一種具有廣譜抗腫瘤活性的槐角總黃酮提取物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種天然植物總黃酬及其制備方法與應(yīng)用，尤其是設(shè)及一種具有廣譜 抗腫瘤活性的槐角總黃酬提取物及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 槐角（化UC化SSophorae)是《中華人民共和國(guó)藥典》（W下簡(jiǎn)稱藥典）收載的常用 中藥材，為豆科植物槐（SophorajaponicaL.)的干燥成熟果實(shí)。按照藥典規(guī)定，藥用槐角 通常應(yīng)采用冬季采收的成熟芙果。冬至W后采摘的干燥槐角芙果，其呈圓柱形，有時(shí)彎曲， 種子間鎌縮成連珠狀，包皮后，呈棟色或者黃褐色，其種子呈棟黑色；中醫(yī)理論認(rèn)為，槐角性 寒、味苦，歸肝、大腸經(jīng)，有清熱瀉火、涼血止血的功能，適用于腸熱便血，持腫出血，肝熱頭 痛，眩暈?zāi)砍唷?br>[0003] 關(guān)于槐角的化學(xué)研究早有報(bào)道，前人已經(jīng)從槐角中分離得到數(shù)種黃酬類、生物堿 類、=祗類、氨基酸和糖類等成分，其中黃酬類成分含量較高，且高于其他植物中的黃酬類 化合物的含量。目前，應(yīng)用LC/MS方法研究發(fā)現(xiàn)槐角中的黃酬化合物有27種，而運(yùn)些黃酬 類化合物水解后的巧元主要有4種，分別是搬皮素（quercetin)、染料木素（genistein)、山 奈酪化aempferol)和異鼠李素（isorhamnetin)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，槐角黃酬類成分主 要用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥、女性更年期綜合癥、老年癡呆癥、高血脂癥、高血壓癥、冠屯、 病、腦血栓、腫瘤等病癥，還用于抗衰老和防止皮膚老化、面部色斑或雀斑等方面。近年來(lái)， 人們對(duì)槐角中的黃酬類化合物及其提取方法做了大量的研究，ZL200810068891. 9公開了從 槐角中提取黃酬類成分并提取山奈素的方法，通過(guò)將槐角熱水提取、娃藻±過(guò)濾、大孔樹脂 吸附、乙醇洗脫制得槐角黃酬提取物，并將槐角黃酬提取物水解、過(guò)濾、對(duì)濾渣進(jìn)行萃取得 到高純度的山奈素，為槐角中有效成分的合理利用提供了新途徑，但是采用熱水提取對(duì)黃 酬類化合物的提取率較低，反而容易將可溶于水的雜質(zhì)如糖類等提取出，加大了分離的困 難；ZL200380110595. 6公開了一種含異黃酬的槐角提取物的制備方法，通過(guò)對(duì)槐角進(jìn)行熱 水提取、酶處理及乙醇提取制備出生物可吸收性好的高濃度巧元型異黃酬的槐角提取物， 但是采用酶處理不僅對(duì)提取設(shè)備的要求較高，而且在提取過(guò)程中，有可能改變槐角中某些 成分的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)，影響提取物的純度及收率；ZL201210323298. 0提供了一 種從槐角中綜合提取染料木素和山奈酪的方法，通過(guò)對(duì)原料進(jìn)行酸水水解得到山奈酪和染 料木素的混合物，再通過(guò)堿水液提取將兩者分離，該方法進(jìn)行的是單一成分的提取，沒(méi)有對(duì) 總黃酬的提取進(jìn)行研究。近年來(lái)對(duì)槐角總黃酬的提取工藝研究較少且停留在水提階段，提 取率低，也有W乙醇為溶劑，采用超聲輔助提取的報(bào)道，但為常規(guī)提取工藝，選用單一濃度 的乙醇進(jìn)行提取，所提取的槐角總黃酬的應(yīng)用也鮮有報(bào)道。
[0004] 綜上所述，槐角的研究歷史較早，化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用顯著，臨床應(yīng)用廣泛，目 前對(duì)槐角的研究中，染料木素和山奈酪的研究相對(duì)較多，而關(guān)于槐角總黃酬的提取制備方 法的研究報(bào)道較少，尤其是缺少能夠快速、有效提取制備具有良好抗癌活性的槐角總黃酬 提取物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)〇化]本發(fā)明的目的之一是提供一種具有廣譜抗腫瘤活性的槐角總黃酬提取物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠快速、有效提取制備具有良好抗癌活性的槐角 總黃酬提取物的方法。
[0007] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供槐角總黃酬提取物在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 一種具有廣譜抗腫瘤活性的槐角總黃酬提取物，所述提取物中至少含有搬皮素、 染料木素、山奈酪、異鼠李素四種組分，其各組分的質(zhì)量比為2~3 : 14~16 : 15~ 17 : 0? 5 ~Id
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供上述槐角總黃酬提取物的制備方法，包括W下步驟：
[0011] a、取秋季槐角果夾，洗凈，吸干水分，50~60°C烘干，備用；
[0012] b、干燥后的槐角果夾加入80%乙醇，浸潰2~3天，過(guò)濾，得乙醇浸潰液；將濾出 的槐角果夾，除去其中的種子，留取槐角皮，然后將槐角皮和乙醇浸潰液置于勻漿機(jī)中，加 入5~8倍體積的80%乙醇，高速勻漿，得槐角皮勻漿液；
[0013] C、將槐角皮勻漿液置于超聲波提取器中超聲提取1次，離屯、留上清液，所得殘?jiān)?用6倍體積量的60%乙醇超聲提取1次，離屯、留上清液；所剩殘?jiān)偌尤?倍體積量的40% 乙醇超聲提取1次，離屯、留上清液，合并上述各上清液；
[0014]t將合并后的上清液進(jìn)行真空抽濾，得到總黃酬粗提物；
[0015]e、將總黃酬粗提物溶于水中，離屯、過(guò)濾，去除不溶物，濾液上大孔吸附樹脂柱，用 純水沖洗去除多糖，再用65%~70%乙醇洗脫，收集洗脫液；將洗脫液加溫真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 去除乙醇溶液，干燥即得到槐角總黃酬提取物。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟C中每次超聲提取時(shí)間均為比，超聲功率為300W，超聲頻率為 40KHz〇
[0017] 更優(yōu)選地，所述步驟e中的大孔吸附樹脂為AB-8大孔吸附樹脂。
[0018] 再一方面，本發(fā)明提供所述槐角總黃酬提取物在抗腫瘤方面的應(yīng)用，具體地說(shuō)，所 述腫瘤為人食道癌、肝癌、乳腺癌或人淋己瘤。
[0019]本發(fā)明提供的槐角總黃酬提取物具有良好的體外抗氧化作用，并具有廣譜的抗腫 瘤活性，對(duì)人食道癌、肝癌、乳腺癌和人淋己瘤等具有顯著的抑制作用，應(yīng)用價(jià)值非常廣泛； 本發(fā)明提供的制備方法W秋季采摘的槐角為原料，采用梯度濃度乙醇溶液分級(jí)萃取的方 式，能夠快速、有效地從槐角中提取出具有良好抗腫瘤活性的槐角總黃酬成分，且該制備方 法簡(jiǎn)化了提取工藝，降低了提取成本，同時(shí)顯著提高了槐角總黃酬提取物的得率。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是槐角總黃酬提取物紫外光譜圖。
[0021] 圖2是黃酬標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖。
[0022] 圖3是鹽酸水解的槐角總黃酬提取物HPLC色譜圖。
[0023] 圖4是不同濃度槐角總黃酬提取物對(duì)人BL2淋己瘤細(xì)胞死亡率的流式細(xì)胞分析 圖，其中，A~F分別代表濃度為 0,0. 03mg/mL，0.lmg/mL，0. 3mg/mL，lmg/mL，3mg/mL槐角總 黃酬提取物對(duì)BL2淋己瘤細(xì)胞死亡率的影響效果，Q2代表早期調(diào)亡的細(xì)胞，Q4代表細(xì)胞死 亡，W兩者之和計(jì)算細(xì)胞死亡率。
[0024]圖5是不同濃度槐角總黃酬提取物對(duì)Eca-109細(xì)胞周期的影響效果對(duì)比圖，其中A~F分別代表濃度為 0,0. 156mg/mL，0. 313mg/mL，0. 625mg/mL，1. 250mg/mL，2. 500mg/mL 槐角總黃酬提取物對(duì)Eca-109細(xì)胞周期的影響效果，橫坐標(biāo)代表DNA含量，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞 數(shù)。 陽(yáng)0巧]圖6是不同濃度槐角總黃酬提取物對(duì)Eca-109細(xì)胞調(diào)亡的影響效果對(duì)比圖，其中A~F分別代表濃度為 0,0. 156mg/mL，0. 313mg/mL，0. 625mg/mL，1. 250mg/mL，2. 500mg/mL 槐角總黃酬提取物對(duì)Eca-109細(xì)胞調(diào)亡的影響效果，橫坐標(biāo)代表DNA含量，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞 數(shù)。 陽(yáng)0%] 圖7是不同濃度槐角總黃酬提取物對(duì)Eca-109細(xì)胞調(diào)亡率的影響關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 在W下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法， 所用試劑未標(biāo)明來(lái)源、規(guī)格的均為市售分析純或化學(xué)純。 陽(yáng)0測(cè)實(shí)施例1
[0029] 1)槐角總黃酬提取物的制備
[0030] 采摘及處理：將秋季采摘的槐角巧月15日~10月15日之間采自石家莊地區(qū)的 國(guó)槐）用自來(lái)水洗凈，吸干水分，60°C烘干備用。秋季槐角呈扁圓柱形，長(zhǎng)約1~6cm，直徑 約0. 6~1cm，有的略微彎曲，種子間鎌縮成連珠狀，顏色呈綠或黃綠色；果肉肉質(zhì)柔軟多汁 而粘；內(nèi)有個(gè)數(shù)不等種子，約1~6枚，種子長(zhǎng)約8~10mm，寬約5~8mm，厚約5mm，飽滿光 滑呈淡黃色，腎形，一側(cè)有楠圓形的種廝，旁有圓形珠孔，另一旁有略顯凸起的種脊。與冬季 槐角比較單個(gè)槐角平均濕重和干重，考察其成熟度，確定秋季槐角已成熟，只是含水量高于 冬季槐角，約是冬季槐角的3倍。
[0031] 原料預(yù)處理：取干燥的槐角250g，按1:2料液比加入80%乙醇，浸潰2天，手工分 離槐角皮與種子或?qū)⑵渲糜趧驖{機(jī)中低速旋轉(zhuǎn)，使槐角皮與種子分離，將槐角皮與浸潰后 的乙醇液置于勻漿機(jī)中，加入8倍體積的80%乙醇高速勻漿，得槐角皮勻漿液。
[0032] 超聲提取：將槐角皮勻漿液置于超聲波提取器中，超聲提取比（超聲功率：300W， 超聲頻率：40KHz)，將超聲后的勻漿液高速離屯、（離屯、條件：轉(zhuǎn)速：10000r/min，離屯、時(shí)間： 10分鐘，離屯、力：11179牛頓），收集上清液；殘?jiān)?倍量的60%乙醇按前述條件繼續(xù)超 聲提取1小時(shí)，離屯、取上清液；剩余殘?jiān)儆?倍量的40%乙醇按前述條件繼續(xù)超聲提取1 小時(shí)，離屯、取上清液，殘?jiān)稍锖蠓Q重；合并所有上清液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，加溫減壓去除 水醇，溫度分兩級(jí)