基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，涉及一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法及試劑盒。本發(fā)明公開了基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法及試劑盒，包含采集血液，分離血漿，純化cfDNA的方法；設計胰腺癌特征熱點突變區(qū)域的panel；PCR引物擴增，文庫構建，高通量二代測序和數(shù)據(jù)分析的流程方法。本發(fā)明可以根據(jù)每個個體隨著治療的進行和病程發(fā)展，檢測血漿cfD NA中胰腺癌特征突變類型、突變頻率的動態(tài)變化，用來為胰腺癌病程監(jiān)控和抗藥的出現(xiàn)提供信息。
【專利說明】
基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法及試 劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，涉及一種基于血漿CfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基 因檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，通常指胰腺管狀腺癌，其起病隱匿、早期 診斷困難、進展迅速和易復發(fā)轉移等特征導致臨床治療效果差，是目前預后最差的惡性腫 瘤之一，中位生存期約6個月，總體5年生存率為3~5%，嚴重威脅人類的健康，被稱為"癌中 之王"。
[0003] 研究表明，人類癌癥是由致癌基因和抑癌基因突變積累造成的，絕大多數(shù)的基因 突變都是沒有功能或不是致病的突變，叫做"Passenger Mutation" ；少部分基因突變是具 有致癌功能，大部分腫瘤都共有的突變，叫做"Driver Mutation"。這一類型的突變是導致 腫瘤發(fā)生的主要原因，同時也是早期診斷和預警的重要分子標志物。
[0004] 隨著基因組技術的不斷發(fā)展進步，在胰腺癌基因組研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些高頻突 變，如導管腺癌中KRAS的體細胞突變率大于90%，它是胰腺癌中突變率最高的癌基因 。KRAS 突變主要集中在特定的密碼子上(最常發(fā)現(xiàn)在12密碼子），這被證實與胰腺癌的發(fā)展至關重 要。
[0005] 循環(huán)DNA又稱游離DNA(cfDNA)，是一種存在于動、植物和人體液中的無細胞狀態(tài)的 胞外DNA。目前，研究表明腫瘤患者血漿中游離DNA具有與腫瘤組織中DNA相一致的分子遺傳 學改變(如基因突變、抑癌基因啟動子高甲基化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性丟失等）。而在胰腺 癌的早期診斷及預警監(jiān)控中，采集外周血比其他樣本如胰液、腫塊等更為簡便、無創(chuàng)和廣泛 適用。因此通過檢測血漿中腫瘤cfDNA的突變成為胰腺癌早期診斷和預警研究的重要方向 之一。
[0006] 隨著痕量DNA檢測技術的不斷進步和二代測序技術的迅猛發(fā)展，更加簡便、經(jīng)濟、 高效的捕獲測序技術被開發(fā)出來，以往疾病基因逐個篩查的傳統(tǒng)模式(周期長、花費大、檢 出率低)被顛覆，實現(xiàn)了"一次取樣，全部篩查"的目標?；虿东@測序技術的優(yōu)點在于充分 利用現(xiàn)二代高通量測序的優(yōu)勢，一次性捕獲檢測幾十到幾千種基因，上百萬位點，不需要把 全部基因組測出來，就能把感興趣的基因片段測出來。此外，該技術具有很高的敏感度。例 如，每個人類細胞中存在著數(shù)百個拷貝的線粒體DNA，傳統(tǒng)的Sanger測序技術的檢測下限為 10-15%，因此許多低豐度的線粒體異質(zhì)性無法用傳統(tǒng)技術檢測出來。通過捕獲測序技術可 以精確檢測線粒體DNA中所有位點>2%以上的異質(zhì)性。
[0007] 綜上所述，本發(fā)明基于痕量DNA檢測技術和二代測序技術提供了一種胰腺癌血漿 cfDNA多基因檢測的方法，并根據(jù)自主設計的胰腺癌panel(基本涵蓋了胰腺癌的高頻突變 位點)開發(fā)成試劑盒。最終，根據(jù)檢測血漿cfDNA中胰腺癌特征突變類型、突變頻率的動態(tài)變 化，用來為胰腺癌病程監(jiān)控和抗藥的出現(xiàn)提供信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法。
[0009] 一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法，包括如下步驟：
[0010] ⑴分離血漿；
[0011] (2)純化 cfDNA;
[0012] (3)將步驟(2)的DNAlOng與胰腺癌特征熱點突變pane 1混合，進行單管多重PCR反 應來擴增目標基因；胰腺癌特征熱點突變panel包括表1所示37個基因的特異性引物。
[0013] (4)文庫構建；
[0014] (5)高通量測序；
[0015] ⑻數(shù)據(jù)分析。
[0016] 其中，
[0017]步驟（1)中：將全血加入含有抗凝劑的EDTA管中；將EDTA管2h內(nèi)轉入4°C冷凍離心 機中以1900g(3000rpm)離心10min，下層為血細胞，上層為血楽；，分別轉移到EP管，存放于-80°C，保存。
[0018] 步驟（2 ) cf DNA純化采用Gnomegen公司的純化試劑盒（Circulat ing DNA Purification Kit)，應用磁珠純化的技術從血衆(zhòng)中集中富集300bp以下的DNA片段。
[0019] 步驟（4)文庫構建采用Gnomegen公司的建庫試劑盒（DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amp1 icon Sequencing)。
[0020] 步驟(5)采用Ion torrent測序平臺進行測序，Proton，讀長為150bp，lOOOOx測序 深度。
[0021] 步驟(6)針對血漿游離DNA中的低頻突變進行檢測的生物信息學分析流程如下
[0022] 1.原始數(shù)據(jù)質(zhì)檢
[0023] 2.過濾
[0024] a)去除read 中的adapter 序列；
[0025] b)去除read 中的primer 序列；
[0026] c)去除含N堿基數(shù)大于整條reads的10%的reads;
[0027] d)去除 read 長度<50bp 的 reads;
[0028] e)去除低質(zhì)量的reads:Q>20的堿基數(shù)不足reads總長的70% ;
[0029] 3.比對
[0030] 利用BWA工具將clean reads比對回參考基因組，BWA通過Burrows Wheeler轉換將 基因組序列壓縮并建立索引，再通過查找和回溯來定位讀段，在查找時可通過堿基替代來 實現(xiàn)允許的錯配；
[0031] 4.體細胞突變檢測
[0032] 過濾掉血漿cfDNA樣品和血細胞樣本中均檢出且頻率相似的變異位點 [0033] 當頻率〈10%時，頻率差〈2%
[0034] 當頻率>10%時，頻率差〈1〇%。
[0035] 另外，本發(fā)明還提供了一種用于檢測血漿cfDNA中胰腺癌多基因的引物組合(如表 1所示的上游引物的組合和/或下游引物的組合)及引物組合在制備無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測 試劑或試劑盒中的應用。
[0036]另外還提供了檢測血漿cfDNA中胰腺癌多基因的檢測試劑和檢測盒。
[0037] 一種檢測血漿cfDNA中胰腺癌多基因的檢測試劑，含有用于檢測血漿cfDNA中胰腺 癌多基因的引物組合(如表1所示的上游引物的組合和/或下游引物的組合）。
[0038] 一種檢測血漿cfDNA中胰腺癌多基因的檢測試劑盒，含有用于檢測血漿cfDNA中胰 腺癌多基因的引物組合(如表1所示的上游引物的組合和/或下游引物的組合）。
[0039]下面對本發(fā)明做進一步的說明，基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢 測方法步驟：
[0040] (1)采集血液，分離血漿
[0041 ] 將全血加入含有抗凝劑的EDTA管中。將EDTA管2h內(nèi)轉入4°C冷凍離心機中以1900g (3000rpm)離心10min，下層為血細胞，上層為血漿，分別轉移到EP管，存放于-80°C，保存。
[0042] (2)純化 cfDNA
[0043] cfDNA純化米用Gnomegen公司的Circulating DNA Purification Kit，應用磁珠 純化的技術從血漿中集中富集300bp以下的DNA片段，更有效地去除大片段基因組DNA的污 染，尤其適用于從腫瘤病人血漿游離DNA中檢測腫瘤相關基因突變信息的研究。具體流程按 照試劑盒說明書進行。
[0044] (3)胰腺癌特征熱點突變panel，PCR引物擴增
[0045] panel覆蓋5個基因的全外顯子區(qū)和32個基因熱點突變區(qū)（見表1)。并將每個樣品 (約10ng DNA)和自主定制的引物混合，進行單管多重PCR反應來擴增目標基因。
[0046] (4)文庫構建
[0047] 米用Gnomegen公司的DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amplicon Sequenc ing。具體流程按照試劑盒說明書進行。
[0048] (5)高通量測序
[0049] 采用Ion torrent測序平臺進行測序，Proton，讀長為150bp，10000x測序深度。
[0050] (6)數(shù)據(jù)分析
[0051]根據(jù)圖1對血漿游離DNA中的低頻突變進行檢測的生物信息學分析流程，以保證檢 測的準確度和靈敏度。
[0052]本發(fā)明公開了基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法及試劑和試 劑盒，包含采集血液，分離血衆(zhòng)，純化cfDNA的方法;設計胰腺癌特征熱點突變區(qū)域的panel; PCR引物擴增，文庫構建，高通量二代測序和數(shù)據(jù)分析的流程方法。本發(fā)明可以根據(jù)每個個 體的血液隨著治療的進行和病程發(fā)展，檢測血漿cfDNA中胰腺癌特征突變類型、突變頻率的 動態(tài)變化，用來為胰腺癌病程監(jiān)控和抗藥的出現(xiàn)提供信息。
[0053]本發(fā)明公開了基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法及試劑盒， 包含采集血液，分離血漿，純化cfDNA的方法;設計胰腺癌特征熱點突變區(qū)域的panel;PCR引 物擴增，文庫構建，高通量二代測序和數(shù)據(jù)分析的流程方法。本發(fā)明可以根據(jù)每個個體隨著 治療的進行和病程發(fā)展，檢測血漿cfDNA中胰腺癌特征突變類型、突變頻率的動態(tài)變化，用 來為胰腺癌病程監(jiān)控和抗藥的出現(xiàn)提供信息。
【附圖說明】
[0054] 圖1為本發(fā)明1-3號病人突變分布圖。
【具體實施方式】
[0055] 下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。
[0056] 本發(fā)明實施例中所需要的材料、試劑除特殊說明均可市場購得。
[0057] 實施例1
[0058]對來源于1-3號3例胰腺癌患者的全血（由浙江大學第一附屬醫(yī)院提供)分別進行 胰腺癌血漿cfDNA多基因檢測試和腫瘤組織DNA的多基因檢測，比較其一致性，判斷血漿 cfDNA檢出的突變是否能作為患者個體化的監(jiān)測標志物。
[0059] 1.取材，分離
[0060] 1.1來源于1-3號3例胰腺癌患者的全血各5ml，將全血加入含有抗凝劑的EDTA管 中。將EDTA管2h內(nèi)轉入4°C冷凍離心機中以1900g(3000rpm)離心10min，下層為血細胞，上層 為血漿，分別轉移到EP管，存放于-80°C，保存。
[0061] 1.2腫瘤手術組織各取30mg，直接放入EP管中立即在-80°c或者液氮凍存即可。
[0062] 2DNA的純化、定量
[0063] 2.1 血衆(zhòng)cfDNA的純化米用Gnomegen Circulating DNA Purification Kit，血細 胞基因組DNA的純化采用Qiamp DNA Blood Mini Kit，具體流程按照試劑盒標準說明書進 行。純化后的血漿游離DNA采用Qubit定量檢測游離DNA的濃度。純化后的血細胞基因組DNA 采用Qubit定量檢測DNA的濃度。
[0064] 2.2腫瘤組織基因組0嫩的純化采用如&8611〇嫩1^1^燈丨，具體流程按照試劑盒 標準說明書進行。純化后的腫瘤組織基因組DNA采用Qubit定量檢測DNA的濃度。
[0065] 3、目標基因 PCR擴增
[0066] 胰腺癌多基因檢測試劑盒，包含胰腺癌特征熱點突變pane 1的37個基因的特異性 引物，其中覆蓋5個基因的全外顯子區(qū)和32個基因熱點突變區(qū)（見表1)。并將每個樣品（約 10ng DNA)和自主定制的引物混合，進行單管多重PCR反應來擴增目標基因。
[0067] 表1:
[0073]
[0074] 4、文庫構建和測序
[0075] 文庫構建米用Gnomegen公司的DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amp 1 icon Sequencing進行。采用Ion torrent測序平臺進行測序，Proton，讀長為150bp， lOOOOx測序深度。
[0076] 5、生物信息學分析流程
[0077] 5.1原始數(shù)據(jù)質(zhì)檢
[0078] 5.2 過濾
[0079] f)去除read 中的adapter 序列；
[0080] g)去除read 中的primer 序列；
[0081 ] h)去除含附咸基數(shù)大于整條reads的10%的reads;
[0082] i)去除 read 長度<50bp 的 reads;
[0083] j)去除低質(zhì)量的reads(Q>20的堿基數(shù)不足reads總長的70% )。
[0084] 5.3比對
[0085] 利用BWA工具將clean reads比對回參考基因組。BWA通過Burrows Wheeler轉換將 基因組序列壓縮并建立索引，再通過查找和回溯來定位讀段，在查找時可通過堿基替代來 實現(xiàn)允許的錯配。
[0086] 5.4體細胞突變檢測
[0087] 比較腫瘤組織樣品中檢出體細胞突變與血漿cfDNA樣品檢出體細胞突變時，做了 以下過濾：
[0088] a).過濾掉腫瘤組織和血細胞樣本中均檢出且頻率相似的變異位點。
[0089] 當頻率〈10%時，頻率差〈2%.
[0090] 當頻率>10%時，頻率差〈10%.
[0091 ] 2.過濾掉血漿cfDNA樣品和血細胞樣本中均檢出且頻率相似的變異位點。
[0092] 當頻率〈10%時，頻率差〈2%.
[0093] 當頻率>10%時，頻率差〈10%.
[0094] 6、數(shù)據(jù)解讀和結果
[0095]體細胞突變檢測報告
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101] 結論:發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA中與腫瘤組織中的檢出效果一致性，具有代替活檢組織的效 果。
[0102] 突變分布圖如附圖1。
[0103] 臨床意義(cfDNA中突變頻率大于5%):
[0104] 病人 1 的個體化高頻突變是FBXW7-chr4: 153249329A>G和MAP2K4-chrl7 : 12044664T>G兩個位點，具有預后監(jiān)測的價值。
[0105] 病人 2 的個體化高頻突變是 81^^2-(：1^13:3291137認>6和41?1014-(31^1:27059176〇 >T兩個位點，具有預后監(jiān)測的價值。
[0106] 病人3的個體化高頻突變是KMT2C-chr7:151879447T>A，具有預后監(jiān)測的價值。
[0107] 研究價值:發(fā)現(xiàn)STK11基因上chrl9:1226599T>C突變位點具有影響其蛋白S419P的 改變，且為三個病人共有，具有研究價值。
【主權項】
1. 一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法，其特征在于，包括如下 步驟： (1) 分離血漿； (2) 純化 cfDNA; (3) 將步驟(2)的DNAlOng與胰腺癌特征熱點突變panel混合，進行單管多重PCR反應來 擴增目標基因；胰腺癌特征熱點突變panel包括表1所示37個基因的特異性引物。 表1:(4) 文庫構建； (5) 高通量測序； (6) 數(shù)據(jù)分析。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法， 其特征在于，步驟（1)中：將全血加入含有抗凝劑的Η)ΤΑ管中；將EDTA管2h內(nèi)轉入4 °C冷凍離 心機中以1900g (3000rpm)離心10min，下層為血細胞，上層為血漿，分別轉移到EP管，存放 于-80°C，保存。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法， 其特征在于，步驟（2) cfDNA純化采用Gnomegen公司的純化試劑盒（Circulating DNA Purification Kit)，應用磁珠純化的技術從血衆(zhòng)中集中富集300bp以下的DNA片段。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法， 其特征在于，步驟(4)文庫構建采用Gnomegen公司的建庫試劑盒(DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amp1 icon Sequencing)。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法， 其特征在于，步驟(5)采用Ion torrent測序平臺進行測序，Proton，讀長為150bp，ΙΟΟΟΟχ測 序深度。6. 根據(jù)權利要求1所述的一種基于血漿cfDNA檢測技術的無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測方法， 其特征在于，步驟(6)針對血漿游離DNA中的低頻突變進行檢測的生物信息學分析流程如下1. 原始數(shù)據(jù)質(zhì)檢2. 過濾 a) 去除read中的adapter序列； b) 去除read中的primer序列； c) 去除含N堿基數(shù)大于整條reads的10 %的reads; d) 去除 read 長度 <50bp 的 reads; e) 去除低質(zhì)量的reads :Q>20的堿基數(shù)不足reads總長的70% ;3. 比對 利用BWA工具將clean reads比對回參考基因組，BWA通過Burrows Wheeler轉換將基因 組序列壓縮并建立索引，再通過查找和回溯來定位讀段，在查找時可通過堿基替代來實現(xiàn) 允許的錯配；4. 體細胞突變檢測 過濾掉血漿cfDNA樣品和血細胞樣本中均檢出且頻率相似的變異位點 當頻率< 1 〇 %時，頻率差< 2 % 當頻率> 10 %時，頻率差< 10 %。7. -種用于檢測血漿cfDNA中胰腺癌多基因的引物組合，其特征在于，如表1所示的上 游引物和下游引物。8. 權利要求7所述引物組合在制備無創(chuàng)胰腺癌多基因檢測試劑或試劑盒中的應用。9. 一種檢測血漿cfDNA中胰腺癌多基因的檢測試劑，含有權利要求7所述的引物組合。10. -種檢測血漿cfDNA中胰腺癌多基因的檢測試劑盒，含有權利要求7所述的引物組 合。
【文檔編號】C12N15/11GK106065414SQ201610415898
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610415898.8, CN 106065414 A, CN 106065414A, CN 201610415898, CN-A-106065414, CN106065414 A, CN106065414A, CN201610415898, CN201610415898.8
【發(fā)明人】王偉林, 趙忻藝, 周東鍇, 胡振華, 葉松, 孔陽
【申請人】浙江大學