本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及gh625-zn7mt3的創(chuàng)新融合蛋白的化學(xué)組成、制備方法，及其在防治阿爾茨海默癥和在制備抗阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默癥（alzheimer’sdisease,ad）,俗稱老年癡呆癥，是由德國學(xué)者alosialzheimer于1907年首次報(bào)道。它是一種常發(fā)于老年人群中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病。ad發(fā)病率與年齡密切相關(guān)，65歲以上人群中發(fā)病率以每年0.5%的速度增長，并且女性比男性發(fā)病多。目前全球共有約4750萬ad患者，其臨床表現(xiàn)為不同程度的記憶力喪失，語言困難，定向力障礙，認(rèn)知能力降低，人格及行為和感情活動(dòng)異常，進(jìn)行性智力障礙，最后全身衰竭，并發(fā)感染而亡。目前ad已經(jīng)成為繼心臟病、腫瘤和中風(fēng)之后的第四位死亡原因。ad最典型的病理特征是：大腦皮層和海馬組織內(nèi)出現(xiàn)大量的老年斑（senileplaques,sp）、神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillarytangles,nfts）、神經(jīng)元數(shù)量減少、顆?？张葑冃院吐陨窠?jīng)炎癥。ad的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，可能是多種因素相互作用的結(jié)果。迄今為止，其確切的發(fā)病機(jī)理還是一個(gè)未解之謎，但在近三十年的研究證據(jù)表明，淀粉樣多肽（amyloid-betapeptide,abeta）、淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursorprotein,app）、金屬硫蛋白（metallothionein,mt3）及其所參與調(diào)節(jié)的金屬離子和相關(guān)的ros內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡與ad的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

國內(nèi)外已對ad的神經(jīng)病理機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。70年代中期以來，大量藥理學(xué)研究集中于提高突觸裂隙中的乙酰膽堿水平，發(fā)現(xiàn)了一系列乙酰膽堿酯酶的抑制劑類藥物。然而，這種治療僅是緩解癥狀的治標(biāo)療法。80年代中期以來，許多研究圍繞abeta的形成、聚集以及清除機(jī)制，或abeta的神經(jīng)毒性機(jī)制進(jìn)行。以abeta為靶標(biāo)治療ad病的藥物有abeta前體蛋白app分泌酶的抑制劑、抗abeta聚集的金屬離子螯合劑和abeta的抗體等。然而，2008年lancet報(bào)道，abeta疫苗能有效地清除腦內(nèi)abeta斑，但并不能阻止癡呆癥狀的發(fā)展。這一報(bào)道對圍繞abeta斑的治療研究提出了疑問。這些結(jié)果說明，abeta斑本身并不是神經(jīng)細(xì)胞毒性的主要根源，可能的機(jī)制可能是，abeta斑在形成過程中產(chǎn)生的ros對神經(jīng)細(xì)胞造成毒性。運(yùn)用同步輻射x-射線熒光分析發(fā)現(xiàn)，老年斑中有高濃度的金屬離子聚集，如銅、鐵、鋅離子的含量分別高達(dá)1.0、0.4和1.0mm。大腦中這些過渡金屬離子異常高濃度聚集及其相關(guān)的蛋白質(zhì)（如abeta、tau蛋白等）異常聚集是多種神經(jīng)退行性疾病的共有特征。因此，金屬離子與神經(jīng)醫(yī)學(xué)高度關(guān)聯(lián)的這一領(lǐng)域受到科學(xué)家和神經(jīng)醫(yī)學(xué)科學(xué)家的極大關(guān)注。大量研究報(bào)道顯示：腦神經(jīng)中某些過渡金屬離子（cu、fe、zn）的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡是ad病人神經(jīng)元死亡的主要起因之一；腦中這些過渡金屬離子，特別是能夠進(jìn)行單電子氧化還原的cu和fe離子的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，以及有關(guān)的活性氧物種（ros）水平的調(diào)控很可能是治療ad病的有效策略。

金屬硫蛋白-3（metallothionein-3,mt3），在大腦中特異性表達(dá)。mt3由68個(gè)氨基酸組成，其中就包括了20個(gè)保守的半胱氨酸。它的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)金屬簇，總共能夠結(jié)合7個(gè)二價(jià)的金屬離子。n-端beta-結(jié)構(gòu)域中的m3s9和存在于c-端的alpha-結(jié)構(gòu)域的m4s11。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間通過kks三個(gè)氨基酸連接。大腦中mt3大量分布于神經(jīng)星形細(xì)胞，但是在ad患者腦中，mt3的表達(dá)量明顯下降約三分之一。mt3表達(dá)的受損可能與ad癥狀的發(fā)生或神經(jīng)功能損傷有關(guān)。mt3還可以將no信號轉(zhuǎn)化為鋅離子信號。no通過與mt3中結(jié)合鋅的半胱氨酸直接發(fā)生s-亞硝基反應(yīng)或者與s-亞硝基硫醇發(fā)生亞硝基轉(zhuǎn)換反應(yīng)，將鋅離子zn²⁺從mt3中釋放出來。

鋅離子是大腦中的信使，大腦具有最高的鋅含量，最典型的是在灰質(zhì)中可達(dá)到約150μm。大腦中處于自由離子形式的鋅大量富集在許多谷氨酸能神經(jīng)末端（10-15%）。當(dāng)鋅被釋放后進(jìn)入突觸間隙，在突觸間隙內(nèi)離子濃度可上升至毫摩爾數(shù)量級。和銅離子一樣，釋放的鋅離子在突觸間隙內(nèi)與神經(jīng)受體如nmda相互作用，同時(shí)也會(huì)作用于多種神經(jīng)元離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)子來調(diào)控神經(jīng)信號傳導(dǎo)。多種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（znts）以及金屬硫蛋白mts等結(jié)合胞質(zhì)中的鋅離子，從而阻止游離的鋅離子轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸緺顟B(tài)。相比于銅離子，血漿中的鋅離子含量從出生后逐步下降，且ad患者的血漿中鋅離子含量比同齡正常人有進(jìn)一步的減少。盡管鋅離子總含量與大腦年齡的老化沒有關(guān)系，然后已知一些特定區(qū)域含有高濃度的z鋅離子，如高谷氨酸能支配的海馬區(qū)，隨著年齡的增長表現(xiàn)出z鋅離子含量的降低?，F(xiàn)在的多篇文獻(xiàn)報(bào)道，大腦補(bǔ)鋅可能是防治老年癡呆癥的有效策略之一。

金屬硫蛋白mt3是神經(jīng)元內(nèi)部鋅的主要來源，近期的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合于mt3上的鋅離子能夠同abeta-cu復(fù)合物發(fā)生金屬置換，從而抑制了abeta還原二價(jià)銅離子cu²⁺所產(chǎn)生的氧化損傷。ad腦中鋅離子失衡，可能源自鋅離子輸出的抑制。小鼠動(dòng)物研究指出，系統(tǒng)性鋅離子的缺失引起了腦中鋅離子的滯留，而這種作用是通過抑制胞內(nèi)鋅離子輸出蛋白znt1所致。

神經(jīng)突觸中，mt3、abeta和銅金屬離子可能形成一種動(dòng)態(tài)平衡。在znt3的作用下，zn²⁺和谷氨酸同時(shí)聚集于前突觸囊泡中，zn²⁺在突觸間隙中濃度高達(dá)0.3mm，而nmda介導(dǎo)的激活使銅離子在突觸后釋放，轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸間隙，隨之銅離子在突觸間隙的濃度達(dá)到毫摩爾級。反過來銅和鋅都可以抑制nmda受體的應(yīng)答反應(yīng)。abeta經(jīng)淀粉樣蛋白前體蛋白app酶切后釋放到突觸間隙后可以與間隙內(nèi)的銅發(fā)生反應(yīng)，然后交聯(lián)形成可溶性的abeta聚集體甚至形成淀粉樣沉淀。mt3由鄰近的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放進(jìn)入突觸間隙，可以緩解這一不利反應(yīng)的發(fā)生。神經(jīng)金屬離子、abeta、mt3在突觸間隙形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，這種平衡可阻止abeta在突觸間隙中形成纖維沉淀。適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)突觸活動(dòng)可能會(huì)促進(jìn)這一平衡系統(tǒng)，但是過度的或異常的神經(jīng)活動(dòng)可能對這一系統(tǒng)有害。調(diào)控腦神經(jīng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)[金屬離子-abeta-mt3]形成有益的平衡可能是治療老年癡呆癥的創(chuàng)新思路，對ad病的調(diào)控治療有重要意義。

維持大腦活性氧物種（ros）內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡是大腦正常生理功能的必要條件。大腦消耗人體五分之一的氧，而且抗氧化劑和相關(guān)酶的濃度相對較低又富含不飽和脂肪酸，易受氧化損傷。正常情況下，細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡對抗氧化攻擊，但隨著年齡增長，細(xì)胞保持穩(wěn)態(tài)平衡的能力減低，導(dǎo)致自由基積累，線粒體功能失調(diào)，神經(jīng)元損傷。當(dāng)ros的數(shù)量超過了神經(jīng)元細(xì)胞對抗的能力時(shí)就會(huì)發(fā)生氧化脅迫，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體機(jī)能障礙以及神經(jīng)元細(xì)胞損傷。線粒體中缺乏組蛋白以及線粒體中dna修復(fù)功能的減弱都是造成線粒體易產(chǎn)生氧化脅迫的原因。銅離子等被認(rèn)為是ad中氧化脅迫發(fā)生的重要因素。在ad病中，氧化損傷的增加不是最終的結(jié)果，而是具有起始作用。ad的初期，神經(jīng)細(xì)胞盡管氧化損傷增加，但實(shí)際上仍然是處于內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的。隨著ad病的發(fā)展及相應(yīng)的ros水平的增加，abeta-金屬化合物和過度磷酸化的tau蛋白將不能有效的被去除，導(dǎo)致淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)的不可控地增加，而這又會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)活性物質(zhì)的進(jìn)一步增多，這種惡化的反饋機(jī)制最終造成神經(jīng)元功能喪失。

因?yàn)閍d大腦中穩(wěn)態(tài)調(diào)控蛋白mt3的表達(dá)量下降至少三分之一，補(bǔ)充mt3是防治ad的有效策略之一。但是，mt3是一個(gè)分子量7000的多肽，很難穿過血腦屏障。本發(fā)明運(yùn)用能夠穿過細(xì)胞膜和血腦屏障的跨膜肽gh625與mt3重組，制備了融合蛋白gh625-mt3，然后經(jīng)過金屬重組而組成gh625-zn7mt3。該創(chuàng)新組成的融合金屬蛋白能有效通過血腦屏障。以補(bǔ)充阿爾茨海默病大腦中缺少的金屬穩(wěn)態(tài)調(diào)控蛋白和增加神經(jīng)營養(yǎng)元素鋅為目的，通過生物基因工程和化學(xué)合成相結(jié)合的復(fù)合方法，制備了gh625-zn7mt3重組融合金屬蛋白。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究了gh625-zn7mt3在腦神經(jīng)中的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控功能，研究發(fā)現(xiàn)，gh625-zn7mt3可以改善阿爾茲海默癥模型小鼠的認(rèn)知和記憶能力，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制淀粉樣蛋白沉積等，能有效阻止老年癡呆癥病情發(fā)展。因此，gh625-zn7mt3在防治老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病方面有重要應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種能穿越血腦屏障的創(chuàng)新融合金屬蛋白gh625-zn7mt3及其制備方法。該重組融合金屬蛋白gh625-zn7mt3是通過基因重組和化學(xué)合成相結(jié)合的復(fù)合方法制備。重組融合金屬蛋白gh625-zn7mt3由兩個(gè)多肽（病毒herpessimplexvirus1（單純皰疹病毒）的糖蛋白中的一段跨膜序列g(shù)h625和金屬硫蛋白mt3）通過融合構(gòu)成融合蛋白gh625-mt3，然后經(jīng)過金屬重組而組成gh625-zn7mt3。

本發(fā)明的目的在于提供了能穿越血腦屏障的創(chuàng)新融合金屬蛋白gh625-zn7mt3，該創(chuàng)新蛋白具有調(diào)節(jié)大腦金屬內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的功能，并能有效提供信使金屬離子鋅。該發(fā)明換提供了創(chuàng)新融合金屬蛋白gh625-zn7mt3的制備方法，及其在防治阿爾茨海默癥和制備抗阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究表明，gh625-zn7mt3可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，抑制淀粉樣蛋白聚集，改善認(rèn)知記憶能力，具有明顯的抗阿爾茨海默癥發(fā)展的作用，可用于制備抗阿爾茨海默癥藥物。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例，具體說明本發(fā)明的內(nèi)容。在本發(fā)明中，以下所述的實(shí)施例是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：gh625-zn7mt3的制備和表征

所有生物化學(xué)試劑、試劑盒，除特別說明外，均購自sigama或invitrogen公司。

（1）smt-mt3質(zhì)粒構(gòu)建

人金屬硫蛋白mt3和融合標(biāo)簽蛋白基因smt3購自廣州福能基因公司?；蜉d體質(zhì)粒mbpht-mcherry-2購自invitrogen公司，基因引物合成由上海杰瑞生物技術(shù)公司完成，利用設(shè)計(jì)的引物p1、p2（擴(kuò)增smt3基因）和p3、p4（擴(kuò)增mt3基因）擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測驗(yàn)證并膠回收正確的片段。產(chǎn)物1和產(chǎn)物2按相同濃度比例混合后作為模板，利用p1和p4引物擴(kuò)增出smt3-mt3序列，其5’端帶有bamhi酶切位點(diǎn)ggatcc，3’端帶有hindiii酶切位點(diǎn)aagctt。設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物如下：

p1:5’-cgcggatccatggctagcatgtcggactc-3’

p2:5’-ggcaggtctcagggtccataccaccaatctgttctc-3’

p3:5’-gagaacagattggtggtatggaccctgagacctgcc-3’

p4:5’-cgcaagctttcactggcagcagctgcac-3’

分別將載體mbpht-mcherry-2和擴(kuò)增的smt3-mt3基因序列用bamhi和hindiii內(nèi)切酶，在37℃雙酶切6小時(shí)，用1%瓊脂糖凝膠檢測驗(yàn)證酶切成功，膠回收酶切片段。酶切的大小片段按1：3混合，用t4連接酶在16℃連接8小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到top10克隆感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行pcr鑒定和測序證明，成功構(gòu)建了融合蛋白smt3-mt3表達(dá)質(zhì)粒。

（2）smt3-gh625-mt3表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以smt3-mt3質(zhì)粒為模板，利用toyobo突變試劑盒，設(shè)計(jì)引物（p5、p6）將gh625的基因序列（h2n-hglastltrwahynalirafggg-conh2）插入到mt3序列的n端，引物如下：

p5:5’-attacaacgcactaatccgggctttcggtggtggaatggaccctgagacctgccc-3’

p6:5’-gtgcccatcgagtcagcgttgaagcgagtcctagaccaccaatctgttctctgt-3’

具體實(shí)驗(yàn)操作如下：

（a）反向pcr

①將引物都稀釋為10pmol/μl，模板質(zhì)粒dna濃度調(diào)整至50ng/ul。

②按以下配比配制pcr反應(yīng)液。

滅菌蒸餾水35μl

10×bufferforipcr5μl

2mmdntps5μl

引物1（10pmol/ul）1.5μl

引物2（10pmol/ul）1.5μl

plasmiddna（50ng/ul）1μl

kod-plus-1μl

totalvolume50μl

③按以下條件進(jìn)行pcr。

194℃2min

298℃10sec

368℃6min

4重復(fù)步驟2至10個(gè)循環(huán)

4℃hold

（b）用dpni對模板質(zhì)粒dna進(jìn)行消化

①pcr反應(yīng)結(jié)束后，在pcr反應(yīng)液（總量50μl）中加入2uldpni，輕輕混勻。

②spindown，37℃反應(yīng)1小時(shí)。

（c）pcr產(chǎn)物自身環(huán)化

①取出t4polynucleotidekinase和ligationhigh，冰浴融解。融解后，將ligationhigh輕輕攪拌均勻，spindown。

②取一個(gè)新的pcr管，如下配制反應(yīng)液：

dpni處理后pcr產(chǎn)物2μl

滅菌蒸餾水7μl

ligationhigh5μl

t4polynucleotidekinase1μl

totalvolume15μl

③輕輕攪拌均勻，spindown。

④16℃反應(yīng)1小時(shí)。

⑤取部分反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆，測序。

測序成功的質(zhì)粒其表達(dá)的蛋白為smt3-gh625-mt3融合蛋白，載體是pet22b(+)，抗性為卡那霉素。

（3）smt3-gh625-mt3蛋白的生物表達(dá)和gh625-mt3的純化

將構(gòu)建成功的smt3-gh625-mt3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌bl21（de3）中，挑取單菌落于3mllb培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u床培養(yǎng)8小時(shí)后以1：100的比例接入50ml的lb培養(yǎng)基中，在37℃搖床中培養(yǎng)6小時(shí)后再以1：100的比例接入2yt培養(yǎng)基中（以上培養(yǎng)基均含有50μg/ml卡那霉素）。37℃200rpm搖床培養(yǎng)至od值為0.6~0.8時(shí)，加入iptg誘導(dǎo)劑至終濃度為0.4mm，于16℃過夜表達(dá)。

融合蛋白的純化過程如下：離心收集的菌體加tris緩沖液（20mmtris-hcl，500mmnacl，10%甘油，5mmβ-巰基乙醇，ph=7.5）懸?。?ml/g菌體），加少量溶菌酶、dna酶、1%pmsf，攪拌溶菌并用超聲破碎機(jī)破菌，然后，用高速離心機(jī)離心（12000rpm、離心30min），取上清液穿流已經(jīng)平衡好的ni-nta親和柱，使得帶有his標(biāo)簽的融合蛋白掛柱。用含20mm咪唑的tris緩沖液洗脫雜蛋白，至考馬斯亮藍(lán)檢測不變色為止。用含200mm咪唑的tris緩沖液洗脫融合蛋白。洗脫的融合蛋白裝入透析袋中透析，透析液為tris緩沖液，之后按1%的比例加入sumo酶酶切6小時(shí)，酶切產(chǎn)物穿流已經(jīng)平衡好的ni-nta柱，共穿流三次除去標(biāo)簽蛋白及sumo酶，再用superdex-g75凝膠分子篩進(jìn)一步除去雜蛋白，純化得到的gh625-mt3蛋白經(jīng)15%sds－page膠檢測純度達(dá)95%以上。

（4）gh625-zn7mt3的制備

取2mlgh625-mt3融合蛋白溶液（5mg/ml），加入dtt至終濃度為5mm，4℃還原2小時(shí)。加入6m的hci溶液調(diào)節(jié)ph至l-2，酸化l小時(shí)后，過superdexg-25柱除去雜金屬離子，用ph2.0的hci溶液洗脫gh625-mt3蛋白。流出液用紫外光譜儀檢測，收集。脫金屬的gh625-mt3蛋白溶液脫氣后立即載入?yún)捬跏痔紫渲?，加入dtt至終濃度為5mm，加20倍于蛋白濃度的zncl2，慢慢滴加2m的tris堿調(diào)節(jié)ph至8-9，室溫下放置過夜，然后透析去除過剩的鋅離子，蛋白濃縮后得到融合金屬蛋白gh625-zn7mt3。

（5）gh625-zn7mt3的金屬含量測定

取一定量的重組好的融合蛋白gh625-zn7mt3，加少量濃硝酸于65℃硝化過夜，稀釋10倍后在電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（icp-oes）上測定金屬zn的含量。結(jié)果顯示重組后每摩爾gh625-zn7mt3融合蛋白含有的zn為7±0.2摩爾。

（6）gh625-zn7mt3內(nèi)毒素的去除

gh625-zn7mt3先用超濾膜截留聚集態(tài)的內(nèi)毒素（lps），再用polymyxinb親和柱除去殘留的內(nèi)毒素。

實(shí)施例2：阿爾茨海默癥模型小鼠及gh625-zn7mt3藥物治療

app/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠購自北京中科澤晟生物技術(shù)有限公司，5月齡，體重24-26g。受試藥物名稱：gh625-zn7mt3；溶媒：生理鹽水；配制方法：臨用前用生理鹽水溶液配制成所需濃度的溶液。小鼠腹腔給藥：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為app/ps1二轉(zhuǎn)基因小鼠。給藥劑量為2mg/kg/天，給藥6周后取血清和腦組織。

實(shí)施例3：用morris水迷宮驗(yàn)證阿爾茨海默癥小鼠認(rèn)知能力

裝置:圓形水池，直徑1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水溫保持在23±2℃；池壁上標(biāo)記四個(gè)等距離點(diǎn)n、e、s、w作為試驗(yàn)的起始點(diǎn)，水池分為四個(gè)象限，在第三象限中央放置平臺(平臺與池壁圓心距離相等)；沒于水下1cm，使平臺不可見。水池周圍貼有豐富的參照線索(不同顏色三角形、四方形、圓、菱形置于各個(gè)象限)且保持不變，供小鼠用來定位平臺。

定位航行試驗(yàn):試驗(yàn)共歷時(shí)6天，每天定于固定時(shí)間段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練開始時(shí)，將平臺置于第一象限，從池壁四個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺的時(shí)間和游泳路徑，4次訓(xùn)練即將小鼠分別從四個(gè)不同的起始點(diǎn)（不同象限）放入水中。小鼠找到平臺后或90秒內(nèi)找不到平臺(潛伏期記為90秒)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)到平臺，在平臺上休息10秒，再進(jìn)行下一次試驗(yàn)。

空間探索試驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)結(jié)束24h后，撤除站臺。然后把小鼠由第三象限放入水中，記錄鼠在180s內(nèi)的游泳路徑，記錄鼠在目標(biāo)象限（第三象限）的停留時(shí)間和穿越原站臺所在位置的次數(shù)，觀察受試鼠的空間定位能力。數(shù)據(jù)用spss10.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（one-wayanova）檢驗(yàn)比較給藥效果的顯著性。

結(jié)果表明：經(jīng)gh625-zn7mt3治療的阿爾茨海默癥小鼠具有認(rèn)知能力明顯改善的現(xiàn)象。相比對照組，給藥組ad鼠在第三象限停留時(shí)間和穿越原站臺所在位置的平均次數(shù)幾率有明顯提高（從50%提高到了78%），說明gh625-zn7mt3能有效地阻止阿爾茨海默癥小鼠病情發(fā)展。

實(shí)施例4：gh625-zn7mt3對阿爾茨海默癥小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)控

ad鼠給藥（gh625-zn7mt3）6周后，取小鼠腦組織，在4％多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋，在切片機(jī)上切成4微米厚的組織切片，然后用蘇木精和曙紅（he）染，在光學(xué)顯微鏡（leica,germany）下觀察海馬體ca1區(qū)的細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示（a：為正常鼠對照組，b：為ad鼠模型組，c：為ad鼠模型給藥組）。ad模型鼠腦組織ca1區(qū)的細(xì)胞變形皺縮，觀察不到染色質(zhì)及核糖體，給藥gh625-zn7mt3后細(xì)胞形態(tài)趨于正常。使用gh625-zn7mt3后，能夠抑制小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞的退化變性，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)正常功能。

實(shí)施例5：gh625-zn7mt3抑制阿爾茨海默癥小鼠腦淀粉樣蛋白聚集

本實(shí)驗(yàn)為硫黃素s染色實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)流程為：ad鼠給藥（gh625-zn7mt3）6周后，取小鼠腦組織，固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，tbs洗三次，0.3%硫黃素s（溶于50%乙醇）滴于組織上，室溫孵育10min，50%乙醇洗三次，tbs清洗，陰干，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。硫磺素s本身自帶綠色熒光，能特異性的與成熟的abeta淀粉樣蛋白結(jié)合，用于標(biāo)記腦組織中淀粉樣蛋白的含量和分布，評價(jià)阿爾茲海默癥的病理狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示（a為對照組，b為ad鼠模型組，c為ad鼠模型給藥組）。給藥后abeta淀粉樣蛋白較模型組有明顯減少。gh625-zn7mt3能夠顯著降低ad鼠腦內(nèi)abeta蛋白的沉積。

實(shí)施例6：gh625-zn7mt3抑制阿爾茨海默癥小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡

tunel凋亡試劑盒（g3250試劑盒）購自promega公司。小鼠給藥6周后，取小鼠腦組織，固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，pbs洗滌，蛋白酶k室溫孵育10min，切片pbs洗滌后甲醛固定，加入平衡緩沖液預(yù)平衡后洗滌，之后加入孵育緩沖液（內(nèi)含平衡緩沖液，核苷混合物和rtdt酶），37℃避光孵育1h，終止反應(yīng)后共染dapi，陰干，封片，激光顯微鏡拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示（a為對照組，b為ad鼠模型組，c為ad鼠模型給藥組），結(jié)果表明：gh625-zn7mt3能夠抑制小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

附圖說明

圖1.gh625-zn7mt3對阿爾茨海默癥鼠腦組織海馬體ca1區(qū)細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控作用（a為對照組，b為ad鼠模型組，c為ad模型鼠給藥六周）。

圖2.gh625-zn7mt3抑制ad鼠腦內(nèi)abeta蛋白的沉積

圖3、gh625-zn7mt3對阿爾茨海默癥鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（a為對照組，b為ad鼠模型組，c為ad模型鼠給藥六周）。

gh625-mt3融合蛋白氨基酸序列（1-91）：

hglastltrwahynalirafgggmdpetcpcpsggsctca

dsckcegckctsckksccsccpaecekcakdcvckggeaa

eaeaekssccq