本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種采用間接競爭ELISA法檢測動物源性過敏原牛血清白蛋白。

背景技術(shù)：

食物過敏是一種人體對食物中抗原物質(zhì)產(chǎn)生的由免疫介導(dǎo)的不良反應(yīng)，由此引發(fā)身體產(chǎn)生一系列臨床病理生理的變化，嚴重時可能產(chǎn)生過敏性休克，甚至危及生命。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，全世界約25％的人患有過敏性疾病，并且以每10年23倍的速度增加，在我國就有2億多食物過敏原患者。近年來，隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化、全球化進程不斷加快，人們生活節(jié)奏、方式不斷改變，生活壓力不斷加劇，以及食物種類、加工工藝越來越多，許多原來不過敏的人群逐漸演變成過敏性體質(zhì)，潛在過敏人群不斷擴大；同時，隨著科技、醫(yī)療水平的提高，許多原來未認識到的過敏現(xiàn)象被不斷揭示出來。食物過敏已成為全世界關(guān)注的公共衛(wèi)生熱點問題，而且這個問題正呈現(xiàn)出逐漸擴大的趨勢。

過敏性疾病屬于慢性病，所產(chǎn)生的直接或間接費用對過敏患者及其家庭，對衛(wèi)生系統(tǒng)和全社會有嚴重的影響。據(jù)報道約90％的食物過敏反應(yīng)主要是由常見的八類食物過敏原(大豆、花生、小麥、堅果、牛奶、蛋類、魚類和甲殼綱動物)引起。其中，牛奶是一類非常重要的過敏原，在兒童中發(fā)病率約為0.3％～7.5％，在成年人中的發(fā)病率則小于1％。牛奶過敏引起的癥狀表現(xiàn)在呼吸道、消化道和皮膚過敏等，也有可能成為其他過敏性疾病的誘因。因此，牛奶過敏問題日益受到國內(nèi)外學者的關(guān)注和研究。牛奶中引起過敏反應(yīng)的蛋白包括：β-乳球蛋白(β-LG)、酪蛋白(CAS)、α-乳白蛋白(α-LA)、牛血清白蛋白(BSA)、乳鐵蛋白(LF)以及免疫球蛋白(Igs)等。其中BSA的致敏性較為常見，美國約有50％牛乳過敏患者對BSA產(chǎn)生過敏，且其引發(fā)的過敏反應(yīng)不受其它過敏原的影響?，F(xiàn)還證實引起牛肉過敏的主要過敏原就是存在于血漿中的BSA。此外，BSA在醫(yī)學臨床及生物領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用，這使得過敏患者很難避免接觸過敏原BSA而遭受健康威脅。

迄今為止，針對食物過敏尚無有效的治療方法，在食品標簽上標識過敏原的存在是避 免過敏患者食入潛在過敏原的最有效的途徑。因此，為保證過敏原標簽、標識制度的實施，各國研究者紛紛開展了針對食物過敏原檢測方法的研究。但目前針對過敏原BSA的檢測方法報道較少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述存在的問題提供一種采用間接競爭ELISA法檢測動物源性過敏原牛血清白蛋白。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種采用間接競爭ELISA法檢測動物源性過敏原牛血清白蛋白，該方法包括以下步驟：

第一步，抗體的制備，具體的制備過程如下：

(1)動物免疫：選取雌性小鼠，將抗原BSA與弗氏完全佐劑混合首次皮下注射進行免疫，2～3周加強免疫1次，根據(jù)小鼠血清效價ELISA檢測結(jié)果，選取效價在1：10000以上的小鼠脾細胞進行細胞融合；

(2)細胞融合：將骨髓瘤細胞和經(jīng)BSA免疫后小鼠的脾細胞混合，通過PEG促使細胞融合；融合10d后開始進行篩選檢測；

(3)融合篩選及亞克隆：將融合后的細胞采用ELISA進行檢測，選取ELISA結(jié)果判斷為陽性的細胞；根據(jù)有限稀釋法將該陽性的細胞進行亞克隆，檢測至100％陽性后，挑出單克隆孔擴大培養(yǎng)定株，獲得1株穩(wěn)定分泌抗BSA單克隆抗體的雜交瘤細胞株9G6；

(4)腹水制備及純化：向預(yù)處理過的小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細胞株9G6，7～10d后取腹水，將所收集的腹水離心取上清液，準備好蛋白A瓊脂糖介質(zhì)并裝柱，將腹水上清液用PBS緩沖液稀釋10倍后緩慢上樣，上樣結(jié)束后用PBS緩沖液洗滌至紫外檢測儀達到最低值，甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體；

第二步，標準曲線的繪制，具體過程如下：

①抗原包被：將抗原稀釋，每孔100μL包被酶標板，37℃包被2h，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干；

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干；

③競爭結(jié)合：用封閉液將抗原稀釋為460ng/mL，然后做2倍梯度稀釋，共計23個濃度梯度，按每孔50μL將各梯度的稀釋液加入孔內(nèi)；隨即每孔加入50μL稀釋過的純化后 的抗體，與之前加入的不同濃度梯度的抗原標準溶液混合，室溫反應(yīng)2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物標記抗體，每孔100μL，室溫反應(yīng)1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值；

⑥標準曲線繪制：以抗原濃度的對數(shù)為橫坐標，各濃度孔的OD₄₅₀值為縱坐標，繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算半數(shù)效應(yīng)濃度；

⑦線性范圍確定：根據(jù)標準曲線呈明顯相關(guān)的區(qū)段，以標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，以抑制率[(A_標/A₀)×100％]為縱坐標繪制擬合后的標準曲線，其中A₀為零標準品孔OD₄₅₀值，A_標為各濃度標準品孔OD₄₅₀值；

第三步，將待測樣品采用如下測定程序進行測定：

①抗原包被：用包被緩沖液將待測樣品稀釋至工作濃度，加入酶標板，每孔100μL，37℃包被2h，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干；

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干；

③競爭結(jié)合：先將待測樣品加入酶標板，每孔50μL，再加入純化后的抗體，每孔50μL，室溫競爭反應(yīng)2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物標記抗體，每孔100μL，室溫反應(yīng)1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干；

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值；

⑥采用第二步擬合的標準曲線，計算得到待測樣品的濃度。

本發(fā)明技術(shù)方案的第二步①中，抗原包被濃度為0.25μg/mL。

本發(fā)明技術(shù)方案的第二步③中，抗體稀釋終濃度為1:32000。

本發(fā)明技術(shù)方案的第三步①中，工作濃度為0.25μg/mL。

附圖說明

圖1單克隆抗體SDS-PAGE電泳圖；

圖2單克隆抗體免疫分析結(jié)果；

圖3包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數(shù)對反應(yīng)靈敏度的影響；

圖4標準曲線；

圖5線性擬合曲線；

圖6特異性檢測。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此：

細胞及實驗動物

鼠骨髓瘤細胞SP2/0購自中國科學研究院上海細胞研究所。6～8周齡BALB/c雌性小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心。

主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)，購自美國Sigma公司；蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay kit)，美國Novagen公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液，購自美國Promega公司；羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體購自美國Proteintech公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Miliipore公司。主要設(shè)備

各種量程微量移液器，德國Eppendorf公司；酶標儀(iMark)、凝膠成像儀(Gel Doc XR)，美國Bio-Rad公司；CO₂恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC)，日本SANYO公司；臺式高速冷凍離心機(Allegra 64R)，美國Beckman公司；紫外可見分光光度計(SpectrumLab54型)，上海棱光技術(shù)有限公司；精密酸度計(PHS-2C)，上海雷磁儀器廠；ELISA酶標板(96孔)，美國Corning Incorporated公司)；電泳儀(DYY-6C)，北京六一儀器廠。

緩沖液及其它溶液配制

10×PBS緩沖液(0.1mol/L，pH7.4)：稱取80g NaCl，2g KCl，2.58g KH₂PO₄，29g Na₂HPO₄·12H₂O，加蒸餾水至1000mL，抽濾，室溫長期保存，用時取100mL加900mL蒸餾水配成1×PBS緩沖液。

包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)：稱取0.17g Na₂CO₃，0.258g NaHCO₃，加蒸餾水至100mL，4℃保存。

洗滌液(PBST，pH7.4)：含0.05％(v/v)Tween-20的0.01mol/L，pH7.4PBS。

封閉液：含10％(w/v)馬血清的pH7.4PBST，4℃保存。

終止液(2mol/L H₂SO₄溶液)：量取11.1mL濃H₂SO₄，加入到80mL蒸餾水中，冷卻后，定容至100mL。

動物免疫

選取6只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，將抗原(BSA)與弗氏完全佐劑混合首次免疫，皮下注射100μg，2～3周加強免疫1次，采用弗氏不完全佐劑與抗原混合，皮下注射100μg。四免后采血檢測，根據(jù)小鼠血清效價ELISA檢測結(jié)果，選取效價在1：10000以上的小鼠進行122細胞融合。未免疫的小鼠血清為陰性血清，-20℃凍存。

細胞融合

融合前1周準備好Sp2/0骨髓瘤細胞。小鼠在融合前3d終免，腹腔注射抗原100μg。融合當天用頸椎脫臼法安樂死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min，無菌取脾臟，經(jīng)過研磨、過網(wǎng)、沖洗、離心等操作，收集脾細胞計數(shù)?；旌瞎撬枇黾毎推⒓毎?，使骨髓瘤細胞同脾細胞數(shù)量比在1:20為宜。通過PEG促使細胞融合，把融合的細胞鋪到96孔板中，每孔100μL。然后將細胞培養(yǎng)板放到CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后4d觀察，雜交瘤細胞克隆率在50％以上，細胞生長狀態(tài)良好。融合10d后開始進行篩選檢測。

融合篩選及亞克隆

(1)融合篩選：吸取細胞上清100μL/孔進行間接ELISA檢測，根據(jù)ELISA結(jié)果判斷陽性孔(樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性孔)，選擇其中較高讀數(shù)的10株陽性細胞進行亞克隆。

(2)亞克隆：根據(jù)有限稀釋法進行亞克隆，檢測至100％陽性后，挑出單克隆孔擴大培養(yǎng)定株，獲得1株穩(wěn)定分泌抗BSA單克隆抗體的雜交瘤細胞株9G6。

腹水制備及純化

(1)腹水制備：向預(yù)處理過的小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細胞。按每只小鼠注射1×10⁶個細胞的量，注射雜交瘤細胞。7～10d，用注射器針頭小心采出盡可能多的液體。小鼠在最后一次采集后頸椎脫位法處死。

(2)純化：將所收集的腹水離心取上清，準備好蛋白A瓊脂糖介質(zhì)并裝柱，將腹水用PBS緩沖液稀釋10倍后緩慢上樣，上樣結(jié)束后用PBS緩沖液洗滌至紫外檢測儀達到最低值，甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，立即在PBS緩沖液中進行4℃透析過夜，隔日進行濃度、純度和效價的測定。

抗BSA單克隆抗體的效價測定

①抗原包被：用包被緩沖液將抗原稀釋至5μg/mL，加入酶標板，每孔100μL，4℃包 被過夜，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干。

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干。

③抗體檢測：加入待測抗體，每孔100μL，室溫競爭反應(yīng)2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:2500倍稀釋)，每孔100μL，室溫反應(yīng)1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，通過間接ELISA法測定其OD₄₅₀值。

單克隆抗體的蛋白免疫印跡分析

過敏原溶液(0.5mg/mL)經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，用10％馬血清室溫封閉2h(或4℃過夜)，用PBST洗滌3次，加入制備的抗BSA單克隆抗體(1:1000倍稀釋)，室溫作用1.5h，用PBST洗滌3次，加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:5000倍稀釋)，室溫作用1.5h，PBST洗滌3次，于TMB顯色液中顯色2min。

將純化后抗體進行SDS-PAGE電泳，可見抗體純化后純度較高，在95％以上(圖1)。純化的單克隆抗體有兩條條帶，一條是分子量約為25KD的輕鏈，一條是分子量約為50KD的重鏈。將所純化的抗體進行蛋白免疫印跡反應(yīng)分析，試驗結(jié)果表明單克隆抗體可與過敏原BSA發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，證明可用所制備的單克隆抗體建立免疫學檢測方法，以檢測食品中BSA成分(圖2)。

最佳包被抗原濃度和抗體稀釋度的確定

①抗原包被：用包被緩沖液將抗原BSA分別稀釋為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0μg/mL，橫向加入酶標板，每孔100μL，37℃包被2h(或4℃包被過夜)，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干。②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干。③抗原抗體反應(yīng)：用封閉液將抗BSA單克隆抗體分別進行1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16000、1/32000、1/64000稀釋，縱向加入酶標板，每孔100μL，同時設(shè)置陰性對照，室溫反應(yīng)2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:2500倍稀釋)，每孔100μL，室溫反應(yīng)1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值。

用矩陣法確定最佳包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數(shù)。一般來說，在OD值為1.0時， 誤差相對最小，所以選擇OD₄₅₀值為1.0，陰性對照小、陽性對照/陰性對照值大的抗原包被濃度及抗體稀釋倍數(shù)為理想工作濃度，結(jié)果見表1和圖3?？乖粷舛冗^高或過低均會影響反應(yīng)的靈敏度，濃度過低，抗原包被量不足，微孔內(nèi)吸附的抗原少，可供抗體結(jié)合的抗原決定簇少；包被濃度過高，微孔內(nèi)吸附的抗原多，產(chǎn)生空間位阻，同樣可控抗體結(jié)合的抗原決定簇少，從而影響包被抗原進一步與抗體的結(jié)合，降低靈敏度。因此確定本試驗的最適包被濃度為0.25μg/mL，抗體工作濃度為1:32000。

表1最佳包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數(shù)的確定

標準曲線的制作及線性范圍的確定

①抗原包被：將抗原BSA稀釋至0.25μg/mL，每孔100μL包被酶標板，37℃包被2h(或4℃包被過夜)，棄包被液，用PBST洗滌5次，拍干。

②封閉：按每孔200μL加入封閉液，室溫封閉2h，棄封閉液，用PBST洗滌5次，拍干。

③競爭結(jié)合：用封閉液將抗原稀釋為460ng/mL，然后做2倍梯度稀釋，共計23個濃度梯度(含460ng/mL)，按每孔100μL將各梯度的稀釋液加入孔內(nèi)；隨即每孔加入100μL最適濃度的抗BSA單克隆抗體，室溫反應(yīng)2h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

④加酶標二抗：加入羊抗鼠IgG辣根過氧化物(HRP)標記抗體(1:2500倍稀釋)，每孔100μL，室溫反應(yīng)1h，棄溶液，用PBST洗滌5次，拍干。

⑤顯色：加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光顯色30min，加終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD₄₅₀值。

⑥標準曲線繪制：以抗原濃度的對數(shù)為橫坐標，各濃度孔的OD₄₅₀值為縱坐標，繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

⑦線性范圍確定：根據(jù)標準曲線呈明顯相關(guān)的區(qū)段，以標準品濃度的對數(shù)為橫坐標， 以抑制率[(A_標/A₀)×100％]為縱坐標繪制標準曲線，并根據(jù)曲線的具體情況選擇最佳的擬合模型，其中A₀為零標準品孔OD₄₅₀值，A_標為各濃度標準品孔OD₄₅₀值。

在上述最佳包被抗原工作濃度和抗體稀釋倍數(shù)條件下，通過間接競爭ELISA程序，以不同待測抗原濃度梯度的對數(shù)為橫坐標，各濃度孔的OD₄₅₀值為縱坐標，作圖得標準曲線(圖4)。根據(jù)標準曲線公式算出IC₅₀為52.3ng/mL。本試驗還根據(jù)標準曲線呈明顯相關(guān)的區(qū)段，選擇合適的抗原濃度梯度(3.5938～460ng/mL)，確定其線性關(guān)系，見圖5。結(jié)果顯示，擬合的線性回歸直線方程為y＝－47.4489x+135.8663(R²＝0.9973)，符合線性關(guān)系的判定標準。

靈敏度試驗

隨機選擇10個孔做零標準品間接競爭ELISA檢測，求所得10個孔OD₄₅₀值的均值和標準差(SD)，在標準曲線上對應(yīng)的標準品濃度即為此方法的靈敏度(最低檢測限)。

靈敏度測定結(jié)果見表2。在標準曲線上對應(yīng)的標準品濃度為6.71ng/mL，即最低檢測限。

表2靈敏度測定

特異性試驗

將競爭結(jié)合步驟中將馬血清、豬血清、兔血清、羊血清、狗血清、雞血清、小鼠血清(陰性對照)分別稀釋，各取100μL，分別與100μL抗BSA單克隆抗體一起加入酶標板，利用間接競爭ELISA檢測其交叉反應(yīng)性。

按照本試驗建立的方法分別對馬血清、豬血清、兔血清、羊血清、狗血清、雞血清和小鼠血清(陰性對照)進行交叉反應(yīng)檢測。結(jié)果表明該方法特異性良好，與所檢測的其他種屬血清白蛋白無交叉反應(yīng)(圖6)。

精密度試驗

本試驗嚴格控制反應(yīng)條件，按照標準進行操作，對建立的間接競爭ELISA檢測方法進行精密度測試，結(jié)果以批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)表示該方法的精密度。分別設(shè)3個濃度梯度的待測樣品，同一樣品測定兩個批次，每個批次重復(fù)測定32次。以每批次內(nèi)3 個水平變異系數(shù)的均值代表各批內(nèi)變異系數(shù)，總的批內(nèi)變異系數(shù)為兩批次批內(nèi)變異系數(shù)之均值。批間變異系數(shù)是將兩批次每個水平按64次重復(fù)計算變異系數(shù)，再取平均值。

分別設(shè)200、100和50ng/mL 3個水平標準品濃度。分兩批每批32個重復(fù)，測定結(jié)果見表3。ELISA方法第一批次批內(nèi)變異系數(shù)為3.21％，第二批次批內(nèi)變異系數(shù)為3.03％，總的批內(nèi)變異系數(shù)為3.12％。批間變異系數(shù)為3.12％。本檢測方法批內(nèi)與批間的變異系數(shù)均小于5％，可知本方法精確度較高，重復(fù)性較好。

表3精密度測定

1.2.8回收率試驗

將不同溶度的BSA與小麥粉蛋白提取液中攪拌均勻，作為待測樣品，檢測待測樣品中BSA濃度，根據(jù)如下公式計算回收率。以小麥粉蛋白提取液作為空白對照檢測。

回收率(％)＝(測量質(zhì)量溶度/實際質(zhì)量溶度)×100

將不同濃度的BSA標準品添加至小麥粉蛋白提取液中，制備不同污染濃度的樣品，以間接競爭ELISA法檢測樣品中BSA的回收率，每個濃度重復(fù)32次，見表4。當添加BSA的質(zhì)量濃度在50～200ng/mL范圍時，隨著樣品中BSA質(zhì)量濃度的增加，回收率變異系數(shù)減小，精確度提高，可知本研究的間接競爭ELISA法滿足檢測要求。

表4 BSA加標回收率測定