重組TsPKA-C蛋白及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供重組TsPKA?C蛋白及其應(yīng)用，尤其涉及重組TsPKA?C蛋白作為豬帶絳蟲(chóng)/囊尾蚴檢測(cè)抗原的應(yīng)用和重組TsPKA?C蛋白在制備豬囊尾蚴病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的重組TsPKA?C蛋白能夠特異性的檢測(cè)豬帶絳蟲(chóng)/囊尾蚴，而與豬細(xì)頸囊尾蚴、豬旋毛蟲(chóng)等無(wú)任何交叉反應(yīng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
重組TsPKA-C蛋白及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及重組TsPKA-C蛋白及其應(yīng)用，尤其涉及重組TsPKA-C蛋白作為豬帶絳 蟲(chóng)/囊尾蝴檢測(cè)抗原的應(yīng)用和重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬帶絳蟲(chóng)（Taenia solium)是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)，其幼蟲(chóng)不僅可寄生于 人的腦、眼、肌肉等處，引起相應(yīng)部位的囊蟲(chóng)病，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。而且還可寄生于豬的肌 肉、腦等組織，導(dǎo)致豬肉因此而廢棄和銷(xiāo)毀，造成養(yǎng)豬業(yè)較大的經(jīng)濟(jì)損失，是世界范圍公認(rèn) 的社會(huì)、政治、經(jīng)濟(jì)病。目前，針對(duì)豬囊蟲(chóng)病診斷方法多以ELISA、EITB等血清學(xué)方法為主，但 這些方法大多都與細(xì)頸囊尾蝴陽(yáng)性血清存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，因而導(dǎo)致臨床診斷中易出現(xiàn) 豬囊尾蝴病假陽(yáng)性病例。此外，豬囊尾蝴病疫苗和藥物開(kāi)發(fā)仍存在很多不足，篩選并鑒定高 效疫苗和藥物靶標(biāo)分子也是目前豬囊蟲(chóng)病研究的熱點(diǎn)。因此，利用豬帶絳蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄 組數(shù)據(jù)，開(kāi)展豬囊尾蝴病診斷和疫苗候選分子鑒定和功能研究，尋找新的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，對(duì) 有效防控豬囊蟲(chóng)病具有重要意義。
[0003] 蛋白激酶是一種潛在的寄生蟲(chóng)病疫苗候選分子和藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。蛋白激酶A (protein kinase Α,ΡΚΑ)又名3' ,5'-環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴(lài)的蛋白激酶，是PKA超家族中重 要成員，是一類(lèi)絲/蘇氨酸激酶。cAMP依賴(lài)性蛋白激酶是cAMP信號(hào)通路中關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分 子，通過(guò)對(duì)許多蛋白質(zhì)特定的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化與凋亡及 特定基因的表達(dá)等。眾多的人類(lèi)疾病與蛋白激酶的活性異常存在著直接或間接關(guān)系，蛋白 激酶已經(jīng)成為治療癌癥、炎癥和其他免疫調(diào)控紊亂等復(fù)雜疾病的重要藥物靶點(diǎn)。除此之外， cAMP依賴(lài)性蛋白激酶也可用于寄生蟲(chóng)病的診斷。Diaz-Masmela Y等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒 定出7個(gè)豬囊尾蝴特異性很高的抗原，其中就包括cAMP依賴(lài)性蛋白激酶。血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果表 明，該蛋白與豬蛔蟲(chóng)(Ascaris suum)、細(xì)頸囊尾蝴(Cysticercus tenuicolIis)、細(xì)粒棘球 蝴(Echinococcus granulosa)等陽(yáng)性血清沒(méi)有交叉反應(yīng)。上述結(jié)果無(wú)疑說(shuō)明，cAMP依賴(lài)性 蛋白激酶有望作為豬囊尾蝴病診斷的候選抗原分子，從而解決現(xiàn)有血清學(xué)診斷方法存在交 叉反應(yīng)的難題。本發(fā)明在成功克隆和鑒定豬帶絳蟲(chóng)cAMP依賴(lài)性蛋白激酶催化亞基基因 (TsPKA-C)的基礎(chǔ)上，探索其作為診斷抗原的可行性，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能和作用機(jī) 制，開(kāi)展基于豬帶絳蟲(chóng)TsPKA-C的重組抗原疫苗和生物藥物奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了重組TsPKA-C蛋白及其應(yīng)用，尤其 涉及重組TsPKA-C蛋白作為豬帶絳蟲(chóng)檢測(cè)抗原的應(yīng)用和重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴 病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供重組TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0006] 本發(fā)明還提供作為重組TsPKA-C蛋白豬帶絳蟲(chóng)/囊尾蝴檢測(cè)抗原的應(yīng)用;所述重組 TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0007] 本發(fā)明提供重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用；所述重組 TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0008] 本發(fā)明還提供一種豬囊尾蝴病ELISA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包被抗原為重組 TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。
[0009] 作為優(yōu)選，所述試劑盒中還包括HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG。
[0010] 本發(fā)明還提供一種豬帶絳蟲(chóng)ELISA檢測(cè)方法，所述方法不以專(zhuān)利法規(guī)定的疾病的 診斷和治療為目的，以純化的重組TsPKA-C蛋白Iyg于37°C包被酶標(biāo)反應(yīng)板lh，封閉液為1% BSA，用I3BST充分洗滌后分別加入待測(cè)樣品和豬陰性血清，37 °C孵育Ih，PBST洗滌三次后，加 入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入DAB顯色，用濃硫酸終止反應(yīng)后 測(cè)定吸光度，當(dāng)P(陽(yáng)性)/N(陰性)>2時(shí)，檢測(cè)結(jié)果可判為陽(yáng)性，反之，則為陰性。
[0011] 本發(fā)明利用豬帶絳蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)豬帶絳蟲(chóng)TsPKA-C特異引物，以豬 帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增TsPKA-C基因完整ORF，并通過(guò)生物信息學(xué)分析進(jìn) 行鑒定。構(gòu)建pET-30a-TsPKA-C重組表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。純化 的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting分析。結(jié)果表明，TsPKA-C的ORF由1032個(gè)核 苷酸組成，編碼343個(gè)氨基酸殘基，與細(xì)粒棘球蝴和多房棘球蝴氨基酸的一致性分別達(dá) 78.7%和98%; TsPKA-C具有蛋白激酶A的結(jié)構(gòu)域及其催化亞基特征性活性位點(diǎn)，且存在9個(gè)潛 在的線性B淋巴細(xì)胞抗原表位。TsPKA-C基因的表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，且可與豬 囊尾蝴陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，在42kDa處產(chǎn)生特異條帶。本發(fā)明克隆并鑒定了豬帶絳蟲(chóng)cAMP依 賴(lài)性蛋白激酶催化亞基(TsPKA-C)基因，其表達(dá)產(chǎn)物可被豬囊尾蝴陽(yáng)性血清所識(shí)別，作為豬 囊尾蝴檢測(cè)抗原使用。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為豬囊尾蝴的TsPKA-C基因的PCR擴(kuò)增，其中，M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；I: TsPKA-C; 圖2為T(mén)sPKA-C三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);A為豬囊尾蝴的TsPKA-C三級(jí)結(jié)構(gòu);B為人PKA-Ca三級(jí)結(jié) 構(gòu)；其中，I: ATP結(jié)合位點(diǎn)；2: Ser/Thr激活位點(diǎn)；3: PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié)合位點(diǎn)；4:保守的磷酸化 位點(diǎn)； 圖3為豬帶絳蟲(chóng)PKA-C與其他物種的PKA-C多序列比對(duì)； 圖4為不同物種PKA-C的系統(tǒng)進(jìn)化分析;E.multilocularis(CDJ04331)，E· granulosus (CDS23692)，Η·sapiens(P17612)，S.mansoni(GQ168377)，S. japonicum(GU130533)， C·elegans(NP_493605)，D·melanogaster(NP_476977)，M. musculus(P05132)，Pig (P36887)； 圖5為重組質(zhì)粒pET-30a-TsPKA-C的酶切鑒定;其中，M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；I:重組質(zhì)粒 pET-30a-TsPKA-C; 2: pET-30a-TsPKA-C 酶切； 圖6為T(mén)sPKA-C重組蛋白的表達(dá);其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:空載體;2:未誘導(dǎo)的 重組菌;3:誘導(dǎo)后的上清;4:誘導(dǎo)后沉淀； 圖7為T(mén)sPKA-C重組蛋白的純化;其中，M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:200 mmol/L咪唑；2: I OOmmo I/L咪唑； 圖8為T(mén)sPKA-C重組蛋白的Western-blotting;其中，Μ:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；I:豬囊尾 蝴陽(yáng)性血清;2:豬囊尾蝴陰性血清。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市 售。
[0014] 實(shí)施例1 1材料與方法 1.1蟲(chóng)株與血清 豬帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)、豬囊尾蝴陽(yáng)性和陰性血清均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所蠕蟲(chóng)病 課題組保存。
[0015] 1.2試劑 TRIzol Reagent、DNA膠回收試劑盒、pMD-T_19(simple)Vector、質(zhì)粒小量提取試劑盒、 限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind ΙΠ 、Τ4 DNA連接酶均購(gòu)自日本Takara公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、Prestained Protein Ladder均購(gòu)自美國(guó)Thermo公 司。大腸埃希菌DH(5a)感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET-30a、大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)、X-Gal、5 X蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù) 有限公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗豬IgG購(gòu)自Sigma公司。Ni Sepharose 6 Fast Flow蛋白純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)GE公司。
[0016] 1.3總RNA的提取及CDNA合成 用Trizol法提取豬帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的總RNA，以RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。
[0017] 1.4引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)豬帶絳蟲(chóng)全基因組注釋信息及轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，并結(jié)合GeneDB數(shù)據(jù)庫(kù)公布的豬帶 絳蟲(chóng)PKA-C的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列，利用軟件Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異 性引物，上游引物加入BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物加入Hind ΙΠ 酶切位點(diǎn)： 上游引物:5'-CGGGATCCATGGCGCAAGCGGAGTTC-3' ； 下游引物：5 ' -CCCAAGCTTGGTAAAATTCTGCAAATTCTGCC-3 '。
[0018]引物送江蘇金唯智生物技術(shù)有限公司合成。
[0019] 1.5基因克隆和轉(zhuǎn)化 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，用設(shè)計(jì)合成的TsPKA-C特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增 體系如下：cDNA模板I yL，5XPS Buffer 10yL，dNTP Mix 4yL，上游引物 1 μ!Χ0·3 μπιο1/μ L)，下游引物 1 μLΧ0·25 μπιο?/μυ，補(bǔ)充 ddH20 至 50 yL。擴(kuò)增程序如下：95 °C 5 min;94 °C 40 s，62.5 °C 40 s，72 °C I min，30個(gè)循環(huán);72 °C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電 泳回收并純化后克隆入pMD-19-T simple載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌液 PCR和酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆送江蘇金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序。該擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸 序列為： ATGGCGCAAGCGGAGTTCGAAAAGATTCTCGAAGCCAAGTCCCGAGGGTTTTTTGAGGTCTTCAATTCGCCGC CCAAGAACACTGCTACTTGGGATGATTTTACACGCATTCGAACCCTTGGACGGGGCGCATTTGGCCGGGTTTTGTTG GTTCGCTATCGAGATACGGAGAGGTACTACGCAATGAAGGTTCTTTCCAAGTTGGAAGTGGTAAAATCACGACAAAT TGACAACGCCATAATGGAAAAACGCATCCTAGCAGCATGCAATGTCAACCAAATCATCAAATTAGCCTATAGTTTTA AGGACAACAGCTATCTTTACATGGTAATGGAATTTGTAGTGGGAGGAGAGATGTTCGCTCTGTTGCGAAACATGCGT CGCTTTCCTGAGGGTATGGTAAAGTTTTACGCTGCTCAGGTCCTGCTGGCGTTTGAATACCTCCACTACCTCACCAT CACTTACCGAGATTTAAAACCTGAGAATTTGCTCATAACCGGTGAGGGCTTTATCAAAGTTGCAGATCTTGGATTTG CGAAACTTCTGCCCAAGGATAAGCGCACGTGGACTCTGTGTGGAACTCCGGACTACATGGCGCCAGAGATTATCATG AACAAGGGATACGCCCATGCAGTGGATTGGTGGGCTTATGGAGTGCTTCTCTACGAAATGACCACAGGCTTTCCTCC CTTCATGCACCAGGAGCAGATGAAGACTTTTGAGCACATCATTTCGGGCAAAATAAAGTTTACTAACCAATTTAGTC CAGATCTAAAAGATCTCATCAAGAATCTCATTCAAACTGACCTCTCGAGGCGCTTTGGGAACCTCCGTAATGGCATT ATGGATATCAAGGGACACGCCTACTTCAGTGACGTCGATTTTATGGCCATCTTCAACCAGAGTGTACGACCGCCGTA TGTGCCGAAGGTGAAGAGTCCCGGTGATGCAAGCAACTTTGAGAAGTGGGATGAGGAGAAACTAAAAATTGCTGACA GGGAGAAATTTAAGGCAGAATTTGCAGAATTTTAG 1.6 TsPKA-C基因的生物信息學(xué)分析 利用ProtParam(http : //www · expasy · org/tools/protparam· html)在線軟件預(yù)測(cè) TsPKA-C蛋白的理論分子質(zhì)量、氨基酸組成等；ProtScal (http: //www · expasy · org/tool s/ protscale.html)分析其氨基酸的親疏水性。利用SignaIP 4. I Server(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)其信號(hào)肽。用在線軟件（http:// www. imtech.res. in/raghava/bcepred/bcepred_submission.html11(? 位。MotiScan (http: //myhits · isb-sib · ch/cgi_bin/motif_scan)預(yù)測(cè)其糖基化位點(diǎn)、磷 酸化位點(diǎn)和模體及結(jié)構(gòu)域。利用在線軟件SWISS_MODEL(http: //swissmodel · expasy · org/) 預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0020] 1.7 TsPKA-C蛋白的序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析 用BlastP軟件在GenBank中搜索與TsPKA-C氨基酸序列同源的其他物種PKA-C序列，利 用Clustal XI.83及Mega 6.0軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，并計(jì)算遺傳距離。然后用 Paup4.0程序中的鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)繪制種系發(fā)育樹(shù)。
[0021] 1.8重組表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá) 將鑒定正確的pMD19-T-TsPKA-C質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pET-30a分別用BamH I+ Hind ΙΠ 進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收目的片段。利用T4 DNA連接酶將目的 片段與pET-30a連接，并轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn) 行測(cè)序驗(yàn)證。
[0022] 取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌液1:100(v/v)接種于100 mL LB(含卡那抗性100 mg/ mL)液體培養(yǎng)基中，37 °C 220 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液吸光度A6qq=O. 6~0.8時(shí)，加入100 yL 500 mmol/L的IPTG，37 °C 220 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE分 析。同時(shí)設(shè)置誘導(dǎo)前和pET-30a轉(zhuǎn)化菌液的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為對(duì)照。
[0023] 1.9重組蛋白的純化及Western-blot分析 取50 mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，8000 r/min離心15 min，棄上清，加等體積的PBS溶液重懸菌 體沉淀(反復(fù)重懸3-5次）。然后將其放入-80 °C冰箱冷凍I h，取出后溶解，如此反復(fù)凍融3 次。利用超聲波破碎儀處理菌體懸液，直至溶液澄清透亮。菌體裂解物4 °C，12000 r/min離 心10 min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。利用鎳NTA瓊脂糖凝膠FF在不同 咪唑梯度下對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白以豬囊尾蝴陽(yáng)性血清為第一抗體，HRP標(biāo)記 的兔抗豬IgG為第二抗體進(jìn)行Western-blotting分析，用DAB顯色后觀察結(jié)果。該純化后的 重組蛋白的氨基酸序列為： MAQAEFEKILEAKSRGFFEVFNSPPKNTATWDDFTRIRTLGRGAFGRVLLVRYRDTERYYAMKVLSKLEVVKS RQIDNAIMEKRILAACNVNQIIKLAYSFKDNSYLYMVMEFVVGGEMFALLRNMRRFPEGMVKFYAAQVLLAFEYLHY LTITYRDLKPENLLITGEGFIKVADLGFAKLLPKDKRTWTLCGTPDYMAPEIIMNKGYAHAVDffffAYGVLLYEMTTG FPPFMHQEQMKTFEHIISGKIKFTNQFSPDLKDLIKNLIQTDLSRRFGNLRNGIMDIKGHAYFSDVDFMAIFNQSVR PPYVPKVKSPGDASNFEKWDEEKLKIADREKFKAEFAEF 2結(jié)果 2.1 TsPKA-C基因的PCR擴(kuò)增 以提取的豬帶絳蟲(chóng)總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得大小為10 3 2bp左右的片段，與預(yù) 期結(jié)果一致(圖1)。
[0024] 2.2豬帶絳蟲(chóng)TsPKA-C蛋白的生物信息學(xué)分析 TsPKA-C基因完整ORF為1032bp，編碼343個(gè)氨基酸殘基，其理論分子質(zhì)量為40.0 kDa。TsPKA-C蛋白不含有信號(hào)肽序列，可能為非分泌型蛋白。PredictProtein預(yù)測(cè)表明，在 該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占40.52%，β折疊13.99%，其余為無(wú)規(guī)卷曲。綜合分析表明，TsPKA-C 蛋白的抗原表位可能主要位于氨基酸序列的第8~14、19~26、97~103、124~130、156~162、180 ~186、265~274、307~313、329~335位。]?〇衍€5。311分析表明，了8?1^-(：的第34-290位氨基酸可 能為蛋白激酶A的結(jié)構(gòu)域，并具有蛋白激酶A特征性活性位點(diǎn)：ATP結(jié)合位點(diǎn) (40LGRGAFGRVLLVRYRDTERYYAMK)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活位點(diǎn) (153ITYRDLKPENLLI)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，TsPKA-C蛋白含有12個(gè)α螺旋和9個(gè)β折疊，其余為 無(wú)規(guī)卷曲（圖2)。
[0025] 2.3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 同源序列相似性比對(duì)表明，豬帶絳蟲(chóng)TsPKA-C與其他物種PKA-C氨基酸的相似性高達(dá) 71.7%，與豬的一致性和相似性分別達(dá)51.6%和72%;與細(xì)粒棘球蝴的一致性和相似性分別達(dá) 78.7%和79.7%，表明PKA-C在絳蟲(chóng)種間非常保守。TsPKA-C與其他生物的PKA-C-樣，擁有 cAMP依賴(lài)性蛋白激酶催化亞基特征性結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)（圖3所示）。表明TsPKA-C為豬帶絳 蟲(chóng)cAMP依賴(lài)性蛋白激酶催化亞基。
[0026] 在圖3中， 紅色下劃線表示PKA-C激酶結(jié)構(gòu)域;黑色方框表示PKA-C特征性活性位點(diǎn)，I: ATP活性位 點(diǎn)（GTGSFGRV) ; 2: Ser/Thr激活位點(diǎn)（RDLKPEN) ; 3:保守的磷酸化位點(diǎn)（188T) ; 4: PKA調(diào)節(jié)亞 基結(jié)合位點(diǎn)（LCGTPEY); E·multilocularis(CDJ04331)，E·granulosus(CDS23692)，H·sapiens(P17612)， S.mansoni(GQ168377),S. japonicum(GU130533),C.eIegans(NP_493605), D.melanogaster(NP_476977)，M. musculus(P05132)，Pig(P36887) 用Mega 6.0軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，并計(jì)算遺傳距離。然后用Paup4.0程序中的鄰 接法(Neighbor-joining method, NJ)繪制種系發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，TsPKA-C與帶科絳蟲(chóng)的 PKA-C位于同一分支，親緣關(guān)系最近，而與其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果如圖4。
[0027] 2.4重組菌株的表達(dá)與分析 重組質(zhì)粒pET-30a-TsPKA-C經(jīng)PCR和酶切鑒定均得到約1032bp的片段（圖5)，說(shuō)明成功 構(gòu)建了攜帶TsPKA-C基因的原核表達(dá)載體。用IPTG對(duì)pET-30a-TsPKA-C重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，并 經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分析，在預(yù)期的42kDa附近出現(xiàn)目的條帶。經(jīng)超聲波破碎處理的菌體SDS-PAGE分析結(jié)果表明，目的蛋白主要以包涵體形式存在（圖6)。
[0028] 2 · 5 目的蛋白的Western-blot 6 mol/L尿素溶解包涵體沉淀后，用Ni-NTA Purification System進(jìn)行純化。SDS-PAGE分析表明，目的蛋白獲得較好的純化效果(如圖7)。以純化的TsPKA-C重組蛋白為抗原， 進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果顯示，TsPKA-C蛋白可與豬囊尾蝴陽(yáng)性血清特異性反應(yīng)，而與 陰性血清不反應(yīng)。說(shuō)明TsPKA-C蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性(圖8 )。
[0029] 3 討論 cAMP依賴(lài)性蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過(guò)對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的改變和激活蛋白激酶A 來(lái)調(diào)控機(jī)體的生命活動(dòng)。PKA是一種由四聚體(R2C2)組成的異構(gòu)酶，其中R是調(diào)節(jié)亞基，C是催 化亞基。每個(gè)調(diào)節(jié)亞基R上有2個(gè)cAMP結(jié)合位點(diǎn)，催化亞基具有催化底物蛋白質(zhì)特定絲氨酸/ 蘇氨酸殘基磷酸化的功能。PKA以兩個(gè)催化亞基結(jié)合兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基的全酶的形式存在時(shí)， 呈非活性狀態(tài)。當(dāng)2個(gè)調(diào)節(jié)亞基結(jié)合4分子的cAMP后，引起調(diào)節(jié)亞基的構(gòu)象改變，釋放出具有 活性的催化亞基，通過(guò)使底物蛋白質(zhì)特定絲/蘇氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代 謝和基因表達(dá)。PKA-C在進(jìn)化過(guò)程中非常保守，具有一些特征性結(jié)構(gòu)域，例ATP結(jié)合位點(diǎn) (Gly-X-Gly-X-X-Gly-X-Val)和絲/蘇氨酸激酶活性位點(diǎn)（Arg-Asp-Leu-Lys-x-x-Asn)。同 源序列比對(duì)顯示，TsPKA-C具有cAMP依賴(lài)性蛋白激酶催化亞基特征性保守結(jié)構(gòu)域:ATP結(jié)合 位點(diǎn)(GTGSFGRV)、Ser/Thr激活位點(diǎn)（RDLKPEN)、保守的磷酸化位點(diǎn)（188T)和PKA調(diào)節(jié)亞基結(jié) 合位點(diǎn)（LCGTPEY)。其中，188T是影響催化亞基活性關(guān)鍵性磷酸化位點(diǎn)。進(jìn)化分析表明， TsPKA-C與帶科絳蟲(chóng)的PKA-C位于同一分支，親緣關(guān)系較近，說(shuō)明本發(fā)明獲得的序列即為豬 帶絳蟲(chóng)PKA-C基因。
[0030] 本發(fā)明在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了豬帶絳蟲(chóng)的PKA-C基因，融合蛋白主要以包 涵體形式存在。利用豬囊尾蝴陽(yáng)性血清進(jìn)行的Western-blotting實(shí)驗(yàn)證明，重組TsPKA-C具 有良好的免疫反應(yīng)原性，有望用于豬囊尾蝴病的血清學(xué)診斷。ELISA檢測(cè)試驗(yàn)表明，重組 TsPKA-C具有良好的特異性，與細(xì)頸囊尾蝴、豬旋毛蟲(chóng)和豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。所 以，以TsPKA-C為抗原的診斷方法將可能解決豬囊尾蝴血清樣品診斷中細(xì)頸囊尾蝴感染導(dǎo) 致的交叉反應(yīng)問(wèn)題。此外，抗原表位預(yù)測(cè)表明，TsPKA-C蛋白具有9個(gè)潛在的線性B細(xì)胞表位， 說(shuō)明TsPKA-C還可能成為新型疫苗研發(fā)的候選分子。
[0031 ]蛋白激酶A的催化亞基是目前研究的熱點(diǎn)，尤其在治療癌癥、炎癥和其他免疫調(diào)控 紊亂等復(fù)雜疾病和寄生蟲(chóng)病防控方面是潛在的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。曼氏血吸蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)蛋白激 酶A催化亞基的研究表明，cAMP依賴(lài)性蛋白激酶在寄生蠕蟲(chóng)等多種生物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝 調(diào)控中也起著重要作用，有望成為抗寄生蟲(chóng)藥的藥物靶標(biāo)。利用RNAi干擾技術(shù)和PKA的抑制 劑處理血吸蟲(chóng)毛蝴和成蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)毛蝴失去運(yùn)動(dòng)活力，成蟲(chóng)的產(chǎn)卵量顯著下降，這一結(jié)果表明 cAMP依賴(lài)性蛋白激酶有望作為血吸蟲(chóng)病治療的祀標(biāo)。Nathalie Wurtz等在惡性皰原蟲(chóng)上研 究表明，cAMP依賴(lài)性蛋白激酶在調(diào)控寄生蟲(chóng)發(fā)育的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，體外酶抑制試驗(yàn) 表明，cAMP依賴(lài)性蛋白激酶是一種潛在的治療惡性瘧原蟲(chóng)的新型藥靶。以上研究表明，開(kāi)展 TsPKA相關(guān)研究，篩選TsPKA抑制劑來(lái)干預(yù)其活性或抑制TsPKA的表達(dá)，從而控制cAMP介導(dǎo)的 信號(hào)通路，阻斷豬囊尾蝴或豬帶絳蟲(chóng)的正常發(fā)育，開(kāi)發(fā)基于TsPKA-C的新型藥物，對(duì)有效防 控豬囊尾蝴病都具有重要意義。
[0032] 實(shí)施例2基于重組抗原TsPKA-C的豬囊尾蝴病ELISA檢測(cè) 以純化的TsPKA-C Iyg于37°C包被酶標(biāo)反應(yīng)板lh，包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖 液，包被抗原濃度為l〇μg/ml，封閉液為1%BSA，用PBST充分洗滌后分別加入倍比稀釋的豬陰 性血清及豬囊尾蝴、豬細(xì)頸囊尾蝴、豬旋毛蟲(chóng)和豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清，37 °C孵育Ih，PBST洗滌 三次后，加入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入DAB顯色，用濃硫酸 終止反應(yīng)后測(cè)定吸光度。檢測(cè)結(jié)果如表1所示。
[0033] 表1以TsPKA-C為包被抗原的ELISA檢測(cè)結(jié)果
從表1可以看出，TsPKA-C抗原僅與豬囊尾蝴陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，100倍稀釋的豬囊尾蝴 陽(yáng)性血清的平均OD值達(dá)1.08,而與豬陰性血清、豬細(xì)頸囊尾蝴陽(yáng)性血清、豬旋毛蟲(chóng)陽(yáng)性血 清、豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清反應(yīng)的OD值均在0.4以下，即P(陽(yáng)性)/N(陰性)=2.7>2。說(shuō)明以TsPKA-C為抗原的ELISA方法，具有很好的特異性，克服了現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)方法易與豬細(xì)頸囊尾蝴 存在交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)，是理想的豬囊尾蝴病特異性檢測(cè)抗原。
[0034] 實(shí)施例3對(duì)豬帶絳蟲(chóng)陽(yáng)性血清的鑒定方法 應(yīng)用實(shí)施例2中的試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)并分析檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)P(陽(yáng) 性)/N(陰性)>2時(shí)，檢測(cè)結(jié)果可判為陽(yáng)性，反之，則為陰性。
[0035] 最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 重組TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。2. 重組TsPKA-C蛋白作為豬帶絳蟲(chóng)/囊尾蝴檢測(cè)抗原的應(yīng)用；所述重組TsPKA-C蛋白的 氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。3. 重組TsPKA-C蛋白在制備豬囊尾蝴病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用;所述重組TsPKA-C蛋白的 氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。4. 一種豬囊尾蝴病ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中包被抗原為重組 TsPKA-C蛋白，所述重組TsPKA-C蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID No.2。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包括HRP標(biāo)記的兔抗豬 IgG〇6. -種豬帶絳蟲(chóng)ELISA檢測(cè)方法，所述方法不以專(zhuān)利法規(guī)定的疾病的診斷和治療為目 的，其特征在于：以純化的重組TsH(A-C蛋白lyg于37°C包被酶標(biāo)反應(yīng)板lh，封閉液為1% BSA，用TOST充分洗滌后分別加入待測(cè)樣品和豬陰性血清，37 °C孵育lh，PBST洗滌三次后，加 入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG，充分洗滌后再加入DAB顯色，用濃硫酸終止反應(yīng)后 測(cè)定吸光度，當(dāng)P(陽(yáng)性)/N(陰性)>2時(shí)，檢測(cè)結(jié)果可判為陽(yáng)性，反之，則為陰性。
【文檔編號(hào)】C12N9/12GK105861461SQ201610248923
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】駱學(xué)農(nóng), 劉光學(xué), 張少華, 郭愛(ài)疆, 鄭亞?wèn)|, 梁盼紅, 侯俊玲, 才學(xué)鵬
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所