人血清白蛋白-藥物復(fù)合物及其合成方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及三種藥物與人血清白蛋白的復(fù)合物及其合成 方法及其合成方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是涉及多種途徑的復(fù)雜疾病，其特點(diǎn)是一條線(xiàn)上的細(xì)胞連續(xù)突變致使病情惡 化。此外，由于化療過(guò)程導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞基因突變使得其存活率增高，腫瘤也面臨著化療劑內(nèi) 源性和獲得性抗性的挑戰(zhàn)。顯然，通過(guò)單一藥物抑制的方法不足以達(dá)到使腫瘤衰退的目的。 因此，多靶向聯(lián)合治療正在成為癌癥治療越來(lái)越重要的策略，通過(guò)多重藥物調(diào)劑疾病細(xì)胞 不同的信號(hào)通路，最大限度的克服阻力提高治療效果。
[0003] 事實(shí)上，有非常多的證據(jù)顯示，多種藥物組合比單獨(dú)用藥對(duì)腫瘤的治療更加有效。 目前，已有超過(guò)9500種不同的聯(lián)合治療癌癥臨床試驗(yàn)。例如，紫杉醇與5-氟尿嘧啶（5FU) 的聯(lián)合用藥已被用于治療胃癌、乳腺癌、胰腺癌等多種類(lèi)型的癌癥。盡管組合藥物的使用似 乎是非常有希望的癌癥療法，但其研發(fā)方面仍然存在著很大的挑戰(zhàn)，就是如何統(tǒng)籌好生物 利用度、藥動(dòng)力學(xué)以及細(xì)胞吸收結(jié)合的治療效果等諸多問(wèn)題。比如，藥物通常會(huì)被血液循環(huán) 系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞以及其他分子成分所結(jié)合從而被清除出整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)。將具有體外協(xié)同 作用的聯(lián)合藥物注入到血液中，其分布與消除都是相對(duì)獨(dú)立的。不同的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)使 得相同的腫瘤細(xì)胞中兩種藥物的摩爾比不可控制。這些障礙都限制了聯(lián)合治療的在臨床方 面的治療效果。為了克服這一難題，人們嘗試?yán)脝我坏乃幬镙d體同時(shí)結(jié)合多個(gè)治療藥物 從而同時(shí)遞送至作用部位達(dá)到同時(shí)治療的效果。比如我們已知的納米顆粒遞送系統(tǒng)，通過(guò) 增強(qiáng)滲透性和保留效應(yīng)有效的將多種藥物傳遞至腫瘤位點(diǎn)，從而提高腫瘤中藥物的濃度。 然而不幸的是，由于多種藥物可能存在化學(xué)不相容性或者它們的組合會(huì)影響到載體的穩(wěn)定 性，從而導(dǎo)致這種共輸送的單載體多種藥物組合方式不可行。為此，我們提出通過(guò)調(diào)節(jié)多種 藥物在單載體中的空間分布從而避免它們相互之間的干擾。
[0004] 目前還未見(jiàn)有以人血清白蛋白（HSA)為載體，同時(shí)輸送5-氟尿嘧啶、富G寡核苷 酸（AS1411)以及銅配合物的復(fù)合物的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人血清白蛋白-藥物復(fù)合物及其合成方法 和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的人血清白蛋白-藥物復(fù)合物，是以人血清白蛋白為載體，在人血清 白蛋白IB子域中酪氨酸161和組氨酸146兩個(gè)位點(diǎn)上共同結(jié)合5氟尿嘧啶（即酪氨酸161 和組氨酸146兩個(gè)位點(diǎn)上共同結(jié)合一個(gè)5氟尿嘧啶分子），在人血清白蛋白的IIA子域中 組氨酸242位點(diǎn)上結(jié)合有銅（II)金屬配合物，該銅（II)金屬配合物具有如下式（I)所示 結(jié)構(gòu)，在人血清白蛋白的半胱氨酸34位點(diǎn)上通過(guò)交聯(lián)劑結(jié)合有富G寡核苷酸；
[0007]
[0008] 上述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物的合成方法為：取如下式（I)所示結(jié)構(gòu)的銅（II) 金屬配合物（簡(jiǎn)寫(xiě)為BpT)、5_氟尿嘧啶以及人血清白蛋白進(jìn)行孵育，孵育所得混合物進(jìn)行 濃縮、洗滌，然后通過(guò)交聯(lián)劑接上富G寡核苷酸即得；
[0009]
[0010] 上述合成方法中，所述的交聯(lián)劑通常為N-琥珀酰亞胺基-4- (4-馬來(lái)酰亞胺苯基） 丁酸鹽（SMPB)。
[0011] 更為具體的人血清白蛋白-藥物復(fù)合物的合成方法包括以下步驟：
[0012] 1)取式⑴所示結(jié)構(gòu)的銅（II)金屬配合物、5-氟尿嘧啶以及人血清白蛋白進(jìn)行 孵育，孵育所得混合物進(jìn)行濃縮、洗滌，得到HSA-5FU-BpT復(fù)合物；
[0013] 2)取富G寡核苷酸溶解于PBS緩沖液，加入過(guò)量的交聯(lián)劑，反應(yīng)，所得產(chǎn)物滴 加到HSA-5FU-BpT復(fù)合物中，在保護(hù)氣氛下孵育，孵育所得混合物進(jìn)行濃縮、洗滌，得到 HSA-5FU-BpT-AS1411 復(fù)合物。
[0014] 上述合成方法的步驟1)和2)中涉及的孵育操作與現(xiàn)有技術(shù)相同。
[0015] 上述合成方法的步驟2)中，交聯(lián)劑的加入量通常為富G寡核苷酸物質(zhì)的量的2~ 10倍，加入交聯(lián)劑后的反應(yīng)在低于40°C的條件下進(jìn)行，當(dāng)反應(yīng)在20~30°C的室溫條件下進(jìn) 行時(shí)，反應(yīng)的時(shí)間通常為20~60min。反應(yīng)完成后，未反應(yīng)的N-琥珀酰亞胺基-4-(4-馬來(lái) 酰亞胺苯基）丁酸鹽可使用凝膠層析過(guò)濾除去。所述的保護(hù)氣氛通常為氮?dú)獾榷栊詺怏w。 在完成富G寡核苷酸與HSA-5FU-BpT復(fù)合物的孵育后，可以采用凝膠層析過(guò)濾除去未綴合 到HSA-5FU-BpT復(fù)合物中的富G寡核苷酸。
[0016] 本發(fā)明還提供上述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明還包括以上述權(quán)利要求1所述人血清白蛋白-藥物復(fù)合物為活性成分制備 的抗腫瘤藥物。
[0018] 同時(shí)本發(fā)明還提供一種以2-苯甲?；拎たs氨基硫脲為配體的銅（II)金屬配合 物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其與人血清白蛋白-藥物復(fù)合物中提及的銅（II)金屬配合物具 有相同的結(jié)構(gòu)，即具有如下式（I)所示結(jié)構(gòu)：
[0019]
[0020] 上述銅（II)金屬配合物的合成方法，包括以下步驟：
[0021] a)取2-苯甲?；拎ず桶被螂?，以醇類(lèi)物質(zhì)作為溶劑，進(jìn)行反應(yīng)，有沉淀生成， 收集沉淀，洗滌，得到配體2-苯甲?；拎たs氨基硫脲；
[0022] b)取配體2-苯甲?；拎たs氨基硫脲和CuBr2，以醇類(lèi)物質(zhì)作為溶劑，進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)物靜置、析晶，收集晶體，即得到目標(biāo)產(chǎn)物。
[0023] 上述銅（II)金屬配合物的合成方法中，所述的醇類(lèi)物質(zhì)優(yōu)選為甲醇和/或乙醇， 其中，甲醇優(yōu)選采用體積濃度為2〇~80%的甲醇，乙醇優(yōu)選采用體積濃度為20~80%的 乙醇；當(dāng)醇類(lèi)物質(zhì)的選擇為甲醇和乙醇的組合時(shí)，甲醇和乙醇之間的配比可以為任意配比。
[0024] 上述銅（II)金屬配合物的合成方法中，所述的反應(yīng)優(yōu)選是在20°C至溶劑（即醇 類(lèi)物質(zhì)）的回流溫度范圍內(nèi)反應(yīng)。反應(yīng)采用的方式可以為常溫條件下反應(yīng)、常規(guī)的加熱反 應(yīng)或回流反應(yīng)，優(yōu)選采用回流反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)選是在50°C至溶劑的回流溫度范圍內(nèi)進(jìn) 行，更優(yōu)選是在60°C至溶劑（即醇類(lèi)物質(zhì)）的回流溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)是否完全可以可 采用薄層層析（TLC)跟蹤檢測(cè)。在步驟a)中，當(dāng)反應(yīng)50°C至溶劑的回流溫度范圍內(nèi)進(jìn)行 時(shí)，通常是控制反應(yīng)時(shí)間為12~24h。在步驟b)中，當(dāng)反應(yīng)50°C至溶劑的回流溫度范圍內(nèi) 進(jìn)行時(shí)，通常是控制反應(yīng)時(shí)間為1~2h。
[0025] 上述銅（II)金屬配合物的合成方法的步驟a)中，收集得到的沉淀通常采用甲醇、 乙醇、乙醚和水中的一種或兩種以上洗滌。本步驟中，2-苯甲?；拎ず桶被螂宓奈镔|(zhì)的 量之比為化學(xué)計(jì)量比，通常為1 :1。所述溶劑的用量以能溶解參加反應(yīng)的原料為宜，通常情 況下，lmmol的2-苯甲?；鵓比啶或氨基硫脲用4~10mL的溶劑來(lái)溶解。在具體的溶解步驟 中，可將2-苯甲?；拎ず桶被螂宸謩e用溶劑溶解，再混合在一起反應(yīng)；也可將2-苯甲 酰基吡啶或氨基硫脲混合后再加溶劑。
[0026] 上述銅（II)金屬配合物的合成方法的步驟b)中，優(yōu)選是將反應(yīng)所得的反應(yīng)物先 過(guò)濾，收集濾液，再將濾液進(jìn)行靜置、析晶。本步驟中，優(yōu)選是在較低的溫度條件下進(jìn)行靜 置，通常選擇在0~8°C條件下進(jìn)行靜置析晶。進(jìn)一步地，在靜置析晶時(shí)，在盛裝濾液的容器 開(kāi)口上罩上一層薄膜，然后在薄膜上開(kāi)設(shè)若干個(gè)小孔使溶劑緩慢揮發(fā)，以獲得更好的析晶 效果。本步驟中，配體2-苯甲?；拎たs氨基硫脲和CuBr2的物質(zhì)的量之比為化學(xué)計(jì)量比， 通常為1 :1。所述溶劑的用量以能溶解參加反應(yīng)的原料為宜，通常情況下，以1_〇1的配體 2-苯甲?；拎たs氨基硫脲為基準(zhǔn)計(jì)算，溶劑的用量為4~10mL。在具體的溶解步驟中， 可將配體2-苯甲?；拎たs氨基硫脲和CuBr2*別用溶劑溶解，再混合在一起反應(yīng)；也可 將配體2-苯甲酰基吡啶縮氨基硫脲和CuBr2混合后再加溶劑。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種以人血清白蛋白為載體，同時(shí)負(fù)載5-氟尿嘧 啶、富G寡核苷酸（AS1411)以及如式（I)所示結(jié)構(gòu)的銅（II)配合物的人血清白蛋白-藥 物復(fù)合物，并提供了該復(fù)合物的合成方法；申請(qǐng)人對(duì)所得復(fù)合物進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性研究， 結(jié)果表明，以白蛋白為基礎(chǔ)的多藥物遞送系統(tǒng)較單獨(dú)的三種藥物提高了靶向性以及治療效 果，且毒性更低。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制得的最終產(chǎn)物的紅外光譜圖；
[0029] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制得的最終產(chǎn)物的單晶結(jié)構(gòu)圖；
[0030] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物的整體結(jié)構(gòu)圖；
[0031] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物中5-氟尿嘧啶和銅金屬配合物的電子云 密度圖，其中（a)為5-氟尿嘧啶的電子云密度圖，（b)為銅金屬配合物的電子云密度圖；
[0032] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物中5-氟尿嘧啶以及銅金屬配合物分別與 人血清白蛋白作用結(jié)合位點(diǎn)圖，其中（a)為5-氟尿嘧啶與人血清白蛋白作用結(jié)合位點(diǎn)圖， (b)為銅金屬配合物與人血清白蛋白作用結(jié)合位點(diǎn)圖；
[0033] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物的質(zhì)譜圖；
[0034] 圖7為小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)組織學(xué)切片圖片；其中A為28天后對(duì)不同藥物組和對(duì)照組 腫瘤細(xì)胞使用蘇木精和曙紅染色的圖片，B為28天后對(duì)不同藥物組和對(duì)照組腫瘤細(xì)胞使用 TUNEL染色的圖片，C為28天后對(duì)不同藥物組和對(duì)照組肝臟細(xì)胞使用蘇木精和曙紅染色的 圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下各實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例中，涉及的簡(jiǎn)稱(chēng)代表的意思如下：
[0036] BpT配合物：表示以2-苯甲?；拎たs氨基硫脲為配體的銅（II)金屬配合物，即 本發(fā)明式（I)所示化合物。
[0037] HSA:人血清白蛋白。
[0038] 5-FU:5_ 氟尿嘧啶。
[0039] AS1411 :富G寡核苷酸。
[0040] DMS0 :二甲基亞砜。
[0041] SMPB:N-琥珀酰亞胺基-4-(4-馬來(lái)酰亞胺苯基）丁酸鹽。
[0042] HSA-5FU-BpT-AS1411復(fù)合物：表示由以2-苯甲?；拎たs氨基硫脲為配體的銅 (II)金屬配合物、5-氟尿嘧啶以及富G寡核苷酸和人血清白蛋白孵育得到的人血清白蛋 白-藥物復(fù)合物。
[0043] 實(shí)施例1:BpT配合物的合成
[0044] a)將lOmmol的2-苯甲酰基吡啶溶解于20ml的乙醇（溶劑乙醇的濃度為50v/ v% )中，于60°C攪拌15min，制得溶液，將上述溶液逐滴滴入20ml加有l(wèi)Ommol氨基硫脲的 乙醇（溶劑乙醇的濃度為50v/v% )溶液中，于60°C回流攪拌反應(yīng)24h得淡黃色沉淀物，將 上述所得淡黃色沉淀過(guò)濾后用無(wú)水乙醇和乙醚各洗3次，干燥后，得配體2-苯甲酰基吡啶 縮氨基硫脲；
[0045] b)將含有CuBr2(223.