Kif5b基因和ret基因的融合基因、以及以該融合基因為目標(biāo)的判斷癌癥治療有效性的方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于，提供一種在癌癥中鑒定能夠成為預(yù)測藥劑的治療有效性的指標(biāo)的基因、以該基因為目標(biāo)預(yù)測藥劑的治療有效性的新型的方法，并進行了肺腺癌的全轉(zhuǎn)錄組測序。其結(jié)果，鑒定了KIF5B基因和RET基因的框內(nèi)融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。另外，該KIF5B-RET基因融合在日本人肺腺癌的6/319（2%）、美國人肺腺癌的1/80（1%）中被檢測出。而且發(fā)現(xiàn)，該7例均不顯示EGFR、KRAS、ALK癌基因這樣的公知的活化突變，因此，判明該基因融合為癌化中的責(zé)任突變（驅(qū)動突變）。該基因融合被認為是導(dǎo)致RET酪氨酸激酶蛋白的穩(wěn)定活化的因素，因此，對于檢測出該基因融合的患者，以RET酪氨酸激酶抑制劑進行的治療是有效的。
【專利說明】KIF5B基因和RET基因的融合基因、以及以該融合基因為目標(biāo)的判斷癌癥治療有效性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及KIF5B基因和RET基因的融合基因。還涉及一種以該融合基因為目標(biāo)的判斷利用RET蛋白酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的方法。而且，本發(fā)明涉及一種利用有該有效性的判斷的癌癥的治療方法。另外，本發(fā)明還涉及用于這些方法的分子。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥為日本占死因第一位的疾病，一直謀求其治療方法的改善。特別是肺癌，不僅在日本，在世界上也是癌癥死亡的首要因素，一年間引起100萬人以上的死亡。肺癌大致分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，而且，非小細胞肺癌分為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LADC)、肺鱗狀上皮癌、大細胞癌3種。而且，其中肺腺癌占非小細胞肺癌的約50%，其頻率正在上升(非專利文獻I)。
[0003]關(guān)于肺腺癌，已知相當(dāng)一部分是因癌基因活化而產(chǎn)生的。而且也得知，在癌基因的活化中，EGFR基因(10~40%)或KRAS基因(10~20%)的體細胞突變、ALK基因和EML4(echinoderm microtubule-associated protein_like4)基因的融合、或 ALK 基因和 KIF5B基因的融合等(5%)相互排斥地產(chǎn)生(非專利文獻2~6)。
[0004]在包含肺腺癌的人癌癥中，鑒定參與產(chǎn)生癌癥的突變基因(突變蛋白質(zhì))或融合基因(融合蛋白質(zhì))等癌基因大大有助于以這些基因為目標(biāo)的新型癌癥治療方法或癌癥檢查方法的開發(fā)，因此強烈期望。
[0005]特別是在晚期肺癌中，利用藥劑的治療成為主體，但每個病例對藥劑的反應(yīng)性大大不同，所以，正在謀求預(yù)測`哪種藥劑具有治療效果的方法。因此，如上述那樣一直在進行突變基因或融合基因這樣的能夠成為其預(yù)測指標(biāo)的分子的鑒定，例如已知以EGFR或ALK蛋白為目標(biāo)的酪氨酸激酶抑制劑對具有EGFR突變或ALK融合的肺腺癌的治療特別有效。而且，存在于4~5%的肺癌中的ALK酪氨酸激酶基因的融合的檢測方法作為ALK蛋白質(zhì)的酪氨酸激酶抑制劑的適應(yīng)例的選出方法被開發(fā)，并進行了臨床試驗。
[0006]但是，包含肺癌在內(nèi)的癌癥中的融合基因等的闡明還不充分，目前的現(xiàn)狀為，期望對能夠成為預(yù)測利用藥劑的治療有效性的指標(biāo)的突變基因或融合基因進行鑒定。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0008]非專利文獻
[0009]非專利文獻I:Herbst, R.S.等、The New England journal of medicine、2008年、359 卷、1367 ~1380 頁
[0010]非專利文獻2:Paez，J.G.等、Science、2004 年、304 卷、1497 ~1500 頁
[0011]非專利文獻3:Takeuchi，K.等、Clin Cancer Res、2009 年、15 卷、3143 ~3149 頁
[0012]非專利文獻4:Soda, Μ.等、Nature,2007 年、448 卷、561 ~566 頁
[0013]非專利文獻5:Janku, F.等、Nat Rev Clin 0ncol、2010 年、7 卷、401 ~414 頁
[0014]非專利文獻6:Lovly, C.M.等、Nat Rev Clin Oncol,2011 年、8 卷、68 ~70 頁
【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明要解決的課題
[0016]本發(fā)明就是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)具有的課題而完成的發(fā)明，其目的在于，鑒定在肺癌等中能夠成為預(yù)測利用藥劑的治療有效性的指標(biāo)的基因。還提供一種以該基因為目標(biāo)預(yù)測利用藥劑的治療有效性的新型的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種基于以該基因為目標(biāo)的利用藥劑的治療有效性的預(yù)測而治療肺癌等的方法。而且，本發(fā)明的目的在于提供一種在這些方法中用于該基因的檢測的分子。
[0017]用于解決課題的方法
[0018]本發(fā)明的發(fā)明人等為了達到上述目的而進行了反復(fù)深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過30例肺腺癌的全轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了驅(qū)動蛋白家族成員5B (KIF5B)基因和RET受體型酪氨酸激酶癌基因(RET基因)的框內(nèi)(In-flame)融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。該融合基因是由第10染色體pll、qll區(qū)域間的倒位而產(chǎn)生的。該KIF5B-RET基因融合在日本人肺腺癌的6/319 (2%)中被檢測出，但檢測出該基因融合的6例均不顯示EGFR突變、KRAS突變、ALK融合這樣的公知的癌基因活化突變。而且，該融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在來自美國人的肺腺癌中也存在(1/80 (1%))。由這些事實得知，該基因融合在廣泛的人種中為癌化中的責(zé)任突變(驅(qū)動突變)。 [0019]該基因融合認為是導(dǎo)致RET酪氨酸激酶的穩(wěn)定活化的因素，產(chǎn)生這種活化的患者認為是RET酪氨酸激酶抑制劑在治療中顯示有效性的。因此，本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，可以在肺癌等中以該基因融合為目標(biāo)預(yù)測利用藥劑的治療有效性，而且，如果對在該預(yù)測中被判斷為利用藥劑的治療有效的患者投與該藥劑，則可以有效地進行治療，從而完成了本發(fā)明。
[0020]因此，本發(fā)明涉及一種KIF5B和RET的融合多肽、以該多肽的存在為指標(biāo)的判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的方法、利用有該有效性判斷的癌癥的治療方法、以及用于這些方法的分子，更詳細而言，提供以下的發(fā)明。
[0021](I)一種多肽，其為KIF5B蛋白的N末端部分與RET蛋白的C末端部分融合而成的多肽。
[0022](2)—種多核苷酸，其編碼(I)所述的多肽。
[0023](3) 一種判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的方法，其包括檢測從患者分離的試樣中的(2)所述的多核苷酸存在或不存在的工序，如果檢測出上述多核苷酸存在，則判斷為上述患者利用上述RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高。
[0024](4)一種藥劑，用于通過(3)所述的方法判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性，其含有具有至少15個堿基的鏈長的下述(a)~(C)所記載的任一種多核苷酸、或下述(d)所記載的抗體，
[0025]Ca)作為選自與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸雜交的探針和與編碼RET蛋白的多核苷酸雜交的探針中的至少一種探針的多核苷酸，
[0026](b)作為與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸和編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點雜交的探針的多核苷酸，
[0027](c)作為以插入編碼KIF5B蛋白的多核苷酸與編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點的方式設(shè)計的一對引物的多核苷酸，[0028](d)與KIF5B蛋白和RET蛋白融合而成的多肽結(jié)合的抗體。
[0029](5)—種癌癥的治療方法，其包括將上述RET酪氨酸激酶抑制劑對通過(3)所述的方法判斷為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高的患者進行給藥的工序。
[0030](6)—種以RET酪氨酸激酶抑制劑作為有效成分的癌癥治療劑，其是對通過(3)所述的方法判斷為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高的患者進行給藥的治療劑。
[0031]發(fā)明的效果
[0032]根據(jù)本發(fā)明，可以預(yù)測對癌癥治療的有效性，特別是預(yù)測利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性。由此，可以避免對認為投藥無效的癌癥患者投與藥劑，因此可以實現(xiàn)有效的癌癥治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033][圖1]是表示野生型KIF5B和RET蛋白的結(jié)構(gòu)(圖1上部的“KIF5B”和“RET”)、在肺腺癌患者中鑒定的4個KIF5B-RET融合突變體(圖1下部的“I~4”)及各自的突變體中的切斷點(圖1上部的“KIF5B”和“RET”所添加的線(1、2、3、4、1-3))的概略圖。需要說明的是，圖1中，“TM”表示跨膜結(jié)構(gòu)域。
[0034][圖2]是表示肺腺癌患者(病例:BR0020)中的KIF5B-RET融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的概略圖。需要說明的是，圖 2的上部表示雙末端讀段分析的結(jié)果，下部表示接合區(qū)讀段(junction read)分析的結(jié)果。另外,各核酸(A、T、G、C)用各自圖中所示的對應(yīng)的顏色進行識別。
[0035][圖3]是表示利用RT-PCR檢測各肺腺癌患者中的KIF5B-RET融合(圖3的上部)、RET激酶結(jié)構(gòu)域(外顯子12-13，圖3的中部)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，內(nèi)部標(biāo)準，圖3的下部)的結(jié)果的電泳照片。需要說明的是，圖3中，“T”表示各肺腺癌患者的肺腺癌組織的結(jié)果，“N”表示各肺腺癌患者的非癌肺組織的結(jié)果(在圖5中也同樣)。另外，BR0019為KIF5B-RET 融合陰性肺腺癌的病例，BR0020、BR1001、BR1002、BR0030、BR1003 和 BR1004 為KIF5B-RET融合陽性肺腺癌的病例(在圖5中也同樣)。而且，“NTC”表示沒有模板DNA的陰性對照的結(jié)果。
[0036][圖4]是表示利用桑格測序分析KIF5B-RET融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA的結(jié)果的電泳圖。需要說明的是，將使用KIF5B-RET-F1弓丨物和KIF5B-RET-R1弓丨物進行擴增得到的RT-PCR產(chǎn)物使用 KIF5B-RET-F1 (BR0020、BR1001、BR1002 和 BR0030)引物以及 KIF5B-F_orf2438(BR1003和BR1004)引物直接測序。
[0037][圖5]是表示利用基因組PCR檢測各肺腺癌患者中的KIF5B-RET融合的結(jié)果的電泳照片。圖5中，照片的下方表示含有KIF5B基因和RET基因的融合點(切斷點結(jié)合部)的DNA片段的擴增所的引物的位置。另外，“int”表示內(nèi)含子，“ex”表示外顯子。而且，用星號表示BR0030和BR1004的非癌肺組織中所看到的非特異條帶。
[0038][圖6]是表示利用桑格測序分析了含有KIF5B基因和RET基因的融合點的基因組片段的結(jié)果的電泳圖。需要說明的是，PCR產(chǎn)物利用直接測序進行分析，在各自的樣品的擴增及測序中使用下述引物。BR0020:KIF5B-1ntl5-Fl/KIF5B-RET-Rl 和 RET-1ntll-R0.5、BR1001:KIF5B-1ntl5-Fl/KIF5B-RET-Rl 和 RET-1ntll-Rl、BR1002:KIF5B-1ntl5-F2/RET-1ntll-R3 和 KIF5B-1ntl5_F3.5、 BR0030:KIF5B-exl6_Fl/KIF5B-RET-Rl 和KIF5B-exl6-Fl、BR1003:KIF5B-ex23-Fl/KIF5B-RET-Rl 和 KIF5B_ex23_Fl，另外，融合點中的重復(fù)核苷酸用BR1002和BR0030所附的方框表示，KIF5B基因和RET基因的融合點中的插入(insertion)核苷酸用BRlOOl和BR1003所附的方框表示。
[0039][圖7]是表示利用桑格測序分析含有KIF5B-RET融合點的基因組片段的結(jié)果(特別是含有RET外顯子7-RET內(nèi)含子7的349bp的基因組片段插入于切斷點結(jié)合部)的電泳圖。需要說明的是，將使用KIF5B-ex24-Fl引物和RET_int7_Rl引物擴增得到的PCR產(chǎn)物使用RET-1nt7-R2引物直接測序。
[0040][圖8]是表示研究了KIF5B基因和RET基因融合的6個病例中的2個病例(BR0020和BR1001)中10號染色體的基因組拷貝數(shù)的結(jié)果的概略圖。需要說明的是，拷貝數(shù)利用CNAG程序分析進行推定(在圖9中也同樣)。另外，圖中，參考基因組上的KIF5B基因和RET基因的位置及方向利用箭頭表示(在圖9中也同樣)。
[0041][圖9]是表示研究KIF5B基因和RET基因融合的6個病例中的2個病例(BR0012和BR0005)中10號染色體的基因組拷貝數(shù)的結(jié)果的概略圖。
[0042][圖10]是表示參與KIF5B-RET融合的推定染色體重構(gòu)(突變體I)的概略圖。
[0043][圖11]是表示利用使用熒光標(biāo)記的DNA探針而施行的原位雜交檢測出的BR0020病例中產(chǎn)生KIF5B-RET融合的染色體倒位的顯微鏡照片(觀察倍數(shù):400倍)。在該病例中，檢測出在比RET基因的激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域雜交的探針(5’ RET,圖中紅色的熒光點)、和在RET基因的激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域雜交的探針(3’RET，圖中綠色的熒光點)的信號的分離(split，用圖中箭頭指示的地方)。另外，在圖11的下`部表示各探針組基因組上雜交的位置。
[0044][圖12]是表示進行了蘇木精-伊紅染色的KIF5B-RET融合陽性肺腺癌(BR1004)中的代表的組織結(jié)構(gòu)的顯微鏡照片(觀察倍數(shù):50倍)。需要說明的是，在該肺腺癌細胞中，看到克拉拉(Clara)細胞或II型肺上皮細胞分化。另外,這些腫瘤細胞沿肥厚的肺胞壁伸長至腫瘤邊緣部(左側(cè)的載玻片)。而且，在其中央部也看到乳頭狀的增殖(右側(cè)的載玻片)。
[0045][圖13]是表示對甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)進行了免疫染色的KIF5B-RET融合陽性肺腺癌(BR1004)中的代表性組織結(jié)構(gòu)的顯微鏡照片(觀察倍數(shù):50倍)。需要說明的是，在該肺腺癌細胞中，觀察到TTF-1在核中彌漫性很強的表達。
[0046][圖14]是表示利用U133APlus2.0微陣列分析評價了肺腺癌(ADC)及非癌肺組織(N)中的RET表達水平的結(jié)果的標(biāo)繪圖。需要說明的是，RET的表達水平使用211421sat 探針(ret proto-oncogene (multiple endocrine neoplasia and medullary thyroidcarcinomal, Hirschsprung disease))進行評價。另外，圖 14 中，“ +，，表不 KIF5B-RET 融合陽性肺腺癌的評價結(jié)果，“一”表示KIF5B-RET融合陰性肺腺癌的評價結(jié)果。而且，圖14中的P值是利用U檢驗評價表達水平之差而得到的值。
[0047][圖15]是表示KIF5B-RET融合陽性肺腺癌腫瘤樣品(BR1004)中的RET蛋白的免疫組織學(xué)染色結(jié)果的顯微鏡照片(觀察倍數(shù):50倍)。需要說明的是，在該肺腺癌腫瘤樣品中，看到RET蛋白在腺癌細胞的細胞質(zhì)中以顆粒狀表達。
[0048][圖16]是表示研究沒有看到RET融合、但RET基因的表達水平高的2個病例中10號染色體的基因組拷貝數(shù)的結(jié)果的概略圖。需要說明的是，拷貝數(shù)利用CNAG程序分析進行推定。另外，圖中，KIF5B基因及RET基因的位置及方向利用箭頭表示。
[0049][圖17]是表示沿RET子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(NM_020975.4)顯示來自肺腺癌及非癌肺組織的序列讀段分布的結(jié)果的圖。需要說明的是，來自KIF5B-RET融合陽性樣品BR0020的序列讀段大致位于融合點的下游。另一方面，在沒有確認融合、但看到RET基因表達的6個樣品(圖17中，利用星號標(biāo)記的樣品)中，序列讀段遍及RET轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物整體分布，另外，沒有檢測出突變。需要說明的是，圖17中，“RET表達”表示利用寡聚核苷酸微陣列評價的RET表達水平。
[0050][圖18]是表示在來自USA群體的肺腺癌病例中，利用RT-PCR檢測KIF5B-RET融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(突變體1，圖18的上部)及GAPDH (內(nèi)部標(biāo)準，圖18的下部)的結(jié)果的電泳照片。需要說明的是，圖18中，“T”表示上述群體的肺腺癌組織的結(jié)果，“N”表示上述群體的非癌肺組織的結(jié)果?！癠SA1580”表示來自USA群體的肺腺癌病例。
[0051][圖19]是表示利用桑格測序分析了來自USA群體的肺腺癌病例中的KIF5B-RET融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(突變體I)的cDNA的結(jié)果的電泳圖。
【具體實施方式】
[0052]< KIF5B-RET融合多肽及編碼該多肽的多核苷酸>
[0053]如后述的實施例中所示，KIF5B蛋白和RET蛋白的融合例最初在肺腺癌中得知。因此，本發(fā)明提供一種KIF5B蛋白的N末端部分和RET蛋白的C末端部分融合的多肽(以下也稱為“KIF5B-RE T融合多肽”)。本發(fā)明還提供一種編碼該多肽的多核苷酸(以下也稱為“KIF5B-RET融合多核苷酸”)。
[0054]本發(fā)明中上述的“KIF5B (驅(qū)動蛋白家族成員5B，KINESIN FAMILY MEMBER5B)蛋白”也稱為KNSl (驅(qū)動蛋白1，KINESIN1)蛋白、UKHC (驅(qū)動蛋白，重鏈，普遍存在的、KINESINHEAVY CHAIN,UBIQUITOUS)蛋白或KINH蛋白，是在人體中以定位于IOpll.2的基因所編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，“KIF5B蛋白”只要是來自人的蛋白質(zhì)即可，典型而言，是由序列號2所記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。而且，在本發(fā)明中，“KIF5B蛋白的N末端部分”典型而言為包含位于上述KIF5B蛋白的N末端側(cè)的馬達區(qū)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的一部分或全部的部分(參照圖1)。
[0055]本發(fā)明中上述的“RET (轉(zhuǎn)染重排，REARRANGED DURING TRANSFECTION)蛋白”也稱為RET酪氨酸激酶蛋白或RET受體型酪氨酸激酶蛋白，是在人體中以定位于IOqll.2的基因所編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，“RET蛋白”只要是來自人的蛋白質(zhì)即可，典型而言，是由序列號為4記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。而且，在本發(fā)明中，“RET蛋白的C末端部分”典型而言包含位于上述RET蛋白的C末端側(cè)的激酶結(jié)構(gòu)域(參照圖1)。
[0056]另外，作為本發(fā)明的“KIF5B蛋白的N末端部分和RET蛋白的C末端部分融合而成的多肽”，如后述的實施例中所示，是由IOpll.2和IOqll.2的區(qū)域間的倒位產(chǎn)生的融合基因所編碼的多肽即可，典型而言，是包含位于上述KIF5B蛋白的N末端側(cè)的馬達區(qū)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的一部分或全部的多肽以及包含位于上述RET蛋白的C末端側(cè)的激酶結(jié)構(gòu)域的多肽融合而成的多肽，例如是由序列號6、8、10或12中記載的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0057]本發(fā)明中上述的“KIF5B蛋白”、“RET蛋白”及“KIF5B-RET融合多肽”的氨基酸序列可以在自然界中(即非人工性地)發(fā)生突變。另外，也可以人為地向氨基酸導(dǎo)入突變。因此，這種突變體也包含在本發(fā)明中。
[0058]作為KIF5B-RET融合多肽的突變體，可列舉由序列號6、8、10或12中記載的氨基酸序列中將I個或多個氨基酸進行了取代、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。在此，“多個”通常為50個氨基酸以內(nèi)，優(yōu)選30個氨基酸以內(nèi)，更優(yōu)選10個氨基酸以內(nèi)，特別優(yōu)選數(shù)個的氨基酸以內(nèi)(例如5個氨基酸以內(nèi)、3個氨基酸以內(nèi)、2個氨基酸以內(nèi)、I個氨基酸)。
[0059]另外，作為KIF5B-RET融合多肽的突變體，可列舉與由序列號5、7、9或11中記載的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴格條件下雜交的DNA所編碼的多肽。作為高嚴格度的雜交條件，可列舉例如0.2XSSC、65°C的條件，作為低嚴格度的雜交條件，可列舉例如2.0XSSC、50°C的條件。
[0060]而且，作為KIF5B-RET融合多肽的突變體，可列舉與由序列號6、8、10或12中記載的氨基酸序列具有80%以上(例如85%、90%、95%、97%、99%以上)的相同性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。序列的相同性可以利用BLASTX或BLASTP (氨基酸水平)的程序(Altschulet al.J.Mol.Biol., 215:403-410,1990)而確定。該程序以利用 Karlin 及 Altschul 的算法 BLAST (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,87:2264-2268,1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,90:5873-5877，1993)為基礎(chǔ)。在利用BLASTX等分析氨基酸序列的情況下，參數(shù)設(shè)定為例如score = 50、wordlength = 3。另外,使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情況下,可以以 Altschul 等(Nucleic Acids Res.25:3389_3402，1997)中記載的方式進行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情況下，使用各程序的默認參數(shù)。這些分析方法的具體方法為公知的。
[0061]在本發(fā)明的“編碼KIF5B-RET融合多肽的多核苷酸”中，包括編碼該多肽的mRNA、編碼該多肽的cDNA、編碼該多肽的基因組DNA等。本發(fā)明的編碼KIF5B-RET多肽的cDNA的典型例為由序列號5、7、9或11中記載的DNA序列構(gòu)成的多核苷酸。
[0062]需要說明的是，就本發(fā)明的多核苷酸而言，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以從由保持KIF5B基因和RET基因的融合基因的肺腺癌等制備的cDNA文庫或基因組DNA文庫中利用公知的雜交技術(shù)而提取。另外，也可以通過以上述由肺腺癌等制備的mRNA、cDNA或基因組DNA為模板利用公知的基因擴增技術(shù)(PCR)來擴增、制備。而且，也可以以天然型KIF5B基因和天然型RET基因的cDNA為材料，利用PCR、限制性內(nèi)切酶處理、定位誘變(site-directedmutagenesis)法(Kramer, ff.& Fritz, HJ.，Methods Enzymol, 1987,154,350.)等公知的基因擴增技術(shù)或重組技術(shù)而制備。
[0063]進而，通過將這樣制備的多核苷酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中并將該載體導(dǎo)入無細胞蛋白質(zhì)合成體系(例如網(wǎng)織紅細胞提取液、小麥胚芽提取液)而進行培育，另外通過將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募毎?例如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞)中，將得到的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，由此可以制備本發(fā)明的多肽。
[0064]<判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的方法>
[0065]如后述的實施例中所示，得知:KIF5B基因和RET基因的融合為癌癥中的責(zé)任突變，通過該融合而產(chǎn)生RET酪氨酸激酶蛋白的表達亢進，進而產(chǎn)生RET酪氨酸激酶蛋白的穩(wěn)定活化，有助于癌的惡性化等。因此，在檢測出這種融合的癌癥患者中，利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療有效的可能性高。[0066]因此，本發(fā)明提供一種判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的方法，該方法包括檢測從患者分離的試樣中的KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的工序，如果檢測出上述多核苷酸存在，則判斷為上述患者的上述利用上述RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性聞。
[0067]本發(fā)明中，“患者”不僅是患有癌癥的人，也可以為懷疑是患有癌癥的人。作為成為適用本發(fā)明的方法的對象的“癌”，只要是看到KIF5B基因和RET基因的融合基因的表達的癌，就沒有特別限制。優(yōu)選為肺癌，進一步優(yōu)選為非小細胞肺癌，特別優(yōu)選為肺腺癌。
[0068]本發(fā)明中，“試樣”不僅包含生物體試樣(例如細胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、痰、肺胞-支氣管清洗液、尿、便)，也包含由這些生物體試樣得到的核酸提取物(基因組DNA提取物、mRNA提取物、由mRNA提取物制備的cDNA制備物或cRNA制備物等)和蛋白質(zhì)提取物。另外，對上述試樣可以實施福爾馬林固定處理、醇固定處理、冷凍處理或石蠟包埋處理。
[0069]而且，就基因組DNA、mRNA、cDNA或蛋白質(zhì)而言,只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以考慮上述試樣的種類及狀態(tài)等而選擇適合的公知方法來制備。
[0070]在本發(fā)明中，作為成為評價癌癥治療的有效性的對象的“ RET酪氨酸激酶抑制劑”，只要是可以直接或間接性地抑制RET酪氨酸激酶的功能的物質(zhì)，就沒有特別限制。只要可以抑制RET酪氨酸激酶，則也可以為抑制其它酪氨酸激酶的物質(zhì)。作為可以適用于本發(fā)明的公知的RET酪氨酸激酶抑制劑，可列舉例如:4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(通用名:凡德他尼(Vandetanib)；以VEGFR、EGFR及RET為目標(biāo)的化合物)、4-[4-[3-[4_氯-3-(三氟甲基)苯基]酰脲]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(通用名:索拉非尼(Sorafenib )；以BRAF及RET等為目標(biāo)的化合物)、N-[2- (二乙基氨基)乙基]-5-[ (Z) - (5-氟-2-氧代-1，2- 二氫-3H- 口引哚-3-茚)甲基]_2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺單[(2S)-2-羥基琥珀酸酯](通用名:舒尼替尼(Sunitinib)`;以H)GFR、VEGFR、RET等為目標(biāo)的化合物)、N-(3，3-二甲基吲哚啉-6-基)-2-(吡啶-4-基甲基氨基)煙酰胺(通用名:莫特塞尼(Motesanib);以TOGFR、VEGFR、RET等為目標(biāo)的化合物)、XL184/卡博替尼膠囊(XL184/Cabozantinib ；以VEGFR、MET、RET等為目標(biāo)的化合物)。
[0071]本發(fā)明中，“KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的檢測”可以以編碼上述融合多肽的基因組DNA或來自上述基因組DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為對象直接性地進行，也可以以來自上述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯產(chǎn)物(上述融合多肽)為對象間接性地進行。
[0072]另外，上述編碼融合多肽的基因組DNA是由IOpll.2和IOqll.2的區(qū)域間的倒位形成的，因此，在“KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的檢測”中，也可以檢測該倒位的現(xiàn)象。在該倒位的檢測中,可以檢測例如比RET基因的激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域和RET基因的激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域的分離，另外，還可以檢測RET基因的鈣粘素重復(fù)子的編碼區(qū)域及比該區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域和RET基因的跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域的分離，而且，還可以檢測KIF5B基因的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的一部分或全部的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域和比KIF5B基因的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域的分離。[0073]在本發(fā)明中的“KIF5B-RET融合多核苷酸存在或不存在的檢測”中可以使用公知方法。在以“編碼上述編碼融合多肽的基因組DNA”為對象的情況下，可以采用例如使用熒光等的原位雜交(ISH)、基因組PCR法、直接測序、Southern印跡法、基因組微陣列分析。另外，在以“來自上述基因組DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物”為對象的情況下，可以采用例如RT-PCR法、直接測序、Northern印跡法、斑點雜交法、cDNA微陣列分析。
[0074]治療或診斷的過程中得到的生物體試樣(活檢樣品等)大多進行福爾馬林固定，在該情況下，從作為檢測對象的基因組DNA在福爾馬林固定下也穩(wěn)定、檢測靈敏度高的觀點出發(fā)，優(yōu)選使用原位雜交。
[0075]在原位雜交中，通過使具有至少15個堿基的鏈長的下述(a)或(b)中記載的多核苷酸與上述生物體試樣雜交，可以檢測編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA。
[0076](a)作為選自與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸雜交的探針和與編碼RET蛋白的多核苷酸雜交的探針中的至少一種探針的多核苷酸，
[0077](b)作為與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸和編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點雜交的探針的多核苷酸。
[0078]本發(fā)明中的上述編碼KIF5B蛋白的多核苷酸只要是來自人的多核苷酸即可，典型而言，為由Genbank登錄號NT_008705.16確定的基因組序列中的第32237938~32285371的DNA序列構(gòu)成的基因。
[0079]另外，本發(fā)明中的上述編碼RET蛋白的多核苷酸只要是來自人的多核苷酸即可，典型而言，為由Genbank登錄號NT_033985.7確定的基因組序列中的第1217582~1270862的DNA序列構(gòu)成的基因。
[0080]但是，基因的DNA序列通過其突變等可以在自然界中(B卩非人工性地)發(fā)生突變。因此,這種天然的突變體也能夠成為本發(fā)明的對象(以下同樣)。
[0081]本發(fā)明的(a)中記載的多核苷酸只要是通過與作為該多核苷酸的目標(biāo)堿基序列的編碼KIF5B蛋白的多核苷酸或編碼RET蛋白的多核苷酸雜交而可以檢測出上述生物體試樣中的編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA的存在的多核苷酸即可，優(yōu)選為下述(al)~(a4)中記載的多核苷酸。
[0082](al)與KIF5B基因的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的一部分或全部的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域雜交的多核苷酸(以下也稱為“5’ KIF5B探針I(yè)”)和與RET基因的激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域雜交的多核苷酸(以下也稱為“3，RET探針I(yè)”)的組合，
[0083](a2)與比RET基因的激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域雜交的多核苷酸(以下也稱為“5’RET探針I(yè)”)和RET基因的激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域雜交的多核苷酸(3’ RET探針I(yè))的組合，
[0084](a3)與RET基因的鈣粘素重復(fù)子的編碼區(qū)域及比該區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域雜交的多核苷酸(以下也稱為“5’RET探針2”)和與RET基因的跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域雜交的多核苷酸(以下也稱為“3’ RET探針2”)的組合，
[0085](a4)與KIF5B基因的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的一部分或全部的編碼區(qū)域及比該編碼區(qū)域更靠5’側(cè)的上游區(qū)域雜交的多核苷酸(5’ KIF5B探針I(yè))和比KIF5B基因的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域更靠3’側(cè)的下游區(qū)域雜交的多核苷酸(以下也稱為“3’ KIF5B探針I(yè)”)的組合。
[0086]在本發(fā)明中，作為用于原位雜交的上述(al)中記載的多核苷酸所雜交的區(qū)域(目標(biāo)喊基序列)，從對于目標(biāo)喊基序列的特異性及檢測靈敏度的觀點出發(fā)，優(yōu)選為從KIF5B基因和RET基因的融合點1000000個堿基以內(nèi)的區(qū)域，另外，作為用于原位雜交的上述(a2)~(a4)中記載的多核苷酸雜交的區(qū)域，從相同的觀點出發(fā)，優(yōu)選為從KIF5B基因或RET基因中的切斷點1000000個堿基以內(nèi)的區(qū)域。
[0087]另外，在本發(fā)明中，用于原位雜交的上述(b)中記載的多核苷酸只要是通過與作為該多核苷酸的目標(biāo)堿基序列的編碼KIF5B蛋白的多核苷酸和編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點雜交而可以檢測出上述生物體試樣中的編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA的存在的多核苷酸即可，作為典型例，為與編碼由序列號5、7、9或11中記載的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸的基因組DNA雜交的多核苷酸，例如與圖6及7中記載的KIF5B基因和RET基因的融合點雜交的多核苷酸。
[0088]另外，在本發(fā)明中，從對于目標(biāo)堿基序列的特異性及檢測的靈敏度的觀點出發(fā)，用于原位雜交的上述(a)或(b)中記載的多核苷酸優(yōu)選為可以覆蓋上述目標(biāo)堿基序列整體的、由多種多核苷酸構(gòu)成的集團。在上述的情況下，構(gòu)成該集團的多核苷酸的長度至少為15個堿基，優(yōu)選為100~1000個堿基。
[0089]為了檢測，用于原位雜交的上述(a)或(b)中記載的多核苷酸優(yōu)選利用熒光色素等進行標(biāo)記。作為上述的熒光色素，可列舉例如DEAC、FITC、R6G、TexRed, Cy5，但并不限于這些物質(zhì)。另外，除熒光色素之外，還可以利用DAB等色素(chromogen:色原)或基于酶的金屬沉淀而通過銀等標(biāo) 記上述多核苷酸。
[0090]在原位雜交中，在使用5’ KIFlB探針I(yè)和3’ RET探針I(yè)的情況下、使用5’ RET探針I(yè)和3’RET探針I(yè)的情況下、使用5’RET探針2和3’RET探針2的情況下、使用5’KIFlB探針I(yè)和3’KIF1B探針I(yè)的情況下，這些探針優(yōu)選用互不相同的色素進行標(biāo)記。而且，在使用這樣用不同的色素標(biāo)記的探針的組合進行原位雜交的情況下，在觀察到5’ KIFlB探針I(yè)的標(biāo)記發(fā)出的信號(例如熒光)和3’ RET探針I(yè)的標(biāo)記發(fā)出的信號的重疊時，可以判斷為能夠檢測出編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA。另一方面，在觀察到5’ RET探針I(yè)的標(biāo)記發(fā)出的信號和3’ RET探針I(yè)的標(biāo)記發(fā)出的信號的分離、5’ RET探針2的標(biāo)記發(fā)出的信號和3’RET探針2的標(biāo)記發(fā)出的信號的分離或5’KIFlB探針I(yè)的標(biāo)記發(fā)出的信號和3’KIFlB探針I(yè)的標(biāo)記發(fā)出的信號的分離時，可以判斷為能夠檢測出編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA。
[0091]需要說明的是，多核苷酸的標(biāo)記可以利用公知方法進行。例如，可以利用切口平移法或隨機引物法，將利用熒光色素等標(biāo)記的底物堿基引入多核苷酸中，標(biāo)記該多核苷酸。
[0092]在原位雜交中，使上述(a)或(b)中記載的多核苷酸與上述生物體試樣雜交時的條件可以因該多核苷酸的長度等各種因素而變動，作為高嚴格度的雜交的條件，可列舉例如0.2 X SSC、65 V的條件，作為低嚴格度的雜交的條件，可列舉例如2.0 X SSC、50 V的條件。需要說明的是，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，除鹽濃度(SSC的稀釋率等)和溫度之外，可以通過適當(dāng)選擇例如表面活性劑(NP-40等)的濃度、甲酰胺的濃度、pH等各種條件來實現(xiàn)與上述條件同樣的嚴格度的雜交的條件。
[0093]作為使用上述(a)或(b)中記載的多核苷酸檢測編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA的方法,除上述原位雜交之外,可列舉=Southern印跡法、Northern印跡法及斑點雜交法。在這些方法中，通過使上述(a)或(b)中記載的多核苷酸與轉(zhuǎn)印有由上述生物體試樣得到的核酸提取物的膜雜交而檢測上述融合基因。在使用上述(a)的多核苷酸的情況下，與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸和與編碼RET蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸識別為在膜中被展開的相同條帶時，可以判斷為能夠檢測出編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA。
[0094]作為使用上述(b )的多核苷酸檢測編碼KIF5B-RET融合多肽的基因組DNA的方法，還可列舉基因組微陣列分析或DNA微陣列分析。在這些方法中，制作在基板上固定有上述(b)的多核苷酸的陣列，使上述生物體試樣與該陣列上的多核苷酸接觸，由此檢測該基因組DNA。
[0095]在PCR或測序中，為了以由上述生物體試樣制備的DNA (基因組DNA、cDNA)或RNA為模板特異性地擴增KIF5B-RET融合多核苷酸的一部分或全部，可以使用下述(c)的多核苷酸。
[0096](c)作為以插入編碼KIF5B蛋白的多核苷酸和編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點的方式設(shè)計的一對引物的多核苷酸
[0097]“作為一對引物的多核苷酸”為在作為目標(biāo)的上述融合多核苷酸等堿基序列中，一個引物與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸雜交，另一引物與編碼RET蛋白的多核苷酸雜交的引物組。這些多核苷酸的長度通常為15~100個堿基，優(yōu)選為17~30個堿基。
[0098]另外，從 利用PCR法進行檢測的精度或靈敏度的觀點出發(fā)，本發(fā)明的(c )中記載的多核苷酸優(yōu)選為與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸和編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點至5000個堿基內(nèi)的上述融合多核苷酸的堿基序列互補的序列。
[0099]“作為一對引物的多核苷酸”可以基于作為目標(biāo)的KIF5B-RET融合多核苷酸等堿基序列，利用公知方法而適當(dāng)設(shè)計。作為公知方法，可列舉例如利用Primer Express軟件(注冊商標(biāo)，ABI公司制)的方法。
[0100]作為“作為一對引物的多核苷酸”的優(yōu)選的例子，可列舉包含選自KIF5B-RET-F1、KIF5B-1ntl5-Fl、KIF5B_intl5_F2、KIF5B_exl6_Fl、KIF5B_ex23_Fl、KIF5B_ex24_Fl、KIF5B-F-orf2438 及 KIF5B_int 15-F3.5 中的 I 個引物和選自 KIF5B-RET-R1、RET-1nt11-R3、RET-1nt7-Rl、RET-1ntll-R0.5、RET-1ntll-Rl、RET_int7_R2 及 RET-R-orf2364 中的I個引物的引物組，更優(yōu)選列舉KIF5B-RET-F1和KIF5B-RET-R1、KIF5B_intl5_Fl和KIF5B-RET-R1、KIF5B-1ntl5-F2 和 RET-1ntl 1-R3、KIF5B_exl6_Fl 和 KIF5B-RET-R1、KIF5B-ex23-Fl 和 KIF5B-RET-R1、KIF5B_ex24_Fl 引物和 RET_int7_Rl 引物。需要說明的是，關(guān)于這些引物的序列以及雜交的基因的位置，參照后述的表1及序列表。
[0101]在本發(fā)明中，作為檢測KIF5B-RET融合多核苷酸的翻譯產(chǎn)物的方法，可列舉例如:免疫染色法、Western印跡法、ELISA法、流式細胞法、免疫沉降法、抗體陣列分析。在這些方法中，可使用與KIF5B-RET融合多肽結(jié)合的抗體。作為上述抗體，可列舉例如:對含有KIF5B蛋白和RET蛋白的融合點的多肽特異性的抗體(以下也稱為“融合點特異性抗體”)、與RET蛋白的比上述融合點靠近C末端側(cè)的區(qū)域構(gòu)成的多肽結(jié)合的抗體(以下也稱為“RET-C末抗體”)、與KIF5B蛋白的比上述融合點靠近N末端側(cè)的區(qū)域構(gòu)成的多肽結(jié)合的抗體(以下也稱為“KIF5B-N末抗體”)。在此，“融合點特異性抗體”是指:與含有上述融合點的多肽特異性地結(jié)合，但不與野生型(正常型)KIF5B蛋白及野生型(正常型)RET蛋白的任一種結(jié)合的抗體。
[0102]KIF5B-RET融合多肽可以利用上述融合點特異性抗體、另外可以利用上述RET-C末抗體和上述KIF5B-N末抗體的組合來檢測。但是，例如在正常肺細胞中，幾乎檢測不到RET蛋白的表達，因此，在免疫染色法中，即使在單獨使用RET-C末抗體的情況下，也可以檢測出肺腺癌組織中的KIF5B-RET融合多肽的存在。
[0103]只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以選擇適當(dāng)?shù)墓椒ㄖ苽洹芭cKIF5B-RET融合多肽結(jié)合的抗體”。作為上述的公知方法，可列舉:將由上述RET蛋白的C末端部分構(gòu)成的多肽、KIF5B-RET融合多肽、由上述KIF5B蛋白的N末端部分構(gòu)成的多肽等接種于免疫動物，使該動物的免疫系統(tǒng)活化，然后回收該動物的血清(多克隆抗體)的方法；雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法等單克隆抗體的制作方法。只要采用結(jié)合了標(biāo)記物質(zhì)的抗體，就可以通過檢測該標(biāo)記而直接檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)。作為標(biāo)記物質(zhì)，只要是可以與抗體結(jié)合且能夠檢測的物質(zhì)，就沒有特別限制，可列舉例如:過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微過氧化物酶、辣根過氧化物酶(HRP)、異硫氰酸熒光素(FITC)、異硫氰酸羅丹明(RITC)、堿性磷酸酶、生物素及放射性物質(zhì)等。而且，除采用結(jié)合了標(biāo)記物質(zhì)的抗體直接檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法之外，也可以利用采用結(jié)合了標(biāo)記物質(zhì)的二次抗體、蛋白G或蛋白A等間接性地檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。
[0104]利用上述方法，在從患者中分離的試樣中檢測出KIF5B-RET融合多核苷酸的存在的情況下，該患者被判斷為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高，另一方面，在沒有檢測出KIF5B-RET融合多核苷酸的存在的情況下，該患者被判斷為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性低。
[0105]<用于判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的藥劑>
[0106]如上所述，作為具有至少15個堿基的鏈長的下述(a)~(C)中記載的任一種多核苷酸可以適用于檢測KIF5B-RET融合多核苷酸的存在或不存在。
[0107](a)作為選自與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸雜交的探針和與編碼RET蛋白的多核苷酸雜交的探針中的至少一種探針的多核苷酸，
[0108](b)作為與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸和編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點雜交的探針的多核苷酸，
[0109](c)作為以插入編碼KIF5B蛋白的多核苷酸與編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點的方式設(shè)計的一對引物的多核苷酸。
[0110]因此，本發(fā)明還提供一種含有這些多核苷酸的、用于判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的藥劑。
[0111]這些多核苷酸具有與目標(biāo)基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。在此，就“互補的”而言，只要可以進行雜交，則也可以不是完全互補的。這些多核苷酸相對于該特定的堿基序列通常具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選100%的相同性。
[0112]需要說明的是，(a)~(C)的多核苷酸可以為DNA，也可以為RNA，另外，可以為在其一部分或全部被 PNA (polyamide nucleic acid,妝核酸)、LNA (注冊商標(biāo)，locked nucleicacid、Bridged Nucleic Acid,交聯(lián)核酸)、ENA (注冊商標(biāo)，2’ -O, 4，-C-EthyIene-bridgednucleic acids)、GNA (Glycerol nucleic acid,甘油核酸)、TNA (Threose nucleic acid,蘇糖核酸)等人工核酸取代了核苷酸的多核苷酸。
[0113]另外，如上所述，與KIF5B-RET融合多肽結(jié)合的抗體可以適用于KIF5B-RET融合多核苷酸的翻譯產(chǎn)物的檢測。因此，本發(fā)明還提供一種含有該抗體的、用于判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的藥劑。
[0114]在本發(fā)明的藥劑中，除作為有效成分的上述物質(zhì)(多核苷酸、抗體)之外，可以含有藥理學(xué)上可接受的其它成分。作為這種其它成分，可列舉例如:緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為乳化劑，可以使用阿拉伯膠、藻酸鈉、黃蓍膠等。作為懸浮劑，可以使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二烷基硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、二乙氨基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。作為防腐劑，可以使用疊氮鈉、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。
[0115]另外，除含有多核苷酸和抗體的標(biāo)準品之外，也可以將檢測多核苷酸或抗體所附加的標(biāo)記所需要的底物、陽性對照(例如KIF5B-RET融合多核苷酸、KIF5B-RET融合多肽、或保持它們的細胞等)或陰性對照、在原位雜交等中使用的對比染色用試劑(DAPI等)、抗體的檢測中需要的分子(例如二次抗體、蛋白G、蛋白A)、用于試樣的稀釋或清洗的緩沖液等標(biāo)準品組合，做成用于使用本發(fā)明的方法的試劑盒。在該試劑盒中可以包含該試劑盒的使用說明書。本發(fā)明還提供一種用于使用上述本發(fā)明的方法的試劑盒。
[0116]<治療癌癥的方法、癌癥治療劑>
[0117]如上所述，利用本發(fā)明的方法檢測出KIF5B-RET融合多核苷酸的存在的患者認為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高。因此，通過對癌癥患者中的保持KIF5B基因和RET基因的融合基因的患者選擇性地投與RET酪氨酸激酶抑制劑，可以有效地進行癌癥的治療。因此，本發(fā)明提供一種治療癌癥的方法，其包括將上述RET酪氨酸激酶抑制劑對通過本發(fā)明的方法判斷為`利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高的患者進行給藥的工序。
[0118]另外，本發(fā)明提供一種癌癥治療劑，其以RET酪氨酸激酶抑制劑作為有效成分，其是對通過上述本發(fā)明的方法判斷為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高的患者進行給藥的治療劑。
[0119]作為“RET酪氨酸激酶抑制劑”，如上所述，只要是可以直接或間接性地抑制RET酪氨酸激酶的功能的物質(zhì)，就沒有特別限制。只要可以抑制RET酪氨酸激酶，則也可以為抑制其它酪氨酸激酶的物質(zhì)。作為可以適用于本發(fā)明的公知的RET酪氨酸激酶抑制劑，可列舉例如:4_ (4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(通用名:凡德他尼(Vandetanib);以VEGFR、EGFR及RET為目標(biāo)的化合物)、4-[4-[3-[4_氯_3_(三氟甲基)苯基]酰脲]苯氧基]-N-甲基吡啶-2-羧酰胺(通用名:索拉非尼(Sorafenib)；以BRAF及RET等為目標(biāo)的化合物)、N-[2-( 二乙基氨基)乙基]_5_[ (Z) -(5-氟-2-氧代-1，2- 二氫-3H-吲哚-3-茚)甲基]-2，4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺單[(2S)_2_羥基琥珀酸酯](通用名:舒尼替尼(Sunitinib)；以TOGFR、VEGFR、RET等為目標(biāo)的化合物)、N-(3，3-二甲基吲哚啉-6-基)-2-(吡啶-4-基甲基氨基)煙酰胺(通用名:莫特塞尼(Motesanib);以TOGFR、VEGFR、RET等為目標(biāo)的化合物)、XL184/卡博替尼膠囊(XL184/Cabozantinib ;以 VEGFR、MET、RET 等為目標(biāo)的化合物)。[0120]對患者投與RET酪氨酸激酶抑制劑的方法根據(jù)該抑制劑的種類或癌癥的種類等而適當(dāng)選擇，可以采用例如口服、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)(氣霧劑)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)等給藥方式。
[0121]實施例
[0122]以下，基于實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于以下的實施例。
[0123]<樣品 >
[0124]日本人群體包含在1997年至2008年在國立癌研究中心中央醫(yī)院接受了外科的切除的319例的肺腺癌患者。USA (UMD)群體在1987年至2009年在巴爾的摩大都市圈(Metropolitan Baltimore)地區(qū)的醫(yī)院被招募。另外，全部的腫瘤按照惡性腫瘤的TNM分類進行了病理診斷。
[0125]總RNA從粗略切分并凍結(jié)的組織樣品中按照制造者的指導(dǎo)使用三唑試劑提取，使用型號2100生物分析儀(model2100bioanalyzer,安捷倫科技社制)進行品質(zhì)檢定。結(jié)果，顯示全部的樣品超過6的RIN (RNA integrity number)值。另外,使用QIAamp DNA小量提取試劑盒(注冊商標(biāo)，Qiagen公司制)從組織樣品中也提取了基因組DNA。需要說明的是，該研究是得到本研究相關(guān)組織的倫理審查員會的承認而進行的。
[0126]<RNA 測序>
[0127]用于RNA測序的cDNA文庫按照制造者的標(biāo)準操作方法使用mRNA_Seq樣品制備試劑盒(Illumina公司制)而制備。簡潔地進行說明的話，從2 μ g的總RNA精制poly_A ( +)RNA，用片段化緩沖液在94°C下加熱5分鐘而進行片段化之后，用于雙鏈cDNA合成。將得到的雙鏈cDNA與PE接頭DNA連接之后，將250~300bp (插入DNA大小:150~200bp)的部分進行凝膠精制，用15個循環(huán)的PCR進行擴增。接著，將這樣形成的文庫提供給使用基因組分析儀IIx測序儀(GAIIx, Illumina公司制)的50_bp雙末端測序。
[0128]<融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測>
[0129]融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測是改變Totoki Y等、Nat Genet.、2011年5月、43卷、5號、464~469頁中記載的方法而進行的。簡潔地進行說明的話，首先，將相同堿基序列的雙末端讀序(paired-end read)認為是在PCR擴增過程中生成的而將它們除去。接著,使用BOWTIE 程序(版本 0.12.5),相對于 RefSeq 數(shù)據(jù)庫(File:human.rna.fna from ftp: //ftp.ncb1.nih.gov/refseq, Date: Sep20, 2010)中注冊的人RNA序列以允許2個堿基以下的錯配的條件下繪制雙末端讀段(paired-end read)。而且,除去以適當(dāng)?shù)拈g隔和方向而繪制的同一 RNA序列的“適當(dāng)?shù)摹弊x段對(read pair)。接著，除去符合多個基因組座位的讀段之后，構(gòu)建讀段的“簇(cluster)”。
[0130]接著，利用以下的分析條件選出暗示融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的“對簇”。
[0131](I)由正向、反向分別的比對構(gòu)建由在相當(dāng)于最大的插入序列長的距離內(nèi)排列的讀段構(gòu)成的“簇”(兩個讀段只要其終點不超出相當(dāng)于最大插入序列長的距離，則使其位于相同的簇)。
[0132](II)位于最左或最右的讀段間的距離如果大于插入序列長，則舍去。
[0133](III)如果一個序列位于“正向簇”，另一個序列位于“反向簇”，則選出其雙末端讀段(將該“正向簇” 和“反向簇”合稱為“對簇”)。
[0134](IV)選出至少一個雙末端讀段與基準人RNA序列完全一致的對簇。[0135](V)除去因堿基的多樣性而誤選的基因?qū)Α３鲇谠撃康?，使用BLASTN程序，將對簇中所含的雙末端讀段相對人基準RNA序列排列。接著，在一端的序列排列為對簇、另一端以適當(dāng)?shù)木嚯x和方向排列為相同的RNA序列的情況下，將該基因?qū)ε懦谕?。作為截止值，使用預(yù)測值1000。 [0136]而且，在一個肺腺癌樣品中可得到超過20的雙末端讀段，獲得在3例非癌肺組織的任一個中均不表現(xiàn)的基因?qū)?。在一個基因區(qū)域內(nèi)或鄰接的基因區(qū)域中繪制的對簇，它們具有在RefSeq數(shù)據(jù)庫中未注冊的選擇性剪接、通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的可能性，因此，進一步從分析中除去。使用MapSpl ice(文本1.14.1)軟件探索跨越融合邊界點的接合區(qū)讀段(junctionread)。此時，相互接合兩個由與相對于每個基因的讀段簇區(qū)域與鄰接的300bp的區(qū)域構(gòu)成的基因組DNA序列而制作一個DNA序列，對該DNA使用MapSplice軟件探索接合區(qū)讀段。
[0137]< RT-PCR、基因組PCR、桑格測序>
[0138]將總RNA (500ng)使用superscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(注冊商標(biāo)，Invitrogen公司制)進行逆轉(zhuǎn)錄。而且，將得到的cDNA (相當(dāng)于IOng的總RNA)或IOng的基因組DNA供于使用了 KAPA Taq DNA聚合酶(ΚΑΡΑ生物系統(tǒng)公司制)的PCR擴增。在以下條件下的熱循環(huán)器內(nèi)進行反應(yīng):于95°C 30秒、60 V 30秒、72°C 2分鐘進行40個循環(huán)，其后，于72°C進行最終延長反應(yīng)10分鐘。另外，為了評價cDNA合成效率而擴增了編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的基因。而且，PCR產(chǎn)物使用BigDye終止子試劑盒和ABI3130xl DNA測序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)在雙向直接確定堿基序列。需要說明的是，表1表示本研究中使用的引物。
[0139][表 I]
【權(quán)利要求】
1.一種多肽，其特征在于: 其為KIF5B蛋白的N末端部分與RET蛋白的C末端部分融合而成的多肽。
2.一種多核苷酸，其特征在于: 其編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
3.一種判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性的方法，其特征在于: 包括檢測從患者分離的試樣中的權(quán)利要求2所述的多核苷酸存在或不存在的工序，如果檢測出所述多核苷酸存在，則判斷為所述患者利用所述RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性聞。
4.一種藥劑，用于通過權(quán)利要求3所述的方法判斷利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性，所述藥劑的特征在于: 含有具有至 少15個堿基的鏈長的下述(a)~(c)所記載的任一種多核苷酸、或下述(d)所記載的抗體， Ca)作為選自與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸雜交的探針和與編碼RET蛋白的多核苷酸雜交的探針中的至少一種探針的多核苷酸， (b)作為與編碼KIF5B蛋白的多核苷酸和編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點雜交的探針的多核苷酸， (c)作為以插入編碼KIF5B蛋白的多核苷酸與編碼RET蛋白的多核苷酸的融合點的方式設(shè)計的一對引物的多核苷酸， Cd)與KIF5B蛋白和RET蛋白融合而成的多肽結(jié)合的抗體。
5.一種癌癥的治療方法，其特征在于: 包括將所述RET酪氨酸激酶抑制劑對通過權(quán)利要求3所述的方法判斷為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高的患者進行給藥的工序。
6.一種以RET酪氨酸激酶抑制劑作為有效成分的癌癥治療劑，其特征在于: 其是對通過權(quán)利要求3所述的方法判斷為利用RET酪氨酸激酶抑制劑治療癌癥的有效性高的患者進行給藥的治療劑。
【文檔編號】C07K16/32GK103764676SQ201280038650
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月4日
【發(fā)明者】河野隆志, 蔦幸治 申請人:日本國立癌癥研究中心, Lsip基金運營聯(lián)合公司