5個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。例如，所述的肽具有5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在某些情況中，所述的肽更大一些，例如，15、 20、 25個(gè)氨基酸或者更長(zhǎng)的長(zhǎng)度。例如， 一個(gè)特定序列例如表位序列的肽的側(cè)翼是其他氨基酸，其中所述的氨基酸與天然產(chǎn)生的蛋白中的序列的側(cè)翼上的氨基酸不同。對(duì)于核酸而言，所述參考核酸序列的長(zhǎng)度將通常為至少15、20或者25個(gè)核酸的長(zhǎng)度。然而，具有更大的構(gòu)建體，例如那些具有至少50個(gè)核苷、優(yōu)選具有至少60個(gè)核普、更優(yōu)選具有至少75個(gè)核苷、以及最優(yōu)選具有100個(gè)核苷或者300個(gè)核普的構(gòu)建體。
本發(fā)明還包4舌才艮據(jù)T細(xì)胞受體序列或者表位序列而產(chǎn)生的布f生肽。在與參考序列具有小于100%同一性的多肽序列的情況中，在不相同的位置處優(yōu)選但不是必須的存在針對(duì)所述參考序列的保守性取代基。保守性取代基通常包括具有下述基團(tuán)的取代基甘氨酸以及丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，以及亮氨酸；天冬氨酸以及谷氨酸；天冬酰胺以及谷酰胺；絲氨酸以及蘇氨酸；賴(lài)氨酸以及4青氨酸；以及苯丙氨酸以及酪氨酸。在相對(duì)于所述參考序列而言具有氨基酸耳又代基的肽中，所述T細(xì)胞受體對(duì)其HLA限制性表位的結(jié)合親和性增加了 ?；蛘?，含有書(shū)于生序列的構(gòu)建體具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性，例如，在生理可接受性溶液中具有更長(zhǎng)的半衰期，其中所述的生理可^妄受性溶液是例如培養(yǎng)基或者體液，并且其中所述的體液是例如血液，血漿或者血清。例如，相對(duì)于所述參考
肽序列而言，這類(lèi)4汙生肽的結(jié)合親和性和/或穩(wěn)、定性為至少5%、10%、 25%、 50%、 75%、 90%、 100%、 2倍、5倍、10倍、20倍或者更高?？梢匀芜x的，衍生的肽序列包括其他的氨基酸，其中所述的氨基酸在所述參考序列的側(cè)翼上，位于所述序列的氨基末端和/或羧基末端。如上所述，這類(lèi)含有非天然產(chǎn)生的側(cè)翼序列的構(gòu)建體的特4正是具有增加了的表位結(jié)合親和性和/或增加了的內(nèi)。
一種分離的或者純化的核酸分子是從5，編碼序列以及3，編碼序列或者非編碼序列中分離出來(lái)的，在有才幾體天然產(chǎn)生的基因組中，它們之間是直4妻才目々卩的(immediately contiguous )。分離的4亥酸分子包4舌那些不是天然產(chǎn)生的核酸分子，例如，由重組DNA技術(shù)生成的核酸分子。這里所識(shí)別的核酸包括那些與參考序列具有至少85%、 90%、 95%、 98%、 99%的同一't"生的序列，以及參考沖亥f復(fù)序列的退4匕變體(degenerate variants )。
通過(guò)下文對(duì)于優(yōu)選實(shí)施方式的描述以及4又利要求，本領(lǐng)域才支術(shù)人員可以明顯看出本發(fā)明的其他特征以及優(yōu)點(diǎn)。這里所引用的參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。
具體實(shí)施例方式
HIV-I或者HCV特異性細(xì)胞精確的識(shí)別I類(lèi)MHC (主要組織相容性復(fù)合體)限制的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位，并通過(guò)有限稀釋克隆的方法對(duì)其進(jìn)4亍分離。 -使用MHC (主要組織相容性復(fù)合體)I類(lèi)四聚體對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行染色，其中所述的MHCI類(lèi)四聚體與各自的表位肽發(fā)生了折疊，并且使用 一種FACS ARIA (流式細(xì)胞分選4義)4義器對(duì)四聚體結(jié)合細(xì)月包進(jìn)行分選。分離儲(chǔ)存細(xì)胞的mRNA,利用巢式PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))對(duì)所述T細(xì)胞受體基因的逆轉(zhuǎn)錄體以及cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。使PCR產(chǎn)物與克隆載體發(fā)生結(jié)合，用來(lái)轉(zhuǎn)化E.coli (大腸桿菌)。在細(xì)菌擴(kuò)增之后，利用標(biāo)準(zhǔn)操作對(duì)插入的載體進(jìn)行純化和測(cè)序。下述T細(xì)胞受體的序列4皮i。、別出來(lái)。
表1: T細(xì)胞受體序列
T細(xì)胞受體(a (a), P (b)鏈對(duì))表位特異性限制的I類(lèi) HLA(人類(lèi)白 細(xì)胞抗原)的 類(lèi)型
Vb27-CASSLGQGLANYGYT-Jl .2 序列1 Va3-CAVRDLTGNQFY-J49 序列3FL8 (FLKEKGGL) 序列2 HIV-I (nef)B8
Vb 14-C AS SQGVTLLN-J2.1 序列4 Va5-CAETY-J36 序列6AL9(A腿LQQL) 序列5 HIV-I ( vpr)A2
Vbl9-CASSIDGASNQPQH-J1.5 序列7 Val 3.2-CAENSDAGGTSYGKLT-J52 序列9SL9(SLYNTVATL) 序歹'J 8 HIV-I ( gag)A2
Vb 15-CATSRGAGSNTGELF-J2.2 序列10 Val 2.2-CAVRGSGTYKYI-J40 序列11FL8 (FLKEKGGL) 序列2 HIV-I (nef)B8
Val 9-CALSGNHSGGATNKLI-J32 序列12 Vb4.3-CASSPWTGGGQPQH-Jl .5 序列14TW10(TSTLQEQIGW) 序列13 HIV-I ( gag)B57
Va5-CAASGGY()KVTFGTGTKLQVIP 序列15 Vb 19-CASTGTYGYT-J1.2 序列16KF11(KAFSPEVIPMF) 序列17 HIV-I ( gag)B57
Val2.3-CAMSAQQAGTALI-J15 序列18 Vbl 1.2-CASSLVIMSEQY-J2.7 序列20SL9(SEGATPQDL) 序列19 HIV-I ( gag)B60
11Val 3.1-CAATSGYALN-J41 序列21 Vb9-CASSVQGEFREKLF-Jl .4 序列23E18(EIYKRWI1) 序列22 HIV-I ( gag)B8
Va27-CAGRDYKLS-J20 序列24 Vb20.1 -CS ARGDNPNTE AF陽(yáng)J1.1 序列26KL9(KEKGGLEGL) 序列25 HIV-I (nef)B60
Va8.1-CAVNEYGQNFV-J26 序列27 Vb30-CAWSGGLNTEAF-Jl 1 序列29AL9(ALYDWTKL) 序列28 (HCV)A2
Vb27-CASSVRTGELF-J2.2 序列30 Va29-CAASFTQNGLT-J45 序列32QKl O(QVPLRPMTYK) 岸列31 HIV-I ( nef)A3以及All
Vb9-CASSERDSQYQETQY-J2.5 序列33 Va29-CAASFTQNGLT-J45 序列34QKl O(QVPLRPMTYK) 岸歹'j 31 HIV-I ( nef)A3以及All
VM4-CASSPVLYEQY-J2.7 序列35 Va39-CAVVAQGGSEKLV-J57 序列36QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I (nef)A3以及All
Vb9-CASSARAFPEGNQPQH-Jl .5 序列37 Va3 9-CAVVAQGGSEKLV-J57 序列38QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I (nef)A3以及All
Vb 10.2-C AS SETNRVMEAF陽(yáng)J1.1 序列39 Va8.6-CAVSDPGFKTI-J9 序列40QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I ( nef)A3
Vb24-CATSAGRQRDTGELF-J2.2 序列41 Va8.6-CAVSDPGFKTI-J9 序列42QKl O(QVPLRPMTYK) 序列31 HIV-I (nef)A3
Vb25.1-CASSNGYEQY-J2.7 序列43 Va38.2-CAYRSDNDMR-J43 序列44KV10(KLVALGINAV) 序列45 (HCV)A2
Vb24.1 -CATSSQDGQVYEQY-J2.7 序列46 Va24-C AS YKAAGNKLT-J17 序列47GT9(GPRLGVRAT) 序列48 (HCV)B7
Vb7.9-CASSSPKDPSNQPQH-Jl .5 序列82 Va5-CAEDPTSSSGYALN-J4 序列84KKIO(KRWIILGLNK) 序列83 (HIV-I gag)B27
12表2:編碼T細(xì)"包受體的核香酸序列HCV-A2-KV10 ( KLVALGINAV )Vb25.1-CASSNGYEQY-J2.7 (序列43)
NNN麗NNNGNNNNNNNTCGCCCTT麗CAGTGGTTCAACGC
ATAGNNNNTTTCCTNN (序列49)Va38.2-CAYRSDNDMR-J43 (序列44)NN麗NTTTCNNNN (序列50 ) HCV畫(huà)B7-GT9 ( GPRLGVRAT )(序歹'j 48 ) Vb24.1國(guó)CATSSQDGQVYEQY畫(huà)J2.7 (序列46)
CTGAGC TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTNNNTTNNNNG麗 (序列51 )Va24-CASYKAAGNKLT畫(huà)J17 (序列47)
NNNNN麗N麗麗NCNNCNAATTCGCCCTTANGCAGTGGTAT
NNT麗TNN麗麗(序列52 ) HCV A2國(guó)AL9
Va8.1隱CAVNEYGQNFV國(guó)J26 (序列27)
N麗麗NNNNNG麗NNCN麗TCNCCCTTATACNCATCAGAAT
15GCNNNACTAGTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTCTGAGCTTGG NGTAATCATGG TCNNNN麗TGTTTTCCNGN (序歹'J 53)
HCV A2畫(huà)AL9
Vb30畫(huà)CAWSGGLNTEAF-J1.1 (序歹寸29)TTCACTGGC麗麗C麗TTTTAN (序歹'J 54) B8-EI8
Val3.1-CAATSGYALN-J41 (序列21 )
NN麗NNNNNNN麗CGCCCTTATACACATCAGAATCCTTACT
ATTACAATTCACTGGCN TNCCNTTTTTAN (序歹'J 55) B8-EI8
Vb9-CASSVQGEFREKXF-J1.4 (序歹'J 23)
NN麗NNNNNNNNNNNNCGCCCTTGGTGTGGGANANCTCTGTGGCAGGATCTCTAGCTTGGGGCTGGTGTCTCTGTAGTAAG
GTAT TACAATTCACTGGCCNNN麗TTTTTACANN麗(序列 56)
B60-KL9
Va27-CAGRDYKLS-J20 (序歹ll 24)CACTGGCN麗NNNNTTTTANN (序列57) B60匿KL9
Vb20.1-CSARGDNPNTEAF-Jl.l (序列26)
NN麗N麗GGN麗CNNANTCGCCCTTANGCAGTGGTATCAA CGGGAGAGAAGGTGGTGTGAGGCCATCACGGAAGATGCTG
ACCAAGGGCGAAT[Gamma]CGTTTAAACCTGCAGGACTAGT CATANNNN麗TTTCCTNN (序歹'J 58) A2-AL9 a鏈 Va5畫(huà)CAETY-J36 (序歹'J 6)NNNNN麗TTTN麗麗(序列59 )
A2畫(huà)AL9 M連Vbl4-CASSQGVTLLN國(guó)J2.1 (序歹'J 4 )
NNNN麗NNNNNNNNNCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCTGCTAGT GAGTCGTATTACAATTCACTGGCN (序列60 ) B8隱FL8 a鏈Val2.2-CAVRGSGTYKYI陽(yáng)J40 (序列11)
N麗NNNNNNTTNNNNNNN (序歹'J 61 )
B8-FL8 |3鏈Vbl5-CATSRGAGSNTGELF誦J2.2 (序列10 )AATTCTGAGCTTGGCGTANTCATGGNNNNNNNNNTNTTTNC NNGN (序歹'J 62 )
A2-SL9: Val3.2畫(huà)CAENSDAGGTSYGKLT國(guó)J52 (序歹'J 9)
CGTATCATGTNNNNNN (序列63 )
A2-SL9: Vbl9畫(huà)CASSIDGASNQPQH畫(huà)J1.5 (序歹'J 7)
22麗N麗NNNGNNNNCNANTTCGCCCTTCCCTTTGCACTATGA
AATTCTGAGCTTGGCGTAATCATGTCATA NNNNNTTNNNNN (序列64 )
B8-FL8: Vb27-CASSLGQGLANYGYT畫(huà)J1.2 (序歹'J 1)
GANACNNCTGNNN (序歹'J 65)B8畫(huà)FL8: Va3-CAVRDLTGNQFY-J49 (序歹'J 3)GACCCCCC麗NN麗CGCCCGCCGNGAGCTTA麗TGGAGCC
TCACAGGGGATAACCTGGTTAAAGGCAGCTATGGCTTTGAA
GTCACAAANNNNN (序列66 )B57-TW10
Val9國(guó)CALSGNHSGGATNKLI國(guó)J32 (序歹寸12)AATTCTGANCTNGNCGNNATCNNNNNNNAfNNNNNNNNAAAAIN麗NNNN (序歹ij 67)
B57-TW10
Vb4.3-CASSPWTGGGQPQH畫(huà)J1.5 (序歹'J 14)
TAGNNNNGT TTCCNGA (序列68 )B56-KF11
Va5誦CAASGGYQKVTFGTGTKLQVIP (序歹'J 15)麗NNNNNN麗麗NNTCNCCCTT麗NCNGNGGT麗C麗CGC NNAGNANNCGGGGGAAGANATACTTGNNNNTATNGCTCTCT TGGCTGGAGATTGCAGGTCCCAGTGGGGAGAACAATGAAG
GTAATCNTGGNNNNNNCNNNNNNTTTNCCNGNNNNN (序列 69)
B57-KF11
Vbl9-CASTGTYGYT-JL2 (序歹'J 16)
NN麗麗N麗CNC麗ANTCGCCCTTAAGCAGTGGTATCAACCTGAGCTTGGCGTANTCATGGTCNNN麗NTNNNTTNCCNGN N (序列70)
B60-SL9
Val2.3-CAMSAQQAGTALI-J15 (序列18)AATTCTGAGCTTGGCGNNATC麗N麗NAAN麗TNTTTTNNN NNNNNN (序歹'J 71 )
B60-SL9 Vbll.2
Vbll.2-CASSLVIMSEQY-J2.7 (序歹'J 20)
麗NNN麗NGNNNCN麗TCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCT
麗NNN麗TTTNCCNNNN (序列72 ) A3/A11 QK10
Vb27畫(huà)CASSVRTGELF-J2.2 (序歹'J 30)
NN麗麗NNNNNANTCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCTGCTGAGAGGTCTGGTTGGGGCTCGGCGACTCCAGGATCAGGGG
TTTANNN (序歹'J 73)
Vb9-CASSERDSQYQETQY畫(huà)J2.5 (序列33)
NNNNNNNNNN麗NTCGCCCTTGGTGTGGGAGANCTCTGCT
TGGCCGNNCGTTTTANAN (序列74 ) Va29-CAASFTQNGLT-J45 (序歹'J 34)
29CAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCAC TGNNN麗CNN麗TTT麗(序列75 )
A3/A11 QK10
Vbl4-CASSPVLYEQY-J2.7 (序歹'j 35)
TTT麗NN (序列76 )
Vb9畫(huà)CASSARAFPEGNQPQH-J1.5 (序歹'J 37)TCCATTATAATAGTGAATGAGGAACTGGAGGCCCTGGTCCA
CAATTCACTGGCCGTCGTTTTANAN (序列77) Va39-CAVVAQGGSEKLV-J57 (序列38)
NNNNNTNNNNNNNATTCGCCCTTGGTGTGGGANANCTCTGC
CAATTCACTGGCCGTCGTTTTANAN (序歹'J 78) A3 QK10
Vbl0.2-CASSETNRVMEAF-Jl.l (序列39)ATCGGGGACTTCTCCTTTATCTGTAATATCAGCAGCTGCTGA
GTCGTTTTACN (序歹'J 79 ) Vb24-CATSAGRQRDTGELF國(guó)J2.2 (序歹'J 41 ) NNNN麗NNNNNNTCGCCCTTGGTGTGGGANNNCTCTGCTT
TGGCCGTCGTTTTANNN (序歹'J 80) Va8.6-CAVSDPGFKTI畫(huà)J9 (序歹'J 40)AGGGACTTGGCTGTCAAGCTGGGTCACAGGCTGGGCTCTG
CTGGCNN (序列81 ) B27-KK10
Va5-CAEDPTSSSGYALN-J4 (序列84)
N (序歹'J 85 )Vb7.9-CASSSPKDPSNQPQH畫(huà)J1.5 (序歹'J 82)
N麗NNNNNNNNNGCN麗TCGCCCTTNAGCAGTGGTATCAA
NNNNNNNN (序歹'J 86 )
病原體特異性可溶性T細(xì)胞受體構(gòu)建體
對(duì)于體內(nèi)免疫治療途徑而言，能夠特異性的識(shí)別在感染 HIV-I的細(xì)胞的表面上結(jié)合有MHC (主要組織相容性復(fù)合體)I 類(lèi)分子的HIV-I細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位的分子化合物是一種有力的 工具，它可以直接命中感染細(xì)胞。而且，這些化合物#1用來(lái)在自 然感染的過(guò)程中對(duì)淋巴細(xì)胞或者專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞上呈現(xiàn)出的 HIV-I抗原進(jìn)行-珍斷性的體外評(píng)估。能夠特異性的與同源MHC 復(fù)合體發(fā)生結(jié)合的可溶性單鏈a/(3 T細(xì)胞受體構(gòu)建體代表的是 能夠?qū)IV-I感染細(xì)月包進(jìn)4亍直4妻體外命中或者體內(nèi)命中的最有希 望的分子。可溶性T細(xì)"包受體的氨基酸序列對(duì)特異性病原體的識(shí)別是以天然產(chǎn)生的T細(xì)胞受體的序列為基礎(chǔ)的。在本發(fā)明公開(kāi)之 前，對(duì)于具有HIV-I表位或者HCV表位特異性的天然產(chǎn)生的T 細(xì)月包受體的T細(xì)月包受體序列而言，〗又有非常有限的^f言息可以利 用。本發(fā)明描述的數(shù)據(jù)闡明了 HIV-I或者HCV特異性T細(xì)胞受 體基因的序列，所述的序列可以用于進(jìn)4亍可;容性T細(xì)l包受體的構(gòu) 建，用于i貪斷和治療的用途。
目前，可以利用重組HIV-I特異性抗體進(jìn)4亍HIV-I感染細(xì)胞 的直接命中。所述的抗體途徑的一個(gè)缺點(diǎn)在于，HIV-I抗體僅僅 能才妾觸到HIV-I病毒的包膜，而官能上最重要的HIV蛋白隱藏在 包膜之內(nèi)，并且只能在由MHC I類(lèi)分子或者II類(lèi)分子進(jìn)4亍月包內(nèi) 加工和呈遞之后與免疫系統(tǒng)相接觸。 一旦被MHC分子所呈遞， 這些HIV基因產(chǎn)物會(huì)凈皮T細(xì)胞受體所識(shí)別，而不是一皮抗體所識(shí) 別。因此，HIV-I抗體僅僅能夠用于進(jìn)行非常有限的HIV-I感染 細(xì)胞的命中。本發(fā)明描述的組合物提供了 一種解決上述問(wèn)題的方 法。
對(duì)于HIV I或者HCV具有特異性的可;容性T細(xì)月包受體與現(xiàn) 有方法相比具有顯著的〗尤點(diǎn)
已經(jīng)識(shí)別出天然產(chǎn)生的HIV-I特異性CD8+ T細(xì)月包克隆的T 細(xì)胞受體cc鏈以及P《連的完整序列。迄今為止(todate)已經(jīng)識(shí) 別出這些HIV-I或者HCV特異性CD8+ T細(xì)l包的T細(xì)i包受體序列。
所述的T細(xì)月包受體序列能夠有歲支的用于重組單鏈T細(xì)月包受體 的生產(chǎn)當(dāng)中，其中所述的重組單鏈T細(xì)胞受體能夠特異性的識(shí)別 HIV-I感染細(xì)胞。這些重組T細(xì)胞受體在實(shí)踐中被用來(lái)(i)在免 疫治療方法中進(jìn)行HIV-I感染細(xì)胞的體內(nèi)命中；(ii)對(duì)'淋巴細(xì)胞 或者專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)月包中表達(dá)的HIV-I抗原進(jìn)4于體外評(píng)估。對(duì)HIV-I抗原表達(dá)的定量分析對(duì)于HIV-I免疫發(fā)病機(jī)理的研究而言 是重要的，其對(duì)于免疫治療方法的體外監(jiān)測(cè)而言也是有效的。
當(dāng)前，對(duì)于HIV-I感染患者的治療是以抗逆壽爭(zhēng)錄病毒類(lèi)藥物 的使用為基礎(chǔ)的。這些藥物是非常有效的，但是具有蓄積毒性， 同時(shí)伴隨著高度的服藥負(fù)擔(dān)(pill burden)且能夠產(chǎn)生病毒抗性。 因此，對(duì)于這些患者而言，其他的治療選擇仍然是一種持續(xù)的需 要。利用可溶性T細(xì)胞受體的免疫治療方法代表的是對(duì)于HIV-I 或者HCV感染患者人群的一種可供選擇的治療選擇。除此之外， 所述的T細(xì)胞受體可以被用來(lái)進(jìn)行HIV-I抗原表達(dá)的體外評(píng)估。
-沴斷方法
可溶性T細(xì)胞受體被用來(lái)對(duì)呈遞于專(zhuān)職抗原呈遞細(xì)胞之上的 細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位的I類(lèi)HLA介導(dǎo)的呈遞進(jìn)行分析。例如， 從宿主處獲得一種體液樣本，例如，血液，或者身體組織，例如 淋巴結(jié)。將來(lái)自于所述樣本中的白細(xì)胞與本發(fā)明所述的單鏈T細(xì) 月包受體進(jìn)^f亍-接觸。為了增加靈壽丈性，將四個(gè)單《連T細(xì)月包受體構(gòu)建 體連接在一起，例如與一種中心鏈親和素進(jìn)行連4妄，從而形成一 種四聚物復(fù)合體。將所述的構(gòu)建體與 一種可4t測(cè)的標(biāo)^己物進(jìn)行連 接，例如使用熒光基團(tuán)對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記?？蓹z測(cè)的標(biāo)記物包括熒光 染料，例如藻紅蛋白(PE)，異石危氰酸熒光素(FITC)，以及別 藻藍(lán)蛋白(APC)。 4企測(cè)是通過(guò)流式細(xì)月包術(shù)和/或組織染色(免疫 組織化學(xué))來(lái)進(jìn)行的。在另外一種實(shí)施例中，將大量的T細(xì)I包受 體構(gòu)建體固定于一種;f效陣列之上，例如木片或者平才反之上，并且
允許來(lái)自于患者的樣本與所述的陣列發(fā)生接觸，對(duì)所述的陣列進(jìn) 行洗滌，并且對(duì)結(jié)合的細(xì)胞進(jìn)4亍4全測(cè)。通過(guò)這種方式，測(cè)定出患 者的抗原呈遞細(xì)月包所表達(dá)或者呈遞出的肽。因此，可溶性T細(xì)胞^ 受體同樣可以作為一種有效的研究工具，用來(lái)對(duì)HIV-I或者HCV CTL (細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)表位呈遞進(jìn)行體外評(píng)估以及量化分
36析。它們是有用的工具，用來(lái)對(duì)表達(dá)特異性HIV-I或者HCVCTL 表位的患者進(jìn)行識(shí)別，并且因此成為本發(fā)明描述的免疫治療干涉 法的最有前途的候選物。
治療方5去
為治療感染HCV或者HIV的患者，給他們施用可溶性單鏈 T細(xì)月包受體的一種或者多種的混合物。所述的T細(xì)胞受體共輒于 另外一種組合物，例如細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-2， Y干擾素， a干擾素或者細(xì)胞毒素試劑，例如穿孔素，粒酶或者特異性藥物。 對(duì)于HCV的治療而言，將所述的可溶性單鏈HCV特異性T細(xì)胞 受體任選的共軛或者連接至干擾素之上，例如a干擾素。這種構(gòu) 建體的一種優(yōu)點(diǎn)是延長(zhǎng)了半衰期，并且增加了這些試劑對(duì)于感染 細(xì)胞所進(jìn)行的直接的抗原特異性傳遞。這種治療策略降低了總體 的藥物劑量，給藥頻率，以及與治療相關(guān)的副作用。
才艮據(jù)目標(biāo)群體的遺傳特性(例如，特定的HLA類(lèi)型的發(fā)生 率)對(duì)T細(xì)胞受體構(gòu)建體進(jìn)行選擇。例如，使用可溶性T細(xì)胞受 體的集合(pool), "i只另'J全告卩的(a repertoire of)細(xì)月包毒小生T細(xì)月包 表位，其中所述的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位受到一種特殊的群體中最 頻繁產(chǎn)生的HLA I類(lèi)分子的限制。或者，測(cè)定一種特定患者的 HLA類(lèi)型，根據(jù)所述患者的HLA類(lèi)型選擇一種或者多種HLA 特異性T細(xì)胞受體進(jìn)4亍施用。
腸胃外施用，例如靜脈內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，以及腹腔內(nèi)給藥 途徑，可以用來(lái)傳遞可溶性T細(xì)胞受體構(gòu)建體。例如，將可溶性 T細(xì)胞受體以每個(gè)動(dòng)物32微克的劑量靜脈注射給小鼠。使用本 領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)4于患者劑量的確定。
37施用本發(fā)明所述的組合物來(lái)抑制病毒病原體。對(duì)于 一種特定 的情形而言，確定合適的劑量以及纟合藥方案在本領(lǐng)域的才支術(shù)范圍
之內(nèi)。治療性化合物的有效劑量?jī)?yōu)選在大約0.1毫克/千克至大約 150毫克/千克的范圍之內(nèi)。本領(lǐng)域4支術(shù)人員知曉，有效劑量的改 變?nèi)Q于給藥途徑，賦形劑的使用，以及與其他治療方案的共同 施用，其中所述的其他治療方案包括其他試劑或者治療劑的4吏 用。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)遭受病毒病原體感染的(或者存在感染 危險(xiǎn)的)哺乳動(dòng)物患者例如人類(lèi)患者進(jìn)4亍識(shí)別，來(lái)實(shí)施治療方案。 使用本領(lǐng)域已知的方法將所述的藥物化合物施用給這樣的個(gè)體。 優(yōu)選的，所述的化合物通過(guò)口服，直腸內(nèi)，鼻腔內(nèi)，局部或者腸 胃外的形式施用，其中所述的腸胃外的形式是例如皮下，腹腔內(nèi)， 革肖內(nèi)，月幾肉內(nèi)，以及靜月永內(nèi)的形式。
其他實(shí)施方式
盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，前述的描述意在進(jìn)行 闡述而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是又后附的權(quán)利要 求進(jìn)行定義的。其他的特征，優(yōu)點(diǎn)以及修改在隨后的權(quán)利要求的 范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種組合物，包括編碼可溶性I類(lèi)HLA限定的T細(xì)胞受體(TCR)多肽的分離的核酸，其中所述的多肽特異性的與HIV或者HCV表位發(fā)生結(jié)合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 括序列4的分離的T細(xì)胞受體多肽。
3. 才艮據(jù)4又利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 4舌序歹'J 6的分離的T細(xì)月包受體多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 括序歹'J 4以及序列6的分離的T細(xì)胞受體多肽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 括序列27的分離的T細(xì)月包受體多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 4舌序歹'J 29的分離的T細(xì)月包受體多肽。
7. 才艮據(jù)4又利要求1所述的組合物，其中所述的核酸編碼一種包 二括序列27以及序列29的分離的T細(xì)月包受體多肽。
8. —種組合物，包4舌一種分離的T細(xì)月包受體多肽，其中所述的 多肽與HIV或者HCV表位發(fā)生了特異性的結(jié)合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的分離的T細(xì)胞受 體多肽包4舌序列4。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物， 體多肽包括序列6。
11. 才艮據(jù)纟又利要求8所述的組合物， 體多肽包括序列4以及序列6。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物， 體多肽包4舌序列27。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物， 體多肽包括序列29。其中所述的分離的T細(xì)萬(wàn)包受 其中所述的分離的T細(xì)月包受 其中所述的分離的T細(xì)月包受 其中所述的分離的T細(xì)月包受
14. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的分離的T細(xì)胞受 體多肽包4舌序列27以及序列29。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1或者8所述的組合物，其中所述的T細(xì)胞受 體多肽與HIV-I表位發(fā)生了結(jié)合。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1或者8所述的組合物，其中所述的T細(xì)胞受 體多肽與HCV表位發(fā)生了結(jié)合。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述的核酸包括一種oc鏈 T細(xì)胞受體序列以及一種(3鏈?zhǔn)荏w序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的T細(xì)胞受體多肽 進(jìn)一 步包括一種可4企測(cè)的標(biāo)記物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的T細(xì)胞受體多肽，其中所述的可檢 測(cè)標(biāo)記物是熒光染泮牛。
20. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的T細(xì)胞受體多肽，其中所述的T細(xì)胞 受體多肽進(jìn)一步包括一種細(xì)月包毒性組合物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的T細(xì)胞受體多肽，其中所述的T細(xì)胞 受體多肽進(jìn)一步包4舌一種細(xì)月包因子。
22. —種組合物，包括大量權(quán)利要求8所述的可溶性單鏈I類(lèi) HLA限制性T細(xì)胞受體多肽，其中所述的多肽是固定于一種 固體支持物之上的，其中所述的大量的T細(xì)胞受體多肽中的 每一種都結(jié)合了不同的病毒表位。
23. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的T細(xì)胞受體多肽 包括一種oc鏈序列以及一種(3鏈序列，所述的oc鏈序列以及 (3鏈序列均具有至少8個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
24. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的oc鏈序列以及P 鏈序列均具有8至20個(gè)殘基的長(zhǎng)度。
25. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的多肽包括一種如 表l中所示的a《連序列以及l(fā)3鏈序列對(duì)。
26. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的多肽包括一種來(lái) 自于表1中所列出的cc鏈序列。
27. 才艮據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的多肽包4舌一種來(lái) 自于表1中所列出的P鏈序列。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的核酸包括一種來(lái) 自于表2中所列出的a鏈編碼序列。
29. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的核酸包括一種來(lái) 自于表2中所列出的(3鏈編碼序列。
30. —種診斷病毒感染的方法，包括使一種分離的病毒特異性可 溶性T細(xì)胞受體構(gòu)建體與來(lái)自于受試宿主的體液或者組織樣 本發(fā)生4妄觸，以及4全測(cè)結(jié)合的T細(xì)月包受體構(gòu)建物，其中所述 的結(jié)合意p未著病毒感染。
31. —種抑制病毒感染的方法，包括:纟合宿主施用一種分離的單鏈 可溶性病毒特異性T細(xì)胞受體，所述受體包4舌一種細(xì)"包毒性 試劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的受體與HIV或者 HCV表位發(fā)生了特異性的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于診斷病毒感染的組合物以及方法，以及抑制這類(lèi)感染的方法。上述方法是以對(duì)來(lái)自于細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆的T細(xì)胞受體基因序列的識(shí)別為基礎(chǔ)的，其中所述的T細(xì)胞受體基因序列對(duì)HIV-I或者HCV具有特異性。已經(jīng)識(shí)別并且構(gòu)建成與I類(lèi)HLA限制的HIV病原體以及HCV病原體相結(jié)合的可溶性T細(xì)胞受體組合物。
文檔編號(hào)C07K4/00GK101490078SQ200780016349
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者B·D·沃克, G·勞爾, M·利施特費(fèi)爾德, M·阿特費(fèi)爾德, X·G·于 申請(qǐng)人:通用醫(yī)院有限公司